CN111088395B - 小麦全蚀病菌禾顶囊壳lamp检测引物组及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及小麦全蚀病菌禾顶囊壳LAMP检测引物组及方法，属于基因工程技术领域，本发明以该病原菌的ITS为靶序列，建立禾顶囊壳的LAMP检测技术，采用的引物特异性强，反应体系的灵敏度高；通过对发病组织的检测，所述反应体系能够准确快速地从发病小麦组织中检测出小麦全蚀病。该检测方法简单、快速和灵敏，并且不需要昂贵仪器，有利于在基层植保站大面积推广和使用，为小麦全蚀病的早期、精准防控提供技术支持。

Description

小麦全蚀病菌禾顶囊壳LAMP检测引物组及方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地，涉及小麦全蚀病菌禾顶囊壳LAMP检测引物组及方法。

背景技术

河南省是全国重要的粮食生产基地，是我国最重要的小麦主产区。近年来，随着免耕播种、小麦浅耕播种和秸秆还田等保护性耕作技术的实施以及机械化跨区作业，使得小麦土传病害的发生面积不断扩大。特别是小麦全蚀病，自1992 年在河南省发现以来，不断传播蔓延，近几年来更是在全省呈现大爆发的趋势，严重影响河南省小麦的安全生产。小麦全蚀病是由禾顶囊壳(Gaeumannomyces graminis)引起，危害小麦的根部和茎基部，严重时全田植株枯死，是小麦生产上的一种毁灭性土传病害。此外还有小麦纹枯病和小麦根腐病也是小麦重要的土传病害，但是这3种小麦土传病害的早期症状容易混淆，为在病害发生早期能够准确诊断病害，从而对症下药在病害发生的初期及时进行防治，达到事半功倍的效果，需要开发特异、敏度、快速的小麦全蚀病早期诊断技术。

环介导等温扩增 (Loop mediated isothermal amplification，LAMP) 技术是一种恒温体外核酸扩增技术。通过针对靶序列的６个区域设计一组４个特异引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在60～65℃恒温条件下60 min即可扩增出10⁹个靶序列。相比常规PCR检测技术，该技术具有特异性强、灵敏度高、快速简便且成本低廉的特点，已广泛应用于病原微生物的检测。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明的目的在于提供小麦全蚀病菌禾顶囊壳LAMP检测引物组及方法，所述引物的特异性强，灵敏度高，能准确快速检测小麦全蚀病，为小麦全蚀病的早期、精准防控提供技术支持。

为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

小麦全蚀病菌禾顶囊壳LAMP检测引物组，其特征在于：包括四条特异性引物，具体如下：

QS-FIP：CAGGGTTTGTAACCTCCGGCACATACCTTTACTGTTGCTTC；

QS-BIP：AACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTACTTATCGCATTTCGCTG；

QS-F3：AAACTCCAACCCCTGTGA；

QS-B3：ACTGAATTCTGCAATTCACA；

所述四个特异引物的靶标基因为小麦全蚀病菌禾顶囊壳的ITS。

本发明还提供利用所述LAMP检测引物组对小麦全蚀病进行检测的方法，包括以下步骤：

步骤一、提取基因组DNA：选取小麦植株的发病部位，提取基因组DNA，测定提取的基因组DNA的浓度和纯度，作为模板DNA，备用；

步骤二、确定反应体系：每25μL反应体系中，由以下成分组成：2.5 μL 10×ThermoPol Buffer，1.5 μL 100 mM MgSO₄、3.5 μL 10 mM dNTPs、10 μM QS-FIP和QS-BIP各4 μL、10 μM QS-F3和QS-B3各0.5 μL、１μL 8000U/mL Bst DNA Polymerase和１μL模板DNA，灭菌超纯水补足25 μL；

步骤三、执行反应程序：将步骤二中所述反应体系中的试剂混均匀后，置恒温64℃水浴锅中反应60 min，然后向反应体系中加入 1μL核酸染料SYBR Green I，混匀后观察反应体系颜色的变化，在波长440～485 nm照射下，阳性为荧光黄绿色，阴性为橙色。

有益效果：

1、LAMP技术对引物设计的要求非常高，技术的关键点是用于设计引物靶标基因的选择与引物的设计，本发明提供的2对特异性引物，在小麦全蚀病检测方面特异性很强，对禾顶囊壳、小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌、小麦赤霉病菌、小麦叶锈病菌、小麦条锈病菌、小麦白粉病菌、整齐小核菌、立枯丝核菌、链格孢菌、固执腐霉、瓜果腐霉、大豆疫霉和烟草疫霉等14种病原菌的DNA进行扩增，结果显示只有禾顶囊壳的LAMP反应呈黄绿色的阳性反应，其它病原菌的LAMP反应均呈橙色的阴性反应。本发明以该病原菌的ITS为靶序列，建立禾顶囊壳的LAMP检测技术，为小麦全蚀病的早期、精准防控提供技术支持。

2、采用本发明所述的引物，反应体系的灵敏度仅为10pg；通过对发病组织的检测，所述反应体系在小麦DNA干扰条件下仍能够检测出禾顶囊壳，检出时间为浸染12h以上；而且，采用本发明所述引物的反应体系，能够准确快速地区分检测出小麦全蚀病和土传病害，防止小麦全蚀病和土传病害的混淆，避免因采取不合适的防止措施造成的损害。

附图说明

图1是LAMP引物的特异性试验结果图；其中，1-禾顶囊壳，2-小麦纹枯病菌，3-小麦根腐病菌，4-小麦赤霉病菌，5-小麦叶锈病菌，6-小麦条锈病菌，7-小麦白粉病菌，8-整齐小核，9-立枯丝核，10-链格孢菌，11-固执腐霉，12-瓜果腐霉，13-大豆疫霉，14-烟草疫霉，15-阴性对照；

图2是LAMP引物的灵敏度结果图；其中，N为阴性对照；

图3是LAMP检测小麦发病组织试验结果图；其中，N为阴性对照，P为阳性对照。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株共14种植物病原菌，均为小麦的重要病原菌和常见的土传病原菌，其中小麦全蚀病菌禾顶囊壳8株，其它种类病原菌各1株，具体信息见表1。

表

用于LAMP检测菌株的信息

1.2 供试培养基

供试培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）和V8汁琼脂培养基（V8 juice agar, V8A）。

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉15 g、蒸馏水1 L。

V8A培养基：V8汁200 mL，碳酸钙3 g，琼脂粉15 g、蒸馏水800 mL。

液培菌株时，所用的培养基为不添加琼脂粉的对应液体培养基。

1.3 引物的设计与合成

禾顶囊壳G. graminis的ITS序列（KT819300.1）从GenBank网站下载，使用PrimerExplore在线软件设计LAMP引物，选定3套引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，通过预试验筛选出1套符合要求的LAMP引物（表2），-20℃冰箱保存备用。其中，QS-FIP的引物序列如SEQ ID NO：1所示；QS-BIP的引物序列如SEQ ID NO：2所示；QS-F3的引物序列如SEQ ID NO：3所示；QS-B3的引物序列如SEQ ID NO：4所示。

表

LAMP引物序列

1.4 基因组DNA的提取

液体培养病原菌3 d，滤纸过滤收集菌丝（小麦条锈病菌、小麦叶锈病菌和小麦白粉病菌等专性寄生菌直接从小麦发病部位收集孢子堆），使用植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）进行基因组DNA的提取，NanoDrop 1000超微量分光光度计测定DNA的浓度和纯度。

1.5 LAMP反应体系与程序

通过预试验确定LAMP反应体系为：2.5 μL 10×ThermoPol Buffer，1.5 μL 100mM MgSO4、3.5 μL 10 mM dNTPs、10 μM QS-FIP和QS -BIP各4 μL、10 μM QS -F3和QS -B3各0.5 μL、１μL 8000U/mL Bst DNA Polymerase和１μL模板DNA，灭菌超纯水补足25 μL。

反应程序：上述试剂混均匀后，置恒温64℃水浴锅中反应60 min，然后向反应体系中加入 1μL核酸染料SYBR Green I，混匀后观察反应体系颜色的变化，蓝光切胶仪照射下（波长440～485 nm）阳性为荧光黄绿色，阴性为橙色。

1.6 LAMP引物特异性与灵敏度的检测

为检测LAMP引物的特异性，使用小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌、小麦赤霉病菌、小麦秆黑粉病菌、小麦叶锈病菌、小麦条锈病菌、小麦白粉病菌、整齐小核、立枯丝核、链格孢菌、固执腐霉、瓜果腐霉、大豆疫霉和烟草疫霉等13种小麦重要病原菌和常见土传病原菌作为参考菌株，以禾顶囊壳为目标菌株，以灭菌超纯水为阴性对照，进行LAMP反应。

为检测LAMP引物的灵敏度，将禾顶囊壳DNA稀释成10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL和1 fg/μL，添加１μL到体系中进行LAMP反应。以灭菌超纯水为阴性对照。

1.7 发病组织与田间样品的检测

平板培养禾顶囊壳3d，切取菌丝快接种到小麦茎基部，保湿3 h、6 h、12 h、24 h和48 h后，截取小麦接种部位组织，使用植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取小麦组织DNA，将其作为 DNA模板用于LAMP检测，以禾顶囊壳DNA作为阳性对照，以健康小麦组织DNA作为阴性对照。

2019 年3月，从河南省洛阳市采集疑似小麦全蚀病样品48份，选取根和茎基部，使用植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取样品 DNA，以禾顶囊壳DNA作为阳性对照，以健康小麦组织DNA作为阴性对照，进行LAMP检测，每个样品重复检测3次。

2 结果与分析

2.1 LAMP引物的特异性

使用LAMP引物（QS-FIP、QS-BIP、QS-F3和QS-B3）对禾顶囊壳、小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌、小麦赤霉病菌、小麦叶锈病菌、小麦条锈病菌、小麦白粉病菌、整齐小核菌、立枯丝核菌、链格孢菌、固执腐霉、瓜果腐霉、大豆疫霉和烟草疫霉等14种病原菌的DNA进行LAMP扩增，结果显示只有禾顶囊壳的LAMP反应呈黄绿色的阳性反应，其它病原菌的LAMP反应均呈橙色的阴性反应（图1），说明该反应体系的特异性很强。

2.2 LAMP引物的灵敏度

以10倍梯度稀释的禾顶囊壳DNA为模板进行LAMP扩增，结果显示当DNA模板的量为10 ng、1 ng、100 pg和10 pg时LAMP反应呈黄绿色的阳性反应，而DNA模板的量为1 pg、100fg、10 fg和1 fg时LAMP反应呈橙色的阴性反应（图2），说明该反应体系的灵敏度为10 pg。

2.3 发病组织的检测

提取接种禾顶囊壳3 h、6 h、12 h、24 h和48 h的小麦组织DNA，进行LAMP扩增，结果显示DNA模板为接种3 h和6 h的小麦组织DNA时LAMP反应呈橙色的阴性反应，DNA模板为接种12h、24h和48 h的小麦组织DNA时LAMP反应呈黄绿色的阳性反应（图3），说明该反应体系在小麦DNA干扰条件下能够准确检测出禾顶囊壳，检出时间为侵染12 h以上。

2.4 田间小麦样品的检测

使用选定的LAMP引物对从洛阳采集的48份疑似小麦全蚀病样品进行了LAMP检测，结果发现18份样品呈阳性反应，检出率为37.50%，说明小麦全蚀病在苗期的症状容易与土传病害混淆，多数样品不是小麦全蚀病，LAMP技术可从中准确快速检测出小麦全蚀病。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南科技大学

<120> 小麦全蚀病菌禾顶囊壳LAMP检测引物组及方法

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成

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cagggtttgt aacctccggc acataccttt actgttgctt c 41

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<212> DNA

<213> 人工合成

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aactttcaac aacggatctc ttggttactt atcgcatttc gctg 44

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<212> DNA

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<400> 3

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

actgaattct gcaattcaca 20

Claims (2)

1.小麦全蚀病菌禾顶囊壳LAMP检测引物组在小麦全蚀病菌禾顶囊壳检测方面的应用，其特征在于：所述LAMP引物组包括四条特异性引物，具体如下：

QS-FIP：CAGGGTTTGTAACCTCCGGCACATACCTTTACTGTTGCTTC；

QS-BIP：AACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTACTTATCGCATTTCGCTG；

QS-F3：AAACTCCAACCCCTGTGA；

QS-B3：ACTGAATTCTGCAATTCACA；

所述四条特异引物的靶标基因为小麦全蚀病菌禾顶囊壳的ITS。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测的方法，包括以下步骤：

步骤一、提取基因组DNA：选取小麦植株的发病部位，提取基因组DNA，测定提取的基因组DNA的浓度和纯度，作为模板DNA，备用；

步骤二、确定反应体系：每25μL反应体系中，由以下成分组成：2.5 μL 10×ThermoPolBuffer，1.5 μL 100 mM MgSO₄、3.5 μL 10 mM dNTPs、10 μM QS-FIP和QS-BIP各4 μL、10 μM QS-F3和QS-B3各0.5 μL、1μL 8000U/mL Bst DNA Polymerase和1μL模板DNA，灭菌超纯水补足25 μL；

步骤三、执行反应程序：将步骤二中所述反应体系中的试剂混均匀后，置恒温64℃水浴锅中反应60 min，然后向反应体系中加入 1μL核酸染料SYBR Green I，混匀后观察反应体系颜色的变化，在波长440～485 nm照射下，阳性为荧光黄绿色，阴性为橙色。

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