CN104561278A - 一种西瓜枯萎病菌的检测引物、检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种西瓜枯萎病菌的检测引物、检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种西瓜枯萎病菌的检测引物和检测试剂盒，检测引物由枯萎病菌通用引物和只能特异的扩增西瓜枯萎病菌的引物组成的双重检测引物集，该试剂盒的试剂包括检测引物、缓冲液、dNTPs、Taq聚合酶、西瓜枯萎病菌阳性对照DNA、超纯水；还公开了检测方法，(1)提取被西瓜枯萎病菌感染的植物组织DNA；(2)采用检测试剂盒对(1)步分离出的DNA进行PCR扩增；(3)将步骤(2)的PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分离，分离后再经溴化乙锭染色于紫外灯下，根据扩增产物的大小判定结果，本发明的优点在于，提供了一种在生物分子层面上检测西瓜枯萎病菌的方法，且具备精确度高、操作简便的特点。

Description

一种西瓜枯萎病菌的检测引物、检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于农作物病害检测鉴定及植物检疫的领域，具体是一种西瓜枯萎病菌的检测引物、检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
西瓜枯萎病俗称蔓割病或萎蔫病，是由尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)引起的一种世界性瓜类土传病害。它的发生极为普遍，对西瓜产量和品质构成了严重的威胁，是西瓜生产上的重要病害。目前，对这类维管束病害的有效防治方法主要是依靠抗病品种选育，但可供选育的抗病品种抗源单一，效率不高。有研究人员从西瓜根际土壤中筛选出对西瓜枯萎病菌防治效果好、无污染土壤中生存良好的放线菌菌株XF9、XF18和XF22，能较好的防治西瓜枯萎病。三种有益微生物为生物农药的研发奠定了基础，也为西瓜枯萎病上拮抗菌的拮抗机制奠定了理论基础。国际上公认的西瓜枯萎病菌有3个生理小种，即生理小种0号、1号和2号，其中2号生理小种的侵染性最强。除以上3个生理小种外，还有其他的小种分化，生理小种3于2010年鉴定分离，但在中国尚未见报道，需进一步证实。传统上对西瓜枯萎病菌的鉴定主要是采用形态特征的比较法，即对不同地区的西瓜枯萎病菌分离物进行形态特征(如菌落颜色、菌落密度、大小孢子的大小与形状以及菌落直径等)的比较。但利用传统的鉴定方法来鉴别病原菌准确性不高，已不能满足生产的要求。近年来，随着分子生物学技术的发展，包括AFLP、RFLP、RAPD以及SCAR在内的分子检测技术在病原菌鉴定、分类及群体遗传多样性研究中得到植物病理学家的高度重视。基于特异基因组设计的特异性引物已经广泛应用于病原菌的分子检测，前人基于特异性引物成功建立了快速检测双重PCR技术已用于检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌、小麦条纹花叶病毒和小麦花叶病毒等植物病原菌的分子鉴定体系。目前在尖孢镰刀菌的分子检测方面，有研究人员利用甘蓝枯萎病菌特异性引物Focs-1/Focs-2和尖孢镰刀菌通用引物W106R/W106F建立了检测甘蓝枯萎病菌的多重PCR检测体系。该技术既可应用于甘蓝枯萎病发病区病情的检测，也可从发病植株中检测出甘蓝枯萎病菌。而对于西瓜枯萎病菌的分子检测，有研究人员把西瓜枯萎病菌和西瓜蔓枯病菌的2对特异性引物Fn-1/Fn-2和Mn-1/Mn-2置于同一反应中，建立了检测西瓜枯萎病菌和蔓枯病菌的双重PCR体系，但这种双重PCR体系适用于检测两种病原菌，双重PCR只检测西瓜枯萎病菌的方法在国内外都未见报道。
发明内容
为解决现有技术中通过形态特征检测西瓜枯萎病菌不精确、操作不简便的缺陷，本发明公开了一种西瓜枯萎病菌检测试剂盒及其检测方法，其实现的目的是，从生物分子层面上、以高精确度检测出西瓜枯萎病菌，并且采用该试剂盒以及检测方法操作简便、特异性强且灵敏度高，对于西瓜枯萎病菌引起病害显症之前的早期检测和诊断具有十分重要的意义。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是，本发明公开了检测西瓜枯萎病菌的检测引物，由枯萎病菌通用引物和只能特异的扩增西瓜枯萎病菌的引物组成的双重检测引物集，其中，枯萎病菌通用引物对，Fos-R：5’-GCAGTCGTACGTCATCGACC-3’，下游引物序列为Fos-S：5’-CCATGGCAGATGGCGAGTCA-3’；特异性扩增西瓜枯萎病菌的引物对，其上游引物序列为Fow-R：5’-CCCGCTGGCTACTAATCTTTGA-3’，下游引物序列为：Fow-S：5’-ATGTAGTGGCGATACTTCCTTG-3’；本检测试剂盒中的检测双重检测引物集，其中Fos为公开发表的用于检测枯萎病菌的引物对，而特异性扩增西瓜枯萎病菌的引物对则为本实验室通过对西瓜枯萎病菌进行全基因组测序，并通过比较基因组学的方法找出西瓜枯萎病菌特异于其他枯萎病菌的基因组片段，然后针对西瓜枯萎病菌的特异片段序列设计出了一系列引物对，并对这些引物对进行筛选，筛选出那些扩增的特异性强，并且不会和Fos引物相互干扰的引物对。最后得到的Fow引物能够特异扩增出一条491bp的条带，该引物对灵敏度高、特异性强，能够用于带西瓜枯萎病菌的快速、精确的分子检测。
本发明还公开了包含上述检测引物的检测试剂盒，包括均为1μl的枯萎病菌通用引物和特异性扩增西瓜枯萎病菌的引物，且两种引物中上游引物与下游引物的体积比为1∶1、2×Taq Master Mix(Dye Plus)12.5μl、1μl的西瓜枯萎病菌阳性对照DNA、重量浓度≥99％的超纯水9.5μl。检测引物与其它辅助试剂混合，在后续PCR扩增程序时，能够很好地溶解引物，且对于扩增程序不会带来影响，使其能清晰的显示出扩增产物亮带。
本发明还公开了采用所述试剂盒检测西瓜枯萎病菌的方法，该方法包括如下步骤，(1)提取被西瓜枯萎病菌感染的植物组织DNA；
(2)采用检测试剂盒对(1)步分离出的DNA进行PCR扩增；
(3)将6μl步骤(2)的PCR扩增产物用质量浓度为1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，分离后再经溴化乙锭染色于紫外灯下，根据扩增产物的大小判定结果，当特异性地扩增出491bp产物时，即可判断植物组织中存在西瓜枯萎病菌。
作为优选的实施例，所述步骤(1)的提取方法包括如下步骤：①取250mg西瓜枯萎病菌菌体液氮、石英砂充分碾磨成白色粉末状，装入10ml离心管；在离心管中加入4ml 65℃预热的CTAB提取液、60μl β-巯基乙醇，剧烈振荡至样品分散均匀；再将离心管65℃水浴45min，其间颠倒2～3次；加入0.25体积的无水乙醇和0.11体积的5mol/L醋酸钾，充分混匀，于冰上放置1h；
②经①步处理后将上述混合物于55～60℃水浴1.5h，每10min颠倒混匀一次，水浴1.5小时后离心15min，离心速度为12,000rpm；
③离心后取上清液加入与上清液等体积的酚、氯仿和异戊醇混合溶液，所述混合溶液中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为：25∶24∶1，离心5min，离心速度为12,000rpm；
④经③步离心后取上清液，即水相，加入等体积氯仿抽提一次，离心5min，离心速度为12,000rpm，收集上清液；
⑤向④步上清液加入0.1ml的质量浓度为3m0l/L NaAC溶液和2ml的-20℃无水乙醇，-20℃下沉淀30min后12,000rpm离心5min，轻轻地倒去上清液；
⑥向⑤步弃去上清液的沉淀部分加入700μl体积浓度70％的-20℃乙醇进行洗涤，在超净工作台上自然晾干无酒精味后用1×TE溶液进行溶解，得到菌株的DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至50ng/μl待用。所述步骤(1)利用改良的CTAB法提取被西瓜枯萎病菌感染的植物组织DNA时，该方法和传统用于真菌基因组DNA提取的CTAB法相比，其得到的基因组DNA更加完整，其检测的电泳条带更加清晰。
进一步的，所述步骤①中的CTAB提取液包括质量浓度为2％的CTAB，100mmol/L、pH 8.0的Tris-HCl，20mmol/L、pH8.0的EDTA，1.4mol/L的NaAC。
所述步骤(2)的扩增方法包括：①取(1)步的DNA1μl，将其与试剂盒的试剂混合；
②将①步的混合物放入PCR仪器中进行扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性40sec；60℃退火30sec；72℃延伸100sec；30个循环最后72℃延伸10min。
本发明方法适用于植物组织样品中西瓜枯萎病菌的快速可靠检测和鉴定，对于农业生产中西瓜枯萎病菌引起的病害防治具有重要的实用价值。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：
1、精确度高：本发明检测方法是利用比较基因组学方法对西瓜枯萎病菌和其他枯萎病菌的全基因组序列进行分析得到西瓜枯萎病菌的特有片段，根据特异片段设计引物进行检测。已经对源于来自我国北京、山西省及国外的西瓜枯萎病菌和尖孢镰刀菌近缘种及其他常见病菌的验证，本发明设计的特异性引物具有很强的特异性，因此能够高精准度地检测出西瓜枯萎病菌；
2、操作简便：本发明采用的技术方案是在生物分子层面上进行的检测，传统的检测方法，需要生物学的专家以形态特征进行检测，因此本发明操作简便，可用于带西瓜枯萎病菌的植物组织的高灵敏度快速分子检测，满足对发病植物组织中存在的西瓜枯萎病菌进行快速可靠的检测和鉴定的需要。
附图说明
图1、本发明和传统的CTAB法提取真菌基因组DNA电泳图；
图中，1，2为传统CTAB法提取的真菌基因组DNA；3，4本发明提取的真菌基因组DNA；
图2、根据特异片段设计的不同引物PCR扩增出的产物对比图；
图中，条带从上往下依次对应5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、，100bp，M：Trans2kplus marker；1-14分别对应着设计的14对特异引物对西瓜枯萎病菌基因组DNA进行扩增的电泳图；
图3、利用PCR对12组双重检测引物进行筛选结果的电泳图；
图中，M：Trans2kplus marker；1-12为12组双重检测引物集PCR的电泳图，每组双重检测引物集中包含一对枯萎病菌通用引物对及筛选的西瓜枯萎病菌特异引物对；
图4、本发明双重检测引物对各种枯萎病菌检测的电泳图；
图中，M：Trans2kplus marker；Fuw-BN3：西瓜枯萎病生理小种0#；1-1，1-5，1-9：西瓜枯萎病生理小种1#；2-1，2-2，2-3：西瓜枯萎病生理小种2#；A5-beans：枯萎病菌菜豆专化型；F-pepper-F1：枯萎病菌辣椒专化型；Foc-banana-4：枯萎病菌香蕉专化型；cotton：枯萎病菌棉花专化型；Fuc-BN-8：枯萎病菌黄瓜专化型；F-eggplant-F11：枯萎病菌茄子专化型；F-tomato-DB1：枯萎病菌番茄专化型；Lettuce：枯萎病菌莴苣专化型；Foc：枯萎病菌甘蓝专化型生理小种1#；58：枯萎病菌甘蓝专化型生理小种2#；Botrytis cinerea：灰霉菌；T30-4：叶霉菌；Rhizoctonia：丝核菌；Pythium：腐霉菌；Colletotrichum：炭疽菌；ddH2O：清水对照；
图5、不同退火条件下Fom引物的扩增电泳图；
图中，M：Trans 3k maker，其条带从上往下依次对应3kb，2kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp；1-11分别为PCR退火温度65℃，62℃，60℃，58℃，57℃，56℃，55℃，54℃，52℃，50℃，48℃。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明内容，需要说明的是，在没有特殊说明的情况下，本发明所采用的试剂以及操作方法均是本领域技术人员公知的常识，操作条件均是常温常压下的自然条件。
实施例一：本发明公开了检测西瓜枯萎病菌的检测引物，由枯萎病菌通用引物和只能特异的扩增西瓜枯萎病菌的引物组成的双重检测引物集，其中，枯萎病菌通用引物对，其上游引物序列为Fos-R：5’-GCAGTCGTACGTCATCGACC-3’，下游引物序列为Fos-S：5’-CCATGGCAGATGGCGAGTCA-3’；特异性扩增西瓜枯萎病菌的引物对，其其上游引物序列为Fow-R：5’-CCCGCTGGCTACTAATCTTTGA-3’，下游引物序列为：Fow-S：5’-ATGTAGTGGCGATACTTCCTTG-3’。
在设计引物时，Fos引物对的序列为公开发表的枯萎病通用引物对，Fow引物为根据西瓜枯萎病菌基因组特异序列设计，该特异序列可以在ftp：//foc1：foc1linjianbrassicadb.org获得。该特异序列含有124个长度大于500bp的片段，我们从最大的片段着手设计引物，并进行一系列筛选，如图2所示，从图中可以看到，有些引物(如1)扩增效果较好，有些引物扩增有弥散条带(如11)，而有些引物则没有扩增出目的条带(如10)，筛选的标准如下：能够特异的扩增西瓜枯萎病菌的特异条带；和Fos组成的双重PCR检测体系中，不互相干扰，影响PCR的效果，本实施例仅列举了12组双重检测引物集的扩增电泳图，如图3所示，从图中可以看到，Fos对西瓜枯萎病特异引物抑制只用非常明显，导致西瓜枯萎病特异引物无法扩增出片段(1-7)，或者由于相互干扰，二者都无法扩增出条带(8-12)。
在PCR扩增程序时，与引物相配合的其它试剂，即检测试剂盒，包括均为1μl的枯萎病菌通用引物和特异性扩增西瓜枯萎病菌的引物，且两种引物中上游引物与下游引物的体积比为1∶1、2×Taq Master Mix(DyePlus)12.5μl、1μl的西瓜枯萎病菌阳性对照DNA、重量浓度≥99％的超纯水9.5μl，采用该试剂盒，对不同的枯萎病菌进行扩增，如图4所示，从图中可以看到，西瓜专化型的三个生理小种(lane2-8)都可以扩增出两条带，分别对应729bp的枯萎菌，通用引物Fos扩增的条带以及491bp西瓜枯萎病特异引物Fom扩增的条带。而其他枯萎病菌株(lane9-18)只能扩增出一条729bp的条带。其他真菌及清水对照(lane19-24)则不能扩增出任何条带。由此可以明确，本发明最终选择的引物以及试剂盒其它试剂的相互配合，具备特异性强的优点，使检测的结果精确度高。
需要注意的是，本发明公开的仅是众多次试验中的几个例子而已，用以说明选择引物的过程。
实施例二：本发明除了公开检测西瓜枯萎病菌的引物、检测试剂盒，还公开了检测方法，该方法包括如下步骤，(1)提取被西瓜枯萎病菌感染的植物组织DNA；
(2)采用检测试剂盒对(1)步分离出的DNA进行PCR扩增；
(3)将6μl步骤(2)的PCR扩增产物用质量浓度为1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，分离后再经溴化乙锭染色于紫外灯下，根据扩增产物的大小判定结果，当特异性地扩增出491bp产物时，即可判断植物组织中存在西瓜枯萎病菌。
所述步骤(1)的提取方法包括如下步骤：①取250mg西瓜枯萎病菌菌体与液氮、石英砂充分碾磨成白色粉末状，装入10ml离心管；在离心管中加入4ml 65℃预热的CTAB提取液、60μl β-巯基乙醇，剧烈振荡至样品分散均匀；再将离心管65℃水浴45min，其间颠倒2～3次；加入0.25体积的无水乙醇和0.11体积的5mol/L醋酸钾，充分混匀，于冰上放置1h；
②经①步处理后将上述混合物于55～60℃水浴1.5h，每10min颠倒混匀一次，水浴1.5小时后离心15min，离心速度为12,000rpm；
③离心后取上清液加入与上清液等体积的酚、氯仿和异戊醇混合溶液，所述混合溶液中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为：25∶24∶1，离心5min，离心速度为12,000rpm；
④经③步离心后取上清液，即水相，加入等体积氯仿抽提一次，离心5min，离心速度为12,000rpm，收集上清液；
⑤向④步上清液加入0.1ml的质量浓度为3m0l/L NaAC溶液和2ml的-20℃无水乙醇，-20℃下沉淀30min后12,000rpm离心5min，轻轻地倒去上清液；
⑥向⑤步弃去上清液的沉淀部分加入700μl体积浓度70％的-20℃乙醇进行洗涤，在超净工作台上自然晾干无酒精味后用1×TE溶液进行溶解，得到菌株的DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至50ng/μl待用。所述步骤(1)利用改良的CTAB法提取被西瓜枯萎病菌感染的植物组织DNA时，该方法和传统用于真菌基因组DNA提取的CTAB法相比，其得到的基因组DNA更加完整，其检测的电泳条带更加清晰，如图1所示，1，2为传统CTAB法提取的真菌基因组DNA；3，4本发明提取的真菌基因组DNA。
进一步的，所述步骤①中的CTAB提取液包括质量浓度为2％的CTAB，100mmol/L、pH 8.0的Tris-HCl，20mmol/L、pH8.0的EDTA，1.4mol/L的NaAC。
所述步骤(2)的扩增方法包括：①取(1)步的DNA1μl，将其与试剂盒的试剂混合；
②将①步的混合物放入PCR仪器中进行扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性40sec；60℃退火30sec；72℃延伸100sec；30个循环最后72℃延伸10min。
扩增条件的选择，也是经过PCR无限次重复，才最终得到的扩增程序，如图5所示，从图中可以看到60℃的时候扩增效果最好。需要说明的是，本实施例只选取了部分试验用以说明选择PCR扩增程序是如何进行试验的，最终的优选参数并不用于限制本发明的技术方案。
以上所述，并非对本发明内容作任何限制，凡是根据本发明内容技术实质上的修改，均仍属于本发明内容技术方案的保护范围内。

Claims (6)

1.一种西瓜枯萎病菌的检测引物，其特征在于，该检测引物由枯萎病菌通用引物和只能特异的扩增西瓜枯萎病菌的引物组成的双重检测引物集，
其中，枯萎病菌通用引物对，其上游引物序列为Fos-R：5’-GCAGTCGTACGTCATCGACC-3’，下游引物序列为Fos-S：5’-CCATGGCAGATGGCGAGTCA-3’；
特异性扩增西瓜枯萎病菌的引物对，其上游引物序列为Fow-R：5’-CCCGCTGGCTACTAATCTTTGA-3’，下游引物序列为：Fow-S：5’-ATGTAGTGGCGATACTTCCTTG-3’。
2.一种包含权利要求1所述检测引物的检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒的试剂包括均为1μl的枯萎病菌通用引物和特异性扩增西瓜枯萎病菌的引物，且两种引物中上游引物与下游引物的体积比为1∶1、2×Taq Master Mix(Dye Plus)12.5μl、1μl的西瓜枯萎病菌阳性对照DNA、重量浓度≥99％的超纯水9.5μl。
3.一种采用权利要求2所述试剂盒检测西瓜枯萎病菌的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤，(1)提取被西瓜枯萎病菌感染的植物组织DNA；
(2)采用检测试剂盒对(1)步分离出的DNA进行PCR扩增；
(3)将6μl步骤(2)的PCR扩增产物用质量浓度为1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，分离后再经溴化乙锭染色于紫外灯下，根据扩增产物的大小判定结果，当特异性地扩增出729bp和491bp产物时，即可判断植物组织中存在西瓜枯萎病菌。
4.根据权利要求3所述检测西瓜枯萎病菌的方法，其特征在于，所述步骤(1)的提取方法包括如下步骤：①取250mg西瓜枯萎病菌菌体与液氮、石英砂充分碾磨成白色粉末状，装入10ml离心管；在离心管中加入4ml 65℃预热的CTAB提取液、60μl β-巯基乙醇，剧烈振荡至样品分散均匀；再将离心管65℃水浴45min，其间颠倒2～3次；加入0.25体 积的无水乙醇和0.11体积的5mol/L醋酸钾，充分混匀，于冰上放置1h；
②经①步处理后将上述混合物于55～60℃水浴1.5h，每10min颠倒混匀一次，水浴1.5小时后离心15min，离心速度为12,000rpm；
③离心后取上清液加入与上清液等体积的酚、氯仿和异戊醇混合溶液，所述混合溶液中酚：氯仿：异戊醇的体积比为：25∶24∶1，离心5min，离心速度为12,000rpm；
④经③步离心后取上清液，即水相，加入等体积氯仿抽提一次，离心5min，离心速度为12,000rpm，收集上清液；
⑤向④步上清液加入0.1ml的质量浓度为3mol/L NaAC溶液和2ml的-20℃无水乙醇，-20℃下沉淀30min后12,000rpm离心5min，轻轻地倒去上清液；
⑥向⑤步弃去上清液的沉淀部分加入700μl体积浓度70％的-20℃乙醇进行洗涤，在超净工作台上自然晾干无酒精味后用1×TE溶液进行溶解，得到菌株的DNA溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至50ng/μl待用。
5.根据权利要求3所述的检测西瓜枯萎病菌的方法，其特征在于，所述步骤①中的CTAB提取液包括质量浓度为2％的CTAB，100mmol/L、pH8.0的Tris-HCl，20mmol/L、pH8.0的EDTA，1.4mol/L的NaAC。
6.根据权利要求3所述检测西瓜枯萎病菌的方法，其特征在于，所述步骤(2)的扩增方法包括：①取(1)步的DNA1μl，将其与试剂盒的试剂混合；
②将①步的混合物放入PCR仪器中进行扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性40sec；60℃退火30sec；72℃延伸100sec；30个循环最后72℃延伸10min。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106399511A (zh) * 2016-09-28 2017-02-15 湖南省西瓜甜瓜研究所 一种实时荧光定量pcr检测土壤西瓜枯萎病菌的方法及引物
CN107164462A (zh) * 2017-04-24 2017-09-15 江苏省农业科学院 一种土壤中西瓜枯萎病菌的定量检测方法
CN108866165A (zh) * 2018-07-17 2018-11-23 河北农业大学 一种西瓜枯萎病菌定量检测引物及检测方法
CN109182582A (zh) * 2018-10-18 2019-01-11 河北农业大学 一种西瓜枯萎病菌定性检测引物及检测方法
CN113186333A (zh) * 2021-05-12 2021-07-30 湖南省农业生物技术研究所 一种西瓜枯萎病菌快速lamp检测方法
CN114480700A (zh) * 2021-12-27 2022-05-13 仲恺农业工程学院 一种检测鉴定香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的pcr引物、方法及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101906466A (zh) * 2009-06-02 2010-12-08 华东理工大学 瓜类主要病原菌的多重pcr检测试剂盒及其检测方法
CN103451298A (zh) * 2013-09-09 2013-12-18 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 一种甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种检测的试剂盒及其检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101906466A (zh) * 2009-06-02 2010-12-08 华东理工大学 瓜类主要病原菌的多重pcr检测试剂盒及其检测方法
CN103451298A (zh) * 2013-09-09 2013-12-18 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 一种甘蓝枯萎病菌1号和2号生理小种检测的试剂盒及其检测方法

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106399511A (zh) * 2016-09-28 2017-02-15 湖南省西瓜甜瓜研究所 一种实时荧光定量pcr检测土壤西瓜枯萎病菌的方法及引物
CN106399511B (zh) * 2016-09-28 2019-11-05 湖南省农业生物技术研究所 一种实时荧光定量pcr检测土壤西瓜枯萎病菌的方法及引物
CN107164462A (zh) * 2017-04-24 2017-09-15 江苏省农业科学院 一种土壤中西瓜枯萎病菌的定量检测方法
CN108866165A (zh) * 2018-07-17 2018-11-23 河北农业大学 一种西瓜枯萎病菌定量检测引物及检测方法
CN108866165B (zh) * 2018-07-17 2021-08-10 河北农业大学 一种西瓜枯萎病菌定量检测引物及检测方法
CN109182582A (zh) * 2018-10-18 2019-01-11 河北农业大学 一种西瓜枯萎病菌定性检测引物及检测方法
CN109182582B (zh) * 2018-10-18 2021-08-10 河北农业大学 一种西瓜枯萎病菌定性检测引物及检测方法
CN113186333A (zh) * 2021-05-12 2021-07-30 湖南省农业生物技术研究所 一种西瓜枯萎病菌快速lamp检测方法
CN114480700A (zh) * 2021-12-27 2022-05-13 仲恺农业工程学院 一种检测鉴定香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的pcr引物、方法及应用
CN114480700B (zh) * 2021-12-27 2024-03-19 仲恺农业工程学院 一种检测鉴定香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的pcr引物、方法及应用

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