CN103952495B - 一种鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的lamp检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的LAMP检测方法，该方法是针对传染性脾肾坏死病毒特异性片段的6个区域设计4种特异性引物，利用LAMP快速扩增模版DNA特异性区域，通过加入染料，在自然光下通过肉眼观察颜色变化就能判断结果，整个反应不超过2h，又由于LAMP呈瀑布式扩增，因此其扩增效率非常高，灵敏度是普通PCR的100倍，且无需复杂的检测仪器和检测过程，操作简单，可实现现场实时检测，因此本发明是一种检测快速、灵敏度高、操作简便、成本低，检测结果易于判断的传染性脾肾坏死病毒的LAMP检测方法。

Description

一种鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的LAMP检测方法
技术领域
本发明涉及病毒检测方法，具体涉及一种鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的LAMP检测方法。
背景技术
传染性脾肾坏死病毒（Infectiousspleenandkidneynecrosisvirus，ISKNV）于1998年从鳜鱼中分离出来。该病毒具有囊膜，直径为150nm，是细胞质双链线状DNA病毒，是鳜暴发性传染病的主要病原，主要流行于我国南方淡水养殖的鳜中，该病毒病流行性快、发病率高，且目前尚无有效控制措施，严重影响鳜鱼养殖业的发展。何建国等通过回归感染证明了该病毒的病原性，认为可能是一种虹彩病毒，并对其感染的组织范围进行了研究，发现脾肾是其主要感染器官，导致脾肾坏死，因此命名为传染性脾肾坏死病毒(infectiousspleenandkidneynecrosisvirus，ISKNV)。
目前对于ISKNV的检测，主要有组织学检测方法和分子生物学技术检测方法，但这些检测方法在实际操作中，由于自身条件的限制，均不适合临床大量检测。
发明内容
本发明目的是针对已有的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒检测方法的缺陷，提供一种具有检测快速、操作简便、成本低、灵敏度高、检测结果准确和检测周期短等优点的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的LAMP检测方法。
本发明所采用的技术方案为：
一种鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的LAMP检测方法，其包括以下步骤：
1）DNA提取：从染病鳜鱼的肾脏组织中提取基因组DNA；
2）DNA片段扩增：取1μL提取的基因组DNA加入到25μL反应液中，混匀后置63℃恒温水浴中进行LAMP扩增1h，所述反应液由下述成分组成：
其中，F3引物的核苷酸序列为GCCTGGAAGACATACCCGA；B3引物的核苷酸序列为CGTCATGTACGCGGACATG；FIP引物的核苷酸序列为CGCAGGCAATCCATAAGCGCTTTTCATACCGCCGGAATCTTACC；BIP引物的核苷酸序列为CCGGAGCCGTGCGCAATAAATTTTCGAGGAACGACACGTACTG。
3）向反应体系中再加入0.5μL绿色荧光染料并进行阴阳性判断，若呈绿色为阳性，则鳜鱼中感染有传染性脾肾坏死病毒；若呈现橙色为阴性，则鳜鱼中无传染性脾肾坏死病毒。
本发明针对传染性脾肾坏死病毒特异性片段的6个区域设计4种特异性引物，利用LAMP快速扩增模版DNA特异性区域，通过加入染料，在自然光下通过肉眼观察颜色变化就能判断结果，整个反应不超过2h，又由于LAMP呈瀑布式扩增，因此其扩增效率非常高，灵敏度是普通PCR的100倍，且无需复杂的检测仪器和检测过程，操作简单，可实现现场实时检测，因此本发明是一种检测快速、灵敏度高、操作简便、成本低，检测结果易于判断的传染性脾肾坏死病毒的LAMP检测方法。
附图说明
图1是传染性脾肾坏死病毒的特异性保守区域ORF72的基因片段，图中的黑体表示六个特异性区域(F3，F2，F1，BI，B2，B3)。
图2是LAMP引物F3，B3，FIP，BIP和普通PCR引物，上游（ORF72F）、下游（ORF72B）引物的核苷酸序列及相关信息。
图3是不同Mg2+浓度的ISKNV-LAMP电泳图，图中的M为markerDL5000；1～6分别代表反应体系中的Mg2+浓度为2、4、6、8、10和12mM；7为空白对照。
图4是不同甜菜碱浓度的ISKNV-LAMP电泳图，图中的M为markerDL5000；1～7分别代表反应体系中的甜菜碱浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2M；8为空白对照。
图5是不同dNTPs浓度的ISKNV-LAMP电泳图，图中的M为markerDL5000；1～8分别代表反应体系中的dNTPs浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mM；9为空白对照。
图6是不同引物比例（外引物：内引物）的ISKNV-LAMP电泳图，图中的M为markerDL5000；1～6分别代表反应体系中的引物比例为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8和1:10mM；7为空白对照。
图7是不同反应时间的ISKNV-LAMP电泳图，图中的M为markerDL5000；1～7分别代表反应时间为10、20、30、40、50、60和70min；8为空白对照。
图8是不同反应温度的ISKNV-LAMP电泳图。图中的M为markerDL5000；1～7分别代表反应温度为45、55、58、60、63和65℃；8为空白对照。
图9是ISKNV-LAMP灵敏性电泳实验结果，图中的M为markerDL5000；1～9分别代表10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8和10-9倍比稀释的ISKNVDNA；10为空白对照。
图10是ISKNV-LAMP灵敏性染色实验结果，图中的M为markerDL5000；1～9分别代表10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8和10-9倍比稀释的ISKNVDNA；10为空白对照，样品加入SYBRgreenⅠ染料。
图11是ISKNV-PCR灵敏性实验结果，图中的M为markerDL5000；1～9分别代表10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8和10-9倍比稀释的ISKNVDNA；10为空白对照。
图12是ISKNV-LAMP特异性实验结果，图中的M为markerDL5000；1为阳性对照；2～6分别代表SVCV、IHNV、CCV、VHSV和IPNV；7为空白对照。
图13是ISKNV-LAMP特异性染色实验结果，图中的M为markerDL5000；1为阳性对照；2～6分别代表SVCV、IHNV、CCV、VHSV和IPNV；7为空白对照，样品加入SYBRgreenⅠ染料。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
1、LAMP引物的设计与合成：
本发明利用NCBI中BLAST软件对GeneBank中ISKNV的全基因组进行序列分析，找出特异性保守区域ORF72基因（图1所示），针对特异性保守区的6个区域设计4种特异性引物，利用荣研专利LAMPprimerexplorer（http://primerexplorer.jp/e/index.html）在线软件设计多组引物。每组引物包括一对F3/B3内引物和一对FIP/BIP外引物；并利用LAMP对设计的特异性引物进行筛选，确定高度特异性的引物。
特异性引物的核苷酸序列如下：
ISKNVF35`-GCCTGGAAGACATACCCGA-3`
ISNNVB35`-CGTCATGTACGCGGACATG-3`
ISKNVFIP5`-CGCAGGCAATCCATAAGCGCTTTTCATACCGCCGGAATCTTACC-3`
ISKNVBIP5`-CCGGAGCCGTGCGCAATAAATTTTCGAGGAACGACACGTACTG-3`
2、鳜鱼基因组DNA的提取：
按常规方法提取基因组DNA，参照动物组织DNA提取试剂盒（商业途径购买）的说明书。
3、DNA片段的扩增：
优化其反应条件：针对Mg2+浓度，甜菜碱浓度，dNTP浓度，外引物与内引物比例(1:1、1:2、1:4、1:6、1:8和1:10)，反应时间(10、20、30、40、50、60和70min)和反应温度(45、55、58、60、63和65℃)，分别进行优化，最终确立扩增反应为：
取1μL提取的基因组DNA加入到25μL反应液中，混匀后置63℃恒温水浴中进行LAMP扩增1h，所述反应液由下述成分组成：
其中，引物F3的核苷酸序列为GCCTGGAAGACATACCCGA；引物B3的核苷酸序列为CGTCATGTACGCGGACATG；引物FIP的核苷酸序列为CGCAGGCAATCCATAAGCGCTTTTCATACCGCCGGAATCTTACC；引物BIP的核苷酸序列为CCGGAGCCGTGCGCAATAAATTTTCGAGGAACGACACGTACTG。
4、反应显色并判断结果：
向反应体系中再加入0.5μL绿色荧光染料（SYBRgreenⅠ）并进行阴阳性判断，若呈绿色样品为阳性，则样品中感染有传染性脾肾坏死病毒，若呈现橙色样品为阴性，则样品中无传染性脾肾坏死病毒。
5、LAMP检测的特异性试验：
参照DNA提取试剂盒说明书，分别对传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）、鲤春病毒血症病毒（SVCV）、传染性造血器官坏死病毒（IHNV）、病毒性出血败血症病毒（VHSV）和传染性胰腺坏死病病毒（IPNV）、斑点叉尾鮰病毒（CCV）的DNA和RNA进行提取。通过LAMP扩增体系分别对不同样品进行扩增。反应水浴63℃恒温，扩增1h。向扩增产物中加入0.5μL的荧光染料SYBRgreenⅠ，只有传染性脾肾坏死病毒呈现绿色，其他扩增样品均为橙色，说明LAMP扩增反应体系对传染性脾肾坏死病毒的特异性。
6、LAMP检测的敏感性试验：
将ISKNV的基因组DNA进行10倍倍比稀释，同时建立LAMP方法和常规PCR方法进行检测，用SYBRgreenⅠ染色和1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。结果显示LAMP可以检测10-9ng/μL，而普通PCR能检测到10-7ng/μL基因组DNA，说明LAMP扩增灵敏度相对普通PCR扩增具有较大优势。
LAMP具有高的灵敏性和特异性，针对基因组特异性保守片段的6个区域，设计4种特异性引物，只有4种引物全部匹配才能出现扩增反应。几乎不可能出现非特异性扩增的情况。并且扩增条带是瀑布状的，一般能检测到10拷贝一下的样品，因此对于低拷贝的病毒及没有临床症状的病毒携带者的检测往往高于普通PCR扩增反应。
本发明构建的方法，操作简单，成本低廉，只需要恒温水浴锅，不需要其他昂贵仪器就可以在2h内完成现场临床检测。LAMP扩增产物的判断有传统的琼脂糖凝胶电泳法和SYBRgreenⅠ绿色荧光染料染色等两种方法，本发明选择荧光染料检测方法，该方法的突出特点是不需要仪器、操作简便、肉眼即可判断结果，很适合与野外、现场及临床检测传染性脾肾坏死病毒。

Claims (1)

1.LAMP引物组用于制备鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的检测试剂盒的用途，所述LAMP引物组中各引物的核苷酸序列分别为：
F3引物的核苷酸序列为GCCTGGAAGACATACCCGA；B3引物的核苷酸序列为CGTCATGTACGCGGACATG；FIP引物的核苷酸序列为CGCAGGCAATCCATAAGCGCTTTTCATACCGCCGGAATCTTACC；BIP引物的核苷酸序列为CCGGAGCCGTGCGCAATAAATTTTCGAGGAACGACACGTACTG。
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