CN105648111B

CN105648111B - 诺如病毒的逆转录环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒

Info

Publication number: CN105648111B
Application number: CN201610079851.9A
Authority: CN
Inventors: 罗鸿斌
Original assignee: Dongguan University of Technology
Current assignee: SHENZHEN KANGMEI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2016-02-04
Filing date: 2016-02-04
Publication date: 2019-04-05
Anticipated expiration: 2036-02-04
Also published as: CN105648111A

Abstract

本发明公开了一种诺如病毒的逆转录环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒。检测引物组包括上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP、下游内引物BI P，分别如SEQ ID NO.1、2、3和4所示。本发明建立的检测NV的RT‑LAMP技术简便、特异、灵敏，适用于野外和简易实验室检测，提供了新的病毒检测方法。在样品检测中，RT‑LAMP技术的灵敏度达97.7％，高于RT‑PCR的90.7％，更适用于野外样品和简陋实验室的快捷检测，可广泛应用于医院、食品行业、出入境检验检疫及质量监督等部门及领域。

Description

诺如病毒的逆转录环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种诺如病毒的逆转录环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒。

背景技术：

诺如病毒感染性腹泻具有发病急、传播速度快、涉及范围广等特点，是引起非细菌性腹泻暴发的主要病因。诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。不同地区、不同时间流行的诺如病毒，其基因RNA多聚酶区序列相对保守。根据RNA多聚酶区核苷酸序列的相似性，诺如病毒被分为5个基因群(genogroup)。同一基因群内的诺如病毒，其主要衣壳蛋白(major capsid protein)氨基酸序列的异质性约为30％，但不同基因群间的诺如病毒，其主要衣壳蛋白(major capsid protein)氨基酸序列的异质性超过50％。目前已知，感染人类的诺如病毒至少包括基因Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅳ群。诺如病毒对各种理化因素有较强的抗性，已知其耐热和耐冻，60℃孵育30min仍有感染性，冷冻数年后仍保持活性；对乙醚和酸稳定，20％乙醚4℃处理可存活18h，室温pH2.7环境下可存活3h。诺如病毒对处理污水的10ppm的氯浓度敏感，但对处理饮用水的3.75～6.25ppm的氯浓度耐受。此外，诺如病毒的感染剂量很低，10-100个病毒粒子即可使人致病，而且诺如病毒常呈暴发流行，因此，即使环境中存在的微量病毒，仍然对人得健康存在很大威胁。

诺如病毒遗传高度变异，在同一时期和同一社区内可能存在遗传特性不同的毒株流行。诺如病毒抗体没有显著的保护作用，尤其是没有长期免疫保护作用，极易造成反复感染。诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。美国每年在所有的非细菌性腹泻暴发中，60-90％是由诺如病毒引起。荷兰、英国、日本、澳大利亚等发达国家也都有类似结果。在发展中国家，诺如病毒感染性腹泻普遍存在，也常引起暴发流行。在我国5岁以下腹泻儿童中，诺如病毒检出率为15％左右，血清抗体水平调查表明我国人群中诺如病毒的感染亦十分普遍。

目前诺如病毒病原的检测方法有电镜技术、病毒分离培养技术、免疫学技术及分子生物学技术，但上述的前三种技术往往存在灵敏度较低、操作繁琐耗时、需要大型昂贵的仪器设备等缺点，在应用时往往有其局限性，尤其不能适用于大规模的病原筛查和检测等实际应用。分子生物学技术，其中尤其以RT-PCR检测技术由于其快速、灵敏、适合处理大通量的样品等特点，在病毒检测中显示出其优越性并越来越多的得以应用，但该方法从检测到结果的判读仍然需要多种专用仪器，操作较为繁琐，所需时间仍然在5小时以上，常有非特异性出现等缺陷。LAMP方法是2000年Notomi等开发的一种新型核酸扩增技术，针对待测靶基因的6个区域设计4-6条特异性引物，在BstDNA聚合酶的作用下，在65℃左右等温条件1h内可以进行特异高效快速的核酸扩增，达到10⁹拷贝，扩增结果可直接观察焦磷酸镁沉淀或者加入显色剂进行判断。近年来LAMP方法已广泛用于细菌、病毒等致病微生物的检测，并在此基础上发展了RT-LAMP检测方法，成功应用于多种RNA病毒的检测。

发明内容：

本发明的第一目的是提供一种应用逆转录环介导等温扩增检测诺如病毒(norovirus)的检测引物组，利用该检测引物组可以特异性的检测诺如病毒(norovirus)。

一种应用逆转录环介导等温扩增检测诺如病毒的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成：

上游外引物F3：5’-GATGGGTCCRCAGCCAAC-3’；(其序列如SEQ ID NO.1所示)

下游外引物B3：5’-TCARATCAGGGCCYAAGG-3’；(其序列如SEQ ID NO.2所示)

上游内引物FIP：5’-GCTACAGGYGCCGCRATAGCCCCAGAGGTCAACAATGAGG-3’；(其序列如SEQ ID NO.3所示)

下游内引物BIP：5’-TACAAGCCCCTGGTGGAGAGTCGCGCTCCAYAGTATYTCAC-3’；(其序列如SEQ ID NO.4所示)

所述的R为A/G，Y为C/T。

本发明的第二个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的诺如病毒的检测方法，其特征在于，对样品进行病毒RNA提取，得到RNA样品，然后通过逆转录环介导等温扩增的方法用所述的检测引物组对RNA样品进行扩增，确认是否存在有扩增产物。

优选，所述的样品为医院的腹泻样品，水或食品。

优选，所述的通过逆转录环介导等温扩增的方法用所述的检测引物组对RNA样品进行扩增具体为：环介导等温扩增体系为：10×buffer 2.5μL、10mM dNTPs 3μL、10μM FIP2μL、10μM BIP 0.5μL、10μM F3 0.5μL、10μM B3 2μL、25mM MgSO₄ 2μL、0.4M Betaine 2.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、AMV逆转录酶0.25μL、RNA1μL，去离子水补足至25μL，反应条件为：64℃孵育40min。

优选，所述的确认是否存在有扩增产物是在终止反应的反应管中加入1μL 10％SYBR GreenⅠ显色剂，10min后观察结果，如果颜色为黄色，则样品诺如病毒阴性，无诺如病毒，如果颜色为绿色，则样品诺如病毒阳性，含有诺如病毒。

本发明的第三个目的是提供一种诺如病毒的检测试剂盒，包括RNA提取试剂，逆转录环介导等温扩增试剂和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组由下列引物组成：

上游外引物F3：5’-GATGGGTCCRCAGCCAAC-3’；

下游外引物B3：5’-TCARATCAGGGCCYAAGG-3’；

上游内引物FIP：5’-GCTACAGGYGCCGCRATAGCCCCAGAGGTCAACAATGAGG-3’；

下游内引物BIP：5’-TACAAGCCCCTGGTGGAGAGTCGCGCTCCAYAGTATYTCAC-3’；

所述的R为A/G，Y为C/T。

本发明建立了敏感高、特异高、简便的RT-LAMP检测NV病毒的方法，并且将简并引物引入其中以增强检测的特异性。该方法只需一台水浴锅在一个小时内即可完成。而且，可直接用肉眼观察，使之便于在简易实验室用于病原诊断。该方法在野外实验中，也显示出很高的灵敏性，能够用于临床试验。

RT-LAMP比RT-PCR快约60min，敏感度高，有两个实验可以证明。一个是梯度稀释RNA模板来进行扩增；另一个是50个临床样品检测。扩增引物的设计要考虑到RNA病毒基因组容易变异这一点。本发明设计的简并引物能够特异地扩增NV，并不能扩增其他种病毒的基因组。

总之，本发明建立的检测NV的RT-LAMP技术简便、特异、灵敏，适用于野外和简易实验室检测，提供了新的病毒检测方法。设计了一套RT-LAMP简并引物，建立了检测NV的一步法RT-LAMP技术，能简便、特异、灵敏检测尿囊液和组织样品中的NV；并优化了反应温度(64℃)、反应时间(40min)等参数。在样品检测中，RT-LAMP技术的灵敏度达97.7％，高于RT-PCR的90.7％，更适用于野外样品和简陋实验室的快捷检测，可广泛应用于医院、食品行业、出入境检验检疫及质量监督等部门及领域。

附图说明：

图1是不同反应温度扩增的结果，其中M，DL2000 DNA Marker；65、64、63、62、61、60、59分别代表65℃、64℃、63℃、62℃、61℃、60℃、59℃，N,阴性对照；

图2是不同反应时间扩增的结果，其中M，DL2000 DNA Marker；60、50、40、30、20分别为60min,50min,40min,30min，20min；N，阴性对照；

图3是不同Mg²⁺浓度扩增的结果，其中M，DL2000 DNA Marker；泳道1-4的MgSO₄浓度分别为5mM、4mM、3mM、2mM时的LAMP扩增结果，N为阴性对照；

图4是限制性内切酶BamHI.酶切鉴定M：DL2000 DNA Marker；product为未酶切的扩增产物；Bam HI为扩增产物的酶切产物；

图5是肉眼直接观察结果，N1和N2是阴性对照，P1和P2是阳性反应，P1的管底出现白色沉淀，N1管是透明的；P2管的反应产物呈绿色，而N2管呈橙黄色；

图6是RT-PCR和RT-LAMP的敏感性比照，M,DL2000 DNA Marker；0～-6(log10)分别为模板按10倍稀释后的扩增结果，N，阴性对照，RT-PCR的产物为186bp；

图7是RT-LAMP反应特异性试验，M：DNA分子量标准DL2000；NV为诺如病毒；EV为肠道病毒(Enteroviruses，EV)；RV为轮状病毒(Rotavirus,RV)；AstV为星状病毒(Astrovirus,AstV)；N为RNAase free H₂O；

图8是碱基对比图。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1、材料

1.1 NV毒株及对照毒株

诺如病毒(NV)毒株分离自广东省各地。肠道病毒(Enteroviruses)，轮状病毒(Rotavirus,RV)，星状病毒(Astrovirus,AstV)，由实验室保存。

1.2主要试剂

Bst DNA聚合酶(8U/μL)及配套缓冲液为NEB公司产品；AMV反转录酶(5U/μL)、HRPRNA酶抑制剂(40U/μL)及相应缓冲液、Ex Taq DNA聚合酶(5U/μL)、dNTPs(2.5mM each)、BamHI(15U/μL)、DNA Marker DL 2000、RNAase free H2O均为TaKaRa产品。RNA提取试剂TRIzol Reagent(TaKaRa)；甜菜碱betaine(Sigma)；10000×SYBR GreenⅠ(百维信生物科技有限公司)；青霉素和链霉素(BBI)；琼脂糖(BIOWEST)。

PBS缓冲溶液(pH7.2)：KH2PO4 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.85g，NaCl 8g，KCl 0.2g加超纯水定容至1000mL。

50×TAE：Tris碱242g，Na2EDTA 37.2g，冰醋酸57.1mL，加超纯水定容至1000mL。使用液为1×TAE溶液。

1.3引物设计和合成

下载GeneBank上的诺如病毒(NV)的全基因的序列，通过DNAStar、ClustalX等软件比对序列找到最保守的区域，比对后发现ORF1与ORF2接头处最为保守，因此，用此段来设计LAMP引物，一共包括4条简并引物，互补于模板的6个片段，引物中包含简并碱基。引物序列见表1。F3和B3两条引物用做RT-PCR检测的引物。引物序列送至上海生工有限公司合成，合成后稀释成10μM，分装后置于-20℃保存。

表1 RT-PCR和RT-LAMP的引物

简并碱基用斜体标识，R＝G/A,Y＝C/T，BamHI的酶切位点位于F1c和F2，B1c和B2之间，用粗体标识

2方法和结果

2.1、参照试剂盒说明书，提取诺如病毒(NV)的总RNA，得到诺如病毒总RNA。

2.2 RT-LAMP反应体系优化

反应体系包括以下组分：10×buffer、dNTPs(10mM)、FIP(10μM)、BIP(10μM)、F3(10μM)、B3(10μM)、MgSO₄(25mM)、Betaine(0.4M)、Bst DNA聚合酶、AMV逆转录酶、抽提的总RNA(诺如病毒总RNA)，去离子水补足至25μL。

(1)优化反应温度

根据引物的Tm值，将反应体系分别放在59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃水浴锅中反应1h，80℃，2min终止反应。反应后取5μL反应液，用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mLEB)电泳对反应产物进行检测。同时设RNAase free H₂O阴性对照。

(2)优化反应时间

将反应体系放入64℃水浴锅中，以优化后的反应温度反应，分别在反应后60min、50min、40min、30min、20min后取出一管。全部取出后，取5μL反应液，用2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL EB)电泳检测。同时设RNAase free H₂O阴性对照。

(3)各重要组分浓度的优化

在25μL反应体系中，引物浓度、酶单位和模板浓度不变，因为Bst DNA聚合酶的buffer含有MgSO₄，除去该组分，改变组分MgSO4的浓度，探讨MgSO4浓度高低是否会影响扩增效率，加入量依次为5mM、4mM、3mM、2mM；所有分组反应都以RNAase free H₂O作为模板设阴性对照，反应后，进行电泳检测。

2.3最佳反应温度，时间及最佳Mg²⁺浓度

4条简并引物要根据退火的顺序来起始和延续反应，因此，反应温度是RT-LAMP扩增的一个最重要的因素。图1显示，在65～59℃范围内反应都能进行，但65℃，64℃，63℃和62℃比其它温度的条带要更明亮，选择64℃作为最佳反应温度。反应的时间，如图2所示，20min就能看到特征性的梯状条带，但需要40min才能产生明亮的条带。不同Mg²⁺浓度的RT-LAMP扩增结果如图3显示，4mM时即可达到最佳反应效率，因此，最后选定4mM作为最佳Mg²⁺浓度进行反应。因为Bst DNA聚合酶的缓冲液已含有终浓度为2mM的MgSO₄，实际加入量为2mM即可。

2.4优化后反应体系的确定

依照以上试验结果，优化的LAMP反应体系简述如下：

2.5 RT-LAMP产物的酶切鉴定

图4显示出，用限制性内切酶BamHI酶切扩增产物后，产生大小为223bp和196bp大小的预期目的带。

2.6 RT-LAMP扩增结果的肉眼判断

有两种肉眼直接观察的方法，如图5所示。其一是，阳性反应体系会有白色混浊物，经短暂离心后会积聚在管底形成明显的沉淀，而阴性反应仍为原来的透明清亮。其二是，加入SYBR Green I后，阳性反应变为绿色而阴性反应表现为染料原本的橙黄色。这两种判定方法灵敏度与电泳近乎一样。

实施例2：RT-LAMP的敏感性和特异性实验

一、取上述200μl诺如病毒(NV)总RNA，然后按10倍倍比稀释，每个稀释度都取1μl模板，按照以下反应体系：10×buffer 2.5μL、dNTPs(10mM)3μL、FIP(10μM)2μL BIP(10μM)0.5μL、F3(10μM)0.5μL、B3(10μM)2μL、MgSO₄(25mM)2μL、Betaine(0.4M)2.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、AMV逆转录酶0.25μL、抽提的总RNA(诺如病毒总RNA)1μL，去离子水补足至25μL，反应条件为：64℃孵育40min，进行RT-LAMP，以判断敏感度。RNAase free H2O作为阴性对照。

二、对比实验：

为了比较RT-LAMP扩增的敏感性和特异性，使用One-step RT-PCR一步法试剂盒与RT-LAMP方法同步进行。

根据试剂盒说明书，50μl反应体系包含0.4μM的F3和B3引物，一定的DNAPolymerase，5U AMV Reverse Transcriptase和4μl的RNA模板。

RT-PCR反应的程序为：50℃，30min；94℃，2min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；72℃，10min；共30个循环，RT-PCR反应大概需要100min。

反应完毕，取5μl的产物在核酸染料染色的2％浓度的凝胶跑胶，扩增片段大小约为209bp。

结果如图6显示，RT-PCR的可检测的最高稀释度为RNA稀释10³倍(10ng/μl)，RT-LAMP可检测的最高稀释度稀释10⁵倍(0.1ng/μl)。可见，RT-LAMP比RT-PCR约敏感100倍。

实施例3：RT-LAMP的特异性

提取20份不同来源的诺如病毒、肠道病毒(Enteroviruses，EV)、轮状病毒(Rotavirus,RV)、星状病毒(Astrovirus,AstV)的RNA，分别得到20份诺如病毒总RNA、肠道病毒总RNA、轮状病毒总RNA和星状病毒总RNA。

分别按照以下反应体系：10×buffer 2.5μL、dNTPs(10mM)3μL、FIP(10μM)2μL、BIP(10μM)0.5μL、F3(10μM)0.5μL、B3(10μM)2μL、MgSO₄(25mM)2μL、Betaine(0.4M)2.5μL、BstDNA聚合酶1μL、AMV逆转录酶0.25μL、抽提的总RNA(诺如病毒总RNA、肠道病毒总RNA、轮状病毒总RNA或星状病毒总RNA)1μL，去离子水补足至25μL，反应条件为：64℃孵育40min，进行RT-LAMP。RNAase free H2O作为阴性对照。

结果如图7所示，诺如病毒为阳性，均能检测出来，而肠道病毒总RNA、轮状病毒总RNA和星状病毒总RNA，以及阴性对照都为阴性，没有出现非特异性反应，说明所建立的RT-LAMP技术具有特异性。

实施例3：RT-LAMP应用于临床样品的检测

一、所有的50份样品都使用了传统的病毒分离和鉴定，确定43份是阳性(含诺如病毒)，7份阴性。阴性样品被RT-PCR和本发明的RT-LAMP检测也确定是阴性，但是43份阳性样品的检测中，RT-LAMP漏检1份，RT-PCR漏检4份。5份被RT-PCR漏检的样品为直接从送检的病变气管肾组织中抽提RNA进行检测，用RT-LAMP检测则为阳性。所有的样品检测的结果说明，本发明的RT-LAMP表现出97.7％的敏感度，而RT-PCR为90.7％。

表2不同方法对野外疑似样品的检测结果

二、LAMP检测方法与常规PCR检测方法的比较

本研究的临床样品检测中，首先对样品进行了病毒分离鉴定，最后采用了常规PCR的方法进行鉴定，鉴定结果与RT-LAMP方法完全相同。在同样模板浓度检测试验中，RT-LAMP法的敏感性至少比PCR法高100倍。相对于RT-LAMP法，PCR法漏检了3份组织样品，可能是目的基因的核酸含量低于PCR的检测极限，因为经过病毒浓缩，漏检的样品就能被PCR鉴定为阳性。

三、RT-LAMP的缺陷及改进

本发明的RT-LAMP漏检了1株NV毒株，出现假阴性，这是很大的缺陷。经过基因序列分析，这1株毒株的核苷酸位点发生了点突变，与引物B1c(BIP＝B1c+B2)错配，如图8所示，核苷酸点突变是核酸扩增反应用于病原微生物检测的一个重大缺陷，需要几套引物相互验证。

50份样品用传统的病毒分离和鉴定方法确认，43份是阳性，17份是阴性。RT-LAMP还是漏检了病毒分离鉴定为阳性的1份样品，通过测序发现病毒基因组在引物位置没有发生突变，分析可能是由于样品中病毒含量低于检测极限。

本发明建立的RT-LAMP，改进之处包括：

(1)特异性增强，简并引物的设计，弥补因模板点突变带来的缺陷；

(2)内引物加了酶切位点，可进行特异性分析；

(3)进行了反应试剂的优化和组合，像试剂盒一样操作，更加简便快捷；

(4)本研究还对大量临床样品进行了检测，证实了RT-LAMP的可操作性。

Claims

1.一种应用逆转录环介导等温扩增检测诺如病毒的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成：

上游外引物F3：5’- GATGGGTCCRCAGCCAAC -3’；

下游外引物B3：5’- TCARATCAGGGCCYAAGG -3’；

上游内引物FIP：5’- GCTACAGGYGCCGCRATAGCGGATCCCCCAGAGGTCAACAATGAGG -3’；

下游内引物BIP：5’- TACAAGCCCCTGGTGGAGAGTGGATCCCGCGCTCCAYAGTATYTCAC -3’；

所述的R为A/G，Y为C/T。

2.一种非疾病的诊断和治疗目的的诺如病毒的检测方法，其特征在于，对样品进行病毒RNA提取，得到RNA样品，然后通过逆转录环介导等温扩增的方法用权利要求1所述的检测引物组对RNA样品进行扩增，确认是否存在有扩增产物。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的样品为水或食品。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的通过逆转录环介导等温扩增的方法用权利要求1所述的检测引物组对RNA样品进行扩增具体为：环介导等温扩增体系为：10×buffer 2.5µL、10 mM dNTPs 3µL、10 µM FIP 2µL、10 µM BIP 0.5µL、10 µM F3 0.5µL、10 µM B3 2µL、25 mM MgSO₄ 2µL、0.4 M Betaine 2.5µL、Bst DNA聚合酶 1µL、AMV逆转录酶0.25µL、RNA样品1µL，去离子水补足至25µL，反应条件为：64℃孵育40min。

5.根据权利要求2、3或4所述的检测方法，其特征在于，所述的确认是否存在有扩增产物是在终止反应的反应管中加入1μL 10% SYBR Green Ⅰ显色剂，10min后观察结果，如果颜色为黄色，则样品诺如病毒阴性，无诺如病毒，如果颜色为绿色，则样品诺如病毒阳性，含有诺如病毒。

6.一种诺如病毒的检测试剂盒，包括RNA提取试剂，逆转录环介导等温扩增试剂和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组由下列引物组成：

上游外引物F3：5’- GATGGGTCCRCAGCCAAC -3’；

下游外引物B3：5’- TCARATCAGGGCCYAAGG -3’；

所述的R为A/G，Y为C/T。