CN110804670A - 一种基于rpa-lfs快速检测副溶血弧菌的特异性引物对、试剂盒及应用 - Google Patents

一种基于rpa-lfs快速检测副溶血弧菌的特异性引物对、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及检测技术领域，具体而言，涉及一种基于RPA‑LFS快速检测副溶血弧菌的特异性引物对、试剂盒及应用，该试剂盒包括特异性引物对及探针、侧流层析试纸条；所述探针5’末端的修饰方式为：用FITC进行标记，3’末端的修饰方式为：引入3C‑spacer进行末端封闭，在探针中间引入THF，即无嘌呤无嘧啶位点(AP位点)；所述探针在AP位点前至少要保留30bp的碱基，在AP位点之后至少有15bp的碱基；所述下游引物的5’末端的修饰方式为：标记生物素。本发明优点在于：不依赖实验室设备，能够很好的应用到现场检测中，可实现在25℃‑45℃，20min内快速检测副溶血弧菌。

Description

一种基于RPA-LFS快速检测副溶血弧菌的特异性引物对、试剂 盒及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于RPA-LFS快速检测副溶血弧菌的特异性引物对、试剂盒及应用。
背景技术
目前，检测副溶血弧菌的常用方法有传统的培养法，免疫诊断，核酸诊断，其中，核酸诊断主要有聚合酶链式反应(PCR)和(LAMP) 两种方法，传统培养法是在我国颁布的国家标准GB/T4789.7—2008 《食品卫生微生物学检验副溶血弧菌检验》中，将送检的样品增菌后进行分离培养，随后对分离培养的可疑菌株进行形态学和生化鉴定，对鉴定结果进行综合评价，确定可疑菌株是否是副溶血弧菌。该方法检测周期长，工作量大，对工作人员实验技能要求高，该实验操作只能在实验室进行，无法进行现场检测。
免疫诊断是结合抗原抗体免疫反应和酶的高效催化反应的一种可视化检测。通过酶降解底物呈现的颜色深浅来判断检测抗原的多少。该方法特异性强，但对试剂的选择性高，灵敏度低，并且容易出现交叉反应。
核酸诊断技术因其特异性强，灵敏度高而受到人们的高度关注，常用的核酸诊断技术主要包括常规PCR扩增和LAMP两大类。据报道 PCR技术用于检测病原体的种类已超过100多种，但是由于要经过三个温度阶段，实验设备要求高且耗时长。因此，PCR技术被局限于实验室研究，不宜做野外实地检测(POCT检测)。与PCR相比，等温扩增技术更简单，快速，其特异性和灵敏度与PCR相当，该技术既克服了传统PCR技术高温变性获得单链模板的缺陷，也避免了升降温的过程，无需温控设备，很大程度上降低了检测成本。
传统的培养法检测副溶血弧菌的检测周期长，工作量大，对工作人员实验技能要求高，该实验操作只能在实验室进行，无法进行现场检测。PCR要经过三个温度阶段，实验设备要求高且耗时长，因此， PCR技术被局限于实验室研究，不宜做野外实地检测(POCT检测)。 LAMP在很大程度上避免了PCR的缺陷，但其自身也存在一定的问题： 1、LAMP引物设计比较复杂，需要2-3对引物；2、LAMP很容易产生假阳性的结果，降低结果的精确度；4、LAMP扩增时间一般在 40min-60min，在一定程度上增加了时间成本。
传统的副溶血弧菌检测方法由于检测时间长，设备依赖性强，对检测人员实验操作技能要求高，因此被局限于实验室检测，不适合进行现场检测。此外，再样本送检过程中会影响样本的质量，对后期检测造成不同程度的影响。因此需要建立一个不依赖于设备的现场快速检测方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的检测副溶血弧菌的技术无法很好的应用到现场快速检测中的缺点，而提出的一种基于RPA-LFS快速检测副溶血弧菌的特异性引物对、试剂盒及应用。
本发明涉及一种基于RPA-LFS快速检测副溶血弧菌的特异性引物对，包括特异性引物对以及探针，所述特异性引物及探针的序列为：
上游引物：5’-TCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCG
下游引物：5’-Biotin-CTGTAACTTGTTTAGCGTTGTGACTGCAGTG
探针：
5’-FITC-GAAGAGCATGGTTTCGTGAACGCGAGCGAT[THF]CTTGTTTGGAG ATCA-SpC3
本发明还涉及一种基于RPA-LFS快速检测副溶血弧菌的试剂盒，所述试剂盒包括：特异性引物对及探针、侧流层析试纸条；所述探针的长度至少为46bp；所述探针5’末端的修饰方式为：用FITC进行标记，3’末端的修饰方式为：引入3C-spacer进行末端封闭，在探针中间引入THF，即无嘌呤无嘧啶位点(AP位点)；所述探针在AP位点前至少要保留30bp的碱基，在AP位点之后至少有15bp的碱基；所述下游引物的5’末端的修饰方式为：标记生物素。
优选地，所述检测试剂盒还包括水解缓冲液、双蒸水、副溶血弧菌DNA模板以及醋酸镁。
优选地，所述侧流层析试纸条通过与水解缓冲液和样品的混合物进行接触显色。
优选地，采用所述试剂盒检测在35℃-45℃，20min内可以得到检测结果
优选地，采用所述试剂盒进行检测的检测下限为1CFU/反应。
本发明还涉及一种上述特异性引物对和试剂盒在区分副溶血弧菌与其他弧菌以及其他细菌的样本中的应用；
所述其他弧菌包括：创伤弧菌，溶藻弧菌，哈维是弧菌，霍乱弧菌，地中海弧菌，席罗弧菌，沙门氏菌，丹增李斯特菌，蜡样芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌。
优选地，所述样本包含水产养殖对象，水产品加工食品，养殖环境等。
本发明的有益效果：
1、在海产品养殖过程中，对病原菌的早期检测在疾病的预防和治疗中极其重要，本发明的检测方法能够对副溶血弧菌进行现场快速检测，并且对操作人员要求低，很适合养殖户自身使用，而且能够快速得到检测结果。
2、保证海产品食品安全及其重要，副溶血弧菌主要分布在沿海及海产品中，误食携带副溶血弧菌的海产品严重威胁人们的身体健康，本发可以快速的对海产品市场中的海产品进行现场检测，避免被副溶血弧菌感染的海产品流入到餐桌，威胁让人们的身体健康。
3、快速、便携、现场检测，本发明创造的一种基于RPA-LFS快速检测副溶血弧菌的方法及应用在不依赖实验室设备，能够很好的应用到现场检测中；本发明创造的检测方法在20min内可以得到检测结果。
4、可视化检测，本发明创造的检测副溶血弧菌的方法是将RPA 技术和LFS技术有机结合，是检测的扩增产物不需要琼脂糖凝胶电泳检测额，可以短时间内检测出可视化结果。
5、事实监控：本发明创造的检测副溶血弧菌的方法具有快速便携等特点，且不依赖与实验室设备和高素质技术人员，养殖户可以进行现场快速检测，在养殖过程中可以实时监控副溶血弧菌的情况。
附图说明
图1为试纸条原理图；
图2为本发明实施例中特异性检测的结果示意图；
图3为本发明实施例中体系优化检测的结果示意图；
图4为本发明实施例中最低检出限定测定的结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明涉及一种基于RPA-LFS快速检测副溶血弧菌的特异性引物对，包括特异性引物对以及探针，特异性引物及探针的序列为：
上游引物：5’-TCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCG
下游引物：5’-Biotin-CTGTAACTTGTTTAGCGTTGTGACTGCAGTG
探针：
5’-FITC-GAAGAGCATGGTTTCGTGAACGCGAGCGAT[THF]CTTGTTTGGAG ATCA-SpC3
本发明还涉及一种基于RPA-LFS快速检测副溶血弧菌的试剂盒，试剂盒包括：特异性引物对及探针、侧流层析试纸条；探针的长度至少为46bp；探针5’末端的修饰方式为：用FITC进行标记，3’末端的修饰方式为：引入3C-spacer进行末端封闭，在探针中间引入THF，即无嘌呤无嘧啶位点(AP位点)；探针在AP位点前至少要保留30bp 的碱基，在AP位点之后至少有15bp的碱基；下游引物的5’末端的修饰方式为：标记生物素。
检测试剂盒还包括水解缓冲液、双蒸水、副溶血弧菌DNA模板以及醋酸镁。
侧流层析试纸条通过与水解缓冲液和样品的混合物进行接触显色。
采用试剂盒检测在35℃-45℃，20min内可以得到检测结果
采用试剂盒进行检测的检测下限为1CFU/反应。
本发明还涉及一种上述特异性引物对和试剂盒在区分副溶血弧菌与其他弧菌以及其他细菌的样本中的应用；
其他弧菌包括：创伤弧菌，溶藻弧菌，哈维是弧菌，霍乱弧菌，地中海弧菌，席罗弧菌，沙门氏菌，丹增李斯特菌，蜡样芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌。
样本包含水产养殖对象，水产品加工食品，养殖环境等。
试纸条原理：DNA扩增产物的可视化检测基于：1)RPA扩增产物的化学修饰；2)用AuNPs功能化的抗体。在本发明中，扩增产物分别在两端被FITC和生物素修饰，该抗体是来自小鼠的抗FITC，并被 AuNPs功能化。将扩增产物加载到样品垫上后，它们会迁移穿过胶体金垫并与抗FITC AuNPs结合。当这些扩增产物到达用链霉亲和素包被的检测线时，由于生物素修饰而被捕获，并导致AuNP聚集，在检测线上显示红色。未与扩增产物结合的抗FITC抗体分子继续迁移至涂有抗小鼠抗体的对照线，并在此处聚集以验证试纸条的可用性。通过LFS测试，可以直观地读取RPA扩增产物，其中正信号为测试线的红色带，而验证信号为控制线的第二红色带。如图1所示。
引物设计：根据副溶血弧菌不耐热溶血毒素(TLH)，耐热直接溶血毒素(TDH)，相对耐热直接溶血毒素(TRH)的基因为靶序列，在NCBI primer blast中设计五对引物，并将设计好的引物送至合成公司合成。引物设计原则为：1、引物长度为30-36bp；2、引物GC含量为20％-80％；3、引物Tm值为50-100。
引物筛选：以副溶血弧菌为模板，用RPA试剂盒进行扩增，检测 5对引物的扩增效果。首先取10装有重组酶和聚合酶等组分的干粉管，想里面加入41.5μL的A buffer，加入2.4μL的上游引物和下游引物(10μM)，充分涡旋混匀并离心后，为保证所有反应体系的同步进行，将1μL的模板DNA(即副溶血弧菌基因组)和2.5μL的280mM 醋酸镁加到盖子上，NTC用1μL H20补足体积，瞬时离心时模板和镁离子同时加入反应体系中，最后充分涡旋混匀并瞬时离心后，将样品放在恒温金属浴中37℃反应30min。并将扩增产物用PCR清洁试剂盒进行纯化，清洁后的样品可用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
扩增效果最好的引物对序列为：
上游引物：5’-TCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCG
下游引物：5’-Biotin-CTGTAACTTGTTTAGCGTTGTGACTGCAGTG
引物种间特异性检测：分别以副溶血弧菌，创伤弧菌，溶藻弧菌，霍乱弧菌，沙门氏菌，单增李斯特菌，金黄色葡萄求菌的基因组为模板，检测筛选出扩增效果最佳引物的种间特异性。取8管装有重组酶和聚合酶等组分的干粉管，向里面加入41.5μL的A buffer，加入2.4μL的上游引物和下游引物(10μM)，充分涡旋混匀并离心后，为保证所有反应体系的同步进行，将2.5μL的280mM醋酸镁加到盖子上，按顺序依次将不同基因组的模板加入相应的管子中，NTC用1μL H20补足体积，最后充分涡旋混匀并瞬时离心后，将样品放在恒温金属浴中37℃反应30min。并将扩增产物用PCR清洁试剂盒进行纯化，清洁后的样品可用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
探针设计：根据筛选出的最佳引物设计探针，在primer5.0软件中设计探针，探针位置在上游引物和下游引物之间。探针设计原则为： 1、引物探针筛选探针长度至少46bp；2、探针5’末端用FITC进行标记，3’末端引入3C-spacer进行末端封闭，在探针中间引入THF，即无嘌呤无嘧啶位点(AP位点)；3、AP位点前至少要保留30bp的碱基，AP位点之后至少有15bp的碱基。下游引物的5’末端标记生物素。如此一来，探针和下游引物扩增产物的一端带有FITC，另一端带有生物素，因此可以用LFS检测。
探针筛选：采用Twixt Amp nfo试剂盒筛选引物探针。扩增反应总体积为50μL，以副溶血弧菌基因组为模板，在装有各种酶组分的干粉管中加入29.5μL的再水化buffer，2.1μL的上游和下游引物(10μLM)，12.2μLddH2O，为保证所有反应体系的同步进行，将1 μL模板DNA(副溶血弧菌基因组DNA)和2.5μL的280mM醋酸镁加到管盖上，瞬时离心并充分涡旋混匀后再瞬时离心，最后将反应体系放入37℃反应20min。反应结束后取2mL的EP管并编号向EP管中加入95μL的稀释buffer，再去5μL的扩增产物加入EP管中，充分混匀、离心后将试纸条按正确的方向插入EP管，2min后可以判定结果。
筛选出的最佳探针序列为：
5’-FITC-GAAGAGCATGGTTTCGTGAACGCGAGCGAT[THF]CTTGTTTGGAG ATCA-SpC3
RPA-LFS种间特异性检测：采用Twixt Amp nfo试剂盒检测筛选出来的探针、引物。扩增反应总体积为50μL，分别以以副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌，霍乱弧菌，沙门氏菌，单增李斯特菌，金黄色葡萄球菌基因组为模板，在装有各种酶组分的干粉管中加入29.5μL的再水化buffer，2.1μL的上游和下游引物(10μLM)，2.2μLddH2O，为保证所有反应体系的同步进行，将1μL模板DNA(副溶血弧菌基因组DNA)和2.5μL的280mM醋酸镁加到管盖上，瞬时离心并充分涡旋混匀后再瞬时离心，最后将反应体系放入37℃反应20min。反应结束后取2mL的EP管并编号向EP管中加入95μL的稀释buffer，再去5μL的扩增产物加入EP管中，充分混匀、离心后将试纸条按正确的方向插入EP管，2min后可以判定结果。结果如图2所示。
RPA-LFS反应温度优化：以副溶血弧菌基因组为模板，选用筛选出来的一组引物探针进行反应温度优化，反应温度梯度设置为 15℃,20℃,25℃,30℃,35℃,37℃,40℃,45℃,50℃。取10个装有重组酶、聚合酶等组分的干粉管，向管内加入29.5μL的再水化buffer，2.1μL的上游和下游引物(10μLM)，12.2μLddH2O，为保证所有反应体系的同步进行，将1μL模板DNA(副溶血弧菌基因组DNA)和 2.5μL的280mM醋酸镁加到管盖上，NTC加入1μLddH2O补足体积，瞬时离心并充分涡旋混匀后再瞬时离心，最后将反应体系分别方人员对应的温度中反应20min。反应结束后取2mL的EP管并编号向EP管中加入95μL的稀释buffer，再去5μL的扩增产物加入EP管中，充分混匀、离心后将试纸条按正确的方向插入EP管，2min后可以判定结果。结果如图3所示。
RPA-LFS反应时间优化：以副溶血弧菌基因组为模板，选用筛选出来的一组引物探针进行反应时间优化。取9个装有重组酶、聚合酶等组分的干粉管，向管内加入29.5μL的再水化buffer，2.1μL的上游和下游引物(10μLM)，12.2μLddH2O，为保证所有反应体系的同步进行，将1μL模板DNA(副溶血弧菌基因组DNA)和2.5μL的 280mM醋酸镁加到管盖上，NTC加入1μLddH2O补足体积，瞬时离心并充分涡旋混匀后再瞬时离心，最后将反应体系分再37℃分别反应 5min，10min，15min，20min，25mmin，30min，35min，40min后进行LFS检测。反应结束后取2mL的EP管并编号向EP管中加入95μL 的稀释buffer，再去5μL的扩增产物加入EP管中，充分混匀、离心后将试纸条按正确的方向插入EP管，2min后可以判定结果。结果如图3所示。
RPA-LFS检出限测定：分别以107，106，105，104，103，102， 101CFU的副溶血弧菌基因组作为模板，进行RPA-LFS检出限测定。取8个装有重组酶、聚合酶等组分的干粉管，向管内加入29.5μL的再水化buffer，2.1μL的上游和下游引物(10μLM)，12.2μLddH2O，为保证所有反应体系的同步进行，将1μL模板DNA(副溶血弧菌基因组DNA)和2.5μL的280mM醋酸镁加到管盖上，瞬时离心并充分涡旋混匀后再瞬时离心，NTC加入1μLddH2O补足体积，最后将反应体系分在37℃分别反应30min后进行LFS检测。反应结束后取2mL 的EP管并编号向EP管中加入95μL的稀释buffer，再去5μL的扩增产物加入EP管中，充分混匀、离心后将试纸条按正确的方向插入 EP管，2min后可以判定结果。结构如图4所示。
qPCR检出限测定：分别以107，106，105，104，103，102，101CFU 的副溶血弧菌基因组作为模板，进行qPCR检出限测定。反应体系为： 10μL MonAmpTM SYBR Green qPCR Mix，0.4μL上游引物(10μM)， 0.4μL下游引物(10μM)，1μL基因组模板，8.2μLddH2O补足体积至20μL。将加样完成的体系涡旋混匀并瞬时离心后用罗氏定量 PCR仪检测，检测程序为：95℃30s,95℃10s,60℃10s,72℃30s。 (每个梯度做三个平行)。
RPA-LFS初步应用：用建立完整的RPA-LFS检测方法检测从环境中分离出来的菌株是否是副溶血弧菌。将分离出来的50个菌株过夜培养后取1mL菌液离心后加入100μL ddH2O重悬，沸水煮10min使基因组DNA充分释放出来作为模板进行RPA-LFS检测。取51个装有重组酶、聚合酶等组分的干粉管，向管内加入29.5μL的再水化 buffer，2.1μL的上游和下游引物(10μLM)，12.2μLddH2O，为保证所有反应体系的同步进行，将1μL模板DNA(副溶血弧菌基因组 DNA)和2.5μL的280mM醋酸镁加到管盖上，瞬时离心并充分涡旋混匀后再瞬时离心，NTC加入1μLddH2O补足体积，最后将反应体系分在37℃分别反应30min后进行LFS检测。反应结束后取2mL的EP管并编号向EP管中加入95μL的稀释buffer，再去5μL的扩增产物加入EP管中，充分混匀、离心后将试纸条按正确的方向插入EP管， 2min后可以判定结果。
qPCR样本检测：以从环境中分离出来的菌株基因组为模板用 qPCR进行检测。反应体系为：10μL MonAmpTM SYBR Green qPCR Mix， 0.4μL上游引物(10μM)，0.4μL下游引物(10μM)，1μL基因组模板，8.2μLddH2O补足体积至20μL。将加样完成的体系涡旋混匀并瞬时离心后用罗氏定量PCR仪检测，检测程序为：95℃30s,95℃ 10s,60℃10s,72℃30s。(每个梯度做三个平行)。
利用该技术进行应用检测，对48个对虾样本进行检测。
结果如表所示：
Figure BDA0002326530910000141
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于RPA-LFS快速检测副溶血弧菌的特异性引物对，包括特异性引物对以及探针，其特征在于，所述特异性引物及探针的序列为：
上游引物：5’-TCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCG
下游引物：5’-Biotin-CTGTAACTTGTTTAGCGTTGTGACTGCAGTG
探针：
5’-FITC-GAAGAGCATGGTTTCGTGAACGCGAGCGAT[THF]CTTGTTTGGAG ATCA-SpC3
2.一种基于RPA-LFS快速检测副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的特异性引物对及探针、侧流层析试纸条；
所述探针的长度至少为46bp；
所述探针5’末端的修饰方式为：用FITC进行标记，3’末端的修饰方式为：引入3C-spacer进行末端封闭，在探针中间引入THF，即无嘌呤无嘧啶位点(AP位点)；
所述探针在AP位点前至少要保留30bp的碱基，在AP位点之后至少有15bp的碱基；
所述下游引物的5’末端的修饰方式为：标记生物素。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括水解缓冲液、双蒸水、副溶血弧菌DNA模板以及醋酸镁。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述侧流层析试纸条通过与水解缓冲液和样品的混合物进行接触显色。
5.根据权利要求2-4任一项所述的一种基于RPA-LFS快速检测副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于，采用所述试剂盒检测在35℃-45℃，20min内可以得到检测结果。
6.根据权利要求2-4任一项所述的一种基于RPA-LFS快速检测副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于，采用所述试剂盒进行检测的检测下限为1CFU/反应。
7.权利要求1所述的引物对，以及权利要求2～6任一项所述的试剂盒在区分副溶血弧菌与其他弧菌以及其他细菌的样本中的应用，其特征在于，所述其他弧菌包括：创伤弧菌，溶藻弧菌，哈维是弧菌，霍乱弧菌，地中海弧菌，席罗弧菌，沙门氏菌，丹增李斯特菌，蜡样芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌。
8.根据权利要求7所述的应用检测，其特征在于，所述样本包含水产养殖对象，水产品加工食品，养殖环境等。
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