KR101855965B1

KR101855965B1 - 붉은 곰팡이병 진단용 조성물

Info

Publication number: KR101855965B1
Application number: KR1020160171777A
Authority: KR
Inventors: 윤성환; 김희경
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2016-12-15
Filing date: 2016-12-15
Publication date: 2018-05-10

Abstract

본 발명은 붉은 곰팡이병 진단용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 붉은 곰팡이병원균 검출용 조성물, 키트 및 이의 감염여부를 검출하는 방법, 붉은 곰팡이병 진단용 조성물, 키트 및 이의 진단방법, 및 상기 붉은 곰팡이병원균을 검출하기 위한 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명의 붉은 곰팡이병원균 검출용 조성물을 이용하면, 붉은 곰팡이병을 발병시키는 균주를 특이적으로 검출할 수 있는바, 붉은 곰팡이병의 조기진단을 통한 방제에 널리 활용할 수 있을 것이다.

Description

붉은 곰팡이병 진단용 조성물{Composition for diagnosing Fusarium Head Blight}

본 발명은 붉은 곰팡이병 진단용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 붉은 곰팡이병원균 검출용 조성물, 키트 및 이의 감염여부를 검출하는 방법, 붉은 곰팡이병 진단용 조성물, 키트 및 이의 진단방법, 및 상기 붉은 곰팡이병원균을 검출하기 위한 프라이머 세트에 관한 것이다.

Fusarium 속 자낭균 곰팡이 중 일반적으로 "붉은 곰팡이" 라고 일컬어지는 그룹에는 Fusarium 속에는 푸자리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸자리움 컬머룸 (F. culmorum), 푸자리움 아베나시움 (F. avenacium), 푸자리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum), 및 푸자리움 부시아이(Fusarium boothii) 등이 포함된다. 이 중 푸자리움 그라미네아룸은 더 이상 기존 형태적 분류에 의한 하나의 생물학적 종 (biological species)으로 분류되지 않는다. 대신 전 세계적으로 최소 16 개 이상의 계통발생학적 종 (phylogenetically distinct species)으로 구성된 종복합체(species complex)로서 분류되고 있다. 이러한 푸자리움 그라미네아룸 종복합체 소속 붉은 곰팡이는 전 세계에 분포하는 대표적인 식물병원성 곰팡이로서 맥류인 보리, 밀 뿐 아니라 벼에 붉은 곰팡이병 증상(이삭마름증상) (Fusarium Head Blight)을 일으킬 뿐 아니라 옥수수에 이삭 썩음 (Ear rot)과 뿌리섞음(root rot)을 일으킨다.

실제 미국에서는 1917년 ~ 1919년, 1993년 ~ 2000년 동안 붉은 곰팡이병이 대량 발생하여 $27억불에 해당하는 경제적 손실을 일으켰다. 우리나라의 경우, 보리재배지역에서 1963년도, 1998년도에 붉은 곰팡이병이 대량 발생하여 40 ~ 90% 의 수량 감소를 가져왔다. 한편, 붉은 곰팡이는 오염된 곡류에서 곰팡이 독소인 DON(deoxynivalenol)과 NIV(nivalenol) 등의 트라이코쎄신(trichotheceane)과 지랄레논(zearalenone)를 생산하여 이병 식물 섭취 시 사람과 가축에 중독증을 초래하여 경제적, 산업적으로 피해를 야기시킨다. 이러한 이유로 선진국에서는 지난 수 십 년 동안 붉은 곰팡이 관련 기초 및 응용연구가 체계적으로 활발히 진행되고 있다.

한편 우리나라에 분포하는 푸자리움 그라미네아룸 종복합체 소속 붉은 곰팡이 종의 분포는 북미나 유럽과 매우 다른 양상을 띄고 있다. 우리나라의 작물 재배 지역에서는 현재까지 5 종의 푸자리움 그라미네아룸 종복합체의 분포가 확인되었으며, 각 종의 분포 빈도는 다음과 같은 순서를 나타냈다: 푸자리움 아시아티쿰 (Fusarium asiaticum)>푸자리움 그래미네아룸 (F. graminearum)> 푸자리움 부시아이 (F. boothii)> 푸자리움 메리디오날레 (F. meridionale)> 푸자리움 보로시아이 (F. vorosii). 이 중 우리나라 벼 재배 지역의 경우, 푸자리움 아시아티쿰이 80-90% 의 압도적인 분포 빈도를 보였으나, 옥수수 재배 지역의 경우, 푸자리움 그라미네아룸이 60%를 차지하였다. 최근 연구 결과, 우리나라의 주곡인 벼의 재배 환경 뿐 아니라 벼 식물체로부터 이러한 푸자리움 그라미네아룸 종복합체 소속 붉은 곰팡이가 높은 빈도로 검출되고 있으며, 지금까지 벼 세균성 알마름병으로 오인되었던 벼의 병해가 붉은 곰팡이에 의한 벼 이삭마름병으로 재동정되고 있는 실정이다.

따라서 우리나라에서는 이미 붉은 곰팡이에 의한 벼 이삭마름병의 꾸준한 발생과 이에 따른 수량감소 등에 의한 경제적 피해가 상당한 수준으로 발생하고 있다. 하지만 전 세계적으로 푸자리움 그라미네아룸 종복합체에 의한 식물병 연구는 맥류 (보리, 밀)와 옥수수에 국한되었으며, 벼에 발생하는 이삭마름병에 대한 연구는 기초적인 식물병리학적 연구 분야를 포함하여 거의 전무한 실정이다. 따라서 우리나라에서 발생하는 붉은 곰팡이에 의해 유발되는 벼 이삭마름병(붉은 곰팡이병)의 효과적인 방제 전략 구축을 위해 포장 내 벼 식물체의 병원균 감염 여부를 조기에 진단할 수 있는 수단의 개발이 시급한 실정이다.

한국공개특허 제10-2003-0021839호

본 발명의 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 구성된 프라이머를 포함하는, 붉은 곰팡이병원균 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 붉은 곰팡이병원균 검출용 조성물을 포함하는 붉은 곰팡이병원균 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 구성된 프라이머를 포함하는, 붉은 곰팡이병 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 붉은 곰팡이병 진단용 조성물을 포함하는 붉은 곰팡이병 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 붉은 곰팡이병원균의 감염여부를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 붉은 곰팡이병의 진단방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 붉은 곰팡이병원균을 검출하기 위한, 서열번호 1 및 2으로 표시되는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

이에, 본 발명자는 우리나라의 대표적 푸자리움 그라미네아룸 종복합체 소속 종인 푸자리움 아시아티쿰 SCK04 균주(Fusarium asiaticum SCK04), 푸자리움 그라미네아룸 PH-1 균주(Fusarium graminearum PH-1), 푸자리움 부시아이 GWS2-6-3 균주 (Fuarum boothii GWS2-6-3)의 유전체를 해독하였으며, 기주 식물(벼, 밀) 내 발병과정 (pathogenesis), 균사체 생장 (mycelial growth), 유성생식과정 (sexual development), 무성포자 생성과정 (conidiation), 트라이코쎄신 독소 생성과정 (trichothecene production)과 같은 다양한 생육단계의 조건에서 전사체 해독 및 비교 분석 등을 통한 유전체 차원의 유전자 발현을 분석하였다. 그 결과, 벼 발병과정에서 유전자 발현의 차이를 보이는 3종의 유전자를 발굴하였으며, 상기 유전자들의 발현 분석에 의해 붉은 곰팡이병을 진단할 수 있음을 확인하였다. 또한, 이들 유전자에 결합하여 이들 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 개발하였으며, 상기 프라이머 세트를 이용하여 붉은 곰팡이병을 특이적으로 진단할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 구성된 프라이머를 포함하는, 붉은 곰팡이병원균 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "붉은 곰팡이병원균"은 붉은 곰팡이병을 유발시키는 균주로서, Fusarium 속 곰팡이가 이에 속한다. 구체적으로 이들 Fusarium 속에는 푸자리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 푸자리움 컬머룸 (F. culmorum), 푸자리움 아베나시움 (F. avenacium), 푸자리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum), 및 푸자리움 부시아이(Fusarium boothii) 등을 포함한다. 이 중 푸자리움 그라미네아룸은 기존 형태적 분류에 의한 하나의 생물학적 종(biological species) 으로 분류되지 않는다. 대신 전 세계적으로 최소 16 개 이상의 계통발생학적 종 (phylogenetically distinct species)으로 구성된 종복합체(species complex)로서 분류되고 있다. 이러한 푸자리움 그라미네아룸 종복합체 소속 붉은 곰팡이는 전 세계에 분포하는 대표적인 식물병원성 곰팡이로서 맥류인 보리, 밀 뿐 아니라 벼에 붉은 곰팡이병(이삭마름병) (Fusarium Head Blight)을 일으킬 뿐 아니라 옥수수에 이삭 썩음 (Ear rot)과 뿌리 섞음(root rot)을 일으킨다.

본 발명의 용어 "붉은 곰팡이병"은 상기와 같은 Fusarium 속 곰팡이인 붉은 곰팡이에 의해 유도되는 병을 의미한다.

본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에서, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2의 염기서열로 구성된다. 본 발명에서, 상기 프라이머는 서열번호 3 내지 5로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는데, 서열번호 3 내지 5로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 부분서열과 상보적으로 결합하여 상기 폴리뉴클레오티드를 PCR 분석에 의해 증폭시킬 수 있다.

본 발명에서, 상기 서열번호 1과 2의 동일한 하나의 프라이머 세트를 이용하여, 서열번호 3 내지 5로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있다.

본 발명에서, 상기 붉은 곰팡이병원균은 붉은 곰팡이병을 유발하는 균주로, 푸사리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 및 푸사리움 부시아이(Fusarium boothii)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 균주일 수 있다.

본 발명에서, 상기 붉은 곰팡이병원균은 벼 발병 단계에서 특이적으로 발현할 수 있다. 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는 상기 프라이머 세트를 이용한 실시간 PCR에 의해, 붉은 곰팡이병원균인 F. asiaticum SCKO4 균주의 FASG_00961 유전자, F. graminearum PH-1 균주의 FGSG_00838 유전자, F. boothii GWS263 균주의 GWC1CG08670 유전자를 벼 발병단계에서 검출하였으나, 벼 발병단계가 아닌, 나머지 생육조건 (균사생장, 무성포자, 독소생성, 및 유성생식)에서는 상기 유전자들의 발현이 매우 미미하게 발현되는 것을 확인하여, 상기와 같은 붉은 곰팡이병원균은 벼 발병 단계에서 특이적으로 발현하는 것을 확인하였다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 붉은 곰팡이병원균 검출용 조성물을 포함하는, 붉은 곰팡이병원균 검출용 키트를 제공한다.

상기 조성물에 대해서는 전술한 바와 같고, 붉은 곰팡이병원균을 특이적으로 검출할 수 있으며, 상기 서열번호 3 내지 5의 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위한 프라이머 또는 프로브 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수도 있다.

구체적인 일례로서, 본 발명의 붉은 곰팡이병원균 검출용 키트는 PCR 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 키트는, 각 폴리뉴클레오티드에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

다른 일례로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩분석용 키트는, 서열번호 3 내지 5의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편과 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 부착되어 있는 기판과, 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 구성된 프라이머를 포함하는, 붉은 곰팡이병 진단용 조성물을 제공한다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 붉은 곰팡이병 진단용 조성물을 포함하는, 붉은 곰팡이병 진단용 키트를 제공한다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 서열번호 1과 2의 프라이머를 이용하게 되면, 붉은 곰팡이병을 발병시킬 수 있는 붉은 곰팡이병원균을 검출할 수 있는바, 상기 조성물 및 키트는 붉은 곰팡이병을 진단할 수 있는 효과를 나타낼 수 있다.

상기 진단용 조성물은 서열번호 1 및 2의 프라이머를 포함하여, 상기 프라이머 세트에 의해, 서열번호 3 내지 5의 폴리뉴클레오티드를 증폭 또는 검출할 수 있으며, 상기 붉은 곰팡이병은 푸사리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 및 푸사리움 부시아이(Fusarium boothii)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 균주에 의해 발병할 수 있다. 상기 프라이머 세트에 의해 증폭되는 서열번호 3 내지 5의 폴리뉴클레오티드는 푸사리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 및 푸사리움 부시아이(Fusarium boothii)로 이루어진 군에서 선택되는 붉은 곰팡이병원균에서 발현하는 유전자로, 상기 3 종의 균주는 상기 3종의 서열번호 3 내지 5의 폴리뉴클레오티드를 모두 발현할 수 있다.

또한, 상기 키트 역시, 붉은 곰팡이병 진단용 조성물을 포함하여, 붉은 곰팡이병을 진단할 수 있다. 키트의 구성에 대해서는 전술한 바와 같다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 붉은 곰팡이병원균 검출용 조성물 또는 붉은 곰팡이병원균 검출용 키트를 이용하여 붉은 곰팡이병원균의 감염여부를 검출하는 방법을 제공한다.

구체적으로 a) 붉은 곰팡이병원균의 감염이 의심되는 벼의 시료로부터 gDNA를 수득하는 단계; (b) 붉은 곰팡이병원균 검출용 조성물 또는 붉은 곰팡이병원균 검출용 키트를 이용하여 상기 수득한 gDNA로부터 서열번호 3 내지 5로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계; 및 (c) 서열번호 3 내지 5 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 증폭되는 경우 붉은 곰팡이병원균이 감염된 것으로 판정하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물 및 키트는 상술한 바와 동일하다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 붉은 곰팡이병 진단용 조성물 또는 붉은 곰팡이병 진단용 키트를 이용하여 붉은 곰팡이병의 진단방법을 제공한다.

구체적으로, (a) 붉은 곰팡이병의 발병이 의심되는 벼의 시료로부터 gDNA를 수득하는 단계; (b) 붉은 곰팡이병 진단용 조성물 또는 붉은 곰팡이병 진단용 키트를 이용하여 상기 수득한 gDNA로부터 서열번호 3 내지 5로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계; 및 (c) 서열번호 3 내지 5로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 증폭되는 경우 붉은 곰팡이병이 발병된 것으로 판정하는 단계를 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물 및 키트는 상술한 바와 동일하다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 붉은 곰팡이병원균을 검출하기 위한, 서열번호 1 및 2으로 표시되는 프라이머 세트를 제공한다.

상기 용어 "붉은 곰팡이병원균", "프라이머"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 3 내지 5로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있으며, 상기 프라이머 세트는 붉은 곰팡이병을 진단할 수 있는 효과가 있다.

본 발명의 붉은 곰팡이병원균 검출용 조성물을 이용하면, 붉은 곰팡이병을 발병시키는 균주를 특이적으로 검출할 수 있는바, 붉은 곰팡이병의 조기진단을 통한 방제에 널리 활용할 수 있을 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실시예 1. 균의 종류와 성장 조건

본 발명에 사용된 F. graminearum PH-1 균주 (미국 농무성 ARS 균주보관센터: http://nrrl.usaur.usda.gov/cgi-bin/usda/process.html에 NRRL 31084 이름으로 등록. 이하, "PH-1"으로 약칭)는 미국 유래 균주로서 유전체의 염기서열 분석은 이미 완료되었다(http://www.broadinstitute.org/annotatin/genome/fusarium graminearum/Multihome.html). F. asiaticum SCK04 (KACC NO:46428. 이하, "SCK04"으로 약칭)와 F. boothii GWS263 (KACC NO:46432 이하, "GWS263"으로 약칭) 균주는 우리나라 토종 붉은 곰팡이 종복합체 균주로서 본 발명자에 의해 유전체의 염기서열 분석이 완료되었으며, 균주는 농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자원정보센터에 기탁되었다. 본 연구에 사용된 모든 균주들은 -70℃에서 15% 글리세롤에 냉동 보관하였다.

본 발명자는 5가지 다양한 생육 조건에서 위의 3 종 균주를 배양하였다.

1) 균사체 생장 (mycelia; M)을 위하여 영양분이 풍부한 감자 한천 액체배지 [PDB (potato dextrose broth)]에 균주를 각각 접종하여 25℃에서 3일과 6일 동안 배양하였다. PDB에서 배양 3일째와 6일째에 각각 샘플링을 진행하고, 이하에서 각각 M3과 M6으로 표시했다.

2) 유성생식(sexual development; cd, kd) 유도를 위하여 당근배지 (corrot agar medium)에 균주를 접종한 후 3일과 6일 동안 공중 균사체를 형성하게 한 후 (cd), 배양 3일째와 6일째에 각각 샘플링을 진행하고, 이하에서 각각 cd3과 cd6으로 표시했다. 공중 균사를 제거하고 3일과 6일 동안 추가적으로 배양하여 유성생식의 결과물인 자낭각(자낭포자)의 형성을 유도하였다. 자낭각(자낭포자) 형성 유도 3일째와 6일째에 각각 샘플링을 진행하고 kd3과 kd6으로 표시했다.

3) 트라이코쎄신 곰팡이독소 (trichothecene; T) 생성을 유도하기 위하여 아그마틴 (agmatine) 첨가 액체배지에 균주를 접종한 후 3일, 6일 동안 정치 배양하였다. 배양 3일째와 6일째 각각 샘플링을 진행했고, T3과 T6으로 표시했다.

4) 무성포자(conidiation; C) 생성을 위하여 감자 한천 액체배지에서 4일 동안 배양한 후 균사체를 YEM 배지 (yeast malt agar medium) 위에 옮긴 후 다시 6일 동안 배양하였다. 배양 3일째와 6일째 각각 샘플링을 진행했고, C3과 C6으로 표시했다.

5) 마지막으로 벼 식물체에서 병 발병을 위하여 개화기 벼 식물체에, 붉은 곰팡이 무성포자(1X10⁵/ml conidia)를 분무 접종한 후 3일 동안 25℃, 상대습도 100%의 조건에서 습식 처리하였다. 이후 식물체를 온실로 옮겨 다시 5일과 7일 동안 보관하면서 붉은 곰팡이병 발생을 유도하였다. 각각 배양 3, 6, 9일째에 샘플링을 진행했고, Rice3, Rice6 및 Rice9로 표시했다.

실시예 2. 핵산 추출, 전사체 해독, 벼 발병 단계 특이 후보 유전자 선발

전사체 해독과 정량적 실시간 PCR을 위하여 위에서 기술한 다양한 생육 조건에서 3일, 6일 또는 9일 이후 붉은 곰팡이의 균사체, 자낭각(perithecia), 무성포자, 곰팡이 독소, 감염된 벼 낟알 등을 수확한 후 각 시료로부터 total RNA를 추출하였다. 벼 낟알 시료부터 total RNA의 추출은 RNeasy Plant mini kit(Qiagen, USA)를 사용하였다. 그 밖의 곰팡이 시료로부터 total RNA 추출은 Easy-Spin total extraction kit (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)를 사용하여 수행하였다. 모든 추출 RNA 샘플의 품질은 먼저 아가로오즈 겔 전기영동에 의해 분석하였으며, 나노드롭(Thermo Scientific NanoDrop Lite Spectrophotometer)을 사용하여 5ng/㎕ 수준으로 정량하였다.

벼 발병 단계 전사체 해독을 위하여 벼 낟알에 3 종의 붉은 곰팡이 균주를 각각 접종한 후 3일, 6일, 9차 시료로부터 추출한 total RNA를 사용하였다. 추출한 total RNA로부터 Truseq Standard mRNA prep kit를 이용하여 mRNA library를 제조하였다 [insert size 80~380 bp (main 160 bp)]. 이 후 Illumina HiSeq 2500 기기를 이용하여 paired end 방식 (2 X 101 PE)으로 전사체를 해독하였다 (total throughput 138.3 Gbp, Avg. throughput 15.36 Gbp). 상기 해독한 전사체로부터 붉은 곰팡이 전사체를 추출하기 위하여 벼 유전체에 먼저 검색하여 벼 전사체를 제외한 다음 붉은 곰팡이 유전체에 검색하거나, 붉은 곰팡이 유전체에 바로 검색하는 방법을 시도하였다. 전체 전사체 중 벼 전사체의 비율이 78-81% 이었으며, 붉은 곰팡이 전사체는 0.23~1.5% 수준으로 분포하였다. 3 종의 붉은 곰팡이 균주의 발병 전사체를 각 균주의 유전체에 검색한 결과, 전체 유전자 중 84~89%가 벼 발병 단계에서 FPKM 수치 0.3 이상의 기준으로 발현됨을 알 수 있었다.

벼 발병 단계 3, 6, 9일차 전사체의 FPKM 수치를 각각 기준 (reference)으로 설정하여 서로 다른 발병 조건에서 과발현 (up-regulation) 된 DEG (differentially expressed gene) 유전자 집단을 벼 발병 단계 특이 유전자 집단으로 잠정 선발하였다. 이 중 3 종의 붉은 곰팡이 균주에 공통으로 존재하면서, 모든 벼 발병 단계에서 높은 수준으로 발현될 뿐 아니라 초기 발병 단계인 3 일차에서 발현 수준이 다른 발병 단계 (6일, 9일)보다 상대적으로 높은 3 종의 유전자 (F. asiaticum FASG_00961, F. graminearum FGSG_00838, F. boothii GWC1CG08670: 이 들 유전자는 모든 ortholog 관계임)를 선발하였다(표1).

전사체 해독을 통한 벼 발병 단계별 선발 유전자의 발현 수준

균주명	Gene_id	Normalized_FPKM
균주명	Gene_id	Rice 3^*	Rice 6^*	Rice 9^*
F. asiaticum SCK04	FASG_00961	2,328	930	1,379
F. graminearum PH-1	FGSG_00838	7,312	1,597	1,368
F. boothii GWS263	GWC1CG08670	5,864	1,744	737
^*Rice 3, Rice 6, Rice 9: 벼 접종 후 3일, 6일, 9일 차

상기 선발된 유전자를 선택적으로 증폭할 수 있는 프라이머의 염기서열은 PrimerSelect 프로그램(lasergene7)을 이용하여 디자인하였으며, 프라이머는 ㈜코스모진텍(Cosmogentech, Seoul, Korea)에서 합성되었다(표 2). Total RNA로부터 cDNA의 첫번째 가닥 합성은 ReverTraAcc qPCR RT Kit(TOYOBO, Japan)을 이용하여 수행하였다.

선발 유전자 증폭용 프라이머의 염기서열

번호	유전자	프라이머	서열(5’ → 3’)	크기 (bp)	온도 (℃)
서열번호1	FASG_00961 FGSG_00838 GWC1CG08670	q838F	CCCTGCCTACTTCAACGACTCTCA	219	62.0
서열번호2	FASG_00961 FGSG_00838 GWC1CG08670	q838R	GACCTCGAAGATACCCTCCTCAA	219	60.2

실시예 3. 정량적 실시간 PCR 및 후보 유전자 발현분석

정량적 실시간 PCR (qPCR)은 SYBR Green Super Mix(Bio-Rad, USA)와 실시간 PCR 시스템(Bio-Rad CFX96 system, USA)을 이용하여 수행되었다. 유전자 발현은 각 조건(생물학적 반복)에서 3가지, 각 개별 반응 2가지(기계적 반복)으로 분리된 샘플에서 측정되었다.

실시예 4. 후보 유전자 발현분석 결과

qPCR용 프라이머를 이용하여 각 균주의 genomic DNA와 cDNA로부터 219bp의 앰플리콘(amplicons)를 생성하였다. 프라이머 효율은 0.9로 일반적인 0.9 ~ 1.1 범위에 있어, 선발 유전자의 발현은 특이적으로 증폭됨을 확인하였다. 선발 유전자의 상대적인 발현 수준 비교를 위하여 F. graminearum PH-1 균주의 균사생장 3일차 (M3) 조건의 발현 수준을 1.0 로 설정한 후 비교 분석하였다(표 3). 또한 선발 유전자의 실시간 녹는점 곡선 (melting curve) 분석을 통해 단일 피크 형성을 관찰하였다(데이터 표시 안 함). 따라서 상기 서열번호 1과 2의 프라이머에 의해 F. asiaticum SCK04, F. graminearum PH-1, F. boothii GWS263 균주에 의해 감염된 식물체로부터 선발 유전자를 특이적으로 증폭하는 것이 증명되었다.

특히 F. asiaticum SCKO4 균주의 FASG_00961 유전자는 모든 벼 발병 단계에서 높은 수준의 발현을 보였을 뿐 아니라 초기 발병 단계 (3일차)의 발현 수준이 가장 높았다. F. graminearum PH-1 균주의 FGSG_00838 유전자도 모든 벼 발병 단계에서 높은 발현 수준을 보였다. 한편, F. boothii GWS263 균주의 GWC1CG08670 유전자는 벼 발병 3일차와 6일차에서 발현 수준이 F. asiaticum, F. graminearum 균주 의 유전자에 비해 최소 3 배 이상 높았을 뿐 아니라 3일, 6일차 발현 수준이 9일차 발현 수준에 비해 81~111 배 이상 높았다. 하지만 이들 유전자는 3 종 붉은 곰팡이 균주의 나머지 생육조건 (균사생장, 무성포자, 독소생성, 및 유성생식)에서는 매우 미미하게 발현되었다(표 3).

결론적으로, 상기 3종의 붉은 곰팡이의 후보 유전자는 벼 발병 단계에서만 특이적으로 발현하는 유전자임을 알 수 있었으며, 특히 F. boothii GWS263 균주의 GWC1CG08670 유전자의 경우 3일차 발현이 6일과 9일에 비해 현저히 높아, 붉은 곰팡이병 감염의 초기 검출에 매우 특이적인 것을 알 수 있었다. 또한, F. asiaticum SCKO4 균주의 FASG_00961 유전자의 경우도 3일차 발현이 6일과 9일에 비해, 상대적으로 높아, 붉은 곰팡이병 감염의 초기 검출에 매우 특이적인 것을 알 수 있었다. 아울러, 상기 유전자들을 검출하기 위한 서열번호 1과 2의 프라이머 역시 3종의 후보 유전자의 효율적인 발현양 검출에 유용한 것을 알 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation <120> Composition for diagnosing Fusarium Head Blight <130> DP20160402 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 ccctgcctac ttcaacgact ctca 24 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gacctcgaag ataccctcct caa 23 <210> 3 <211> 2164 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Fusarium asiaticum SCK04 <400> 3 atgggtcccg ccgtcggtat cgatttgggt accacgtact cttgcgtggg tatcttccgt 60 gaggatcggt aagtttttca atattttatt tccttttacc ctaggatcta aatgtctctc 120 gcttgaacat cgacgctaac ttttacccca gatgtgatat catcgccaac gaccagggta 180 accgaactac cccctcattc gtcggtttca ccgacaccga gcgtctgatt ggtgatgccg 240 ccaagaacca ggtcgccatg aacccccaga acaccgtctt cgacgccaag cgattgatcg 300 gtcgcaagtt cgccgatgct gaggtccagg ccgatatgaa gcacttcccc ttcacaatca 360 tcgacaaggc tggcaagccc gccatcgagg ttgagttcaa gggtgagaag aagaccttca 420 cccccgagga 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gccaagaacg gtcttgagtc ttacgcttac tctctccgca acactctctc 1200 cgaccccaag gtcgaggaga agattgaggc ttccgacaag gagaccctca ctgctgagat 1260 tgacaaggtc gtccagtggc tcgatgacaa ccagcaggct actcgtgagg agtacgagga 1320 gcaccagaag gagctcgagg gcaaggctaa ccccatcatg atgaagttct acggagctgg 1380 tggtgagggt gctcccggtg gcatgcccgg catgcccggc ggccctggtg gcttccctgg 1440 tgctggtggc cccgcccccg gtgccggtgg tgacgatggt cccaccgtcg aggaggtcga 1500 ctaa 1504

Claims

서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 구성된 프라이머를 포함하며,
상기 프라이머는 푸사리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum)에서 발현하는 서열번호 3으로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)에서 발현하는 서열번호 4로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 푸사리움 부시아이(Fusarium boothii)에서 발현하는 서열번호 5로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 증폭하는, 붉은 곰팡이병원균 검출용 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 붉은 곰팡이병원균은 벼 발병 단계에서 특이적으로 발현하는 것인, 붉은 곰팡이병원균 검출용 조성물.
제1항의 조성물을 포함하는, 붉은 곰팡이병원균 검출용 키트.
서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 구성된 프라이머를 포함하며,
상기 프라이머는 푸사리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum)에서 발현하는 서열번호 3으로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)에서 발현하는 서열번호 4로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 푸사리움 부시아이(Fusarium boothii)에서 발현하는 서열번호 5로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 증폭하는, 붉은 곰팡이병 진단용 조성물.
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제6항에 있어서, 상기 붉은 곰팡이병은 벼 발병 단계에서 특이적으로 발현하는 것인, 붉은 곰팡이병 진단용 조성물.
제6항의 조성물을 포함하는, 붉은 곰팡이병 진단용 키트.
(a) 붉은 곰팡이병원균의 감염이 의심되는 벼의 시료로부터 gDNA를 수득하는 단계;
(b) 제1항의 조성물 또는 제5항의 키트를 이용하여 상기 수득한 gDNA로부터 서열번호 3 내지 5로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 서열번호 3 내지 5로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 증폭되는 경우 붉은 곰팡이병원균이 감염된 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 붉은 곰팡이병원균의 감염여부를 검출하는 방법.
(a) 붉은 곰팡이병의 발병이 의심되는 벼의 시료로부터 gDNA를 수득하는 단계;
(b) 제6항의 조성물 또는 제10항의 키트를 이용하여 상기 수득한 gDNA로부터 서열번호 3 내지 5로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계; 및
(C) 상기 서열번호 3 내지 5로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 증폭되는 경우 붉은 곰팡이병이 발병된 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 붉은 곰팡이병의 진단방법.
푸사리움 아시아티쿰(Fusarium asiaticum)에서 발현하는 서열번호 3으로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum)에서 발현하는 서열번호 4로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 푸사리움 부시아이(Fusarium boothii)에서 발현하는 서열번호 5로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위한, 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트.
제13항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 붉은 곰팡이병을 검출하기 위한 것인, 프라이머 세트.
제13항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 붉은 곰팡이병을 진단할 수 있는 것인, 프라이머 세트.