CN107058599A

CN107058599A - 一种检测金黄色葡萄球菌的引物组合物、试剂盒及其双信号通道检测方法

Info

Publication number: CN107058599A
Application number: CN201710482548.8A
Authority: CN
Inventors: 方雪恩; 王欣珍; 王雄; 孔继烈
Original assignee: Shanghai Quick Diagnosis Products Co Ltd
Current assignee: Shanghai Quick Diagnosis Products Co Ltd
Priority date: 2017-06-22
Filing date: 2017-06-22
Publication date: 2017-08-18

Abstract

本发明涉及一种检测金黄色葡萄球菌的引物组合物、试剂盒及其双信号通道检测方法，其包括待检样品核酸提取；恒温扩增反应：在含有颜色指示剂、DNA嵌入式染料、待检样品DNA及其扩增引物的反应体系中进行恒温扩增反应；结果判读：根据扩增结束后指示剂的颜色变化进行直接肉眼判读和/或结合特定仪器检测核酸扩增曲线进行判读。本发明在反应体系中加入肉眼可见指示剂避免操作人员不易辨认是否加样成功的问题，其利用DNA嵌入式染料结合配套仪器进行扩增曲线的检测及指示剂可视化肉眼观测结果的双信号通道检测方法，可根据应用场景需要，选定其中一种信号通道进行结果的判定，这使得本发明在实际应用中更加简便、快捷、并且容易操作、适用于现场操作。

Description

一种检测金黄色葡萄球菌的引物组合物、试剂盒及其双信号通道检测方法

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种检测金黄色葡萄球菌的引物组合物、试剂盒及其双信号通道检测方法。

背景技术

根据实际情况，在反应容器中可以实现任何以Bst DNA聚合酶为介导的等温扩增技术(包括交叉引物等温扩增CPA；环介导等温核酸扩增LAMP；智能等温核酸扩增SMAP；多自配引发扩增IMSA等技术)。

环介导恒温扩增利用链置换DNA聚合酶以及特异性引物，保证引物在等温条件下顺利与模板结合并进行链置换扩增反应，有别于聚合酶链式反应需要变温才能进行扩增，可实现在恒温条件下的连续快速扩增，具有较高的灵敏度、特异性和扩增效率。

核酸恒温扩增反应液通常为无色透明，在实际操作过程中，经常出现漏加、遗漏、移液混匀的不方面。需要一种能够方便的确定反应液充满的颜色指示剂以便于实际的操作过程。

专利文献(CN 104312913 A)公开了在反应液中加入荧光染料钙黄绿素作为颜色指示剂，不需要仪器在1小时内即可实现对结果的可视化检测。但是该方法中每个反应室体系为25μL，钙黄绿素阴性结果为黄色，阳性结果为绿色，在微小体积比如小于10μL反应下颜色不易区分。

专利文献(CN 106520517 A)公开了微流控芯片LAMP可视化检测仪，同样利用荧光染料钙黄绿素作为颜色指示剂，这套检测系统包括微型摄像机和微型紫外荧光灯，利用阳性反应紫外下有荧光，阴性反应无荧光进行判定，但该套系统需要借助该外部仪器。

核酸扩增反应系统的建立是目前分子生物学和产业领域重要的一个内容，然而当前反应体系统存在工作液通常为透明，在移液、混匀、加样等操作过程中，存在疏忽、漏加、操作不便等情况。因此建立一种具有颜色体系的核酸扩增反应系统，对于方便操作，避免漏加等具有一定实际意义。

另外当前的核酸扩增反应体系的结果判定通常借助于荧光分析仪(如荧光定量PCR仪等)，不利于在门急诊、现场等进行快速的结果判读，需要引进一种特异性好、灵敏度高、操作方便的颜色变化颜色指示剂。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提出一种金黄色葡萄球菌的引物组合物、试剂盒及其双信号通道检测方法，其在反应体系中加入肉眼可见颜色指示剂，可提高加样准确度，同时在反应体系中加入DNA嵌入式染料在扩增结束时依靠仪器S型曲线判定结果，其与颜色指示剂肉眼可视化判定结合构成双信号通道检测，更有利于实验准确性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一方面，本发明提供一种用于检测金黄色葡萄球菌的引物组合物，其包括SEQ IDNo：1所示序列的外引物1，SEQ ID No：2所示序列的外引物2，SEQID No：3所示序列的内引物1以及SEQ ID No：4所示序列的内引物2。

各引物的序列如下所示：

外引物1(SEQ ID No：1)：

TTAGCATCTGCATGGTTTG；

外引物2(SEQ ID No：2)：

GCAAAGAAGATGGCAACAA；

内引物1(SEQ ID No：3)：

ATTGCTGCAGATAACAAATTAGCTGGTTGCTTCTTATCAACAACAAGT；

内引物2(SEQ ID No：4)：

AGCAGTAGTGCCGTTTGCTTGGTAACGGAGTACATGTCG。

另一方面，本发明提供一种含有权利要求1所述的引物组合物的的试剂盒。

为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：

优选地，该试剂盒包括所述试剂盒包括反应体系，该反应体系包括SEQ IDNo：1-SEQ ID No：4所示序列的引物、模板DNA、颜色指示剂、DNA嵌入式染料。

优选地，该试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、缓冲液和水。

优选地，每100μL反应体系中，含有2μL外引物1、2μL外引物2、16μL内引物1、16μL内引物2、4μLBst DNA聚合酶、0.5～1.5μL颜色指示剂、2.5～5μLDNA嵌入式染料；其中，所述外引物1、外引物2、内引物1和内引物2的浓度均为10μM，Bst DNA聚合酶的浓度为8U/μL，颜色指示剂的浓度为10mM，所述DNA嵌入式染料为20×DNA嵌入式染料；更优选地，每100μL反应体系中，含有1μL颜色指示剂、4μL DNA嵌入式染料，采用该体积的颜色指示剂和DNA嵌入式染料能够更为准确的进行扩增结果的判读。

应当理解的是，在满足扩增反应的条件下，上述反应体系中采用的所有试剂的浓度及体积均可进行适当的调整。

最后，本发明还提供一种采用上述试剂盒检测金黄色葡萄球菌的用于非诊断和治疗目的的双信号通道检测方法，其包括如下步骤：

步骤1)待检样品核酸提取；

步骤2)恒温扩增反应：在预定体积的含有颜色指示剂、DNA嵌入式染料、待检样品DNA及其扩增引物所示序列的引物的反应体系中进行恒温扩增反应；

步骤3)结果判读：根据扩增结束后颜色指示剂的颜色变化进行直接肉眼判读和/或利用DNA嵌入式染料结合特定仪器检测核酸扩增曲线进行判读。。

优选地，待检样品DNA为金黄色葡萄球菌核酸，扩增引物为SEQ ID No：1-SEQ IDNo：4所示序列。

优选地，步骤2)中颜色指示剂包括HNB、Calcein、甲酚红、酚红、间甲酚紫、溴甲酚紫、中性红、萘酚酞、百里酚蓝；更优选地，所述颜色指示剂为中性红，反应结束后，根据各反应体系中样本的颜色变化确定所述待测样本液中是否含有相应靶标基因组：若所述待测样品的颜色为红色，则所述待测样本液中含有相应靶标的基因；若所述待测样品的颜色为黄色，则所述待测样本液中不含有相应靶标的基因。

优选地，步骤2)中DNA嵌入式染料包括SYBR Green、Ever Green、Pico Green、SYTO系列；更优选为SYBR Green。

优选地，该方法也可用于病原体检测，所述病原体包括细菌、真菌、DNA病毒等，还可用于转基因检测，癌症基因检测等，当该方法适用于其他检测对象时，只需改变反应体系内的各试剂的种类，并替换目标DNA及其引物，其具体步骤与检测金黄色葡萄球菌的双信号通道检测方法相同。

优选地，步骤2)中的恒温扩增反应在微流控芯片或PCR反应管中进行；更优选为微流控芯片，由于微流控芯片反应体系体积较小，颜色指示剂及DNA嵌入式染料的种类及用量就更为重要，发明人经过种类及浓度配比之后，优先选用中性红颜色指示剂和SYBR Green染料，上述组合使得肉眼可视化及扩增曲线的两种判读方式互不干扰，且判读结果准确性更高。

优选地，所述微流控芯片的制作包括如下步骤：

a)微流控芯片采用经过表面处理的高透明材料制备；

b)对步骤a)制备的微流控芯片采用等离子清洗机冲洗其表面，用惰性气体风干；

c)对步骤b)中风干后的微流控芯片采用压敏键合膜进行封装。

优选地，所述高透明材料包括PC、PMMA或COC。

优选地，采用等离子清洗和压敏键合膜的封装一方面有利于黏贴的更加牢固，另一方面起到芯片表面清洗的作用。

上述微流控芯片包括底片、反应检测部分、通孔及封膜，所述通孔位于微流控芯片的中心，并与配套的设备相连接；所述反应检测部分包括加样孔、储液区、预留区、反应孔、球阀、废液缸、排气孔、第一通道和第二通道，所述预留区为凹凸线纹通道，一端连接加样孔，另一端连接排气孔，所述第一通道和第二通道位于底片上，第一通道连接预留区、废液缸和排气孔，第二弧形通道连接排气孔、废液缸和预留区，所述球阀位于预留区与反应孔之间；该微流控芯片的结构可以根据需要做相应变化；进一步地，该微流控芯片本身自带内部质控功能(阳性质控、阴性质控)，质控位点可以根据需要灵活调整，以弥补恒温扩增无法进行质控的缺点；反应体系首先加入微流控芯片的加样孔中，液体在离心力作用下流入反应孔内，于微流控芯片核酸分析仪进行恒温扩增反应。

优选地，检测对象为金黄色葡萄球菌时，所述步骤3)中恒温扩增反应的条件为60～70℃15～60min；更优选为60℃60min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明实现以下三个功能：1)反应液的颜色化；2)扩增反应最终结果的肉眼判读法；3)肉眼判读法和荧光法的双信号系统。

本发明的反应体系中加入肉眼可见颜色指示剂，该颜色指示剂可在反应前加入，不影响扩增，同时可以指示反应结果，阴性为黄色，阳性为红色，同时利用该颜色指示剂使得反应混合物具有一定颜色，有利于快速、方便的操作和移取液体。

本发明在基于Bst酶介导的等温核酸扩增系统中，同步使用两种信号通道，一种为DNA扩增子嵌入式染料；另外一种为颜色指示剂染料。通过优化其浓度，实现两个信号通道不相互干扰的效果。根据本发明的定性检测方法，可以依据颜色变化(阳性为红色，阴性为黄色)目测对反应结果进行定性分析，也可以依据S型曲线ct值进行判定，实现双信号判定。本发明可根据不同使用场景，使用不同信号通道来进行扩增结果的判定。在有条件的场所进行扩增反应的实时荧光判读，在没条件的地方实现肉眼直接判读，扩大该反应体系的应用和使用场所。

本发明所提供的基于Bst酶链置换特性的双信号通道检测方法，可以根据应用场景需要，选定其中一种信号通道进行结果的判定，可以在三甲等大医院进行应用，也可以在基层医院进行广泛的应用。

附图说明

图1为本发明一实施例中采用的微流控芯片的结构示意图；

图2是本发明一实施例中可采用的其他微流控芯片的结构示意图；

图3为本发明用于检测金黄色葡萄球菌，在微流控芯片中扩增反应结束后样品的S型曲线检测结果图；

图4为图3所述的样品的肉眼可视化检测结果图；

图5为本发明用于检测单增李斯特氏菌，在反应试管中扩增反应结束后样品的肉眼可视化检测结果图和S型曲线检测结果图；

图6为图5所述的样品中的颜色指示剂的特异性和灵敏度检测结果图；

图7为本发明用于检测转基因大豆基因，在反应试管中扩增反应结束后样品的肉眼可视化检测结果图和S型曲线检测结果图；

图中附图标记为：

1、加样孔；2、储液区；3、预留区；4、反应孔；5、球阀；6、废液槽；7、排气孔；8、第一弧形通道；9、第二弧形通道。

1#～4#：反应检测部分；A～H：样本DNA的扩增反应孔。

在下文中，反应检测部分1#的反应孔A以1#-A表示，反应检测部分1#的反应孔B以1#-B表示，依次类推。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例一

本实施例为用于检测金黄色葡萄球菌的双信号通道检测方法，其与微流控芯片相结合。

(1)本实施例采用的微流控芯片的结构；

如图1所示，本发明采用的微流控芯片为圆盘形微流控芯片，其包括4个反应检测部分，每一反应检测部分包括加样孔1、储液区2、预留区3、反应孔4、球阀5、废液槽6、排气孔7、第一弧形通道8和第二弧形通道9，其中球阀5为为毛细微阀，其尺寸大小非常关键，一方面利于完成液体的二次离心分配(50～300um)，第二方面防止液体蒸发和不同反应孔之间的交叉污染；上述第一弧形通道8和第二弧形通道9位于底片上，第一弧形通道8连接预留区3和排气孔7，第二弧形通道9连接加样孔1、储液区2和预留区3，上述球阀5位于预留区3与反应孔2之间，每个反应检测部分具有8个反应孔；其中，所述加样孔1与排气孔7处均贴有硅胶贴或者橡胶塞，等完成加样后，利用橡胶塞塞住加样孔，增加内部气压，可以避免在加热反应过程中，液体的蒸发情况。

如图2所示，本发明也可采用其他结构形式的微流控芯片，其可以根据需要做相应的调整变化，如A×B型，其中A代表样本数/盘；B代表靶点数。具体为2-1表示的2×16，2-2表示的4×8，2-3表示的8×4，2-4表示的16×2。

上述微流控芯片通过不同加样孔进行进样离心，预留区通过球阀与储液区相通，通过离心机的低速(1000rpm)离心，储液区的液体在离心力作用下依次流入预留区中；预留区通过球阀与反应孔相通，再通过高速(3000rpm)离心，预留区的液体在离心力作用下依次流入反应孔中，多余液体流入废液槽中；在反应孔在一定温度下进行反应，加热进入反应阶段时，球阀防止加样孔中的液体回流到预留区中进而向周围反应孔扩散，同时保证反应孔中的液体是全满状态，保证反应进行并且防止污染。

本发明所述的微流控芯片采用高透明材料制备，如PC，PMMA，或者COC等，并经过表面处理，避免生物大分子，如活性酶在芯片表面的附着，影响整体酶促反应；将微流控芯片进行等离子清洗，用等离子清洗机冲洗微流控基片表面，用惰性气体风干，并采用压敏键合膜进行封装，此种方式一方面有利于黏贴的更加牢固，另一方面起到芯片表面清洗的作用，本发明采用的压力键合膜粘性强度、能够耐受常规加热温度、对所进行的反应没有显著不良影响；微流控芯片还可自带内部质控功能(阳性质控、阴性质控)，质控位点可以根据需要灵活调整，以弥补恒温扩增无法进行质控的缺点。

(2)用于检测金黄色葡萄球菌的双信号通道检测方法的建立；

1)待检测样品核酸提取；

用磁珠法核酸提取试剂盒提取金黄色葡萄球菌核酸，操作步骤如下：

A)核酸提取纯化准备

a.裂解液如有沉淀，请于56℃温浴至沉淀完全溶解后使用。

b.使用前，加24mL无水乙醇至洗液三中，混匀，并做好标记(确保瓶盖拧紧，防止乙醇挥发)。

c.将蛋白酶混合物充分混匀后，按照每管20μL分装至各离心管中。

d.按照每管分装10μL内标的量至各离心管中。

B)核酸提取纯化步骤

a.向上述已分好蛋白酶和内标的离心管中加入200μl临床样本和阴阳性对照，轻轻混匀；然后再加入400μl裂解液，漩涡振荡10s，56℃孵育10分钟。

b.然后加入300μl核酸共沉剂和2μl磁珠，上下颠倒离心管10次，使管内磁珠分布均匀。

c.静置离心管10分钟，期间每隔两分钟上下颠倒离心管5次，使管内磁珠分布均匀。

d.离心管置于离心机上，8000g离心1min，用移液器吸去管内液体。

e.加入500μl洗液一，用移液器枪头轻柔打散管壁磁珠，漩涡振荡10s，直至其分布均匀。

f.将离心管置于离心机上，8000g离心1min，用移液器吸去管内液体。

g.加入500μl洗液二，用移液器枪头轻柔打散管壁磁珠，漩涡振荡10s，直至其分布均匀。

h.将离心管置于离心机上，8000g离心1min，用移液器吸去管内液体。

i.加入500μl洗液三，用移液器枪头轻柔打散管壁磁珠，漩涡振荡10s，直至其分布均匀。

j.将离心管置于离心机上，8000g离心1min，用移液器吸去管内液体。

k.将离心管置于离心机上，8000g离心30s，用移液器吸去管内残余液体。

l.打开管盖，室温干燥2分钟。

m.加入60μl洗脱液，用移液器枪头打散管壁磁珠，直至其分布均匀。56℃孵育3分钟。

n.将离心管置于离心机上，10000g离心1min。将收集到的60μl上清液吸取至一个无核酸酶干净的离心管中，即为纯化后的核酸溶液用于恒温荧光扩增。

将提取好的核酸进行浓度测定。

2)设计特定的金黄色葡萄球菌的特异性引物；

金黄色葡萄球菌特异性引物包括：

外引物1：TTAGCATCTGCATGGTTTG(SEQ ID No：1)；

外引物2：GCAAAGAAGATGGCAACAA(SEQ ID No：2)；

内引物1：ATTGCTGCAGATAACAAATTAGCTGGTTGCTTCTTATCAACA

ACAAGT(SEQ ID No：3)；

内引物2：AGCAGTAGTGCCGTTTGCTTGGTAACGGAGTACATGTCG

(SEQ ID No：4)；

上述引物用于核酸靶标的检测。1组8个反应孔中，检测的是同一浓度的靶标；3)LAMP恒温扩增反应：将待测样本DNA梯度稀释至10⁴，10³，10²copies/μL，ddH₂O分别和颜色指示剂中性红、DNA嵌入式染料SYBR Green、引物、反应试剂(酶，dNTPs和缓冲液)混合后，注入相应芯片的加样孔；

备注：Mix4模板：10⁴copies/μL，mix3模板：10³copies/μL，mix2模板：10²copies/μL，mix1模板：ddH₂O；10mM中性红和20×SYBR Green的最佳体积分别为1uL和4uL。

取80μL上述预混液通过加样孔分别加样，mix1加到1#反应检测部分的反应孔，mix2加到2#反应检测部分的反应孔，mix3加到3#反应检测部分的反应孔，mix4加到4#反应检测部分的反应孔，加样后，加样孔与排气孔用封口硅胶，覆盖在加样孔与排气孔上，对该微流控芯片进行离心处理。

将加样且离心处理后的芯片放到配套仪器微流控芯片核酸分析仪内，60℃60min完成扩增反应。

4)采用双信号通道进行结果判读；

在配套仪器微流控芯片核酸分析仪上阳性反应孔出现S形扩增曲线，阴性反应孔没有扩增曲线，若检测到某反应孔出现扩增曲线，则该反应孔对应的该样本的检测指标为阳性。如图3所示，扩增曲线对应的反应孔分别为4#-A(10⁴copies/μL模板扩增)，3#-A(10³copies/μL模板扩增)，2#-A(10²copies/μL模板扩增)，1#-A(ddH₂O)，其中4#-A、3#-A、2#-A都有S型扩增曲线，1#-A作为阴性对照无扩增曲线。

在芯片上阳性反应孔为红色，阴性反应孔为黄色，若检测到某反应孔出现红色，则该反应孔对应的该样本的该检测指标为阳性。如图4所示，1#反应检测区的8个反应孔为ddH₂O，颜色为黄色；2#反应检测区的8个反应孔为10²copies/μL模板扩增，颜色为红色；3#反应检测区的8个反应孔为10³copies/μL模板扩增，颜色为红色；4#反应检测区的8个反应孔为104copies/μL模板扩增，颜色为红色。

由上述结果可知，扩增曲线的扩增定性结果与中性红颜色指示剂颜色变化判定一致，曲线判定方法与颜色终点法具有一致的检测灵敏度。

本实施例在微流控芯片中的反应体系中加入肉眼可见颜色指示剂，该颜色指示剂可在反应前加入，不影响扩增，同时可以指示反应结果；其结果采用双信号通道判读，采用配套仪器S型曲线ct值检测同步结合颜色指示剂颜色变化肉眼判读，有利于检测结果判读的准确性，同时可在不同应用场合进行应用。在实验室检测时可应用配套仪器对扩增ct值结合肉眼颜色变化进行检测，在现场检测室，无特定检测设备时可仅依靠颜色变化肉眼判定。

本实施例所述的微流控芯片芯片通过缓冲区保障离心分配后反应室里液体全满，但凹凸线纹通道宽度极细，会导致离心时有部分反应室液体未满，透明的液体在透明的芯片中不易观察，因此加入颜色指示剂后可以方便的确定液体充满情况，也便于加样，提高加样的准确度。

根据本实施例的定性检测方法，可以依据目测对芯片结果进行定性分析，本发明的优越之处在与兼顾微流控芯片检测性能以及可操作性，既可以结合配套仪器，也可以根据肉眼观测最终结果，因此该系统可以适应高通量自动化或简便操作的要求。

实施例二

本实施例为用于检测单增李斯特氏菌的双信号通道检测方法。

1)待检测样品核酸提取；

采用磁珠法提取单增李斯特氏菌实际样本(粪便样本)的总基因组核酸，磁珠核酸提取步骤：

a.取待检样本200μL，依次加入20μl蛋白酶K溶液、400μl裂解液，漩涡振荡10s，56℃孵育10分钟。

b.加入300μl异丙醇和2μL磁珠，上下颠倒离心管10次，使管内磁珠分布均匀。

c.静置离心管10分钟，每隔两分钟上下颠倒离心管5次，使管内磁珠分布均匀。

d.将离心管置于离心机上，10000g离心1min，用移液器吸去管内液体。

f.将离心管置于离心机上，10000g离心1min。用移液器吸去管内液体。

h.将离心管置于离心机上，10000g离心1min。用移液器吸去管内液体。

j.将离心管至于离心机上，10000g离心1min。用移液器吸去管内液体。

k.将离心管至于离心机上，10000g离心30s。用移液器吸去管内残余液体。

l.打开管盖，室温干燥2分钟。

m.加入80μl洗脱液，用移液器枪头打散管壁磁珠，直至其分布均匀。56℃孵育3分钟。

n.将离心管置于离心机上，10000g离心1min。吸取上清液至一个干净的无核酶离心管中，此即为纯化后的核酸溶液。

2)设计特定的单增李斯特氏菌的特异性引物；

单增李斯特氏菌特异性引物包括：

外引物1：TGATCACTCTGGAGGCTAC(SEQ ID No：5)；

外引物2：CCATTCCCAAGCTAAACCA(SEQ ID No：6)；

内引物1：

TGAACAATTTCGTTACCTTCAGGATGTTGCTCAATTCAACATCTCTT(SEQ IDNo：7)；

内引物2：AGCAAGTTAGCTCATTTCACATCGGTGCATTCTTTGGCGTAA

(SEQ ID No：8)；

3)配置恒温扩增反应体系(50μl体系)

20mMTris-HCl(pH 8.8@25℃)，10mMKCl，10mM(NH₄)₂SO₄，8mMMgS04,0.1％Tween-20，20×DNA嵌入式染料(SYBR Green)，肉眼颜色指示剂(中性红)。F3/B3＝0.2uM；FIP/BIP＝1.6uM；LF/LB＝0.8uM。Bst酶8U。

4)恒温扩增反应：将混好的反应液加入PCR反应管中，再加入100μl矿物油封闭，用封板膜盖好孔口，放入荧光定量PCR仪中(ABI7500)中60℃60mins。

5)结果判定：如图5中的5-1所示，同时利用肉眼颜色指示剂，反应液变成红色的判定为阳性结果，反应液为阴性的判定为阴性结果；如图5中的5-2所示，出现S型曲线的判定为阳性结果，没有出现S型曲线的判定为阴性结果。

如图6所示，采用6个反应体系来验证颜色指示剂的特异性和灵敏度，由图可知扩增曲线的扩增定性结果与中性红颜色指示剂颜色变化判定一致，曲线判定方法与颜色终点法具有一致的检测灵敏度。

实施例三

本实施例为用于检测转基因大豆基因的双信号通道检测方法。

1)MON87701品系体系配制：

20mMTris-HCl(pH 8.8@25℃)，10mMKCl，10mM(NH₄)₂SO₄，8mM MgS04,0.1％Tween-20，20×DNA嵌入式染料(SYBR Green)，颜色指示剂(中性红)。F3/B3＝0.2uM；FIP/BIP＝1.6uM；LF/LB＝0.8uM。Bst酶8U。

MON87701品系体系特异性引物包括：

外引物1：CACGCTTAGTGTGTGTGT(SEQ ID No：9)；

外引物2：CGACCACGGAAAAAAAACAC(SEQ ID No：10)；

内引物1：

CGATATCAAGCTTGATGGGGATCACAAACACTGATAGTTTAAACTGAAG(SEQ ID No：11)；

内引物2：CGGGGGATCCACTAGTTCTAGTGAATTCGAGCTCGGTAC(SEQ ID No：12)；

2)试验样本准备：

MON87701阴性对照，阳性对照；

MON87701质粒稀释。

稀释后终浓度

1×10⁶

1×10⁵

1×10⁴

5×10³

1×10³

5×10²

1×10²

DNA

15μl

20μl

100μl

40μl

100μl

40μl

H₂O

135μl

180μl

100μl

160μl

100μl

160μl

3)加样及恒温扩增反应：

将Reaction Mix震荡混匀后按每管21μL分装，每管依次加入稀释好的样本4μl，加样顺序见下表。

	12	11	10	9	8	7	6	5	4	3	2	1
														10⁴	10⁴	5x10³	5x10³	10³	10³	5x10²	5x10²	10²	10²	N	N

将混好的反应液加入PCR反应管中，再加入10μl矿物油封闭，用封板膜盖好孔口，放入荧光定量PCR仪中(ABI7500)中60℃60mins。

4)结果判读：如图7的7-1所示，颜色指示扩增的反应产物强阳性为红色，阴性和弱阳性为黄色，颜色指示扩增结果，肉眼可见，区分强阳性和阴性(弱阳)；如图7的7-2所示，出现S型曲线的判定为阳性结果，没有出现S型曲线的判定为阴性结果。

由上述结果可知，扩增曲线的扩增定性结果与颜色指示剂颜色变化判定一致，曲线判定方法与颜色终点法具有一致的检测灵敏度。

通过上述实施例表明，本发明所述的检测金黄色葡萄球菌的双信号通道检测方法，在反应体系中加入肉眼可见颜色指示剂避免操作人员不易辨认是否加样成功的问题，同时兼顾各场地的可操作性，采用双信号通道检测方法，既可以利用DNA嵌入式染料结合配套仪器进行扩增曲线的检测，也可以根据颜色指示剂的可视化肉眼观测最终结果，本发明可根据不同使用场景，使用不同信号通道来进行扩增结果的判定，这使本发明在实际应用中更加简便、快捷、并且容易操作、适用于现场操作；该双信号通道检测方法也适用于其他病原微生物的检测。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海速创诊断产品有限公司

<120> 一种检测金黄色葡萄球菌的引物组合物、试剂盒及其双信号通道检测方法

<130> IPI171686

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 金黄色葡萄球菌外引物1

<400> 1

ttagcatctg catggtttg 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 金黄色葡萄球菌外引物2

<400> 2

gcaaagaaga tggcaacaa 19

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 金黄色葡萄球菌内引物1

<400> 3

attgctgcag ataacaaatt agctggttgc ttcttatcaa caacaagt 48

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 金黄色葡萄球菌内引物2

<400> 4

agcagtagtg ccgtttgctt ggtaacggag tacatgtcg 39

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 单增李斯特氏菌外引物1

<400> 5

tgatcactct ggaggctac 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 单增李斯特氏菌外引物2

<400> 6

ccattcccaa gctaaacca 19

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 单增李斯特氏菌内引物1

<400> 7

tgaacaattt cgttaccttc aggatgttgc tcaattcaac atctctt 47

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 单增李斯特氏菌内引物2

<400> 8

agcaagttag ctcatttcac atcggtgcat tctttggcgt aa 42

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MON87701品系外引物1

<400> 9

cacgcttagt gtgtgtgt 18

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MON87701品系外引物2

<400> 10

cgaccacgga aaaaaaacac 20

<210> 11

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MON87701品系内引物1

<400> 11

cgatatcaag cttgatgggg atcacaaaca ctgatagttt aaactgaag 49

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MON87701品系内引物2

<400> 12

cgggggatcc actagttcta gtgaattcga gctcggtac 39

Claims

1.一种用于检测金黄色葡萄球菌的引物组合物，其特征在于，包括SEQ ID No：1所示序列的外引物1，SEQ ID No：2所示序列的外引物2，SEQ ID No：3所示序列的内引物1以及SEQID No：4所示序列的内引物2。

2.一种含有权利要求1所述的引物组合物的的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括反应体系，该反应体系包括SEQ ID No：1-SEQ ID No：4所示序列的引物、模板DNA、指示剂、DNA嵌入式染料、BstDNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、缓冲液和水。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，每100μL反应体系中，含有2μL外引物1、2μL外引物2、16μL内引物1、16μL内引物2、0.5～1.5μL颜色指示剂、2.5～5μL DNA嵌入式染料。

5.一种利用权利要求2～4中任一项所述的试剂盒检测金黄色葡萄球菌的用于非诊断和治疗目的的双信号通道检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1)待检样品核酸提取；

步骤2)恒温扩增反应：在预定体积的含有颜色指示剂、DNA嵌入式染料、待检样品DNA及其扩增引物的反应体系中进行恒温扩增反应；

步骤3)结果判读：根据扩增结束后指示剂的颜色变化进行直接肉眼判读和/或利用DNA嵌入式染料结合特定仪器检测核酸扩增曲线进行判读。

6.根据权利要求5所述的检测病原微生物的双信号通道检测方法，其特征在于，步骤2)中指示剂包括HNB、Calcein、甲酚红、酚红、间甲酚紫、溴甲酚紫、中性红、萘酚酞、百里酚蓝。

7.根据权利要求5所述的检测病原微生物的双信号通道检测方法，其特征在于，步骤2)中DNA嵌入式染料包括SYBR Green、Ever Green、Pico Green、SYTO系列。

8.根据权利要求5所述的检测病原微生物的双信号通道检测方法，其特征在于，步骤2)中的恒温扩增反应在微流控芯片或反应试管中进行。

9.根据权利要求8所述的检测病原微生物的双信号通道检测方法，其特征在于，所述微流控芯片的制作包括如下步骤：

a)微流控芯片采用经过表面处理的高透明材料制备；

c)对步骤b)中风干后的微流控芯片采用压敏键合膜进行封装。

10.根据权利要求9所述的检测病原微生物的双信号通道检测方法，其特征在于，所述高透明材料包括PC、PMMA、COC。