CN110951899A

CN110951899A - 用于检测副溶血弧菌的pcr检测体系、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN110951899A
Application number: CN202010006870.5A
Authority: CN
Inventors: 古晓奎; 钟青萍; 雷舒文
Original assignee: South China Agricultural University; Guangdong Shunde Industrial Design Institute
Current assignee: South China Agricultural University; Guangdong Shunde Industrial Design Institute
Priority date: 2020-01-03
Filing date: 2020-01-03
Publication date: 2020-04-03
Anticipated expiration: 2040-01-03
Also published as: CN110951899B

Abstract

本发明涉及一种用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系、试剂盒及检测方法，PCR检测体系包括用于检测tlh基因的第一引物对和第一检测探针、用于检测tdh基因的第二引物对和第二检测探针以及用于检测ureR基因的第三引物对和第三检测探针。本发明的用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系基于tlh、tdh、ureR三个基因同时检测，可以精准地区分副溶血弧菌的具体类型。该PCR检测体系的兼容性好，特异性和灵敏度很高，检测限达到了15copies/ml。同时，该PCR检测体系可直接以细胞为模板进行检测，检测效果与以DNA为模板检测的效果相当，因此能够实现从样品到检测这样的一步法，不需要对样品进行DNA提取操作。

Description

用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及生物化学领域，特别是涉及一种用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系、试剂盒及检测方法。

背景技术

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，Vp)是革兰氏阴性嗜盐性细菌，属弧菌科弧菌属，广泛存在于近海岸的海水、螃蟹、虾、鲭鱼、沙丁鱼、鳕鱼、扇贝、牡蛎等海产品和盐渍食品中，是引起海产品弧菌病的主要病原菌之一，也是一种重要的食源性致病菌。使用传统培养方法检测临床和食品样品中的毒力菌株可以符合实际计数要求，但因毒性菌株没有明显的生长表型，可能不能与非毒力菌株区分开来。

海产品中副溶血性弧菌的检出率很高，有时可达100％。但自然环境中分离的副溶血性弧菌有95％是非致病性的，仅有5％的是致病性的。海产品经冷冻或冷藏、烹调等加工处理后，副溶血性弧菌可能处于活的非可培养的状态，但致病性副溶血性弧菌携带的耐热溶血毒素(thermostable direct haemolysin,TDH)和耐热直接溶血毒素相关溶血毒素(TDH-related haemolysin,TRH)依然存在。统计显示，人们食用海产品引发的腹泻率远低于海产品的携带率。为此，筛检出致病性副溶血性弧菌，比只检出副溶血性弧菌更有价值。

对于副溶血弧菌的检测，我国目前采用的国标法GB 4789.7-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验(副溶血性弧菌检验)》使用常规检测方法，仍然是选择性培养、生化鉴定、神奈川现象和血清学反应等，但是这些检测方法不但操作繁琐、耗时长，而且检出率低。随着生物学技术的快速发展，已有多种生物学技术用于副溶血弧菌的检测，例如PCR技术，但针对单个基因进行副溶血弧菌PCR检测很可能出现假阳性(非副溶血弧菌计入)或假阴性(致病性副溶血弧菌漏检)等问题，特异性不高，无法区分副溶血弧菌的具体种类。

发明内容

基于此，有必要提供一种灵敏度高、特异性好且可区分副溶血弧菌的具体种类的PCR检测体系。

一种用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系，包括用于检测tlh基因的第一引物对和第一检测探针、用于检测tdh基因的第二引物对和第二检测探针以及用于检测ureR基因的第三引物对和第三检测探针，所述第一检测探针、所述第二检测探针和所述第三检测探针的5’端均连接有荧光报告基团，3’端均连接有荧光淬灭基团，且最多有两个探针的荧光报告基团相同；所述第一引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述第一检测探针的序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二引物对的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述第二检测探针的序列如SEQ ID NO.6所示，所述第三引物对的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，所述第三检测探针的序列如SEQ ID NO.9所示。

在其中一个实施例中，还包括用于检测orf8基因的第四引物对和第四检测探针，所述第四引物对的序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，所述第四检测探针的序列如SEQ ID NO.12所示；所述第四检测探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团，且所述第一检测探针、所述第二检测探针、所述第三检测探针和所述第四检测探针中最多有两个探针的荧光报告基团相同。

在其中一个实施例中，所述荧光报告基团选自Alexa350、CF350、FAM、Alexa488、CF488、HEX、VIC、Alexa532、CF532、ROX、Cal610、Texas Red、Alexa594、CF594、CY5、Quasar670、Alexa647、CF647、Quasar705、Alexa680或CF680，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2或MGB。

在其中一个实施例中，所述第一检测探针连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为FAM和BHQ1，所述第二检测探针连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为VIC和BHQ2，所述第三检测探针连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为FAM和BHQ1，所述第四检测探针连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为VIC和BHQ2。

本发明还提供了一种用于检测副溶血弧菌的试剂盒，包括所述用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系。

在其中一个实施例中，还包括PCR反应缓冲液、Mg²⁺试剂、dNTPs以及Taq DNA聚合酶中的至少一种。

本发明还提供了一种用于检测副溶血弧菌的检测方法，使用所述用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系，所述检测方法包括以下步骤：以待测样品为模板材料，以各引物对作为扩增引物，并加入各检测探针进行PCR反应，分析得到检测结果。

在其中一个实施例中，所述PCR检测体系包括所述第一引物对、所述第一检测探针、所述第二引物对、所述第二检测探针、所述第三引物对、所述第三检测探针、序列如SEQID NO.10和SEQ ID NO.11所示的第四引物对以及序列如SEQ ID NO.12所示的第四检测探针；在所述PCR反应的反应体系中，各引物对的使用浓度为200nM～1500nM，所述第一检测探针的使用浓度为0.1μM～0.3μM，所述第二检测探针的使用浓度为0.2μM～1μM，所述第三检测探针的使用浓度为0.2μM～0.6μM，所述第四检测探针的使用浓度为0.4μM～2μM。

在其中一个实施例中，所述PCR反应为微滴式数字荧光PCR反应。

在其中一个实施例中，所述PCR反应的热裂解条件为：92℃～98℃，25min～35min。

本发明的用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系基于tlh、tdh、ureR三个基因同时检测，检测结果可以得到清晰的8个分区，从而精准地区分副溶血弧菌的具体类型。通过多种类型的副溶血弧菌和非副溶血弧菌的验证，证明了上述PCR检测体系的可行性和特异性，兼容性好且灵敏度很高，检测限达到了15copies/ml。同时，本发明的用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系可直接以细胞为模板进行检测，检测效果与以DNA为模板检测的效果相当，因此能够实现从样品到检测这样的一步法，不需要对样品进行DNA提取操作，避免了DNA提取过程中的样品损失，极大地简化了操作，而且能够明确菌细胞中各基因间的联系。

附图说明

图1为实施例1的ddPCR结果图；

图2为实施例2的ddPCR结果图；

图3为实施例3的ddPCR结果图；

图4为实施例4的不同第二检测探针浓度的一维散点图；

图5为实施例5的以gDNA为模板和以完整单细胞为模板的qPCR结果图；

图6为实施例7中以完整细胞为模板并采用不同的热裂解时间的ddPCR结果图，其中A为热裂解时间15min，B为热裂解时间25min；

图7为实施例7中以gDNA为模板并采用不同的热裂解时间的ddPCR结果图，其中A为热裂解时间15min，B为热裂解时间25min。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明一实施例的用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系，包括用于检测tlh基因的第一引物对和第一检测探针、用于检测tdh基因的第二引物对和第二检测探针以及用于检测ureR基因的第三引物对和第三检测探针，第一检测探针、第二检测探针和第三检测探针的5’端均连接有荧光报告基团，3’端均连接有荧光淬灭基团，且最多有两个探针的荧光报告基团相同。第一引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，第一检测探针的序列如SEQ ID NO.3所示，第二引物对的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，第二检测探针的序列如SEQ ID NO.6所示，第三引物对的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，第三检测探针的序列如SEQ ID NO.9所示，具体见下表。

本发明的用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系，包括自主设计的分别用于检测tlh基因、tdh基因以及ureR基因的第一引物对和第一检测探针、第二引物对和第二检测探针以及第三引物对和第三检测探针，基于tlh、tdh、ureR三个基因同时检测，检测结果可以得到清晰的8个分区，从而精准地区分副溶血弧菌的具体类型。通过多种类型的副溶血弧菌和非副溶血弧菌的验证，证明了上述PCR检测体系的可行性和特异性，兼容性好且灵敏度很高，检测限达到了15copies/ml。同时，本发明的用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系可直接以细胞为模板进行检测，检测效果与以DNA为模板检测的效果相当，因此能够实现从样品到检测这样的一步法，不需要对样品进行DNA提取操作，避免了DNA提取过程中的样品损失，极大地简化了操作，而且能够明确菌细胞中各基因间的联系。

在一个具体示例中，上述PCR检测体系还包括用于检测orf8基因的第四引物对和第四检测探针，第四引物对的序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，第四检测探针的序列如SEQ ID NO.12所示，具体见下表。第四检测探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团，且第一检测探针、第二检测探针、第三检测探针和第四检测探针中最多有两个探针的荧光报告基团相同。

副溶血弧菌的大流行株通常带有ORF8片段，此片段为大流行株的特异性识别片段，编码的蛋白具有强致病性，可作为一个特殊标记被用来作为检测副溶血弧菌爆发的标志。如此，基于tlh、tdh、ureR和orf8四个基因同时检测能够更有效地区分副溶血弧菌的具体类型，各扩增引物对之间兼容性较好，特异性和灵敏度好，检测限可达到15copies/ml，也适用于直接以细胞为模板进行检测，检测结果可以得到清晰的16个分区。

在一个具体示例中，上述荧光报告基团选自Alexa350、CF350、FAM、Alexa488、CF488、HEX、VIC、Alexa532、CF532、ROX、Cal610、Texas Red、Alexa594、CF594、CY5、Quasar670、Alexa647、CF647、Quasar705、Alexa680或CF680，上述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2或MGB。可以理解，荧光基团的选择不限于此，可根据需要调整。

在一个具体示例中，第一检测探针连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为FAM和BHQ1，第二检测探针连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为VIC和BHQ2，第三检测探针连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为FAM和BHQ1，第四检测探针连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为VIC和BHQ2。

在一个具体示例中，该PCR检测体系包括含有上述引物对的多重PCR引物试剂和含有上述检测探针的探针试剂。

本发明一实施例的用于检测副溶血弧菌的试剂盒，包括上述用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系。

在一个具体示例中，该试剂盒还包括PCR反应缓冲液、Mg²⁺试剂、dNTPs以及Taq DNA聚合酶中的至少一种。可以理解，PCR反应缓冲液、Mg²⁺试剂、dNTPs以及Taq DNA聚合酶等也可以直接以PCR预混液(PCR Mix)的形式提供，从而简化实验操作。

本发明一实施例的用于检测副溶血弧菌的检测方法，使用上述用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系，该检测方法包括以下步骤：以待测样品为模板材料，以各引物对作为扩增引物，并加入各检测探针进行PCR反应，分析得到检测结果。可以理解，该检测方法是用于非疾病的诊断和治疗目的的对非来自于人体的样本进行检测，例如主要是对海产品等食物进行检测，获得的直接结果用于判断食物是否符合食品安全的相关要求。

在一个具体示例中，在上述PCR反应的反应体系中，各引物对的使用浓度为200nM～1500nM，第一检测探针的使用浓度为0.1μM～0.3μM，第二检测探针的使用浓度为0.2μM～1μM，第三检测探针的使用浓度为0.2μM～0.6μM，第四检测探针的使用浓度为0.4μM～2μM。通过对各引物对和检测探针的浓度配比进行调整，有助于进一步优化检测效果，检测结果图谱的分区更清晰。

在一个具体示例中，上述PCR反应为微滴式数字荧光PCR反应。微滴式数字PCR(ddPCR)是核酸绝对定量的新方法，它首先通过分液，将含有目的基因模板的PCR反应体系分配到各自独立的反应器中，然后进行计数。因此，它具有其他方法尤其是目前应用最广的qPCR不能比拟的优点，灵敏性更高，耐受性更高，效率更高，具有绝对的计数定量能力。可以理解，上述PCR反应并不仅限于ddPCR，可以根据需要选择其他PCR技术。

在一个具体示例中，上述PCR反应的热裂解条件为：92℃～98℃，25min～35min。可选地，上述PCR反应的反应程序为：92℃～98℃，25min～35min；92℃～98℃条件下8s～12s，50℃～60℃条件下50s～70s，50～70个循环；96℃～99℃条件下5min～15min；随后降温到4～16℃结束程序。如此，通过优化热裂解时间和循环数，使得细胞充分裂解，DNA释放出来得到更充分的扩增，从而进一步提高检测效果。

在一个具体示例中，检测方法还包括样品破碎步骤：将待测样品放入无菌乳钵，自225mL 3％氯化钠碱性蛋白胨水中取少量稀释液加入无菌乳钵，样品磨碎后放入无菌锥形瓶，再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品1～2次，洗液放入锥形瓶，最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶，充分振荡，制备1:10的样品匀液。取样品匀液2ml至5ml于离心管中1000r/min，1min，4℃离心；取上清液，纱布过滤，6mL ddH₂O洗涤；取1mL滤液12000r/min，10min，4℃离心，弃上清，加入250μl的ddH₂O混匀作为ddPCR的模板进行检测。可以理解，当样品为菌液等不需要进行破碎的情况时，样品破碎步骤可省略，且样品破碎步骤不限于此，只要是能够将样品均匀破碎的方法或仪器(例如均质机)均可使用。

以下为具体实施例。

实施例1

本实施例采用如下表所示的引物对和检测探针。

1、首先配制反应体系

引物：tlh 900nM

tdh 900nM

ureR 900nM

探针：tlh 0.125μM

tdh 0.625μM

ureR 0.25μM

PCR Mix: 10μL

加入待测样品菌液2μL，补充ddH₂O至20μL。

2、生成微滴

油相为40μL的生成油，水相为前述配制的20μL反应体系，混合后在微滴生成仪上生成6～7万个微滴。将生成好的微滴转移至96孔板内，利用热封仪封膜PCR扩增。

3、PCR扩增

将96孔板放入PCR仪器中进行PCR扩增。

4、结果检测

结束PCR扩增后，将96孔板放入ddPCR检测仪中检测，结果如图1所示。

实施例2

本实施例2与实施例1的方法基本相同，区别仅在于将待测样品菌液通过DNA提取试剂盒提取得到DNA样品，以DNA样品为模板进行ddPCR反应，结果如图2所示。

如图1和图2所示，以完整单细胞为模板进行检测的检测效果与以DNA样品为模板进行检测的检测效果相当，得到清晰的8个分区，可以实现从样品到检测的一步法，不需要进行DNA提取，操作简单。另外，图1中可以看到有一个三基因重合的分区，即同一细胞中同时含有三个基因的聚类，而图2中没有该分区。这是由于副溶血弧菌有两段染色体，三个基因分别位于两条染色体上，如果不是完整单细胞检测，无法探测到三个基因在同一个细胞内的情况，即连锁效应。提取DNA的过程使得同一细胞的两条染色体离散，在ddPCR形成液滴时就可能不会在一个液滴里同时有两条染色体，扩增就大概率不会出现三个基因同时出现的现象。而以完整细胞为模板时，ddPCR形成液滴时将细胞包裹在一个液滴里裂解，释放的染色体组是有两个染色体同时存在的。

实施例3

本实施例与实施例1的方法基本相同，区别仅在于采用如下表所示的引物对和检测探针。检测结果如图3所示，可以得到清晰的16个分区，可见以完整细胞为模板的四重PCR检测的效果仍然比较好。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于调整反应体系中第二检测探针的浓度，分别采用0.375μM、0.5μM、0.625μM和0.75μM。

ddPCR的液滴，会出现不包含目标模板分子和包含目标模板分子两种情况，由于每个液滴中所包含的探针浓度是一致的，扩增后形成的阴性液滴(Neg)和阳性液滴(Pos)在一维散点图上呈现分层，中间区域即为不完全扩增的液滴。当探针浓度增加时，阴性和阳性液滴之间的荧光幅值差增大，分层就越明显，但基于成本考虑，探针浓度不能增加很多。另外，需要考虑中间不完全扩增液滴的数量，即通常所说的“rain”，它会影响数字PCR的聚类和计数。不同第二检测探针浓度的一维散点图如图4所示，说明第二检测探针的最佳浓度范围为0.5μM～0.625μM。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于分别以完整单细胞为模板和以gDNA为模板进行qPCR检测，结果如图5所示。可见，以DNA样品为模板和以完整单细胞(cell)为模板的qPCR检测效果相当。

实施例6

本实施例与实施例3的区别在于分别以不同的菌种作为样品进行检测，结果如下表所示。可见，本发明的用于副溶血弧菌的PCR检测体系的特异性较好，能够准确的检出副溶血弧菌及其具体类型。

实施例7

本实施例分别以gDNA和完整细胞两种不同的模板，且分别采用不同的热裂解时间进行检测，结果如图6和图7所示。可见，随着热裂解时间的增加分别以gDNA和完整细胞为模板的检测组，细胞为模板的检测效果变好，优化更明显，各分区聚类更加清晰完整，并且可以明显区分出多达16个聚类；而以gDNA为模板的检测组效果受热裂解时间影响小，且检测效果明显不如以完整细胞为模板的检测效果，不能呈现完整的16个分区聚类，不能辨识单个微滴内是否同时存在3～4个目标基因。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广东顺德工业设计研究院（广东顺德创新设计研究院）

华南农业大学

<120> 用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系、试剂盒及检测方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaacgcagac attacg 16

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

accactttgt tgatttga 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cattgctgcg tcgttgctcc 20

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtcaggaag ttcgt 15

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acggcatagg tgagta 16

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgccacgac agttacga 18

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcactctaac acccaa 16

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agctgataca tcggtt 16

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctaggcgagc aaaagcactc t 21

<210> 10

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcaccctaaa caaaa 15

<210> 11

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agaggtacaa gatca 15

<210> 12

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccccacgaca gcc 13

Claims

1.一种用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系，其特征在于，包括用于检测tlh基因的第一引物对和第一检测探针、用于检测tdh基因的第二引物对和第二检测探针以及用于检测ureR基因的第三引物对和第三检测探针，所述第一检测探针、所述第二检测探针和所述第三检测探针的5’端均连接有荧光报告基团，3’端均连接有荧光淬灭基团，且最多有两个探针的荧光报告基团相同；所述第一引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述第一检测探针的序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二引物对的序列如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示，所述第二检测探针的序列如SEQ ID NO.6所示，所述第三引物对的序列如SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示，所述第三检测探针的序列如SEQ ID NO.9所示。

2.根据权利要求1所述的PCR检测体系，其特征在于，还包括用于检测orf8基因的第四引物对和第四检测探针，所述第四引物对的序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，所述第四检测探针的序列如SEQ ID NO.12所示；所述第四检测探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团，且所述第一检测探针、所述第二检测探针、所述第三检测探针和所述第四检测探针中最多有两个探针的荧光报告基团相同。

3.根据权利要求2所述的PCR检测体系，其特征在于，所述荧光报告基团选自Alexa350、CF350、FAM、Alexa488、CF488、HEX、VIC、Alexa532、CF532、ROX、Cal610、Texas Red、Alexa594、CF594、CY5、Quasar670、Alexa647、CF647、Quasar705、Alexa680或CF680，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2或MGB。

4.根据权利要求3所述的PCR检测体系，其特征在于，所述第一检测探针连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为FAM和BHQ1，所述第二检测探针连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为VIC和BHQ2，所述第三检测探针连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为FAM和BHQ1，所述第四检测探针连接的荧光报告基团和荧光淬灭基团分别为VIC和BHQ2。

5.一种用于检测副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系。

6.根据权利要求5所述的用于检测副溶血弧菌的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应缓冲液、Mg²⁺试剂、dNTPs以及Taq DNA聚合酶中的至少一种。

7.一种用于检测副溶血弧菌的检测方法，其特征在于，使用权利要求1～4任一项所述的用于检测副溶血弧菌的PCR检测体系，所述检测方法包括以下步骤：以待测样品为模板材料，以各引物对作为扩增引物，并加入各检测探针进行PCR反应，分析得到检测结果。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述PCR检测体系包括所述第一引物对、所述第一检测探针、所述第二引物对、所述第二检测探针、所述第三引物对、所述第三检测探针、序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的第四引物对以及序列如SEQ ID NO.12所示的第四检测探针；在所述PCR反应的反应体系中，各引物对的使用浓度为200nM～1500nM，所述第一检测探针的使用浓度为0.1μM～0.3μM，所述第二检测探针的使用浓度为0.2μM～1μM，所述第三检测探针的使用浓度为0.2μM～0.6μM，所述第四检测探针的浓度为0.4μM～2μM。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述PCR反应为微滴式数字荧光PCR反应。

10.根据权利要求7～9任一项所述的检测方法，其特征在于，所述PCR反应的热裂解条件为：92℃～98℃，25min～35min。