CN105695570A - 一种可同时检测四种弧菌的多重lamp方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可同时检测大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的LAMP方法。设计四组LAMP引物FIP，BIP，F3，B3，并在内引物添加不同酶切位点，配制含四种引物的LAMP反应体系，对LAMP扩增产物加入SYBR Green I进行检测。本发明比现有PCR技术检测大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的方法有更高的特异性、灵敏度、快速、便捷，并且可以用于现场的快速检测，有利于及时发现鱼类中大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的传染和爆发。

Description

一种可同时检测四种弧菌的多重LAMP方法

技术领域

本发明涉及大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的检测方法，具体涉及大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的多重LAMP检测方法。

背景技术

大菱鲆弧菌(Vibrioscophthalmi)是一种革兰氏阴性菌，呈短杆状，现已知该菌是大菱鲆、牙鲆等重要经济鱼类的致病菌，病鱼症状为皮肤变黑、肝脏和小肠出血、并伴有腹水和腹胀；创伤弧菌(Vibriovulnificus)是一种革兰氏阴性嗜盐菌,主要分布于近海海洋环境中,是水产养殖虾、蟹和牡蛎等水生动物中最常见、流行最广、危害最严重的致病菌之一；副溶血弧菌(VibrioParahemolyticus)，为革兰氏阴性杆菌，呈弧状、杆状、丝状等多种形状，广泛存在于海水和海产品中,是我国沿海地区常见的食物中毒病原菌；鱼肠道弧菌(Vibrioichthyoenteri)是水产养殖中新发现的一种革兰氏阴性致病菌,呈杆状,两端钝圆,散在或成双,无芽孢,可感染大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、石鲽(Kareiusbicoloratus)等多种名贵海水养殖鱼类，造成严重的经济损失。

目前，针对大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的检测技术主要是PCR法、DNA杂交法和菌落杂交法。然而，由于这些方法通常需要昂贵的仪器设备，且操作繁琐、费时费力，很难推广应用。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是2000年由Notomi等人发明的一种新的病原核酸检测技术，该技术根据靶序列设计四条特异性引物，可以特异性识别靶序列的六个特定区域，在等温条件下，通过BstDNA聚合酶的链置换和链延伸作用，可以在1小时内对靶序列实现10⁹倍的扩增，扩增产物加入荧光染料SYBRGreenI后，阳性结果变为绿色，阴性无变化，可以通过肉眼直接观察。已经有关于创伤弧菌和副溶血弧菌的单重LAMP检测方法，但多重LAMP比单重LAMP更加快速、简便等特点，适合基层养殖场对病原的快速检测。然而，由于引物之间的相互干扰、多重LAMP检测条件的优化、以及检测结果分析等方面的难度和复杂性，至今尚未有报道能同时检测所述四种水产养殖致病菌的多重LAMP方法。

发明内容

本发明提供了一种大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的多重LAMP的检测方法，目的是实现对大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌进行特异、灵敏、快速、简便的现场检测。改善原有检测技术繁琐、费时的弊端。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：1、提供4组LAMP引物序列，大菱鲆弧菌长度分别为49bp，43bp，18bp，20bp的核苷酸序列，分别命名为luxR-FIP、luxR-BIP、luxR-F3、luxR-B3；创伤弧菌长度分别为45bp，46bp，20bp，19bp的核苷酸序列，分别命名为metalloprotease-FIP、metalloprotease-BIP、metalloprotease-F3、metalloprotease-B3；长度分别为47bp，44bp，19bp，22bp的核苷酸序列，分别命名为ompA-FIP、ompA-BIP、ompA-F3、ompA-B3；鱼肠道弧菌长度分别为46bp，46bp，18bp，19bp的核苷酸序列，分别命名为ToxR-FIP、ToxR-BIP、ToxR-F3、ToxR-B3。2、配置LAMP反应体系，通过LAMP反应程序对单一样品模板进行扩增，四种引物按比例加入，确定最佳反应体系和反应条件；3、反应产物的鉴定：2％琼脂糖凝胶电泳；酶切分析；产物加入SYBRGreenI,观察反应管中颜色变化。具体包括如下步骤：

1、设计LAMP引物：根据GeneBank中已知的大菱鲆弧菌luxR基因(GenBank:JN684209.1)，创伤弧菌的metalloprotease基因(GenBank:U50548.1)，副溶血弧菌的ompA基因(GenBank:JTGT01000603.1)和鱼肠道弧菌的ToxR基因(GenBank:KT265743)作为靶序列，通过PrimerExploreV4在线设计软件设计四条特异性引物,对于大菱鲆弧菌，在FIP的F1c和F2之间添加EcorI酶切位点，在BIP的B1c和B2之间添加-TTTT-连接子；对于鱼肠道弧菌，在FIP的F1c和F2之间添加EcorV酶切位点，在BIP的B1c和B2之间添加-TTTT-连接子,对于V.vulnificus，在BIP的B1c和B2之间添加BamHI酶切位点，在FIP的F1c和F2之间添加-TTTT-连接子；V.parahaemolyticus，在BIP的B1c和B2之间添加PstI酶切位点，在FIP的F1c和F2之间添加-TTTT-连接子，设计以下四组LAMP引物：

表1：多重LAMP引物组

2、配制LAMP反应体系

LAMP反应体系各组分含量：总体系25μl,包括BstDNA聚合酶1μl(8000U)，10×BstDNABuffer2.5μl，PCR级甜菜碱4μl(5M)，dNTPs(2.5mMeach)2.5μl,DNA模板1μl，FIP/BIP各0.5μl(1.6μM)，F3/B3各0.5μl(0.4μM)，加双蒸水使反应体系总体积达到25μl。

3、LAMP反应体系扩增：将上述反应体系进行扩增反应，反应温度58到65℃，反应时间为15到90min.

4、扩增产物检测：2％琼脂糖凝胶电泳；酶切分析；产物加入SYBRGreenI,观察反应管中颜色变化。

本发明提供的同时检测四种致病菌的多重LAMP检测方法，有以下优势：

一、灵敏度高对创伤弧菌和副溶血弧菌的检测可低至8CFU/μl,比普通PCR高100—1000倍。

二、特异性强所需的特异性引物分别根据大菱鲆弧菌luxR基因、创伤弧菌的metalloprotease基因、副溶血弧菌的ompA基因和鱼肠道弧菌的ToxR基因的六个不同区域进行设计，特异性比常规PCR强。

三、检测时间短1h左右即可获得检测结果，比普通PCR省时。

四、仪器设备要求低不需要PCR仪等昂贵仪器，产物可以进行电泳，也可以直接加入SYBRGreenI染料，观察颜色变化，从而确定反应与否。

五、操作简单、结果易观察：整个检测过程不涉及复杂仪器设备，产物加入SYBRGreenI染料，可以直接用肉眼观察判断。

综上所述，本发明具有比现有的PCR技术检测大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的方法，有更高的特异性、灵敏度和便捷性，并且可以在实际生产中用于现场检测，有利于及时发现鱼类养殖中的大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌。

附图说明

图1反应温度优化：温度梯度从左往右依次58℃到65℃8个梯度1，3，5，7，9，11，13，15分别为58℃，59℃，60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃的阴性对照；2，4，6，8，10，12，14，16分别为58℃，59℃，60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃加模板。

M：marker，A:大菱鲆弧菌，B：创伤弧菌，C：副溶血弧菌，D：鱼肠道弧菌。

图2反应时间优化：1-6分别代表15min,30min,45min,60min,75min,90min；

M为marker，A:大菱鲆弧菌，B：创伤弧菌，C：副溶血弧菌，D：鱼肠道弧菌。

图3LAMP扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱及酶切分析：

A:大菱鲆弧菌，B：创伤弧菌，C：副溶血弧菌，D：鱼肠道弧菌；

泳道1：EcoRV酶切，2:PstI酶切，3：BamHI酶切，4：EcoRI酶切，5：缓冲液对照，M为marker，。

图4灵敏度比较：A-D分别为大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、鱼肠道弧菌的PCR检测结果，E-H分别为大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、鱼肠道弧菌的LAMP检测结果；

泳道M：Marker，泳道1-8：1.6×10⁶CFU/μl-1.6×10^-1CFU/μl依次10倍比稀释的细菌模板。

图5SYBRGreenI显色反应：对用大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌四种细菌人工感染的大菱鲆鱼的肝、肾、脾、血进行多重LAMP扩增，产物加入SYBRGreenI，感染组显示绿色，对照组无变化。

A:感染大菱鲆弧菌；B:感染创伤弧菌C:感染副溶血弧菌D:感染鱼肠道弧菌；

离心管1，3，5，7分别为健康组的脾、肾、肝、血；2，4，6，8分别为感染组的脾、肾、肝、血。

图6多重LAMP检测方法的应用：平板计数法结合多重LAMP确定四种细菌在不同组织中的检出率

A:感染大菱鲆弧菌；B:感染创伤弧菌C:感染副溶血弧菌D:感染鱼肠道弧菌。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌多重LAMP方法的建立

1材料：dNTPs、BstDNA聚合酶(含10×缓冲液)、PCR级甜菜碱等。

2方法

2.1引物设计与合成

根据GeneBank中已知的大菱鲆弧菌luxR基因(GenBank:JN684209.1)，创伤弧菌的metalloprotease基因(GenBank:U50548.1)，副溶血弧菌的ompA基因(GenBank:JTGT01000603.1)和鱼肠道弧菌的ToxR基因(GenBank:KT265743)作为靶序列，设计四条特异性引物。对于大菱鲆弧菌，在FIP的F1c和F2之间添加EcorI酶切位点，在BIP的B1c和B2之间添加-TTTT-连接子；对于鱼肠道弧菌，在FIP的F1c和F2之间添加EcorV酶切位点，在BIP的B1c和B2之间添加-TTTT-连接子,对于V.vulnificus，在BIP的B1c和B2之间添加BamHI酶切位点，在FIP的F1c和F2之间添加-TTTT-连接子；V.parahaemolyticus，在BIP的B1c和B2之间添加PstI酶切位点，在FIP的F1c和F2之间添加-TTTT-连接子，设计并合成如表1所示四组LAMP引物。

2.2LAMP扩增条件的优化

优化反应温度和反应时间。检测所用的模板用煮沸裂解法制备。分别在温度和时间上设置的不同梯度，进行优化。温度上从58℃到65℃每隔1℃设置一个梯度；时间上15min一个梯度，设置6个梯度。扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析。

分析温度电泳图：大菱鲆弧菌在58到65℃均可发生反应，产生阶梯状扩增条带，且电泳条带亮度接近(1-A)；创伤弧菌在58到65℃均可发生反应，产生阶梯状扩增条带，且电泳条带亮度接近(1-B)；副溶血弧菌在58℃和65℃均无明显阶梯状扩增条带，但在59到64℃有阶梯状扩增条带(1-C)；鱼肠道弧菌在65℃均无明显阶梯状扩增条带，但在58到64℃有阶梯状扩增条带，且条带亮度相当(1-D)。综合比较电泳图谱条带的亮度，选择62℃为反应温度。

分析时间电泳图：除大菱鲆弧菌在30min时出现阶梯型条带(2-A)，创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌均在45min时开始出现阶梯型条带(2-B,2-C,2-D)。综合比较电泳图谱条带的亮度，选择75min为反应时间。

实施例2限制性内切酶酶切分析

为了构建多重LAMP的检测方法，在大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的内引物BIP的B1互补链(B1c)和B2之间分别添加不同的限制性酶切位点，利用限制性酶切分析来确定反应的正确性和特异性。在多重LAMP反应体系中只添加一种模板，并分别对扩增产物进行一种限制性酶切。结果表明：大菱鲆弧菌的扩增产物能够被EcoRI限制性内切酶酶切，酶切得到的特异性条带(图3-A)；创伤弧菌的扩增产物能够被BamHI限制性内切酶酶切，酶切得到的特异性条带见(图3-B)；副溶血弧菌能够被PstI限制性内切酶酶切，酶切得到的特异性条带(见图3-C)，鱼肠道弧菌能够被EcoRV限制性内切酶酶切，酶切得到的特异性条带(图3-D)，证明了多重LAMP扩增结果的准确性。

实施例3本发明多重LAMP检测方法的灵敏度测定

煮沸法提取DNA。

为了检测LAMP方法的灵敏度，将提取大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌基因组DNA进行10倍梯度稀释，共8个梯度，各浓度级分别取1μL作为模板,进行优化条件后的LAMP扩增,扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析。

分别取1μL作为PCR模板，F3/B3各1μl(20mM)，Taq酶0.5μl，dNTPs(2.5mMeach)1μl，Taq10×buffer2.5μl,ddH₂O18μl，进行PCR扩增，94℃预变性5min；94℃变性30s,57℃退火40s，72℃延伸40s,25个循环；72℃延伸5min。扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析。

常规PCR法对四种致病菌基因组DNA按同样的10倍梯度稀释进行检测，图4表明：除单独用副溶血弧菌为模板的多重LAMP检测灵敏度是普通PCR的10³倍，其余三种弧菌的多重LAMP检测灵敏度均为普通PCR的10²倍。

实施例4本发明多重LAMP检测方法的特异性测定

用煮沸法制备大菱鲆弧菌(Vibrioscophthalmi)，鱼肠道弧菌(Vibrioichthyoenteri)，创伤弧菌(Vibriovulnificus)，副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)，鳗弧菌(Vibrioanguillarum)，哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)，大肠杆菌(E.coli)，恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)，藤黄微球菌(Micrococcusluteus)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)的DNA模板,进行LAMP扩增，扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析。结果只有大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌有扩增条带，其他种属的微生物均没有扩增。(表2)

表2：本发明多重LAMP检测方法的特异性测定

“+”表示阳性，“-”表示阴性

实施例5多重LAMP方法具体检测鱼体内的大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌

1.选取大菱鲆作为试验动物，通过腹腔注射方式分别人工感染4种弧菌。感染24h后，无菌操作，分别取血、肾、肝及脾组织，匀浆。匀浆液进行10倍梯度稀释，选择合适的稀释度涂布LB固体培养基平板，计数。剩余血、肾、肝及脾组织的匀浆液经煮沸，进行10倍梯度稀释，多重LAMP方法检测其最低检出率，扩增产物进行2％琼脂糖凝胶分析。

结果显示，多重LAMP方法可以在所有的感染组样品中，检测到4种弧菌的存在。向多重LAMP扩增反应管中加入1μl(1:10)SYBRGreenI，目测反应管中颜色的变化。结果发现，感染组的所有组织的反应管中均发生了阳性反应，颜色变为典型的绿色；对照组健康大菱鲆的所有组织的反应管中颜色变为橙色。(图5)

2.结合平板计数和多重LAMP方法，计算各细菌感染组中所取组织细菌检出率。结果表明：感染大菱鲆弧菌的大菱鲆，脾、肾、肝和血液中创伤弧菌的最低检出率分别为16CFU/反应管,11CFU/反应管,25CFU/反应管,18CFU/反应管(图6-A)；感染创伤弧菌的大菱鲆，脾、肾、肝和血液中创伤弧菌的最低检出率分别为感染副溶血弧菌的大菱鲆19CFU/反应管,24CFU/反应管,15CFU/反应管,10CFU/反应管(图6-B),脾、肾、肝和血液中创伤弧菌的最低检出率分别为23CFU/反应管,17CFU/反应管,19CFU/反应管,13CFU/反应管(图6-C),感染鱼肠道弧菌的大菱鲆，脾、肾、肝和血液中创伤弧菌的最低检出率分别为15CFU/反应管,20CFU/反应管,10CFU/反应管,22CFU/反应管(图6-D)。

序列表

。

Claims (8)

1.一种检测大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的多重LAMP引物组，其包括以下引物：四条特异性检测大菱鲆弧菌luxR基因的引物、四条特异性检测创伤弧菌metalloprotease基因的引物、四条特异性检测副溶血弧菌ompA基因的引物、以及四条特异性检测鱼肠道弧菌ToxR基因的引物。

2.如权利要求1所述的多重LAMP引物组，其特征在于：

特异性检测大菱鲆弧菌luxR基因的LAMP引物为：

luxR-F3AGCAAAAAGACCCCGCAC

luxR-B3CGGTTTCGTTCTCGGTGTT

luxR-FIP

GGCGCGCAAATACATCCAGAGAA-GAATTC-GACTCTCGCCCAAAAAACGT

luxR-BIPGTGGGATTGGTCGTGGTGGT-TTTT-ATACCGTGGCGACCGATAC；

特异性检测创伤弧菌metalloprotease基因的LAMP引物为：

metalloprotease-F3TCAGCAAACCTATTTGGGCC

metalloprotease-B3GTCTTCACGTGTTGGGAAGT

metalloprotease-FIP

CCATGCACATTGCTCAACCCTG-TTTT-CCTGTGTTTGATACCGCCG

metalloprotease-BIP

GATCAGCAACAAGCCATCGCC-GGATCC-TACGATTGGCATGCTTCGC；

特异性检测副溶血弧菌的ompA基因的LAMP引物为：

ompA-F3AATTACGCGGAAAGAAACC

ompA-B3GAGGCTTATTTCAATAACATGC

ompA-FIPAGCGGTAGGTTACTCATCCTCTAA-TTTT-GGATCGCTTCTCATCTTCA

ompA-BIPTTACCCACCCGTAGTGTTCG-CTGCAG-CAATCGAGAACTCGTGCC；

特异性检测鱼肠道弧菌ToxR基因的LAMP引物为：

ToxR-F3TTTGCCGCTCAGCTAACC

ToxR-B3CCCAACCCCAAGTTGAGTT

ToxR-FIP

AAGCGTAACCATGCCGCCAC-GATATC-TACGCGTGGTGTCTATAGCA

ToxR-BIPAGTTCAGCCATGAAGTTGGGCA-TTTT-TGGTTTATGAATTGCCCCCT。

3.一种检测大菱鲆弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌和鱼肠道弧菌的多重LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的引物组。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其还含有10×反应缓冲液、dNTP、BstDNA聚合酶、甜菜碱、SYBRGreenI显色液。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述10×反应缓冲液包含：Tris-Cl200mM，KCl100mM,(NH₄)₂SO₄100mM，MgSO₄20mM，1％TritonX-100。

6.如权利要求3-5任一所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒中还含有一种或多种选自EcoRI、BamHI、PstI、EcoRV的限制性内切酶。

7.一种多重LAMP检测方法，其特征在于包括下述步骤

(1)设计并合成如权利要求1或2所述的引物组；

(2)配制LAMP反应体系

反应体系的终浓度为：总体系25μl,包括BstDNA聚合酶1μl(8000U)，10×BstDNABuffer2.5μl，PCR级甜菜碱4μl(5M)，dNTPs(2.5mMeach)2.5μl,DNA模板1μl，FIP/BIP各0.5μl(1.6μM)，F3/B3各0.5μl(0.4μM)，加双蒸水使反应体系总体积达到25μl；

(3)LAMP反应体系扩增：将上述反应体系进行扩增反应，反应温度58℃到65℃，反应时间为15min到90min；

(4)扩增产物检测：取扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳；或向扩增产物中加入SYBRGreenI，观察反应管中颜色变化。

8.如权利要求7所叙述的创伤弧菌和副溶血弧菌的多重LAMP检测方法，其特征在于步骤3中的最适反应温度是62℃，最适反应时间75min。