CN107012251A - 蜜蜂幼虫芽孢杆菌荧光定量pcr检测试剂盒及其应用 - Google Patents
蜜蜂幼虫芽孢杆菌荧光定量pcr检测试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及蜜蜂幼虫芽孢杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法，专用于蜜蜂幼虫芽孢杆菌的检测。该试剂盒包括：（1）阳性标准品；（2）阴性对照；（3）PCR反应液；（4）ExTaq酶；（5）无菌水。本发明具有以下优点：（1）良好的稳定性和特异性：对蜜蜂幼虫芽孢杆菌的检测具有高度特异性，与其它蜜蜂病原菌无交叉反应，且重复性好；（2）灵敏度高：灵敏度能达到20拷贝/μL；（3）操作简便、快速：整个反应可在2小时内完成。本发明试剂盒可用于蜜蜂美洲幼虫腐臭病的诊断及其蜜蜂幼虫芽孢杆菌的检测，对该病的早期预防和及时治疗具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法，属于动物卫生技术领域，适用于蜜蜂美洲幼虫腐臭病的诊断和监测及蜂产品中蜜蜂幼虫芽孢杆菌的检测。
背景技术
美洲幼虫腐臭病（American foulbrood，AFB）简称美腐病，是侵害蜜蜂幼虫的一种细菌性疾病。该病主要危害意蜂，在世界范围内均有发生，一旦暴发，会带来严重的经济损失。美腐病是我国从日本引进西方蜜蜂时带来的，在我国饲养的意蜂中经常发生，目前已在我国的十几个省市的蜂群中发现该病。被感染的蜜蜂幼虫平均在孵化后12.5天表现出症状，首先体色明显变化，从正常的珍珠白变黄、淡褐色、褐色甚至黑褐色，同时虫体不断失水干瘪，最后成紧贴于巢房壁的、黑褐色的、难以清除的鳞片状物。鉴于该病对养蜂业带来的严重危害，农业部和质检总局联合制定的最新的《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》将其列为二类传染病，世界动物卫生组织（OIE）也将其列为检疫对象。
美洲幼虫腐臭病的病原体为蜜蜂幼虫芽孢杆菌（Paenibacillus Larvae），是一种芽孢形式的革兰氏阳性细菌。产生的芽孢有7层结构包围，这种特殊构造使得幼虫芽孢杆菌的芽孢具有特别强的生命力，对热、化学物质等有极强的抵抗力，在高温干燥等恶劣环境下至少能存活35年。悬浮在蜂蜜中的芽孢阳光照射下能存活4周-6周。
蜜蜂幼虫芽孢杆菌的培养条件极其苛刻，不易分离培养，使得蜜蜂幼虫芽孢杆菌的分离变得很困难，其他方法也难于进一步推广使用，OIE也只推荐了PCR检测方法。而荧光定量PCR方法通过利用荧光探针使特异性进一步增强，直接显示扩增结果，而无需电泳检测，更缩短了检测时间。目前，检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒及其检测方法未见报道。
本发明利用蜜蜂幼虫芽孢杆菌16S rRNA特异的保守序列设计引物和探针，通过对反应体系的优化，研制用于检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的实时荧光定量PCR试剂盒及方法，弥补目前国内有关蜂类疫病检测的技术需求，保护国内蜂群和自然生态的健康发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法，弥补现有检测技术的不足，其具有特异性强、灵敏度高、操作简单的特点，能够对蜜蜂及其蜂产品中蜜蜂幼虫芽孢杆菌进行快速、准确的检疫和鉴定。
为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括正向引物PL-F、反向引物PL-R及TaqMan探针FL-P，各引物核苷酸序列如下：
正向引物PL-F：5’- TTCGGGAGACGCCAGGTTAG -3’，
反向引物PL-R：5’- AGCCGTTACCCTACCAACTAGC -3’；
TaqMan探针FL-P：5’- TCACTTACAGATGGGCCTGCGGCGCA -3’，
探针的 5’端和3’端分别采用荧光基团FAM和TAMRA进行修饰。
其中，该试剂盒的具体试剂组成为：
（1）阳性标准品：100 μL浓度为1×103拷贝/μL的阳性标准品1支，采用含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性标准品，-20℃保存；
（2）阴性对照：100 μL浓度为100 ng/μL的阴性对照1支，采用未感染蜜蜂幼虫芽孢杆菌的健康蜜蜂组织提取的总DNA为阴性对照样品，-20℃保存；
（3）PCR反应液：50个反应体系的PCR反应液组成成分为：2×PCR 缓冲液625μL，浓度为10 μmol/L的正向引物PL-F和反向引物PL-R各25 μL，浓度为5 μmol/L的TaqMan探针FL-P50 μL，浓度为10 mmol/L的dNTP 25μL，浓度为25 mmol/L的MgCl2 100μL，共计850 μL；-20℃保存；
（4）ExTaq酶：25 μL浓度为5 U/μL ExTaq酶1支，-20℃保存；
（5）无菌水：2 mL无菌水2支。
本发明的另一目的在于提供一种使用上述蜜蜂幼虫芽孢杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
（1）PCR反应体系配置：在PCR管中加入PCR反应液17.0 μL，5 U/μL ExTaq酶0.5 μL，待测样品DNA 2.0 μL，然后加入灭菌水5.5μL，使反应总体积为25.0μL；
（2）PCR反应程序：95℃预变性2 min；然后95℃变性5 s、64℃退火延伸30 s，共40个循环，在64℃进行单点荧光检测；
（3）结果判定：阴性对照无Ct值且无扩增曲线，同时阳性对照Ct值≤35，并且出现典型的扩增曲线，说明实验为有效实验，否则实验无效；在实验有效的情况下，待测样品无Ct值且无扩增曲线，表示样品中不含蜜蜂幼虫芽孢杆菌；待测样品Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含有蜜蜂幼虫芽孢杆菌；待测样品Ct值＞35，则对该样品重复检测：重复检测结果无Ct值则该样品不含蜜蜂幼虫芽孢杆菌；重复检测结果有Ct值则该样品中含有蜜蜂幼虫芽孢杆菌。
本发明具有以下优点：（1）良好的稳定性和特异性：本发明系选择蜜蜂幼虫芽孢杆菌16S rRNA基因保守片段为靶目标，不仅设计了一对特异性引物，而且还设计了一条特异性荧光探针，在荧光PCR反应过程中可以对靶目标进行双重控制，对蜜蜂幼虫芽孢杆菌的检测具有高度特异性，与其它蜜蜂病原菌无交叉反应，且重复性好；（2）灵敏度高：本发明采用TaqMan-TAMRA探针，通过反应体系和反应条件的优化，进一步提升其灵敏度，可达到20拷贝/μL；（3）操作简便、快速：实时荧光收集数据，不需要进行电泳检测核酸的扩增情况，整个反应可在2小时内完成。
附图说明
图1为实施例2的幼虫芽孢杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法的退火温度优化结果。当退火温度为64.5℃时，荧光强度最强，所以该试剂盒检测方法中最佳退火温度为64℃。
图2为实施例3的阳性标准品和阴性对照PCR扩增结果。其中M：100bp Ladder DNAMarker I；1：阳性标准品，大小约为196 bp；2：阴性对照。
图3为实施例4的蜜蜂幼虫芽孢杆菌阳性标准品荧光PCR的动力学曲线。图中横坐标代表荧光PCR扩增的循环数，纵坐标代表荧光信号强度；从右至左扩增曲线阳性标准品的浓度分别是2×101至2×109拷贝/μL。
图4为实施例4的蜜蜂幼虫芽孢杆菌阳性标准品实时荧光定量PCR的标准曲线。图中横坐标代表标准品拷贝数值，纵坐标代表PCR扩增循环数；标准曲线方程为Y= -3.398x+42.779；R代表相关系数，决定系数R2为0.998，扩增效率为97.932%。
图5为实施例5 蜜蜂幼虫芽孢杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的特异性测定结果。其中1：蜜蜂幼虫芽孢杆菌；2：蜂房蜜蜂球菌；3：蜜蜂球囊菌；4：蜜蜂副伤寒杆菌；5：黄曲霉菌；6：阴性对照。
图6为实施例6的临床样品检测结果。其中包括阳性对照、阴性对照和5份阳性样品。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
实施例1：
一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括正向引物PL-F、反向引物PL-R及TaqMan探针FL-P，其中正向引物PL-F序列为5’- TTCGGGAGACGCCAGGTTAG -3’，反向引物PL-R序列为5’- AGCCGTTACCCTACCAACTAGC -3’；TaqMan探针FL-P序列为5’-FAM-TCACTTACAGATGGGCCTGCGGCGCA -TAMRA-3’。该试剂盒包括下列试剂（50个反应体系）：
（1）阳性标准品：利用PL-F和PL-R引物扩增蜜蜂幼虫芽孢杆菌基因组DNA，将产物克隆至pMD-18T载体，转化DH5α大肠杆菌，利用碱裂解法提取阳性克隆质粒，计算质粒纯度和浓度后，10倍梯度稀释至1000拷贝/μL作为阳性标准品，100 μL /支，-20℃保存；
（2）阴性对照：100 μL浓度为100 ng/μL的阴性对照1支，采用未感染蜜蜂幼虫芽孢杆菌的健康蜜蜂组织提取的总DNA为阴性对照样品，-20℃保存；
（3）PCR反应液：50个反应体系的PCR反应液组成成分为：2×PCR 缓冲液625μL，浓度为10 μmol/L的正向引物PL-F和反向引物PL-R各25 μL，浓度为5 μmol/L的TaqMan探针FL-P50 μL，浓度为10 mmol/L的dNTP 25μL，浓度为25 mmol/L的MgCl2 100μL，共计850 μL；-20℃保存；
（4）ExTaq酶：25 μL浓度为5 U/μL ExTaq酶1支，-20℃保存；
（5）无菌水：2 mL无菌水2支。
实施例2：
幼虫芽孢杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法的退火温度优化
（1）PCR反应体系：在每一个PCR管中分别加入PCR反应液17.0 μL，5 U/μL ExTaq酶0.5μL，阳性对照2.0 μL，然后加入灭菌水5.5μL，使反应总体积为25.0μL；
（2）PCR优化反应程序：95℃预变性2 min；然后95℃变性5 s，55℃-65℃（梯度温度）退火延伸30 s，每个梯度温度设置3个重复，共40个循环。
（3）退火温度选择：退火温度优化结果如图2所示，退火温度为64.5℃时扩增产物荧光强度最高，因此选择64℃作为该试剂盒反应程序的退火温度。
实施例3：
使用蜜蜂幼虫芽孢杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
（1）PCR反应体系配置：在PCR管中加入PCR反应液17.0 μL，5 U/μL ExTaq酶0.5 μL，待测样品DNA 2.0 μL，然后加入灭菌水5.5μL，使反应总体积为25.0μL；
（2）PCR反应程序：95℃预变性2 min；然后95℃变性5 s、64℃退火延伸30 s，共40个循环，在64℃进行单点荧光检测；
（3）结果判定：阴性对照无Ct值且无扩增曲线，同时阳性对照Ct值≤35，并且出现典型的扩增曲线，说明实验为有效实验，否则实验无效。在实验有效的情况下，待测样品无Ct值且无扩增曲线，表示样品中不含蜜蜂幼虫芽孢杆菌；待测样品Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含有蜜蜂幼虫芽孢杆菌；待测样品Ct值＞35，则对该样品重复检测：重复检测结果无Ct值则该样品不含蜜蜂幼虫芽孢杆菌；重复检测结果有Ct值则该样品中含有蜜蜂幼虫芽孢杆菌。
实施例4：
蜜蜂幼虫芽孢杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒检测标准曲线的建立
（1）标准品DNA稀释：将含有目的片段的阳性克隆质粒用无菌水10倍递增稀释成2×109拷贝/μL ~2×101拷贝/μL的一系列DNA标准品。
（2）标准曲线方程建立：以稀释后的DNA标准品为模板，每个标准样品处理重复3次，并以未感染蜜蜂幼虫芽孢杆菌的健康蜜蜂组织总DNA为对照，以无菌水为空白对照。按实施例3所述方式配置25 μL的实时荧光定量PCR反应体系并进行实时荧光定量PCR反应；获得如图3所示的扩增曲线，然后绘制如图4所示的标准曲线，构建标准曲线方程。本实施例构建的标准曲线方程为Y= -3.398x+42.779，决定系数R2为0.998，扩增效率为97.932%，检测灵敏度可达到20拷贝/μL，满足荧光PCR正常的标准曲线要求。
实施例5：
蜜蜂幼虫芽孢杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的特异性测定
分别以蜜蜂幼虫芽孢杆菌、蜂房蜜蜂球菌、蜜蜂球囊菌、蜜蜂副伤寒杆菌和黄曲霉菌等5种常见的蜜蜂病原菌为样品，按常规方法提取DNA后以实施例3的方法进行PCR反应和结果判定，由图5可知，仅蜜蜂幼虫芽孢杆菌有产生典型的扩增曲线（Ct值为15.10），其他样品均无扩增曲线，说明本试剂盒具有较强的特异性。
实施例6：
临床样品蜜蜂幼虫芽孢杆菌的检测
利用本试剂盒对临床分离的5份感染蜜蜂幼虫芽孢杆菌的蜜蜂阳性样品进行检测，按照CTAB方法提取各个样品总DNA后根据实施例3的方法进行检测。结果如图6所示，5份样品均为阳性，Ct值均在18~30之间，阳性对照为12.09，阴性对照无Ct值，与预期结果相一致。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 蜜蜂幼虫芽孢杆菌荧光定量PCR检测试剂盒及其应用
<130> 3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 正向引物PL-F
<400> 1
ttcgggagac gccaggttag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 反向引物PL-R
<400> 2
agccgttacc ctaccaacta gc 22
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> TaqMan探针FL-P
<400> 3
tcacttacag atgggcctgc ggcgca 26
Claims (3)
1.一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：包括正向引物PL-F、反向引物PL-R及TaqMan探针FL-P，各引物核苷酸序列如下：
正向引物PL-F：5’-TTCGGGAGACGCCAGGTTAG-3’，
反向引物PL-R：5’-AGCCGTTACCCTACCAACTAGC-3’；
TaqMan探针FL-P：5’-TCACTTACAGATGGGCCTGCGGCGCA-3’，
探针的 5’端和3’端分别采用荧光基团FAM和TAMRA进行修饰。
2.根据权利要求1所述的一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒由下列试剂组成：
（1）阳性标准品：100 μL浓度为1×103拷贝/μL的阳性标准品1支，采用含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性标准品，-20℃保存；
（2）阴性对照：100 μL浓度为100 ng/μL的阴性对照1支，采用未感染蜜蜂幼虫芽孢杆菌的健康蜜蜂组织提取的总DNA为阴性对照样品，-20℃保存；
（3）PCR反应液：50个反应体系的PCR反应液组成成分为：2×PCR 缓冲液625μL，浓度为10 μmol/L的正向引物PL-F和反向引物PL-R各25 μL，浓度为5 μmol/L的TaqMan探针FL-P50 μL，浓度为10 mmol/L的dNTP 25μL，浓度为25 mmol/L的MgCl2 100μL，共计850 μL；-20℃保存；
（4）ExTaq酶：25 μL浓度为5 U/μL ExTaq酶1支，-20℃保存；
（5）无菌水：2 mL无菌水2支。
3.利用权利要求1或2所述的蜜蜂幼虫芽孢杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）PCR反应体系配置：在PCR管中加入PCR反应液17.0 μL，5 U/μL ExTaq酶0.5 μL，待测样品DNA 2.0 μL，然后加入灭菌水5.5μL，使反应总体积为25.0μL；
（2）PCR反应程序：95℃预变性2 min；然后95℃变性5 s、64℃退火延伸30 s，共40个循环，在64℃进行单点荧光检测；
（3）结果判定：阴性对照无Ct值且无扩增曲线，同时阳性对照Ct值≤35，并且出现典型的扩增曲线，说明实验为有效实验，否则实验无效；在实验有效的情况下，待测样品无Ct值且无扩增曲线，表示样品中不含蜜蜂幼虫芽孢杆菌；待测样品Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含有蜜蜂幼虫芽孢杆菌；待测样品Ct值＞35，则对该样品重复检测：重复检测结果无Ct值则该样品不含蜜蜂幼虫芽孢杆菌；重复检测结果有Ct值则该样品中含有蜜蜂幼虫芽孢杆菌。
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| CN114075608A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-02-22 | 山东省农业科学院 | 基于实时荧光pcr技术检测中药金银花白绢病的试剂盒 |
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-
2017
- 2017-05-19 CN CN201710354486.2A patent/CN107012251A/zh active Pending
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