CN101805795A - 大豆疫霉的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种大豆疫霉的检测试剂盒及其检测方法，解决现有技术中大豆疫霉的生物学检测方法所需周期长(15-20天)、特异性差(50-100卵孢子/克土)的问题，属于农作物防病治病及植物检疫范畴。利用本发明引物、试剂盒及方法对大豆疫霉进行PCR检测，实用性强，准确性和灵敏性高。

Description

大豆疫霉的检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种大豆疫霉的检测试剂盒及其检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉菌(Phytophothora sojae)引起的，是分布广泛、危害极严重的土传性病害。是我国对外公布的A1类进境植物检疫对象。该病1948年首次发现于美国的印第安那州，1955年公开报道后，在世界大豆主产国巴西、阿根廷、加拿大等15个国家先后发现该病。仅在1989至1991年的3年中，大豆疫病在美国中北部的12个州即造成279万吨的产量损失，经济价值高达5.6亿美元。

1989年北京农业大学沈崇尧等首次在我国东北地区发现了大豆疫霉病菌，目前已在北京、山东、吉林、内蒙古等地发现了疫霉根腐病。黑龙江省植保站1997、1998两年对黑龙江省大豆疫病发生情况进行普查，结果表明仅黑龙江省发病面积已超过30万公顷，占全省大豆播种面积的15％。该病已由初发生阶段向盛发生阶段转化，是一个急需解决的问题。

近年来，我国从美国等有大豆疫霉分布的国家进口商品大豆日趋增多，每年从境外进口大豆的数量几乎超过了国产大豆的总量，其中经常夹带一定量的土壤。由于大豆疫霉是典型的土传真菌病害，卵孢子能在土壤中长期生存，因此进境大豆夹带的土壤中极有可能携带大豆疫霉病菌。国内外大豆的频繁贸易增加了大豆疫病传播扩散的风险，这种严峻的形势要求应尽快建立一套快速灵敏的检测方法。

虽然有直接从土壤分离和检测大豆疫霉的报道，但实际上，由于种植大豆的土壤中也往往含有大量的腐霉等腐生真菌，能选择性地抑制多种腐霉菌的恶疫灵(hymexazo)也强烈抑制大豆疫霉，因而从土壤中直接分离和检测大豆疫霉极为困难，成功率较小；种子也可能是大豆疫霉传播的途径之一，但从干燥甚至稍微阴干的带病大豆种子中分离不到病原，或需经2个月的湿冷处理才能使病种子中的卵孢子萌发，不适合检疫检验；酶联免疫荧光(ELISA)虽已广泛地应用于疫霉病害的检测和诊断，但所用抗体缺乏种的特异性，甚至能和某些腐霉和霜霉菌发生交叉反应，检测到的病原也有可能是死的，也不适合检疫检验；采用土壤浸泡后用大豆幼苗、子叶或叶碟(leafdisc)诱集(baiting)的方法可有效地检测到土壤中活的大豆疫霉，也是目前海关检疫部门的主要检测手段，但这种生物学检测方法约需15-20天，而且灵敏度低，每克土壤需含有50个以上的卵孢子，因此难以适合外检和内检的需求。

PCR技术具有快速和灵敏的优点，在病原物的鉴定和检测中的地位越来越重要。近年来，一些疫霉菌的PCR检测方法被开发出来。这些方法中设计的引物的来源主要都是转录间隔区(ITS)(Cooke et al.，1995a，b；Bonants et al.，1997；Tooley et al.，1997；Trout etal.，1997；Liew et al.，1998；Tooley et al.，1998；Schubert et al.，1999；Bonants et al.，2000；Judelson&Tooley，2000；Winton&Hansen，2001；Grote et al.，2002；Ippolito et al.，2002)或者elicitin基因(Coelho et al.，1997；Lacourt&Duncan，1997；Kong et al.，2003b)。这些区域或者基因在基因组中都是高拷贝的，所以很容易被检测到。但是越来越多的研究发现，部分疫霉种的ITS序列差异很小，以此为靶标设计的引物难以将不同种区分开来。Wang等(2006)根据ITS序列设计大豆疫霉特异性引物时发现，大豆疫霉与P.melonis的ITS序列的相似性高达97％，大豆疫霉的特异性引物3’末端仅仅与P.melonis的相应序列相差1个碱基，需要将退火温度提高到66℃以上才能将这两种疫霉区分开来，但是过高的退火温度会降低PCR反应的灵敏度。而且提高退火温度并不能彻底解决此问题，当P.melonis的浓度较高时仍然会造成假阳性的现象。此外，由于ITS的拷贝数非常高，导致应用该靶标位点进行病原菌的定量检测不够准确。因此筛选新的分子靶标，是改进大豆疫霉检测技术的重要途径。

除了ITS序列和elicitin基因之外，有研究者将线粒体基因Cox1、Cox2(Martin et al.，2004)和可能编码储存蛋白的Lpv基因(Kong et al.，2003a)分别作为P.ramorum和P.cinnamomi检测的靶标。大豆疫霉和P.melonis的线粒体基因的相似性也比较高，要设计区分二者的引物比较困难。而Lpv基因在除了隐地疫霉之外的其他疫霉中的研究比较少，不像ITS序列那样几乎所有的疫霉种都可以从GenBank中获取其序列。Schena和Cooke(2006)的研究为疫霉菌的检测开启了一扇新的大门。Schena等(2006)成功地利用Ypt1基因作为靶标对P.ramorum、P.kernoviae、P.citricola和P.quercina这四种疫霉进行检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是解决现有技术中大豆疫霉的生物学检测方法所需周期长(15-20天)、特异性差(50-100卵孢子/克土)的问题，为此，本发明提供了大豆疫霉的检测引物、试剂盒及方法，对大豆疫霉进行PCR检测，实用性强，准确性和灵敏性高。

本发明提供的技术方案是：一种用于检测大豆疫霉的引物，其为大豆疫霉的特异性引物，即PsYpt3F/PsYpt2R：其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述。

一种检测大豆疫霉的试剂盒，其特征在于：包含上述的PsYpt3F/PsYpt2R引物。

上述的试剂盒，还包含4种dNTP，Tris.Cl溶液、KCl溶液、MgCl₂溶液、dNTPs、BSA、Taq DNA聚合酶。

本发明还公开了一种利用上述的引物检测大豆疫霉的方法，其检测过程是：提取待测样品DNA作为模板，进行PCR扩增，其中，PCR扩增程序为94℃变性5分钟，94℃变性1分钟；60℃退火30秒；72℃延伸1分钟；35个循环，最后72℃延伸10分钟；然后检测扩增产物：取扩增产物，在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为50-100V，30分钟后在紫外光下检测结果，如果存在分子量约为220bp的DNA条带，则证明所检病原为大豆疫霉。

为提高检测的灵敏度，本发明还提供了另一种用于检测大豆疫霉的引物，其包括两对引物，第一对引物即：PsYpt3F/PsYpt2R，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，第二对引物为疫霉属通用引物，即：Ypt1F/Ypt1R，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所述。

本发明还提供另一种检测大豆疫霉的试剂盒，其包含上述的第一对引物和和第二对引物。

本发明还提供另一种检测大豆疫霉的方法，其具体过程是：提取待测样品的DNA，利用上述的两对引物进行套式PCR反应，第一轮PCR反应的模板为提取待测样品的DNA，引物为所述的第二对引物，第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR反应产物，引物为所述的第一对引物，取第二轮PCR反应扩增产物进行凝胶电泳，如果存在分子量约为220bp的DNA条带，则证明所检样品中含有大豆疫霉。

同时本发明还公开了一种用于检测大豆疫霉的PCR反应体系，以总体积1mL计，其包括：模板DNA若干、0.05mmol Tris.Cl、0.125mmol KCl、0.005mmol MgCl₂、0.01mmoldNTPs、0.25mmol所述的PsYpt3F/PsYpt2R引物、0.1mgBSA、100单位Taq DNA聚合酶，余量为灭菌去离子水。

本发明还公开了另一种用于检测大豆疫霉的套式PCR反应体系，其包括第一轮PCR反应体系和第二轮PCR反应体系，其中，第一轮PCR反应体系：以总体积25ul计，其包括：5μL DNA模板，10μL权利要求4所述试剂盒溶液，10μL灭菌去离子水，引物为所述的疫霉属通用引物pt1F/Ypt1R；第二轮PCR反应体系：以总体积25ul计，其包括：5μL DNA模板，10μL上述的试剂盒溶液，10μL灭菌去离子水，引物为所述的特异性引物PsYpt3F/PsYpt2R，其中，第二轮PCR反应体系中的模板DNA为所述第一轮PCR反应产物。

本发明分析了大豆疫霉和其他疫霉菌在Ypt1基因序列上的差异，设计了新的特异性引物，在此基础上建立了检测大豆疫霉的PCR体系，本发明具有如下优点：

(1)实用性好：用卵孢子富集的方法检测含卵孢子土壤具重要的实际应用价值。大豆疫霉随贸易往来最可能的传播途径是随大豆中的尘土传播，在贸易口岸中，检疫部门也正是通过检测口岸大豆尘土中是否存在卵孢子作为重要指标。但事实上，在贸易口岸中截获的“土壤”中，不可能含很多的卵孢子，因此海关目前所用的大豆叶碟法很难有效地进行检测。此外目前的方法由于需要将病原菌卵孢子萌发、诱捕、分离鉴定等过程，需要约15-20天的时间，根本无法满足海关检疫的需要。为了使我们的检测方法更具有实际应用价值，我们在检测方法上作了如下改进，随机取30-50g带菌土样。把土壤碾碎以后，先用200目筛网除去较大的颗粒，再过400目筛网，最后用500、800目筛网加水冲洗，由于卵孢子不能透过800目筛网，这样通过700目筛网达到了使卵孢子富集的效果，富集以后的土壤经过核酸抽取后直接进行PCR扩增，可在1天之内达到对大豆疫霉的检测。因此本方法大大提高了检测效率。

(2)准确性高：由于传统大豆疫霉检测技术只是根据形态特征来确定检疫对象，无法排除人为因素的干扰，很难区分形态相近种，检测准确性只有60-80％；而本发明根据大豆疫霉的Ypt1基因序列，同时包含保守与变异序列，利用Bioedit软件对这些DNA序列进行比较，选定的大豆疫霉特有的一段保守序列做特异引物。能根据变异序列设计特异性引物进行扩增比较，为病原菌的鉴定和检测提供了很好的靶位点。经过与大豆疫霉近似种以及其他不同植物病原菌的比较，该引物的准确率为100％。

(3)灵敏度高：传统大豆疫霉检测技术首先要进行卵孢子的萌发，释放游动孢子后再进行诱捕，由于大豆疫霉菌卵孢子萌发率只有10-30％，因此只有土壤中卵孢子量超过每克土50-100个时才有可能检出。本发明提供的大豆疫霉的特异引物检测方法及其高效准确的检测试剂盒，由于可以有效的富集卵孢子，而且PCR扩增的高灵敏度，使得本研究的方法可以有效地从每克含有1个卵孢子的土壤中检测出卵孢子。

附图说明

图1为特异引物PsYpt3F/PsYpt2R扩增大豆疫霉的电泳图，其中，泳道3-24为22个P.sojae菌株扩增结果，泳道2为阴性对照。

图2为大豆感病组织的检测结果，其中，泳道1为2000bp DNA marker；泳道2为阳性对照；泳道3为阴性对照；泳道4-5为接种大豆中大豆疫霉的扩增结果；泳道6为提取健康大豆组织DNA的扩增结果；泳道7为提取健康大豆植株DNA，用引物ITS1/ITS4扩增的结果(空白对照)。

图3a为引物PsYpt3F/PsYpt2R扩增不同浓度游动孢子的灵敏度结果，其中，泳道1为2000bp DNA marker；泳道2为阴性对照；泳道3-6为25μl的反应体系中分别含有1000个、100个、10个、1个游动孢子DNA的扩增结果。

图3b为以引物Yph1F/Yph2R和PsYpt3F/PsYpt2R组合进行套式PCR反应的灵敏度结果，其中，泳道1为2000bp DNA marker；泳道2为阴性对照；泳道3-6为25μl的反应体系中分别含有1000个、100个、10个、1个游动孢子DNA的扩增结果。

图4a为引物PsYpt3F/PsYpt2R扩增不同浓度卵孢子的灵敏度结果，其中，泳道1为2000bp DNA marker；泳道2为阴性对照；泳道3-5为25μl的反应体系中分别含有100个、10个、1个卵孢子DNA的扩增结果。

图4b不以引物Yph1F/Yph2R和PsYpt3F/PsYpt2R组合进行套式PCR反应的灵敏度结果，其中，泳道1为2000bp DNA marker；泳道2为阴性对照；泳道3-5为25μl的反应体系中分别含有100个、10个、1个卵孢子DNA的扩增结果。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例1：设计、合成引物并建立大豆疫霉检测试剂盒的PCR反应体系

一、引物设计与合成

设计大豆疫霉的特异性引物PsYpt3F/PsYpt2R：

PsYpt3F(20bp)：5’-TACCAATAATCAGAAGCGTA-3’(SEQ ID NO.1)；

PsYpt2R(18bp)：5’-CCTTGTCTGCCCTCTCGA-3’(SEQ ID NO.2)。

同时，还设计了疫霉属的Ypt1通用引物Yph1F/Yph1R(具体见核苷酸序列表SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4)作为套式PCR的一轮反应引物：

Yph1F(20bp)：5’-CGACCATTGGCGTGGACTTT-3’(SEQ ID NO.3)；

Yph1R(20bp)：5’-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3’(SEQ ID NO.4)。

所有引物委托Invitrogen公司合成。

二、建立PCR反应体系

1、建立常规PCR反应体系

1mL常规PCR反应体系中包括：模板若干、0.05mmol Tris.Cl、0.125mmol KCl、0.005mmol MgCl₂、0.01mmoldNTPs、大豆疫霉的特异引物PsYpt3F/PsYpt2R 0.25mmol、0.1mgBSA、100单位Taq DNA聚合酶，余量为超纯水。

2、建立套式PCR反应体系

为了提高检测灵敏度，进一步建立了套式PCR反应体系。以疫霉菌Ypt1基因通用引物Yph1F/Yph1R作为第一轮反应引物与特异引物PsYpt3F/PsYpt2R分别组合进行套式PCR。

1mL第一轮PCR反应的混合液，包括：模板若干、0.05mmol Tris.Cl、0.125mmol KCl、0.005mmol MgCl₂、0.01mmoldNTPs、疫霉属的通用引物Yph1F/Yph1R 0.25mmol、0.1mgBSA、100单位Taq DNA聚合酶。

1mL第二轮PCR反应的混合液，包括：模板若干、0.05mmol Tris.Cl、0.125mmol KCl、0.005mmol MgCl ₂、0.01mmoldNTPs、大豆疫霉的特异引物PsYpt3F/PsYpt2R 0.25mmol、0.1mgBSA、100单位Taq DNA聚合酶，其中，第二轮PCR反应的模板为第一轮反应的扩增产物。

实施例2：检测土壤样品中大豆疫霉

从海关进境大豆带菌土样中检测大豆疫霉，检测过程如下：

1、富集土壤中卵孢子：

取待检土壤样品20-100克，研碎，先采用200目筛网去除较大土粒，然后经过400、500、800目筛网过滤，同时用3-10升水反复冲洗，从800目筛网上收集卵孢子，用1ml无菌水悬浮。由于卵孢子不能透过800目筛网，这样处理可以达到使卵孢子富集的效果。

2、从微量卵孢子中提取DNA：

将用无菌水悬浮的卵孢子转移到1.5mL的离心管中，在12000r.min^-1转速下离心5分钟，倒出液体；

加入50μL CTAB buffer，研磨，再加入500μL CTAB buffer，水浴30分钟；

加入等体积氯仿抽提，在12000r.min^-1转速下离心10分钟，吸取上清；

加入1/10体积的3M NaAc，2倍体积的无水冰乙醇，室温沉淀30分钟，12000r.min^-1转速下离心10分钟，倒干液体；

加1mL 70％(V/V)乙醇洗涤，12000r.min^-1转速下离心10分钟，倒干液体，晾干至无酒精味；

加10μL无菌双蒸水溶解，用于以下的PCR扩增。

3、大豆疫霉的PCR检测

(1)采用实施例1中的常规PCR反应体系检测

取1μL DNA溶液，加入9μL常规PCR反应体系溶液和15μL灭菌去离子水，总体积为25μL。PCR扩增程序为94℃变性5分钟，94℃变性1分钟；60℃退火30秒；72℃延伸1分钟；35个循环，最后72℃延伸10分钟。

扩增产物的电泳检测：取10μL PCR扩增产物，在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为50-100V，30分钟后在紫外光下检测结果。如果存在分子量约为220bp的DNA条带，则证明所检病原为大豆疫霉。检测结果见图4a，图4a中，3-5泳道为25μl的反应体系中分别含有100个、10个、1个卵孢子DNA的扩增结果。

(2)采用实施例1中的套式PCR反应体系检测

第一轮PCR反应：取1μL DNA溶液，加入9μL第一轮PCR反应混和溶液和15μL灭菌去离子水，总体积为25μL。PCR扩增程序为94℃变性5分钟，94℃变性1分钟；60℃退火30秒；72℃延伸1分钟；35个循环，最后72℃延伸10分钟。

第二轮PCR反应：取1μL第一轮PCR反应的扩增产物，加入9μL第二轮PCR反应混和溶液和15μL灭菌去离子水，总体积为25μL。PCR扩增程序为94℃变性5分钟，94℃变性1分钟；60℃退火30秒；72℃延伸1分钟；35个循环，最后72℃延伸10分钟。

扩增产物的电泳检测：取10μL第二轮PCR扩增产物，在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为50-100V，30分钟后在紫外光下检测结果。如果存在分子量约为220bp的DNA条带，则证明所检病原为大豆疫霉。检测结果见图4b，图4b中，3-5泳道为25μl的反应体系中分别含有100个、10个、1个卵孢子DNA的扩增结果。

实例3：从污染水中检测大豆疫霉的游动孢子

取大豆疫霉污染的灌溉水500mL，在6000g的离心力下离心20min，倒去上清液，沉淀的游动孢子用100uL水悬浮，转入1.5mL离心管，加入0.05g石英砂，涡旋震荡10sec，取1uL游动孢子破碎液为模板，按照实施例2的方法进行基因扩增，可以扩增出大豆疫霉特有的片断，结果见图3a和图3b。其中，图3a为引物PsYpt3F/PsYpt2R扩增不同浓度游动孢子的灵敏度；图3b为引物Yph1F/Yph2R和PsYpt3F/PsYpt2R组合进行套式PCR反应扩增不同浓度游动孢子的灵敏度；泳道1为2000bp DNA marker；泳道2为阴性对照；泳道3-6为25μl的反应体系中分别含有1000个、100个、10个、1个游动孢子DNA的扩增结果。

实例4：从发病大豆组织中鉴定大豆疫霉

将有水浸状病斑的大豆叶片或根茎部位用70％酒精消毒后，采用CTAB法或者碱裂解法提取DNA，吸取1uLDNA溶液，按实施例2常规PCR扩增方法，进行PCR扩增，电泳检测扩增产物，如果为大豆疫霉侵染引起的疫病，则可见一条清晰的分子量为220bp的特异性条带，结果见图2，其中，泳道2、4、5为大豆疫霉侵染样品。

实例5：从发病大豆组织中鉴定大豆疫霉

用特异引物PsYpt3F/PsYpt2R对26个疫霉种、30个其它种的菌株共计164株进行了常规PCR扩增，特异性引物PsYpt3F/PsYpt2R只能从供试的22个P.sojae菌株中特异地扩增出一条220bp的条带，结果见图1，其中，泳道3-24为22个P.sojae菌株样品，泳道2为阴性对照。表明该引物具有种的特异性，可以将P.sojae和其它近似种及其它相关种区分开。

核苷酸序列表

<110>南京农业大学

<120>大豆疫霉的检测试剂盒及其检测方法

<160>4

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>1

TACCAATAAT CAGAAGCGTA      20

 

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>2

CCTTGTCTGC CCTCTCGA        18

 

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>3

CGACCATTGG CGTGGACTTT    20

 

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>4

ACGTTCTCGC AGGCGTATCT    20

Claims (10)

1.一种用于检测大豆疫霉的引物，其特征在于：其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述。

2.一种检测大豆疫霉的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的引物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包含4种dNTP，Tris.Cl溶液、KCl溶液、MgCl₂溶液、BSA、Taq DNA聚合酶。

4.一种利用权利要求1所述的引物检测大豆疫霉的方法，其特征在于：提取待测样品DNA作为模板，进行PCR扩增；PCR扩增程序为94℃变性5分钟，94℃变性1分钟；60℃退火30秒；72℃延伸1分钟；35个循环，最后72℃延伸10分钟；然后取扩增产物进行检测，如果存在分子量约为220bp的DNA条带，则证明所检病原为大豆疫霉。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：对PCR反应扩增产物的检测为凝胶电泳检测。

6.一种用于检测大豆疫霉的引物，其特征在于：包括两对引物，第一对引物其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，第二对引物其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所述。

7.一种检测大豆疫霉的试剂盒，其特征在于：包含权利要求6所述的引物。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：还包含4种dNTP，Tris.Cl溶液、KCl溶液、MgCl₂溶液、BSA、Taq DNA聚合酶。

9.一种利用权利要求6所述的引物检测大豆疫霉的方法，其特征在于：提取待测样品的DNA，进行套式PCR反应，第一轮PCR反应的模板为提取待测样品的DNA，引物为所述的第二对引物，第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR反应产物，引物为所述的第一对引物，取第二轮PCR反应扩增产物进行检测，如果存在分子量约为220bp的DNA条带，则证明所检样品中含有大豆疫霉。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：对PCR反应扩增产物的检测为凝胶电泳检测。

Images