CN103627798B - 一种多重pcr法检测水稻病原细菌的引物组及试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多重PCR法检测水稻病原细菌的引物组及试剂盒和方法。引物组包括六对引物，第一对引物的碱基序列如SEQ ID No.1～2所示，第二对引物的碱基序列如SEQ ID No.3～4所示，第三对引物的碱基序列如SEQ ID No.5～6所示，第四对引物的碱基序列如SEQ ID No.7～8所示，第五对引物的碱基序列如SEQ ID No.9～10所示，第六对引物的碱基序列如SEQ ID No.11～12所示。利用本发明的引物组和试剂盒能实现对六种水稻病原细菌的一次性检测，检测结果准确、快速、灵敏、特异稳定，大大节约了时间和成本。
Description
技术领域
本发明属于水稻病原细菌检测技术领域，具体涉及一种多重PCR法检测水稻病原细菌的引物组及试剂盒和方法。
背景技术
水稻是最重要的粮食作物，世界上一半人口以水稻为生。随着水稻种质资源的调运日益频繁，一些水稻病害随种子调运而严重扩散，对稻米产量造成了不可挽回的损失。因此，重视并加强检验检疫工作，对切实保障稻米生产安全及产地生态安全有着重要的意义。此外，我国加入WTO后，在植物出入境检疫方面亦面临着空前的挑战。为确保我国农业的可持续发展，必须一方面有效制止病虫害传入我国，另一方面则要保证我国出口的农产品符合进口国的要求。而这些检疫、防疫工作的落实则依赖灵敏、准确以及便捷的病原检测技术的发展和应用。
细菌性病害是国内外水稻生产的主要障碍，水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo）、水稻细菌性条斑病菌（X.oryzae pv.oryzicola,Xoc）、水稻细菌性谷枯病菌（Burkholderia glumae）、水稻细菌性谷腐病菌（B.gladioli）、水稻细菌性褐条病菌（Acidovorax avenae subsp.Avenae,Aaa）以及水稻叶鞘细菌性褐腐病菌（Pseudomonas fuscovaginae）是六种最主要的水稻细菌病害，对世界和中国的水稻生产造成了重大的经济损失。其中，水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌和水稻细菌性谷枯病菌被列为我国出入境检验检疫名录和全国植物检疫性有害生物名单。由于这六种病原细菌均可通过种子进行传播，现许多国家检疫部门都加大了检疫力度。然而这六种病原细菌通常情况下会在同一水稻产区同时发生，在田间很难区分。更重要的是，当多种病原共同发生时，部分病原菌会潜伏于病株中，暂不表现症状，待环境条件成熟而大面积爆发。特别是水稻细菌性谷枯病菌和水稻细菌性谷腐病菌、水稻细菌性褐条病与水稻细菌性褐斑病的田间症状极为相似，稻农和一般技术人员很难用常规的方法直接区分，进而导致防治措施没有针对性，植物检疫无法落到实处，而造成重大损失。对田间这六种细菌性病害的早期诊断与植物检疫检测刻不容缓。
传统病害诊断采用肉眼症状识别、病原菌分离、革兰氏染色、生理生化反应特性测定、BILOG等鉴定方法，单单检测一种菌的周期就长达一月，过程繁琐，且检测结果不一定可靠。若要分别检测六种病原菌，则更加费时费力，成本极高。
多重PCR技术作为一种新型的病害分子诊断和病原检测手段，利用特异性引物同时检测六种病原菌，且检测的准确性和灵敏度高，能有效地弥补单一菌检测的缺陷。但目前国内外尚未有利用该类技术在植物上同时检测六种不同属病原细菌的先例。
发明内容
本发明提供了一种多重PCR法检测水稻病原细菌的引物组，利用该引物组可同时对六种水稻病原细菌进行快速、灵敏、准确的检测。
多重PCR法检测水稻病原细菌的引物组，包括六对引物，其中：
第一对引物的碱基序列如SEQ ID No.1～2所示，用于检测水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas.oryzae pv.oryzicola，Xoc）；
第二对引物的碱基序列如SEQ ID No.3～4所示，用于检测水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo）；
第三对引物的碱基序列如SEQ ID No.5～6所示，用于检测水稻细菌性褐条病菌（Acidovorax avenae subsp.avenae，Aaa）；
第四对引物的碱基序列如SEQ ID No.7～8所示，用于检测水稻细菌性谷枯病菌（Burkolderia glumae）；
第五对引物的碱基序列如SEQ ID No.9～10所示，用于检测水稻细菌性谷腐病菌（Burkolderia gladioli）；
第六对引物的碱基序列如SEQ ID No.11～12所示，用于检测水稻细菌性叶鞘褐腐病菌（Pseudomonas fuscovaginae）。
本发明的六对引物能用于一次多重PCR扩增中对六种水稻病原细菌进行同时检测，六对引物之间不会形成引物二聚体，且每对引物与各自的目标模板区域均具有高度特异性，检测结果真实可信。
本发明还提供了一种多重PCR法检测水稻病原细菌的试剂盒，包括一次性多重PCR检测体系，所述一次性多重PCR检测体系中含有所述引物组。
作为优选，所述一次性多重PCR检测体系由以下成分混合而成：所述一次性多重PCR检测体系由以下成分混合而成：Multiplex PCR Mix10.2～0.3μL，Multiplex PCR Mix224～26μL，2xTaq PCR Mix4.5～5.5μL，浓度为0.12μM的第一、三、五、六对引物各0.25～0.35μL，浓度为0.096μM的第四对引物0.22～0.26μL，浓度为0.2μM的第二对引物0.4～0.6μL；更优选由以下成分混合而成：Multiplex PCR Mix10.25μL，Multiplex PCRMix225μL，2xTaq PCR Mix5μL，浓度为0.12μM的第一、三、五、六对引物各0.3μL，浓度为0.096μM的第四对引物0.24μL，浓度为0.2μM的第二对引物0.5μL。
如未作特殊说明，上述引物的含量是指每对引物的上下游引物各自的含量。Multiplex PCR Mix1、Multiplex PCR Mix2可购自TaKaRa MultiplexPCR试剂盒，2xTaq PCR Mix可购自博彩生物。
进行多重PCR时，只需在一次性多重PCR检测体系中直接加入扩增模板即可，简单方便，能有效提高检测效率。
本发明还提供了一种多重PCR法检测水稻病原细菌的方法，包括：
（1）从水稻样本中分离病原细菌并提取菌物DNA，或制备水稻样本粉末；
（2）利用如权利要求2～4任一所述的试剂盒，在所述一次性多重PCR检测体系中加入菌物DNA或水稻样本粉末，进行多重PCR扩增；
（3）将PCR扩增产物进行凝胶电泳分离、染色，根据扩增条带判定待测样品中水稻病原细菌的种类。
除可用于对常规提取的菌物DNA进行PCR扩增外，本发明的试剂盒还能以水稻样本粉末为模板，对田间采集的水稻样本进行快速检测。所述水稻样本粉末的制备方法为：采集水稻样本，经无菌水冲洗、晾干后，进行无菌研磨，获得所述水稻样本粉末。所述水稻样本优选为谷粒、叶鞘或叶片。本发明对水稻样本粉末的粒径等参数没有要求，尽量充分研磨即可。
步骤（2）进行多重PCR扩增时，优选采用50μL的扩增体系。其中，利用菌物DNA进行多重PCR扩增时，应保证扩增体系中，水稻细菌性条斑病菌DNA浓度不低于3.5ng/μL，水稻细菌性叶鞘褐腐病菌菌DNA浓度不低于1ng/μL，水稻细菌性谷枯病菌DNA浓度不低于4ng/μL，水稻细菌性褐条病菌DNA浓度不低于0.6ng/μL，水稻细菌性谷腐病菌DNA浓度不低于0.8ng/μL，水稻白叶枯病菌DNA浓度不低于0.5ng/μL。
利用水稻样本粉末进行多重PCR扩增时，扩增体系中水稻样本粉末的浓度不低于2mg/mL。优选地，用ddH2O将水稻样本粉末制成水悬液后，再加入到所述一次性多重PCR检测体系中至总体积50μL，获得扩增体系。
水稻样本粉末中菌物的种类和含量未知但相对较少，因此在扩增体系中加入较多的水稻样本粉末的水悬液，保证扩增体系中水稻白叶枯病菌的浓度不少于102cfu/mL，水稻细菌性条斑病菌、水稻细菌性褐条病菌、水稻细菌性谷枯病菌的浓度不少于105cfu/mL，水稻细菌性谷腐病菌、水稻细菌性叶鞘褐腐病菌的浓度不少于106cfu/mL。
当然，除了直接采用本发明的试剂盒进行多重PCR外，也可利用本发明的引物组，选用其他常规的试剂进行多重PCR。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
（1）利用本发明的引物组和试剂盒能实现对六种水稻病原细菌的一次性检测，检测结果特异稳定，重复性好，对包括标准菌株和分离菌株在内的约130种菌株进行多重PCR扩增发现，只有本发明引物组针对的六种水稻病原细菌出现特异性条带，而同属的近缘菌株和其他腐生菌株均未得到条带；
（2）本发明的试剂盒可以直接对田间采集的样品进行准确检测，而无需进行菌株分离及DNA提取，更加方便实用，样品分析仅需4-5小时，比用常规方法节省时间90%以上；并可同时检测到试剂盒中六种水稻病原细菌的任意一种或多种，大大节约了时间和成本；
（3）本发明的引物组和试剂盒对六种水稻病原细菌的检出率高，从明显发病的样本中均扩增到特异性条带，一些症状不明显或无症状的样本也扩增到特异性条带,，并且分离获得相应病原细菌；有些在田间只显示1到2种细菌病害症状的水稻样本上，能够检测到这六种目标病原细菌中的3到4种；
（4）无论利用菌物DNA或者水稻样本粉末进行多种PCR，本发明的引物组和试剂盒对六种水稻病原细菌的检出限均较低，灵敏度高。
附图说明
图1为以菌物DNA为模板对六种水稻病原细菌进行多重PCR检测的电泳结果图；其中，M为DNA分子量标准，opt泳道中为六种病原细菌的DNA优化的最低限度浓度：水稻白叶枯病菌0.5ng/μL，水稻细菌性条斑病菌3.5ng/μL，水稻细菌性褐条病菌0.6ng/μL，水稻细菌性谷枯病菌4ng/μL，水稻细菌性叶鞘褐腐病菌1ng/μL和水稻细菌性谷腐病菌0.8ng/μL，1泳道中六种病原细菌的DNA均为1ng/μL，2泳道中六种病原细菌的DNA均为2ng/μL，3泳道为水代替DNA的阴性对照；
图2为以菌体为模板对六种水稻病原细菌进行多重PCR检测的电泳结果图；其中，M为DNA分子量标准，opt泳道中为六种病原细菌的菌液优化的最低限度浓度：水稻白叶枯病菌102cfu/mL，水稻细菌性条斑病菌,水稻细菌性褐条病菌和水稻细菌性谷枯病菌105cfu/mL，水稻细菌性叶鞘褐腐病菌和水稻细菌性谷腐病菌106cfu/mL，1泳道中六种病原细菌的菌液浓度均为108cfu/mL，2泳道中六种病原细菌的菌液浓度均为106cfu/mL，3泳道中六种病原细菌的菌液浓度均为104cfu/mL，4泳道为水代替菌液的阴性对照；
图3为以菌体为模板对六种水稻病原细菌的随机组合进行多重PCR检测的电泳结果图；其中，M为DNA分子量标准，1泳道为六种病原细菌的组合，2～5泳道为随机的五种病原细菌组合，6～10泳道为随机的四种病原细菌组合，11～13泳道为随机的三种病原细菌组合，14泳道为水代替菌液的阴性对照；
图4为以菌物DNA为模板对121株近缘菌株和其它腐生或附生菌株进行多重PCR检测的电泳结果图；其中，M为DNA分子量标准，1-2泳道为P.fluorescens，3-5泳道为P.putida，6泳道为P.syringae pv.Oryzae，7-10泳道为P.sp.，11-20泳道为B.ambifaria，21-23泳道为B.anthina，24-25泳道为B.arboris，26-29泳道为B.cenocepacia，30-45泳道为B.cepacia，46-55泳道为B.lateens，56，57泳道为B.pyrrocinia，58-63泳道为B.seminalis，64-66泳道为B.stabilis，67-68泳道为B.vietnamiensis，69-89泳道为B.sp.，90-92泳道为A.avenae subsp.Citrulli，93-98泳道为Enterobacteria.Cancerogenus，99-107泳道为E.cloacae subsp.Dissolvens，108-110泳道为E.pyrinus，111-115泳道为E.sp.，116-121泳道为水稻上分离得到的未知菌株；图中100以上泳道百位数字用·表示；
图5为利用粉末水悬液对30个水稻样本进行多次PCR检测的电泳结果图；其中，M为DNA分子量标准，01～20泳道为谷粒样本，01s、04s、06s、09s、18s泳道为叶鞘样本，22、23泳道为叶片样本。
具体实施方式
1引物合成
通过对水稻细菌性褐条病菌（Aaa）RS-1、水稻细菌性谷枯病菌（B.glumae）ZUB1212及LMG2196、水稻细菌性谷腐病菌（B.gladioli）SD1314及LMG2216和水稻细菌性叶鞘褐腐病菌（P.fuscovaginae）CB98818的全序列基因组进行测序，结合NCBI基因组数据库中得到的有关数据，利用联配软件及引物合成软件并与GeneBank数据库进行比对,设计了本发明的第三至六对引物。
针对水稻细菌性条斑病菌（Xoc）的第一对引物，以及针对水稻白叶枯病菌（Xoo）的第二对引物均引自参考文献（Lang JM et al..2010.Genomics-Based Diagnostic Marker Development for Xanthomonasoryzae pv.oryzae and X.oryzae pv.oryzicola.Plant Dis.94:311-319）。这六对引物的碱基序列见表1。
表1六对引物的碱基序列
表1的引物委托上海生工生物工程有限公司合成。
2试剂盒组成
本具体实施方式的试剂盒内设多管一次性多重PCR检测体系，每管的一次性多重PCR检测体系由以下成分混合而成：Multiplex PCR Mix125μL，Multiplex PCR Mix2（大连TaKaRa）0.25μL，2xTaq PCR Mix（上海博彩）5μL，浓度为0.12μM的XocF/XocR、PfuF/PfuR、BgiF/BgiR、AaaF/AaaR的上下游引物各0.3μL，浓度为0.096μM的BgeF/BgeR的上下游引物各0.24μL，浓度为0.2μM的XooF/XooR的上下游引物各0.5μL。
3利用菌物DNA进行多重PCR检测
（1）DNA提取
①分别接种水稻细菌性褐条病菌（Aaa）RS-1、水稻细菌性谷枯病菌（B.glumae）ZUB1212、水稻细菌性谷腐病菌（B.gladioli）SD1314、水稻细菌性叶鞘褐腐病菌（P.fuscovaginae）CB98818、水稻细菌性条斑病菌（Xoc）ZUB0946和针对水稻白叶枯病菌（Xoo）ZUB0906至5mL的NA培养基中，30℃培养至饱和状态；
②取1.5mL的培养物，10000r/min离心2min，沉淀物加入467μL的TE缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬；
③加入30μL10%的SDS和3μL20mg的蛋白酶K，混匀，37℃水浴1h；
④加入等体积的氯仿/异丙醇（24：1，v/v），轻轻混匀，12000r/min离心10min，取上清液转入一个新管中，如果难以移出上清液，先用牙签除去界面物质；
⑤加入等体积的酚/氯仿（1：1，v/v），混匀，8000r/min离心5min，将上清液移入一只新管中；
⑥加入1/10体积的NaAc(pH5.2)，混匀，加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，12000r/min离心5min，冰浴5-10min，弃上清；
⑦加入1mL70%的冰乙醇洗涤30s，12000r/min离心2min，弃上清；
⑧沉淀物干燥，重溶于100μL的TE缓冲液中，利用紫外分光光度计测核酸浓度和纯度，-20℃保存。
（2）PCR扩增
以步骤（1）获得的DNA为模板，利用试剂盒进行PCR扩增，每管一次性多重PCR检测体系加入1μL DNA模板，ddH2O补足至50μL后，即为扩增体系。
PCR反应条件：94℃预变性2min；92℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸90s，共进行40个循环；72℃延伸5min。
PCR产物用2%的琼脂糖在0.5×TBE缓冲液中电泳后，用Goldview显色拍照，如为阳性反应则在特异位置处显示一条明亮的条带，如果为阴性反应则无任何条带；在各菌特异位置检测到特异性条带的样本可以判断为病原。电泳结果见图1。
由图1可见，水稻白叶枯病菌（Xoo）的检出限为0.5ng/μL，水稻细菌性条斑病菌（Xoc）的检出限为3.5ng/μL，水稻细菌性褐条病菌（Aaa）的检出限为0.6ng/μL，水稻细菌性谷枯病菌（B.glumae）的检出限为4ng/μL，水稻细菌性叶鞘褐腐病菌（P.fuscovaginae）的检出限为1ng/μL，水稻细菌性谷腐病菌（B.gladioli）的检出限为0.8ng/μL。
4利用水稻样本粉末进行多重PCR检测
（1）菌液最低浓度优化
分别接种水稻细菌性褐条病菌（Aaa）、水稻细菌性谷枯病菌（B.glumae）、水稻细菌性谷腐病菌（B.gladioli）、水稻细菌性叶鞘褐腐病菌（P.fuscovaginae）、水稻细菌性条斑病菌（Xoc）和水稻白叶枯病菌（Xoo）至5mL的NA培养基中，30℃培养至饱和状态；取1mL培养物，5000r/min离心5min，沉淀物加入1mL的无菌水，用移液枪反复吹打使之重悬再进行1：9的梯度稀释；稀释后不同浓度的菌液直接为模板，进行PCR检测，获取各菌种的检测限（即最低检测浓度）。
PCR扩增体系：在每管一次性多重PCR检测体系加入1μL各菌种的菌悬液（终浓度为水稻白叶枯病菌（Xoo）102cfu/mL，水稻细菌性条斑病菌（Xoc）、水稻细菌性褐条病菌（Aaa）、水稻细菌性谷枯病菌（B.glumae）105cfu/mL，水稻细菌性叶鞘褐腐病菌（P.fuscovaginae）和水稻细菌性谷腐病菌（B.gladioli）106cfu/mL），ddH2O补足至50μL后，即为扩增体系。
PCR反应条件：94℃预变性10min；92℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸90s，共进行40个循环；72℃延伸5min。
PCR产物用2%的琼脂糖在0.5×TBE缓冲液中电泳，电泳结果见图2。
由图2可见，水稻白叶枯病菌（Xoo）的检出限为102cfu/mL，水稻细菌性条斑病菌（Xoc）、水稻细菌性褐条病菌（Aaa）、水稻细菌性谷枯病菌（B.glumae）的检出限为105cfu/mL，水稻细菌性叶鞘褐腐病菌（P.fuscovaginae）和水稻细菌性谷腐病菌（B.gladioli）的检出限为106cfu/mL。
（2）多重PCR检测
从水稻细菌性褐条病菌（Aaa）、水稻细菌性谷枯病菌（B.glumae）、水稻细菌性谷腐病菌（B.gladioli）、水稻细菌性叶鞘褐腐病菌（P.fuscovaginae）、水稻细菌性条斑病菌（Xoc）和水稻白叶枯病菌（Xoo）中随机选择3～6种菌株，进行多重PCR扩增，扩增体系中各菌种的浓度为上述的检测限浓度，反应条件与第4（1）部分相同。检测结果见图3。
由图3可见，本发明的试剂盒可对这六种水稻病原细菌的随机组合进行准确快速的鉴定。
（3）特异性检测
利用与第4（2）部分相同的扩增体系和反应条件，对121株与六种水稻病原细菌同属的近缘菌株和其他腐生或附生菌株进行PCR扩增，扩增结果见图4。
由图4可见，利用本发明的六对引物均未从这121个菌株中扩增获得特异性条带，表明本发明的引物与各自的模板具有较高的特异性。
（4）利用水稻样本的粉末水悬液进行多重PCR检测
1）制备水稻样本的粉末水悬液
在水稻发病地区采集的30个疑似发病样本（采集水稻谷粒、叶鞘或叶片），用无菌水冲洗3次，晾干，然后用灭菌研钵进行充分研磨，取0.2g粉末装入事先装有1mL无菌水的离心管中，充分漩涡震荡，制成浓度为0.2g/mL的粉末水悬液。
2）多重PCR检测
利用第2部分的试剂盒进行PCR扩增，每管一次性多重PCR检测体系加入步骤1）制备的粉末水悬液至总体积为50μL，即为扩增体系。再利用与第4（2）部分相同的反应条件分别对30个样本进行PCR扩增。扩增产物的电泳结果见图5。
由图5可见，30个疑似发病样本中均出现明显的特异性条带，其中12号样本同时检测出Xoc、B.glumae、Aaa和Xoo这四种目标菌，23号样本同时检测出Xoc、Aaa、B.gladioli和Xoo这四种目标菌；对这些水稻样本进行病原细菌分离，均得到了与PCR结果一致的目标菌；表明一种水稻样本可能存在多种目标病原，且本发明的引物组和试剂盒能有效检出这些病原。
Claims (8)
1.一种多重PCR法检测水稻病原细菌的引物组，其特征在于，包括六对引物，第一对引物的碱基序列如SEQ ID No.1～2所示，第二对引物的碱基序列如SEQ ID No.3～4所示，第三对引物的碱基序列如SEQ ID No.5～6所示，第四对引物的碱基序列如SEQ ID No.7～8所示，第五对引物的碱基序列如SEQ ID No.9～10所示，第六对引物的碱基序列如SEQ ID No.11～12所示。
2.一种多重PCR法检测水稻病原细菌的试剂盒，包括一次性多重PCR检测体系，其特征在于，所述一次性多重PCR检测体系中含有如权利要求1所述的引物组。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述一次性多重PCR检测体系由以下成分混合而成：Multiplex PCR Mix1 0.2～0.3μL，Multiplex PCR Mix2 24～26μL，2xTaq PCR Mix 4.5～5.5μL，浓度为0.12μM的第一、三、五、六对引物各0.25～0.35μL，浓度为0.096μM的第四对引物0.22～0.26μL，浓度为0.2μM的第二对引物0.4～0.6μL。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述一次性多重PCR检测体系由以下成分混合而成：Multiplex PCR Mix1 0.5μL，Multiplex PCR Mix2 25μL，2xTaq PCR Mix 5μL，浓度为0.12μM的第一、三、五、六对引物各0.3μL，浓度为0.096μM的第四对引物0.24μL，浓度为0.2μM的第二对引物0.5μL。
5.一种多重PCR法检测水稻病原细菌的方法，包括：
（1）从水稻样本中分离病原细菌并提取菌物DNA，或制备水稻样本粉末；
（2）利用如权利要求2～4任一所述的试剂盒，在所述一次性多重PCR检测体系中加入菌物DNA或水稻样本粉末，获得扩增体系，进行多重PCR扩增；
（3）将PCR扩增产物进行凝胶电泳分离、染色，根据扩增条带判定待测样品中水稻病原细菌的种类；
所述水稻病原细菌为：水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas.oryzae pv.oryzicola）、水稻细菌性叶鞘褐腐病菌（Pseudomonas fuscovaginae）、水 稻细菌性谷腐病菌（Burkolderia gladioli）、水稻细菌性褐条病菌（Acidovorax avenae subsp.avenae）、水稻细菌性谷枯病菌（Burkolderia glumae）、水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，利用水稻样本粉末进行多重PCR扩增时，扩增体系中水稻样本粉末的浓度不低于2mg/mL。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述水稻样本粉末的制备方法为：采集水稻样本，经无菌水冲洗、晾干后，进行无菌研磨，获得所述水稻样本粉末。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述水稻样本为谷粒、叶鞘或叶片。
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