CN101906466B

CN101906466B - 瓜类主要病原菌的多重pcr检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN101906466B
Application number: CN2009100523696A
Authority: CN
Inventors: 王伟; 高永洋; 王楠; 尹丹韩; 唐建辉
Original assignee: SHANGHAI WEIZHI BIO-TECH Co Ltd; East China University of Science and Technology
Current assignee: SHANGHAI WEIZHI BIO-TECH Co Ltd; East China University of Science and Technology
Priority date: 2009-06-02
Filing date: 2009-06-02
Publication date: 2012-11-07
Anticipated expiration: 2029-06-02
Also published as: CN101906466A

Abstract

本发明提供了用于特异性检测样品中是否存在瓜类主要病原菌的组合物、检测试剂盒和检测方法。本发明利用多重PCR技术检测西瓜上的重要病害，能够同时检测出五种瓜类病害，建立了瓜主要病害的多重PCR检测技术，不但准确、快速、可靠，而且相对与单重PCR检测经济简便，能大大节约检测成本。

Description

瓜类主要病原菌的多重PCR检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本申请涉及生物技术领域，尤其是生物检测领域。具体而言，本申请涉及瓜类主要病害的多重PCR检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

瓜类枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)、瓜类蔓枯病(Didymella bryoniae，国内报道多为Mycosphaerella meloni)、瓜类菌核病(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)deBary)、瓜类炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)和瓜黑星病(Cladosporiumcucumerinum)是常见的、重要的五种瓜类作为上的病害。这五种病害传播途径、发病初期症状和发病条件相似，都可以通过土壤带菌进行侵染，土壤、病残体、流水、风雨均可使病害传播。一旦病害发生，就会严重减产，甚至绝收。

由于防治每种病害的药剂有很多差异，所以在发病初期或在田间土壤中同时鉴定病害的种类，对预测病害的发生情况、及时采取有效的防治方法控制病原菌传播，减少瓜农损失具有重要意义。利用传统的病原菌鉴定方法从发病植物或栽培土壤中分离鉴定病原菌的时间比较长，程序繁琐，从发病初期植株的病原菌分离鉴定需要几天的时间，如这几天中遇到有利于病害发生的天气，那么病害就会迅速扩散，错过最佳防治时期。

随着分子生物学的发展，已有许多分子技术用于植物炭疽病的检测，多重PCR是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增，可用于同时检测多种病原菌。目前国内外利用多重PCR体系检测植物病害的很少报道，由于这五种病害是瓜类上的非常重要的病害，所以在国内已经引起重视，但是能够同时检测鉴定出瓜类五种主要病害的分子检测在国内外尚未报道，仅有的几篇文献报道主要是通过单重PCR检测，单一的鉴定瓜类炭疽病、枯萎病、蔓枯病、菌核病^[1-4]，但由于这五种病害传播途径、发病症状和发病条件相似，都可以通过土壤带菌进行侵染，土壤、病残体、流水、风雨均可使病害传播，而且在田间经常表现为复合侵染，利用单一PCR检测对多种病害进行系统检测，工作量大，加大了对病害检测鉴定的难度，所以多重PCR技术在瓜类病害检测中的优越性就更加明显。

发明内容

为了克服上述难题，本发明的目的是提供一种用于同时检测瓜类(尤其是西瓜)主要病原菌的检测试剂盒和检测方法。

具体而言，本发明第一方面提供了一种用于特异性检测样品中是否存在瓜类主要病原菌的组合物，其特征在于，所述组合物包含至少3对选自以下的引物对：

第一引物对：SEQ ID NO：1所述的序列和SEQ ID NO：2所示的序列；

第二引物对：SEQ ID NO：3所述的序列和SEQ ID NO：4所示的序列；

第三引物对：SEQ ID NO：5所述的序列和SEQ ID NO：6所示的序列；

第四引物对：SEQ ID NO：7所述的序列和SEQ ID NO：8所示的序列；

第五引物对：SEQ ID NO：9所述的序列和SEQ ID NO：10所示的序列。

另一方面，本发明提供了一种用于特异性检测样品中是否存在瓜类主要病原菌的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含PCR反应体系，所述PCR反应体系包含本发明所述的组合物。

本发明还有一个方面提供了一种检测样品中是否存在瓜类主要病原菌的方法，该方法包括以下步骤，

a)用上述的PCR检测试剂盒对样品进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

b)测定步骤a)获得的PCR扩增产物的大小，若产物中存在190bp的DNA片段，则表明所述样品中瓜黑星病菌；若产物中存在327bp的DNA片段，则表明所述样品中瓜枯萎病菌；若产物中存在442bp的DNA片段，则表明所述样品中瓜蔓枯病菌；或产物中存在216bp的DNA片段，则表明所述样品中瓜炭疽病菌；若产物中存在278bp的DNA片段，则表明所述样品中瓜菌核病菌。

本发明利用多重PCR技术检测西瓜上的重要病害，能够同时检测出五种瓜类病害，建立了西瓜主要病害的多重PCR检测技术，不但准确、快速、可靠，而且相对与单重PCR检测经济简便，能大大节约检测成本，体现了多重PCR的优越性。

附图说明

图1显示了采用引物对SSFWD/SSREV、Fn-1/Fn-2和Mn-1/Mn-2的特异性扩增产物，其中M：L2000分子量标记；泳道1：阴性对照；泳道2-3：Fusarium oxysporum、Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary、Didymella bryoniae分离物；泳道4-9：其它不同真菌的分离物。

图2显示用引物对RB/RC、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2的特异性扩增产物，其中M：L2000分子量标记；泳道1：阴性对照；泳道2-3：Fusarium oxysporum、Colletotrichumorbiculare、Didymella bryoniae分离物；泳道4-9：其它不同真菌的分离物。

图3显示了用引物SSFWD/SSREV、Fn-1/Fn-2和Mn-1/Mn-2进行分子检测的灵敏度，图3a、3b和3c分别显示了对不同浓度的DNA用引物SSFWD/SSREV、Fn-1/Fn-2和Mn-1/Mn-2进行PCR检测的灵敏度，其中M：L2000分子量标记；泳道1：阴性对照；泳道2-9：在25μl PCR反应中浓度为30ng、3ng、300pg、30pg、3pg、300fg、30fg、3fg的DNA的扩增产物。

图4显示了用引物对SSFWD/SSREV、Fn-1/Fn-2和Mn-1/Mn-2对不同浓度的DNA进行PCR检测的灵敏度，其中M：L2000分子量标记；泳道1-8：在25μl PCR反应中浓度为30ng、3ng、300pg、30pg、3pg、300fg、30fg、3fg的DNA的扩增产物。

图5a、5b和5c分别显示了用引物对RB/RC、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2对不同浓度的DNA进行PCR检测的灵敏度，其中M：L2000分子量标记；泳道1：阴性对照；泳道2-9：在25μl PCR反应中浓度为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg的DNA的扩增产物。

图6显示了用引物对RB/RC、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2对不同浓度的DNA进行PCR检测的灵敏度，其中M：L2000分子量标记；泳道1：阴性对照；泳道2-9：在25μl PCR反应中浓度为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg的DNA的扩增产物。

图7显示了用PCR从感染的西瓜组织中特异性扩增得到的产物，其中M：L2000分子量标记；泳道1：阴性对照；泳道2-5：受感染的果实；泳道6-9：无病原菌的果实；

图8显示了用PCR从受感染的西瓜组织得到的特异性扩增产物，其中M：L2000分子量标记；泳道1：阴性对照；泳道2-6：受感染的果实。

具体实施方式

多重PCR相对单重PCR有很多优点，能够节省时间，节省试剂，节约经费开支，为病害的预测和防治提供更多更准确的诊断信息。单重PCR检测，当引物针对的序列发生了突变时则可能出现假阴性结果，而针对同种病原的多重PCR检测，因为针对的是多个基因，同时在多个位点发生变异的可能性很小，能大大降低假阴性出现的概率^[10-11]。

多重PCR反应体系较难建立，要求确保反应中的引物之间不会发生相互作用，扩增产物大小相近但又能通过电泳分开。多重PCR扩增对试验操作要求很高，任何一种实验条件控制不当，都将很容易导致扩增条件的失败。国内报道的多重PCR体系的建立，大多数都是针对同一DNA模板的不同区域扩增多个片段，针对不同模板的多重PCR体系的建立很少，特别是检测不同植物病原菌多重PCR体系的建立非常少见，ZhengguangZhang^[3]把西瓜枯萎病菌和西瓜蔓枯病菌的两对特异性引物置于同一反应管中进行PCR扩增，通过优化反应条件，在一次反应中即可将两种病原物成功地检测出来。但是三重PCR的体系建立比两重PCR的建立难很多。解建云等^[12]采用与单一PCR相同的反应条件，对近交系小鼠进行两重和三重PCR检测，结果两重PCR获得预期结果，而三重PCR出现干扰现象，因此认为在不改变PCR反应条件时，进行两重PCR比较容易获得预期结果，而对三重或以上的PCR扩增比较困难。本发明者通过引物组合，对多重PCR体系优化，成功建立五、四、三重PCR检测体系，能够一次性检测出多种病害，不但能快速、简洁、准确地检测病害，而且能大大节约检测成本。

具体的说，本发明第一方面提供了一种用于特异性检测样品中是否存在瓜类主要病原菌的组合物，其特征在于，所述组合物包含至少3对选自以下的引物对：

	真菌	引物序列	产物	序列编号
					第一引物对	Colletotrichum orbiculare	RB：5GCTGTCACTTTGTGGTGTG-3RC：5TGTCGTAGCCCATCTTGTC-3	216bp	SEQ ID NO：1SEQ ID NO：2
第二引物对	Fusarium oxysporum	Fn-1：5′-TACCACTTGTTGCCTCGGC-3′Fn-2：5′-TTGAGGAACGCGAATTAAC-3′	327bp	SEQ ID NO：3SEQ ID NO：4
					第三引物对	Didymella bryoniae	Mn-1：5′-GGATCATTACCTAGAGTTG-3′Mn-2：5′-ACGTCGTCGTFGTGAGTG-3′	442bp	SEQ ID NO：5SEQ ID NO：6
第四引物对	Sclerotinia sclerotiorum	SSFWD：5′-GCTGCTCTTCGGGGCCTTGTATGC-3′SSREV：5′-TGACATGGACTCAATACCAAGCTG-3′	278bp	SEQ ID NO：7SEQ ID NO：8
					第五引物对	Cladosporium cucumerinum	HX-1：5′-TGTTGTCCGACTCTGTTGC-3′HX-2：5′-CATTTCGCTGCGTTCTTC-3′	190bp	SEQ ID NO：9SEQ ID NO：10

例如，所述组合物包含所述第一引物对，所述第二引物对和所述第三引物对；或者，所述组合物包含所述第二引物对，所述第三引物对和所述第四引物对；或者所述组合物包含所述第二引物对、所述第三引物对和所述第五引物对。

在一个较佳的实施方案中，所述组合物包含上述5对引物中的至少4对。例如，所述组合物包含所述第一引物对，所述第二引物对，所述第三引物对，和所述第四引物对；或者，所述组合物包含所述第一引物对，所述第二引物对，所述第三引物对，和所述第五引物对；或者，所述组合物包含所述第一引物对，所述第二引物对，所述第四引物对和所述第五引物对；或者，所述组合物包含所述第一引物对，所述第三引物对，所述第四引物对和所述第五引物对；或者，所述组合物包含所述第二引物对，所述第三引物对，所述第四引物对和所述第五引物对。在更优选的实施方案中，所述组合物包含所述第一引物对，所述第二引物对，所述第三引物对，和所述第五引物对。

在最佳的实施方案中，所述组合物包含所有全部5对引物对。

本发明所用的术语“包含”的含义包括“含有”和“由......构成”，例如“包含”X的组合物可以完全由X构成，或者可以含有X之外的物质，例如X+Y。当采用“所述组合物包含所述第一引物对，所述第二引物对和所述第三引物对”的表述时，“所述组合物由所述第一引物对，所述第二引物对和所述第三引物对组成”的含义也已经清楚地表示在所述表述中。

本文中的术语“瓜类主要病原菌”是指：瓜类枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)、瓜类蔓枯病(Didymella bryoniae，国内报道多为Mycosphaerella meloni)、瓜类菌核病(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)、瓜类炭疽病菌(Colletotrichumorbiculare)和瓜黑星病(Cladosporium cucumerinum))。

本发明的引物可用任何已知的方法产生，例如Matteucci等人[J.Am.Chem.Soc.(1981)103：3185]的三酯合成方法或Urdea等人[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80：7461]的方法，或用市售的自动寡核苷酸合成仪合成。另外，还可以根据偏好选择引物的化学特征。对于某些应用，DNA或RNA是合适的。对于其它的应用，还可以加入修饰，例如骨架修饰，如硫代磷酸酯或甲基磷酸酯，改变RNA亲和力，增加核酶抗性等[例如参见Agrawal和Iyer(1995)Curr Opin Biotechnol 6：12-19；Agrawal(1996)TIBTECH 14：376-387]；还可采用类似物如肽核酸[例如参见Corey(1997)TIBTECH 15：224-229；Buchardt等人(1993)TIBTECH 11：384-386]。

本发明另一方面提供了一种用于特异性检测样品中是否存在瓜类主要病原菌的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含PCR反应体系，所述PCR反应体系包含了前述任一组合物。

本发明中所用的术语“PCR”或“聚合酶链反应”指一种过程或技术(如美国专利No.4,683,195(1987年7月28日授权)中所述的那样)。通常，需要获得感兴趣区域两端或其外延的序列信息，从而可以设计寡核苷酸引物；这些引物应与待扩增模板相反链的序列相同或相似。两个引物的5′端核苷酸可以与扩增材料的两端恰好重合。PCR技术可用来扩增全部基因组DNA中的、从全细胞RNA、噬菌体或质粒序列等转录获得的cDNA中的特定RNA序列、特定DNA序列。见Mullis等，Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.51：263(1987)；Erlich编辑，PCR Technology(Stockton Press，NY，1989)。聚合酶链反应技术是本领域技术人员熟知的一种检测少量靶核酸的手段。类似试验在Mullis等人[Meth.Enzymol.(1987)155：335-350]；美国专利4,683,195和4,683,202中有所描述。用两个“引物”核苷酸与靶核酸杂交，并用来引导反应。引物可包含不与扩增靶序列(或其互补序列)杂交的序列，以帮助双链体的稳定性，或例如可插入一个简便的限制性位点。为了检测出靶核酸的存在，特异性引物的选择是至关重要的。

本领域技术人员能够根据熟知的技术合适的选择本发明试剂盒中的PCR反应体系。另外，本发明的PCR检测试剂盒中还可附带操作说明书。

本发明另一方面还提供了一种检测样品中是否存在瓜类主要病原菌的方法，该方法包括以下步骤，a)用前述PCR检测试剂盒对样品进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；b)测定步骤a)获得的PCR扩增产物的大小，若产物中存在190bp的DNA片段，则表明所述样品中瓜黑星病菌；若产物中存在327bp的DNA片段，则表明所述样品中瓜枯萎病菌；若产物中存在442bp的DNA片段，则表明所述样品中瓜蔓枯病菌；或产物中存在216bp的DNA片段，则表明所述样品中瓜炭疽病菌；若产物中存在278bp的DNA片段，则表明所述样品中瓜菌核病菌。

在所述方法中，样品可以是例如，但不局限于，瓜类植株的子叶、幼茎、真叶、茎、荚及种子，较佳的是上述植株组织的DNA提取物。所述DNA提取物可用市售的DNA提取试剂盒或其他常规的DNA提取方法获得。应当理解，本发明方法适用的瓜并不局限于西瓜和黄瓜，其还可包括甜瓜、冬瓜、瓤瓜、苦瓜、南瓜、西葫芦和丝瓜。在另一较佳的实施方案中，所述样品也可以来自土壤或其他怀疑含有所述瓜类主要病原菌的任何其它形式的样品。

PCR扩增反应可在任何常规市售的PCR扩增仪器(例如PTC-200PCR仪)上进行。

在PCR反应条件中，退火温度是影响PCR实验的重要的一个因素，对于多重PCR反应来说，由于要兼顾三对引物的反应，退火温度的选择更是非常的重要，适当的退火温度是多重PCR体系的建立关键因素。对于在多重PCR中扩增出同样的基因，将退火温度降低4℃-6℃是必需的，假如没有达到扩增效果，没有得到条带，有时甚至要降低10℃-12℃才能满足多重扩增的要求。对于由于降低退火温度带来的非特异性扩增，多重反应中并发的其他基因的特异扩增会消除非特异性扩增的影响，假如出现非特异扩增，可以适度提高退火温度解决。

将引物混合在同一反应中，同时扩增多个基因，根据反应结果对某些反应参数进行改变或优化，初次进行多重反应时，因为不知道哪些引物的浓度或是哪些参数需要改变，所以各种引物按相等的摩尔数添加是很有必要的。根据扩增结果改变各个引物的量。在优化好退火温度的基础上，进行引物量、延伸温度、延伸时间和模板量等因素的调节，最终实现多重PCR的反应体系和反应条件的优化。延伸温度的减低能够增加PCR产物的量，高的延伸温度会减少某些基因的扩增。延长延伸时间时，所有基因的PCR产物量都会增加。当模板的量比较低时，增加模板可以增加PCR产物的量。参照这些经验来逐步实现对多重PCR体系的优化。

在本实验对三重PCR反应体系优化过程中发现，退火温度和引物量这两个因素对三重PCR反应结果的影响最大，是多重PCR反应条件中的关键因素。

在一个较佳的实施方案中，所述PCR反应体系包含所述第一引物对，所述第二引物对，所述第三引物对，所述第四引物对和所述第五引物对；所述PCR的反应体系，以总体积为25μl计，含有ExTaq酶12.5μl，10μM的所述第一引物对引物各0.6μl，10μM的所述第二引物对引物各0.5μl，10μM的所述第三引物对引物各0.7μl，10μM的所述第四引物对引物各0.5μl，10μM的所述第五引物对引物各0.6μl，模板各1μl；所述步骤a)的扩增包括：94℃预变性6分钟，进入循环，94℃变性30S，42℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共40个循环，最后72℃延伸10分钟。

在另一较佳的实施方案中，所述PCR反应体系包含所述第一引物对，所述第二引物对，所述第三引物对和所述第五引物对；所述PCR的反应体系，以总体积为25μl计，含有ExTaq酶12.5μl，10μM的所述第一引物对引物各0.6μl，10μM的所述第二引物对引物各0.5μl，10μM的所述第三引物对引物各0.7μl，10μM的所述第五引物对引物各0.5μl，模板各1μl；所述步骤a)的扩增包括：94℃预变性6分钟，进入循环，94℃变性30S，44℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共40个循环，最后70℃延伸10分钟。

在还有一个较佳的实施方案中，所述PCR反应体系包含所述第一引物对，所述第二引物对和所述第三引物对；所述PCR的反应体系，以总体积为25μl计，含有ExTaq酶12.5μl，10μM的所述第一引物0.5μl，10μM的所述第二引物0.5μl，10μM的所述第三引物0.6μl，模板各1μl。所述扩增步骤a)包括：94℃预变性6分钟，进入循环，94℃变性30S，44～46℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共40个循环，最后72℃延伸10分钟。

在还有一个较佳的实施方案中，所述PCR反应体系包含所述第二引物对、所述第三引物对和所述第四引物对；所述PCR的反应体系，以总体积为25μl计，含有ExTaq酶12.5μl，10μM的所述第四引物0.5μl，10μM的所述第二引物0.5μl，10μM的所述第三引物0.6μl，模板各1μl。所述扩增步骤a)包括：94℃预变性6分钟，进入循环，94℃变性30S，44～46℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共40个循环，最后72℃延伸10分钟。

上述实施方案中的具体数值点仅仅是起列举作用，而没有限定作用。本领域技术人员能够理解，在距所述具体数值±5％的范围内的数值也应当能实现相同/相似的目的，产生相同/相似的效果，这些技术方案也均在本发明的等价范围内。另外，本领域技术人员也可以根据具体的试验条件、扩增设备等对上述过程加以改变。这些都在本领域技术人员的常规试验能力范围之内。

在用PCR扩增方法得到了扩增产物后，可采用常规方法，如凝胶电泳(如琼脂糖凝胶电泳)测定PCR扩增产物的大小。如果可以的话，还可以采用更为精确的测定方法，如对产物进行测序等。在本发明的一个具体实施方案中，采用的是方法是取5μl样品在3.0％的琼脂糖凝胶于0.5×TAE中电泳，并用Bio-rad凝胶成像系统照相。如果结果显示上述两对引物成功扩增出了具有预计长度的条带，则表明所述样品中有目标病原菌。应当理解的是，病原菌的DNA序列可能会发生各种变异(如缺失、增加或取代)，因此实际测得的扩增产物的长度可能会与上述长度有一定的差别。所以，本发明说明书通篇中所用的长度“XXX bp”的含义并不仅仅表示这些长度本身，而是包括了在所述长度附近(例如相差20个bp或更多，较佳为相差10个bp，更佳为相差5个bp的)的长度。

本发明从植物病组织DNA的提取，到多重PCR体系对模板的扩增，整个实验检测需要12个小时的时间就能检测出结果，能够及时做到对病害的预防和监测，确保有力预防病害的发展和蔓延，减少经济损失。而且，本发明能够一次性检测出多种瓜类主要病害，不但能快速、简洁、准确地检测病害，而且能大大节约检测成本，所以具有较强的应用价值。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

实施例

1材料与方法：

1.1菌种和病样：

下表1列出了用于特异性引物筛选的供试真菌菌株以及扩增结果。

表1

注：+为有扩增产物；-为无扩增产物。

1.2菌丝体培养与收集

将供试的西瓜枯萎病菌、西瓜蔓枯病菌、西瓜菌核病和西瓜炭疽病菌在PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)平板上，26℃培养7天后，从菌落边缘切取菌丝块转至马铃薯葡萄糖液体培养基中(每250ml锥形瓶中装100ml培养液)，28℃，100rpm振荡培养7天，过滤收集菌丝，经冷冻抽干研磨成菌丝粉，-20℃保存备用。

1.3基因组DNA的提取

1.3.1菌丝基因组DNA的提取，根据Sun等^[5]方法改进优化：

A、0.008g菌丝粉样品，石英砂研钵研磨，移至1.5毫升管，加25微升20％SDS(十二烷基硫酸钠)，加700微升提取液，50微升溶菌酶，旋涡混匀；

B、37℃水浴30分钟，加700微升氯仿∶异戊醇(24∶1)，小心混合，12000rpm(转/分钟)离心5分钟；

C、取上清液，加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，小心混合，12000rpm离心5分钟；

D、取上清液，加等体积的异戊醇，10％体积的醋酸钠(pH5.2)溶液，-20℃沉淀20分钟；

E、12000rpm离心5分钟，弃上清液，用70％乙醇洗沉淀3次，干燥后加100微升TE(核苷酸保存缓冲液，主要成分是Tris-HCl和EDTA)充分溶解，-20℃保存。

1.3.2发病组织DNA的快速提取：根据Hong等^[6]的方法改进优化：取一段新发病的植物组织(叶片或瓜肉)，每毫克组织加入20μl 0.5M NaOH，在研钵中充分研磨后转移至1.5ml的Eppendorf管中，12000rpm离心5分钟，取5μl上清液加入495μl 0.1mM Tris缓冲液(PH8.0)，混匀后取1μl直接用于PCR反应。

1.3.3土壤DNA的提取，参照Reddy法并加以改进^[7-9]：(1)称取0.6g土样，适量石英砂研磨，加入5ml磷酸缓冲液洗涤土样，反复洗涤3次；(2)在洗涤后的土样中，加入3ml裂解缓冲液和500μl溶菌酶(20mg·ml^-1)，轻轻振荡悬浮土样，置于37℃水浴中温浴2h；(3)加入15μl蛋白酶K(20mg·ml^-1)，轻轻颠倒混匀，置于37℃水浴中温浴30分钟；(4)再加入125μl 20％SDS和0.15g PVPP(固体)，65℃水浴2h；(5)4000r·min^-1离心10分钟(4℃)，收集上清液；(6)用等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提2次，再用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1次；(7)取水相，加入1/3体积的40％PEG-8000，使PEG-8000的终浓度为10％(调整NaCl浓度在0.8-1mol·L^-1范围内)，4℃沉淀DNA 2h；(8)12000r·min^-1离心10分钟(4℃)，收集DNA沉淀；(9)用70％乙醇洗涤沉淀，最后用200μl TE溶解。

1.4核糖体基因转录间隔区ITS的PCR扩增和序列测定

采用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物ITS1(5-TCC GTA GGT GAACCT GCG G-3)和ITS4(5 TCC TCC GCT TAG ATA TGC-3)在PCR仪上扩增ITS1/5.8S/ITS2区域。对与菌核病Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary的ITS区域扩增采用ITS通用引物ITS4(5-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3)和ITS5(5-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3)进行扩增。

PCR的反应混合液的总体积为25μl：包括2.5μl 10×PCR反应缓冲液，2μl 2.5mM Mg²⁺，20μM的引物各0.25μl，4种浓度为2.5mM的dNTP各1μl，1.25单位Taq酶，模板DNA若干，离心后加1滴石蜡油。反应程序为：94℃预变性5分钟，进入循环，94℃变性45S，55℃退火30S，72℃延伸1分钟，共32个循环，最后72℃延伸7分钟。反应结束后，取8μl样品在1.0％的琼脂糖凝胶于1×TAE中电泳，并用Bio-rad凝胶成像系统照相。

1.5多重PCR引物组合

本实施例所用的引物组合如表2和表3所示：

表2

真菌	引物序列	产物(bp)
			Colletotrichumorbiculare	RB：5GCTGTCACTTTGTGGTGTG-3RC：5TGTCGTAGCCCATCTTGTC-3	216
Fusarium oxysporum	Fn-1：5′-TACCACTTGTTGCCTCGGC-3′Fn-2：5′-TTGAGGAACGCGAATTAAC-3′	327
			Didymella bryoniae	Mn-1：5′-GGATCATTACCTAGAGTTG-3′Mn-2：5′-ACGTCGTCGTTGTGAGTG-3′	442

表3

真菌	引物序列	产物(bp)
			Sclerotinia sclerotiorum	SSFWD：5′-GCTGCTCTTCGGGGCCTTGTATGC-3′SSREV：5′-TGACATGGACTCAATACCAAGCTG-3′	278
Fusarium oxysporum	Fn-1：5′-TACCACTTGTTGCCTCGGC-3′Fn-2：5′-TTGAGGAACGCGAATTAAC-3′	327
			Didymella bryoniae	Mn-1：5′-GGATCATTACCTAGAGTTG-3′Mn-2：5′-ACGTCGTCGTTGTGAGTG-3′	442

1.6多重PCR体系的优化

设定10个退火温度梯度：40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃。对延伸时间设定四个时间梯度：1分钟、1.5分钟、2分钟、2.5分钟。循环次数的优化：循环次数选择20、25、30、35、40和45次进行多重PCR体系的优化。

根据所得的扩增产物条带亮度，对引物量进行优化，条带亮度弱的，适当增加引物量：对于SSFWD/SSREV、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2组成的三重PCR反应体系，增加10μM引物Mn-1/Mn-2的量，设定三个梯度：0.6μl、0.7μl、0.8μl；对于引物RB/RC、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2组成的三重PCR反应体系，设定10μM引物RB、RC的量的三个梯度：0.7μl、0.8μl、0.9μl，设定10μM引物Mn-1、Mn-2的量的三个梯度：0.6μl、0.7μl、0.8μl，做正交实验。

最终优化出引物SSFWD/SSREV、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2组成的三重PCR的反应混合液总体积为25μl：ExTaq酶12.5μl，10μM的引物SSFWD、SSREV、Fn-1、Fn-2、Mn-1、Mn-2分别为0.5μl、0.5μl、0.5μl、0.5μl、0.6μl、0.6μl，模板各1μl。反应程序：94℃预变性6分钟，进入循环，94℃变性30S，46℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共40个循环，最后72℃延伸10分钟。

优化出引物RB/RC、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2组成的三重PCR的反应混合液总体积为25μl：ExTaq酶12.5μl，10μM的引物RB、RC、Fn-1、Fn-2、Mn-1、Mn-2分别为0.8μl、0.8μl、0.5μl、0.5μl、0.6μl、0.6μl，模板各1μl。反应程序：94℃预变性6分钟，进入循环，94℃变性30S，44℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共40个循环，最后70℃延伸10分钟。

优化出引物Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2、HX-1/HX-2、RB/RC组成的四重PCR反应体系的反应混合液总体积为25μl：ExTaq酶12.5μl，10μM的引物分别为0.5μl、0.5μl、0.7μl、0.7μl、0.5μl、0.5μl、0.6μl、0.6μl，模板各1μl。反应程序：94℃预变性6分钟，进入循环，94℃变性30S，44℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共40个循环，最后70℃延伸10分钟。

优化出全部5个引物SSFWD/SSREV、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2、HX-1/HX-2、RB/RC组成的五重PCR的反应混合液总体积为25μl：ExTaq酶12.5μl，10μM的引物分别为0.5μl、0.5μl、0.5μl、0.5μl、0.7μl、0.7μl、0.5μl、0.5μl、0.6μl、0.6μl，模板各1μl。反应程序：94℃预变性6分钟，进入循环，94℃变性30S，42℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共40个循环，最后72℃延伸10分钟。

反应结束后，取5μl样品在3.0％的琼脂糖凝胶于0.5×TAE中电泳，并用Bio-rad凝胶成像系统照相。

1.7多重PCR反应灵敏度检测：

将所培养的枯萎病菌、蔓枯病菌、菌核病菌和炭疽病菌液冷冻抽干，利用优化好的尿素法提取基因组DNA，根据核算定量仪测定基因组DNA的核苷酸浓度，将基因组DNA模板浓度调至10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg，在优化好的多重PCR条件下扩增，根据扩增产物的电泳情况，确定反应灵敏度。

1.8西瓜病害的植物组织检测和田间检测

植物组织检测：分别取0.5g发病的枯萎病、蔓枯病、菌核病、炭疽病植物组织，液氮研磨后，用改进后的CTAB法提取染病组织基因组DNA.然后利用优化好的多重PCR体系扩增检测。

田间检测：上海市南汇区惠南镇西瓜保护地取土样，重病区、轻病区和无病区分别取三次，利用优化好的多重PCR体系进行检测。

2结果与分析

2.1ITS通用引物对三种病原菌的PCR扩增测序结果：

ITS通用引物ITS1/ITS4对供试的西瓜炭疽病菌、枯萎病菌、蔓枯病菌扩增，ITS通用引物ITS4/ITS5经过测序得到各自的ITS序列，测序结果在NCBI上BLAST比对，结果如表4所示：

表4

2.2三重PCR反应特异性检测

按照1.6中的引物SSFWD/SSREV、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2组成的三重PCR反应体系，同时扩增供试的黄瓜菌核病菌、枯萎病菌、蔓枯病菌的基因组DNA，能够同时扩增出278bp、327bp、442bp的条带，而相关或近似菌株及空白对照均无扩增条带(图1)。按照1.6中引物RB/RC、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2组成的三重PCR反应体系，同时扩增供试的西瓜炭疽病菌、枯萎病菌、蔓枯病菌的基因组DNA，能够同时扩增出216bp、327bp、442bp的条带，而相关或近似菌株及空白对照均无扩增条带(图2)。

2.3引物SSFWD/SSREV、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2组成的三重PCR体系检测灵敏度

将基因组DNA从10ng/μl开始依次10倍往下稀释至1fg/μl，每浓度取1μl为模板，用优化好的三重PCR体系进行PCR扩增。结果表明在25μl的反应体系中，引物SSFWD/SSREV、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2扩增单个模板时，能够清楚的检测到10pg/μl的基因组DNA(图3)，引物SSFWD/SSREV、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2同时0扩增三个模板时，能够检测到300pg/μl的基因组DNA(图4)。引物RB/RC、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2扩增单个模板时，能够清楚的检测到10pg/μl的基因组DNA(图5)，引物RB/RC、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2同时扩增三个模板时，能够检测到300pg/μl的基因组DNA(图6)。

2.4组成的三重PCR体系检测发病植物组织

按照1.3.2中的方法从发病的西瓜炭疽病、枯萎病、蔓枯病和菌核病植物组织上以及健康的西瓜组织上快速提取DNA，用优化好的三重PCR体系进行检测。结果显示，引物RB/RC、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2组成的三重PCR同时检测三个发病植物组织可以扩增出442bp、327bp和216bp三条条带，单独检测发病能得到相应的条带(图7)。引物SSFWD/SSREV、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2组成的三重PCR体系同时检测三个发病植物组织可以扩增出442bp、327bp和278bp三条条带，单独检测发病也能得到相应的条带(图8)。

2.5田间检测结果

按照1.3.3中提取土壤DNA的方法从上海市南汇区惠南镇发病的西瓜保护地取土样，重病区、轻病区和无病区分别取三次，利用优化好的三重PCR体系进行检测，结果显示，引物RB/RC、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2组成的三重PCR体系、引物SSFWD/SSREV、Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2组成的三重PCR体系和引物Fn-1/Fn-2单重检测都有扩增产物，能够扩增出327bp的条带。结果表明，西瓜病害为西瓜枯萎病，所建立的三重PCR体系能够成功的检测出土壤中的病原菌。结果如表5所示。

表5

注：+为有扩增产物；-为无扩增产物。

2.6四重PCR反应特异性检测

下表6列出了用来自引物Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2、HX-1/HX-2、RB/RC组成的四重PCR反应体系对供试真菌菌株的扩增结果。

表6

菌株	来源	数量	扩增引物RB/RCFn-1/Fn-2Mn-1/Mn-2HX-1/HX-2
				Fusarium oxysporum f.sp.niveum	河南农业大学	4	+
Fusarium oxysporum f.sp.niveum	山东农业大学	2	+
				Fusarium oxysporum f.sp.niveum	黑龙江园艺所	2	+
Fusarium oxysporum f.sp.niveum	上海南汇土壤分离	4	+
				Fusarium oxysporum f.sp.mveum	上海农科院	2	+
Fusarium oxysporum f.sp.niveum	河北农科院	4	+
				Fusarium oxysporum f.sp.niveum	华东理工大学	2	+
Didymella bryoniae	上海交大	4	+
				Didymella bryoniae	上海农科院	2	+
Didymella bryoniae	华东理工大学	2	+
				Didymella bryoniae	上海农技中心	4	+
Colletotrichum orbiculare	河南农业大学	4	+
				Colletotrichum orbiculare	山东农业大学	4	+

Colletotrichum orbiculare	河北农业大学	3	+
				Colletotrichum orbiculare	上海南汇西瓜分离	2	+
Cladosporium cucumerinum	山西农业大学	4	+
				Cladosporium cucumerinum	沈阳农业大学	4	+
Cladosporium fulvum	山西农业大学	2	-
				Cladosporium fulvum	河北农林科学院	4	-
Cladosporium fulvum	沈阳农业大学	2	-
				Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary	上海交大	2	-
Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary	上海农技中心	2	-
				Corynespora cassiicola	中国农业科学院	2	-
Corynespora cassiicola	华东理工大学	3	-
				Fusarium semitectum	华东理工大学	2	-
Fusarium semitectum	中国农业大学	2	-
				Fusarium graminearum	上海农科院	2	-
Fusarium graminearum	中国农业大学	2	-
				Curvularia lunata	中国农业大学	2	-
Curvularia lunata	上海农科院	2	-

注：+为有扩增产物；-为无扩增产物。

2.7五重PCR反应特异性检测

下表7显示了用来自引物Fn-1/Fn-2、Mn-1/Mn-2、HX-1/HX-2、RB/RC以及SSFWD/SSREV组成的五重PCR反应体系对供试真菌菌株的扩增结果。

表7

菌株	来源	数量	扩增引物RB/RCSSFWD/SSREVFn-1/Fn-2Mn-1/Mn-2HX-1/HX-2
				Fusarium oxysporum f.sp.niveum	河南农业大学	4	+
Fusarium oxysporum f.sp.niveum	山东农业大学	2	+

Fusarium oxysporum f.sp.niveum	黑龙江园艺所	2	+
				Fusarium oxysporum f.sp.niveum	上海南汇	4	+
Fusarium oxysporum f.sp.niveum	上海农科院	2	+
				Fusarium oxysporum f.sp.niveum	河北农林科院	4	+
Fusarium oxysporum f.sp.niveum	华东理工大学	2	+
				Didymella bryoniae	上海交大	4	+
Didymella bryoniae	上海农科院	2	+
				Didymella bryoniae	华东理工大学	2	+
Didymella bryoniae	上海农技中心	4	+
				Colletotrichum orbiculare	河南农业大学	4	+
Colletotrichum orbiculare	山东农业大学	4	+
				Colletotrichum orbiculare	河北农业大学	3	+
Colletotrichum orbiculare	上海南汇分离	2	+
				Cladosporium cucumerinum	山西农业大学	4	+
Cladosporium cucumerinum	沈阳农业大学	4	+
				Cladosporium fulvum	山西农业大学农学院	2	-
Cladosporium fulvum	河北农业大学	4	-
				Cladosporium fulvum	沈阳农业大学	2	-
Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)deBary	上海交大	2	+
				Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)deBary	上海农技中心	2	+
Corynespora cassiicola	中国农科院	2	-
				Corynespora cassiicola	华东理工大学	3	-
Fusarium semitectum	华东理工大学	2	-
				Fusarium semitectum	中国农业大学	2	-
Fusarium graminearum	上海农科院	2	-
				Fusarium graminearum	中国农业大学	2	-
Curvularia lunata	中国农业大学	2	-
				Curvularia lunata	上海农科院	2	-

注：+为有扩增产物；-为无扩增产物。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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序列表

<110>华东理工大学

上海伟智生物科技有限公司

<120>瓜类主要病原菌的多重PCR检测试剂盒及其检测方法

<130>092533

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

gctgtcactt tgtggtgtg 19

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

tgtcgtagcc catcttgtc 19

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

taccacttgt tgcctcggc 19

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

ttgaggaacg cgaattaac 19

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

ggatcattac ctagagttg 19

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

acgtcgtcgttgtgagtg 18

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

gctgctcttc ggggccttgt atgc 24

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

tgacatggac tcaataccaa gctg 24

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

tgttgtccga ctctgttgc 19

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

catttcgctg cgttcttc 18

Claims

1.一种用于特异性检测样品中是否存在瓜类主要病原菌的组合物，其特征在于，所述组合物包含下述引物对中的第一引物对，所述第二引物对，所述第三引物对和所述第五引物对：

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含第四引物对：

第四引物对：SEQ ID NO：7所述的序列和SEQ ID NO：8所示的序列。

3.一种用于特异性检测样品中是否存在瓜类主要病原菌的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含PCR反应体系，所述PCR反应体系包含权利要求1-2任一项所述的组合物。

4.一种检测样品中是否存在瓜类主要病原菌的方法，该方法包括以下步骤，

a)用权利要求3所述的PCR检测试剂盒对样品进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

b)测定步骤a)获得的PCR扩增产物的大小，若产物中存在190bp的DNA片段，则表明所述样品中有瓜黑星病菌；若产物中存在327bp的DNA片段，则表明所述样品中有瓜枯萎病菌；若产物中存在442bp的DNA片段，则表明所述样品中有瓜蔓枯病菌；或产物中存在216bp的DNA片段，则表明所述样品中有瓜炭疽病菌；若产物中存在278bp的DNA片段，则表明所述样品中有瓜菌核病菌。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述样品是瓜组织或其DNA提取物，所述瓜选自西瓜、甜瓜、黄瓜、冬瓜、瓤瓜、苦瓜、南瓜、西葫芦和丝瓜。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR反应体系包含所述第一引物对，所述第二引物对，所述第三引物对，所述第四引物对和所述第五引物对；所述PCR的反应体系，以总体积为25μl计，含有ExTaq酶12.5μl，10μM的所述第一引物对引物各0.6μl，10μM的所述第二引物对引物各0.5μl，10μM的所述第三引物对引物各0.7μl，10μM的所述第四引物对引物各0.5μl，10μM的所述第五引物对引物各0.6μl，模板各1μl；所述步骤a)的扩增包括：94℃预变性6分钟，进入循环，94℃变性30S，42℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共40个循环，最后72℃延伸10分钟。

7.如权利要求4所述的方法，所述PCR反应体系包含所述第一引物对，所述第二引物对，所述第三引物对和所述第五引物对；所述PCR的反应体系，以总体积为25μl计，含有ExTaq酶12.5μl，10μM的所述第一引物对引物各0.6μl，10μM的所述第二引物对引物各0.5μl，10μM的所述第三引物对引物各0.7μl，10μM的所述第五引物对引物各0.5μl，模板各1μl；所述步骤a)的扩增包括：94℃预变性6分钟，进入循环，94℃变性30S，44℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共40个循环，最后70℃延伸10分钟。