CN104372092A - 一种木香疫霉的lamp检测引物组合物及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种木香疫霉菌的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。该LAMP检测引物组合物由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成。本发明的检测方法准确性高、特异性强、操作方便、实用性好，在64℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到P.tentaculata，不需要复杂仪器，能较好满足对P.tentaculata的现场检测，为P.tentaculataa的检测提供了新的技术平台，可用于P.tentaculata的高灵敏度快速检测，同时也可用于发病田块中疫病的早期诊断和病菌的监测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种木香疫霉菌(Phytophthora tentaculata)的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。
背景技术
木香疫霉菌(P.tentaculata)于1993年首次在德国苗圃中呈现根腐和茎腐的菊花上分离到，随后又在马鞭草和绵杉菊上也发现了该病原物。2007年，在我国的云南昆明，在木香上也分离到了该病原物，这是我国首次报道P.tentaculata。根据目前已有的资料分析，该病原物主要引起菊科植物的根腐和茎腐，对园艺作物的生产具有较大的危害。云南一直是我国鲜花和园艺植物的主要供应省份，如何制订有效的防治措施以防止该疫霉种随带菌苗木、花草等向其它地区的迁移是一个需要引起重视的问题。为了阻止P.tentaculata传播范围的不断扩大，使P.tentaculata引起的疫霉根腐病得到控制，需要对其进行快速、准确地检测。
传统的P.tentaculata的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特征等。传统方法在P.tentaculata检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉分离、形态学鉴定知识和丰富的经验。随着核酸相关的鉴定方法的发展，PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势，虽然PCR法在特异性和敏感性上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，大概4～5h，同时PCR方法依赖精密的温度循环装置。其检测灵敏度比较高，但是检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围80min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。自LAMP检测技术建立14年以来，该技术已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫、真菌等病原菌的检测研究，但在植物病原卵菌的检测报道很少，P.tentaculata的检测国内外均未见报道。
发明内容
发明目的：针对现有技术中木香疫霉菌生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低的问题，本发明的目的是提供一种木香疫霉菌的LAMP检测引物组合物。本发明的另一目的是提供上述木香疫霉菌的LAMP检测试剂盒。本发明还有一目的是提供上述木香疫霉菌的LAMP检测方法。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种用于检测木香疫霉菌的LAMP检测引物组合物：由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：
FIP：5′-ATCGTACGGATTTTCTGAGCAAAGTAGATCCCGATTTCCATCAG-3′；
BIP：5′-TGGACGGCAAGACCATCAAGTCCGTTAGTTAAATAAATACCTCGA-3′；
F3：5′-TGCCTTATAGGAATAGCGC-3′；
B3：5′-AGCATAAGTGAATTGACCCA-3′；
LB：5′-CTCCAGATTGTACGTCCTTCGT-3′。
所述的LAMP检测引物组合物在检测P.tentaculata的中的应用。
一种检测木香疫霉菌的LAMP检测试剂盒：包含1mL检测溶液，所述的检测溶液包括：32mM正向内引物FIP、32mM反向内引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物B3、8mM环引物LB、56mM dNTPs、0.8M Tris-HC、0.4mM KCl、0.4mM(NH4)2SO4、0.24mM MgSO4、4％Triton X-100、Bst DNA polymerase 320单位，180mM羟基萘酚蓝；其中，各引物序列具体如下：
FIP：5′-ATCGTACGGATTTTCTGAGCAAAGTAGATCCCGATTTCCATCAG-3′；
BIP：5′-TGGACGGCAAGACCATCAAGTCCGTTAGTTAAATAAATACCTCGA-3′；
F3：5′-TGCCTTATAGGAATAGCGC-3′；
B3：5′-AGCATAAGTGAATTGACCCA-3′；
LB：5′-CTCCAGATTGTACGTCCTTCGT-3′。
所述的检测木香疫霉菌的LAMP试剂盒在检测P.tentaculata的中的应用。
一种检测木香疫霉菌的方法，包括提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用所述的LAMP引物组合物进行LAMP；扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果(羟基萘酚蓝不会影响电泳结果)，如果存在特征性阶梯状条带，则证明所检测样品中存在P.tentaculata；羟基萘酚蓝(hydroxylnaphthol blue，HNB)属于金属离子指示剂的一种。HNB是Mg2+的滴定剂，其颜色随溶液pH变化而改变，因此可以通过监测LAMP反应体系中Mg2+浓度的变化及溶液pH而起到颜色指示剂的作用。反应前将HNB加入到反应液中，反应体系呈紫色，反应过程中Mg2+与LAMP反应的副产物P2O7 4-结合产生大量沉淀，溶液中Mg2+浓度降低，pH发生变化，从而使HNB的颜色由紫色变为天蓝色。因此，反应结束后通过反应体系的颜色变化，来判断P.tentaculata的有无：天蓝色表示检测为阳性，存在P.tentaculata；紫色表示检测结果为阴性，不存在P.tentaculata。
所述的检测P.tentaculata的方法，优选：提取待检微生物的DNA，取1μL DNA溶液，加入23μL所述的检测溶液和1μL灭菌去离子水进行LAMP，LAMP反应程序为：60～65℃，55～85min，优选64℃，80min；扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果(羟基萘酚蓝不会影响电泳结果)，如果存在特征性阶梯状条带，则证明所检测的病原为P.tentaculata；或者以羟基萘酚蓝的颜色变化做为结果判定标准，天蓝色表示检测为阳性，存在P.tentaculata；紫色表示检测结果为阴性，不存在P.tentaculata。
本发明的关键性技术之一是P.tentaculata的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。为了验证P.tentaculata的特异性引物序列，本发明以我国江苏、云南、山东和福建等省份的10株P.tentaculata菌株和12种其它卵菌以及19种病原真菌为供试材料(表1)。采用CTAB法提取发病组织中P.tentaculata的DNA。具体方法如下：取少量菌丝粉，加900μL2％CTAB提取液和90μL10％SDS，漩涡混匀，于55℃水浴1h，中间每10min上下颠倒几次。12000rpm离心10min，取上清加等体积酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，12000rpm离心10min；将上清转移至新管，加等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心5min。上清转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAc(pH5.2)，-20℃沉淀(>1h)。12000rpm离心10min，倾去上清，沉淀用70％乙醇洗涤两次，室温晾干。加适量灭菌超纯水或TE(pH8.0)溶解沉淀(含20μg/mL RNase)，37℃处理1h后，-20℃保存备用。所有的土壤样品采用SPIN试剂盒(Q-Biogene Ltd，USA)进行DNA的提取。土壤DNA提取步骤参见试剂盒说明书。这一商用土壤微生物DNA提取试剂盒可以在0.5h内提取到土壤中的微生物。当发生LAMP扩增反应时，产生大量的焦磷酸镁白色沉淀导致反应液的浊度上升，通过HNB的显色反应结果所示，P.tentaculata的反应管里均呈天蓝色，其为阳性结果，而其它疫霉种、真菌、腐霉和阴性对照菌反应管均呈紫色，为阴性结果，证明所设计的LAMP特异性引物具有种的特异性。同时，反应产物经2％琼脂糖凝胶电泳，成像观察扩增的反应产物，P.tentaculata的反应管中的反应液出现了典型阶梯形状条带，而其它疫霉种、真菌、腐霉和阴性对照菌反应管没有出现梯形条带。这说明该引物组可被用于生产实践中发病组织及土壤中P.tentaculata的快速可靠的检测盒鉴定。当用于发病组织中存在P.tentaculata时，采用NaOH快速裂解法提取P.tentaculata的DNA，具体过程如下：取一段发病的植株组织，每毫克组织加入10μL 0.5M NaOH，在研钵中充分研磨后转移至1.5mL的EP管中，12000rpm离心5min，取5μL上清液加入495μL0.1mM Tris(pH8.0)，混匀后取1μL直接用于PCR反应。每个反应至少重复三次，同时为确定植株中无PCR抑制物存在。
表1用于检测P.tentaculata特异性的真菌和卵菌菌株
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点和积极效果表现在：
1)实用性好。普通PCR反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩散，这是实验室污染的一个主要来源；而且溴化乙锭(EB)有巨毒，可累积致癌；长期观察紫外灯也会对实验人员造成一定程度的伤害。而LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行，反应结束之后通过HNB的颜色变化便可直接判断结果，从而增加了其在带菌的植株和土壤中检测的应用价值。
2)实现了恒温扩增，不像PCR法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源LAMP反应就可以发生，极大的扩展了LAMP使用的范围，LAMP之所以能在恒定的热源下发生反应是因为在LAMP反应液中添加了甜菜碱，使双链DNA处于解链的动态平衡中，在Bst DNA聚合酶的作用下实现扩增。
3)准确性高：由于传统P.tentaculata检测技术只是根据形态特征来确定检测对象，无法排除人为因素的干扰，很难区分形态相近种，检测准确性只有60-80％；而本发明根据P.tentaculata的Ypt1基因(Genbank登录号：HQ850014.1)的序列，该序列在P.tentaculata中的基因组进化区和保守区轮流间隔，利用Bioedit软件将P.tentaculata的Ypt1基因序列和其他疫霉种的序列进行比较，选取P.tentaculata特有的一段序列设计特异性的LAMP引物。LAMP反应通过4条引物(FIP、BIP、F3、B3)特异性识别靶序列上的6个独立区域，其特异性和灵敏度都比较高。此外，反向环引物LB能够提高反应速率，和其他四条引物一起，在确保反应准确性的情况下，使本发明能快速的进行P.tentaculata检测。
4)特异性好。本发明在设计引物时，尝试了多种基因靶标，如核糖体基因转录间隔区、转录延伸因子，肌动蛋白基因等，但都没有筛选到合适的。Ypt1基因的结构特点是编码区和非编码区交替出现，使得Ypt1基因的非编码区具有相对于其他检测靶标更多的变化的位点来作为大多数疫霉的分子标记，而且在同一个疫霉种内，Ypt1基因是十分保守的。因此，相对于其他靶标，采用Ypt1基因设计的疫霉种特异引物具有更好的特异性。最终，在比对Ypt1基因时，找到了比较特异的序列，以此为靶标通过软件得到多个备选引物。再针对这些备选引物进行预实验，最终确定了我们所用的特异性引物组。
5)操作方便，用途广。本发明提供的检测P.tentaculata的LAMP方法克服了现有技术中P.tentaculata的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，无法快速检测P.tentaculata的问题。本发明检测方法在64℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到P.tentaculata，不需要复杂仪器，能较好满足对P.tentaculata的现场检测，为P.tentaculataa的检测提供了新的技术平台，可用于P.tentaculata的高灵敏度快速检测，同时也可用于发病田块中疫病的早期诊断和病菌的监测。
附图说明
图1是颜色判定LAMP检测P.tentaculataa的特异性显色图；图中显示第1管以及第9管显天蓝色，呈阳性；其余管显紫色，呈阴性；其中，1，9：P.tentaculata；2：大豆疫霉(P.sojae)；3：寄生疫霉(P.parasitica)；4：辣椒疫霉(P.capsici)；5：草莓疫霉(P.fragariae)；6：致病疫霉(P.infestans)；7：苎麻疫霉(P.boehmeriae)；10：终极腐霉(Pythium ultimum)；11：木贼镰孢菌(Fusarium equiseti)；12：平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)；13：稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)；14：立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；15：大丽轮枝菌(Verticilium dahliae)；8，16：阴性对照；
图2是LAMP检测P.tentaculata的特异性的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M为100bpDNA marker；第1泳道以及第9泳道具有典型的梯形状条带，呈阳性；其余泳道呈阴性；1，9：P.tentaculata；2：大豆疫霉(P.sojae)；3：寄生疫霉(P.parasitica)；4：辣椒疫霉(P.capsici)；5：草莓疫霉(P.fragariae)；6：致病疫霉(P.infestans)；7：苎麻疫霉(P.boehmeriae)；10：终极腐霉(Pythium ultimum)；11：木贼镰孢菌(Fusarium equiseti)；12：平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)；13：稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)；14：立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；15：大丽轮枝菌(Verticilium dahliae)；8，16：阴性对照；
图3是LAMP检测P.tentaculata灵敏度的琼脂糖凝胶电泳图。LAMP反应能从P.tentaculata菌株中特异地扩增出梯形状的条带。电泳图表明LAMP反应的灵敏度达到1ng。M为100bp DNA marker，从左到右分别为25μL的反应体系中分别含有100ng、10ng、1ng、10pg、10pg、1pg、100fg、10fg DNA的扩增结果；
图4是颜色判定LAMP检测P.tentaculata的灵敏度显色图。25μL的反应体系中分别含有100ng、10ng、1ng P.tentaculata DNA的反应管显天蓝色，呈阳性反应，25μL的反应体系中分别含有100pg、10pg、1pg、100fg、10fg P.tentaculata DNA的反应管显紫色，呈阴性反应。显色结果表明LAMP反应的灵敏度达到1ng。
图5是木香病田土壤中病原物和发病木香组织中病原物的LAMP检测。1为阳性对照；2-4为感病木香周围病土中病原物的LAMP显色结果；5-7为为感病木香中病原物的LAMP显色结果,8为未侵染的土样的扩增结果；9为为提取健康木香组织DNA的扩增结果；10-11为阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明不受以下实施例的限制。
实施例1
一种用于检测P.tentaculata的LAMP检测试剂盒，所述的试剂盒优选包括1ml检测溶液，每毫升包括：32mM正向内引物FIP、32mM反向内引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物B3、8mM环引物LB、56mM dNTPs、0.8M Tris-HCl(pH8.8)、0.4mM KCl、0.4mM(NH4)2SO4、0.24mM MgSO4、4％Triton X-100、Bst DNApolymerase 320单位，180mM羟基萘酚蓝加入超纯水至总体积为1mL。各引物序列具体如下：
FIP：5′-ATCGTACGGATTTTCTGAGCAAAGTAGATCCCGATTTCCATCAG-3′；
BIP：5′-TGGACGGCAAGACCATCAAGTCCGTTAGTTAAATAAATACCTCGA-3′；
F3：5′-TGCCTTATAGGAATAGCGC-3′；
B3：5′-AGCATAAGTGAATTGACCCA-3′；
LB：5′-CTCCAGATTGTACGTCCTTCGT-3′。
其中，正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB也可直接构成用于检测P.tentaculata的LAMP检测引物组合物。
实施例2P.tentaculata LAMP反应的特异性试验
为了验证LAMP方法的特异性，以我国江苏、云南、山东和福建等省份的10株P.tentaculata菌株和12种其它卵菌以及19种病原真菌为供试材料，LAMP检测结果显示10株P.tentaculata菌株均可观察到天蓝色的阳性反应或者琼脂糖凝胶电泳出现LAMP阶梯状的条带，其余12种卵菌以及19种病原真菌显色结果为紫色的阴性反应或者琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带。选择与P.tentaculata不同种(寄生疫霉；大豆疫霉；辣椒疫霉；草莓疫霉；致病疫霉)和不同属的菌(终极腐霉；木贼镰刀菌；平头炭疽菌；稻瘟病菌；立枯丝核菌；大丽轮枝菌)的DNA作为模板，取1μL DNA溶液，加入23μL实施例1制备的检测溶液和1μL灭菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为：64℃80min。结果显示基于反应体系颜色反应做为结果判定标准，扩增P.tentaculata的DNA模板时，呈现天蓝色；扩增与P.tentaculata不同种、不同属的菌的DNA模板和阴性对照都呈现紫色(图1)；用LAMP引物扩增P.tentaculata的DNA模板时，都扩增出典型的阶梯状条带；而与P.tentaculata不同种、不同属的菌和阴性对照都没有能够扩增出目的条带(图2)。
实施例3P.tentaculata LAMP反应的灵敏度试验
为了确定LAMP检测方法的灵敏度，将提取的P.tentaculata的DNA用分光光度计测定浓度(1μg/μL)后用DEPC水进行10倍比稀释，-70℃保存作为模板。分别取10倍比稀释后的各浓度DNA稀释液1μL作为模板，加入23μL实施例1制备的检测溶液和1μL灭菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为：64℃80min。取2μL扩增产物上样，在2％琼脂糖凝胶上电泳,结果显示LAMP方法可以检测到浓度是1ng的P.tentaculata的DNA；HNB显色反应表明LAMP反应的灵敏度也达到1ng(图3、图4)。
实施例4P.tentaculata LAMP反应引物特异性验证和灵敏度验证
针对P.tentaculata的LAMP引物组，共设计了20组符合条件的引物，最终筛选出1组最为特异并灵敏度极高的引物即实施例1所采用的引物序列(包括正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3和反向环引物LB)。以设计的其余引物(仅随机从剩余20对引物中选1组来说明)为对照，具体引物序列如下：FIP1：5′-ACGACAATAATGCCGTGGGCGCTGGCCAGGAGCGTTTC-3′；BIP1：5′-CGATGTGACGGATCAGGAGTCGCGCACCTATCGATCTCGTG-3′；F31：5′-TGCTTCTGCAGTGGGACA-3′；B31：5′-TCCTTGTTACAAGGCGG-3′；LB1：5′-CTCCAGATTGTACGTCCTTCGT-3′；以实施例2中所用菌株为供试材料(10株P.tentaculata菌株和12种其它卵菌以及19种病原真菌)，并参照实施例2的方法进行LAMP检测，结果显示所选对照引物组的特异性不高，灵敏度也较差。说明用于本发明的引物组合物具有较高的特异性和灵敏度。
实施例5从带菌土样中检测P.tentaculata
一种检测P.tentaculata的方法，包括：
1)土壤中卵孢子的富集：取待检土壤样品20～100克，研碎，先后采用200目筛网去处较大土粒，然后经过400、500、800目筛网过滤，同时用3～10升水反复冲洗，从800目筛网上收集卵孢子，用1mL水悬浮。由于卵孢子不能透过800目筛网，这样处理可以达到使卵孢子富集的效果。
2)从微量卵孢子中提取DNA：将用无菌水悬浮的卵孢子转移到1.5mL的离心管中，在12000r.min-1转速下离心5分钟，倒出液体；加入50μL CTAB buffer，研磨，再加入500μL CTAB buffer，水浴30分钟；加入等体积氯仿抽提，在12000r.min-1转速下离心10分钟，吸取上清；加入1/10体积的3M NaAc，2倍体积的无水冰乙醇，室温沉淀30分钟，12000r.min-1转速下离心10分钟，倒干液体；加1mL70％(V/V)乙醇洗涤，12000r.min-1转速下离心10分钟，倒干液体，晾干至无酒精味；加10μL无菌双蒸水溶解，用于LAMP扩增的模板。
3)P.tentaculata LAMP检测，包括：取1μL DNA溶液，加入23μL的检测溶液和1μL灭菌去离子水，总体积为25μL；反应程序为：64℃80min；以HNB(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂，扩增结束后LAMP反应体系的颜色呈现天蓝色，以此判断从带菌土样中能够产生阳性反应含有P.tentaculata(图5)。
实施例6活体组织中病原菌的LAMP检测
采用NaOH碱裂解法提取接种P.tentaculata的发病植株的DNA，将其作为模板用于LAMP扩增。取1uL DNA溶液，按实施例5的方法，进行LAMP反应。结果显示接种P.tentaculata的发病植株中进行LAMP，其颜色反应也呈现阳性天蓝色；而健康植株和阴性对照呈现紫色(图5)。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京林业大学
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<220>
<223> F31引物序列
<400> 8
tgcttctgca gtgggaca 18
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> B31引物序列
<400> 9
tccttgttac aaggcgg 17
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> LB1引物序列
<400> 10
ctccagattg tacgtccttc gt 22
Claims (6)
1.一种用于检测木香疫霉菌的LAMP检测引物组合物，其特征在于：由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：
FIP：5′-ATCGTACGGATTTTCTGAGCAAAGTAGATCCCGATTTCCATCAG-3′；
BIP：5′-TGGACGGCAAGACCATCAAGTCCGTTAGTTAAATAAATACCTCGA-3′；
F3：5′-TGCCTTATAGGAATAGCGC-3′；
B3：5′-AGCATAAGTGAATTGACCCA-3′；
LB：5′-CTCCAGATTGTACGTCCTTCGT-3′。
2.权利要求1所述的LAMP检测引物组合物在检测P. tentaculata的中的应用。
3.一种检测木香疫霉菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于：包含1mL检测溶液，所述的检测溶液包括：32mM正向内引物FIP、32mM 反向内引物BIP、8mM正向外引物F3、8mM反向外引物B3、8mM环引物LB、56mM dNTPs、0.8M Tris-HC、0.4mM KCl、0.4mM（NH4）2SO4、0.24mM MgSO4、4%Triton X-100、Bst DNA polymerase 320单位，180mM羟基萘酚蓝；其中，各引物序列具体如下：
FIP：5′-ATCGTACGGATTTTCTGAGCAAAGTAGATCCCGATTTCCATCAG-3′；
BIP：5′-TGGACGGCAAGACCATCAAGTCCGTTAGTTAAATAAATACCTCGA-3′；
F3：5′-TGCCTTATAGGAATAGCGC-3′；
B3：5′-AGCATAAGTGAATTGACCCA-3′；
LB：5′-CTCCAGATTGTACGTCCTTCGT-3′。
4.权利要求3所述的检测木香疫霉菌的LAMP检测试剂盒在检测P. tentaculata的中的应用。
5.一种检测木香疫霉菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取待检微生物的DNA；
2）以提取的DNA为模板，利用LAMP检测引物组合物或LAMP检测试剂盒进行LAMP；
3）扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果，如果存在特征性阶梯状条带，则证明所检测样品中存在P. tentaculata；无特征性阶梯状条带，则所检测样品中无P. tentaculata；或进行步骤4）操作；
4）反应结束后通过反应体系的颜色变化，来判断P. tentaculata的有无：天蓝色表示检测为阳性，存在P. tentaculata；紫色表示检测结果为阴性，不存在P. tentaculata。
6.根据权利要求5所述的检测木香疫霉菌的方法，其特征在于：步骤2）中，取1μL DNA溶液，加入23μL所述的检测溶液和1μL灭菌去离子水进行LAMP，LAMP反应程序为：60~65℃，55~85min。
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