CN106399511B - 一种实时荧光定量pcr检测土壤西瓜枯萎病菌的方法及引物 - Google Patents

一种实时荧光定量pcr检测土壤西瓜枯萎病菌的方法及引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种实时荧光定量PCR检测土壤西瓜枯萎病菌的方法及引物。通过特异性引物先进行普通PCR预扩增，然后以预扩增产物为模板DNA进行实时荧光定量PCR。本发明针对传统的病害诊断和流行趋势研究主要依靠病原菌的分离培养，不仅耗时长且难以准确定量，不能给病害防治提供有效防治时期，以及现有的PCR技术灵敏度不高，引物特异性不够，容易受到土壤背景中其他菌落或者物质干扰的缺陷，提供一种准确性高、特异性强、灵敏度高的西瓜枯萎病菌定量检测技术，对于该病的早期诊断、病情预报及综合防治具有重要意义。

Description

一种实时荧光定量PCR检测土壤西瓜枯萎病菌的方法及引物
技术领域
本发明属于土壤西瓜枯萎病菌的检测技术领域，具体涉及一种实时荧光定量PCR检测土壤西瓜枯萎病菌的方法及引物。
背景技术
西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)引起的一种土传维管束病害。在世界各西瓜产区均有发现，且在西瓜生长各个时期均可发生，对西瓜产业构成严重威胁。西瓜枯萎病常用的防治方法有农业防治、化学防治、生物防治、抗病品种的利用及一些其它的防治措施。目前采用种植抗病品种和嫁接换根可最大限度预防西瓜枯萎病的发生，但大多数抗性品种西瓜口感不如感病品种，而嫁接的成本高且在一定程度上会影响西瓜的口感。又由于西瓜枯萎病具有传播途径多样，快速爆发、迅速蔓延和应急防治难的特点，一旦暴发成灾危害损失大，给西瓜生产造成很大的经济损失。因而及时、快速诊断病害，掌握病原菌在土壤中的蔓延速度，是有效防治该病的关键。
对于枯萎病的检测，传统的方法是根据田间发病病症、病状的分析，结合实验室组织病原菌的分离、群落形态鉴定和显微镜观察结果等进行检测。该方法具有操作繁琐，鉴定周期长，准确性不高，且无法定量的缺点，不能满足生产的要求。近年来，随着PCR技术的发展与成熟，包括AFLP、RFLP、RAPD及SCAR在内的分子检测技术在病原菌鉴定、分类和群体遗传多样性分析方面得到广泛应用。2005年，Zhang等依据镰刀菌属的ITS序列，设计了西瓜枯萎枯萎病菌鉴别引物Fn-1/Fn-2，并建立PCR体系，可从发病组织中鉴别出西瓜枯萎病菌。2010年，Lin等依据OP-M12随机引物扩增片段，设计出西瓜枯萎病鉴别引物Fon-1/Fon-2，并应用此引物从枯萎病发病早期的西瓜病株中检测出西瓜枯萎病菌。到2013年，Peng等也从随机扩增片段中得到特异性检测西瓜枯萎病菌的引物，并应用此引物建立了实时荧光环介导等温扩增技术体系。随着尖孢镰刀菌基因组测序的完成，通过比较基因组学获得特异性的鉴别引物成为一种更高效和更可靠的手段。基于基因组特异序列设计的特异性检测引物已经广泛应用于病原菌的分子检测中。2013年，冯雯杰等通过生物信息学分析3株水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和两株细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola)的基因组信息，获得了能区分该两种病原菌的特异性引物，建立了快速、稳定的PCR鉴定体系。张吉祥等通过比较基因组的方法获得了鉴定甘蓝枯萎病菌的特异性引物Focs-1/Focs-2，建立了检测甘蓝枯萎病菌的PCR检测体系。
实时荧光定量PCR技术(Quantitative Real-time PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该方法不仅进行定量检测，且较普通PCR技术具有更高的灵敏性，可满足病原菌快速定性定量检测的需求。目前此技术已应用于多种植物病原菌检测体系中，但在西瓜病原菌的检测中目前报道较少。由于实时荧光定量PCR对引物的要求相对较高，且要求产物单一，不适用于多重PCR。以往土壤病原菌数量检测体系的建立，采用的多是无其他背景菌落的基质来建立标准曲线，而生产中土壤中的微生物却具有多样性，因此已建好的检测体系难以应用于实际生产中。又由于对土壤DNA进行荧光定量PCR时，对DNA的要求较高，在DNA提取过程中需要多个试剂进行抽提，以去除干扰扩增反应的腐殖质，因此的总DNA损耗较大，从而也降低了中目标病原菌DNA的含量，使得荧光定量PCR的检测灵敏度降低。本发明通过分析西瓜枯萎病菌的基因组信息设计出单条检测西瓜枯萎病菌的特异引物，建立SYBR Green I实时荧光定量PCR检测西瓜枯萎病菌体系和土壤西瓜枯萎病菌检测体系，通过普通预PCR的方法对检测体系进行优化，提高检测灵敏度，并将该体系应用于土壤中西瓜枯萎病菌的定量检测，对防治枯萎病菌的药剂效果进行评测。通过以上研究，以期为西瓜枯萎病的早期预防提供有效的技术支持，为西瓜枯萎病防治药效的评估，提供技术参考。
发明内容
本发明针对传统的病害诊断和流行趋势研究主要依靠病原菌的分离培养，不仅耗时长且难以准确定量，不能给病害防治提供有效防治时期，以及现有的PCR技术灵敏度不高，引物特异性不够，容易受到土壤背景中其他菌落或者物质干扰的缺陷，提供一种快速、准确、定量的土壤西瓜枯萎病菌检测技术，对于该病的早期诊断、病情预报及综合防治具有重要意义。
一种实时荧光定量PCR检测土壤西瓜枯萎病菌的方法，该方法是利用如下序列的引物进行的：
Fonq-2F：GTTGCTTACGGTTCTAACTGTGC
Fonq-2R：GGTACTTGGAAGGAATTGTGGG。
所述的实时荧光定量PCR检测土壤西瓜枯萎病菌的方法，在实时荧光定量PCR之前进行普通PCR预扩增，然后以预扩增产物为模板DNA进行实时荧光定量PCR。
所述的实时荧光定量PCR检测土壤西瓜枯萎病菌的方法，普通PCR预扩增的引物序列：
Fonq-2F：GTTGCTTACGGTTCTAACTGTGC，
Fonp-R：5’–CTGGTACGGAATGGCCGATCAG-3’。
所述的实时荧光定量PCR检测土壤西瓜枯萎病菌的方法，待检测样品为种植西瓜的土壤。
所述的实时荧光定量PCR检测土壤西瓜枯萎病菌的方法，待检测样品为与水稻轮作的种植西瓜的土壤。
所述的实时荧光定量PCR检测土壤西瓜枯萎病菌的方法，普通PCR预扩增的过程：以土壤DNA为模板，利用引物对进行PCR，反应条件为：94℃预变性4min；94℃40s；58℃40s；72℃90s；18个循环；72℃10min。
所述的实时荧光定量PCR检测土壤西瓜枯萎病菌的方法，普通PCR预扩增体系包括：10×Easy DNA Polymerase buffer 2.0μl；活性酶浓度为5U/ml的Easy DNA Polymerase 0.4μl；浓度为10pmol/μl的引物各0.8μl；DNA模板1μl；加ddH2O补足至20μl。
所述的实时荧光定量PCR检测土壤西瓜枯萎病菌的方法，包括以下步骤：
取普通预扩增PCR产物1ul为模板，利用引物对Fonq-2F/Fonq-2R进行荧光定量PCR，反应条件为：94℃预变性30s；94℃5s；60℃30s；45个循环。
所述的实时荧光定量PCR检测土壤西瓜枯萎病菌的方法，实时荧光定量PCR扩增体系包括： Tip green qPCR SuperMix 10μl；引物各0.5μl；模板1μl；ddH2O8.5μl。
本发明方法的优势：
1、能够快速、准确、定量的实现土壤西瓜枯萎病菌检测；
2、在实时荧光定量PCR之前进行普通PCR预扩增，较直接进行qPCR检测灵敏度提高了100倍；
3、能够克服现有PCR技术灵敏度不高，引物特异性不够，容易受到土壤背景中其他菌落或者物质干扰的缺陷。
附图说明
图1为引物特异性检测；Fon-4代表引物对Fon-4F/Fon-4R、Fonq-2代表引物对Fonq-2F/Fonq-2R；
M：marker；0：尖孢镰刀菌西瓜专化型0号生理小种；1：尖孢镰刀菌西瓜专化型1号生理小种；2：尖孢镰刀菌西瓜专化型2号生理小种；3：水稻土壤总DNA；4：串珠镰刀菌；5:尖孢镰刀菌甜瓜专化型；6尖孢镰刀菌番茄专化型。7:阴性对照。
图2为用质粒建立的实时荧光定量标准曲线；
图3为重组质粒DNA为模板的溶解曲线；
图4为以土壤DNA为模板直接进行荧光定量PCR的标准曲线；
检测下限为104个/g；
A:利用104-107个/g的检测数据绘制标准曲线，具有较好的回归性；B：加入103个/g的检测数据绘制标准曲线，回归线显著下降。
图5为土壤病原菌数量的荧光定量PCR标准曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施方式旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例一：
菌株：尖孢镰刀菌西瓜专化型0、1、2号生理小种，串珠镰刀菌，尖孢镰刀菌番茄专化型。感受态大肠杆菌Trans5α购于全式金公司。
载体：载体质粒pKN。
1.1主要试剂
Easypure PCR纯化试剂盒、Easypure快速凝胶回收试剂盒、大肠杆菌感受态Trans5α、限制性内切酶、各分子标量的DNA Marker，Easypure质粒小提试剂盒，Tip green qPCR SuperMix、MOBIO Powersoil@DNA Isolation Kit试剂盒均购自全式金生物技术公司。
1.2实验方法
1.2.1DNA的提取
各菌株的基因组DNA采用CTAB法提取；土壤总DNA采用经改良的MOBIO Powersoil@DNAIsolation Kit试剂盒提取。
1.2.2引物
引物设计：通过比对西瓜枯萎病菌基因组与其近缘病菌基因组，找到特异性片段，并将该特异片段在NCBI的基因组库中进行Blastn比对，选定没有比对结果的特异片段设计引物，获得扩增产物大小为244bp的引物对Fonq-2F/Fonq-2R，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
引物特异性检测：以尖孢镰刀菌西瓜专化型0、1、2号生理小种，串珠镰刀菌，尖孢镰刀菌番茄专化型的基因组DNA和连作水稻土壤的总DNA为模板，利用引物对Fonq-2F/Fonq-2R进行PCR，以曹月霞等发表的引物对Fon-4F/Fon-4R为对照，检测引物的特异性。PCR反应体系为：10×buffer 2μl；Easy DNA Polymerase 0.4μl；引物各0.8μl；DNA模板1μl；加ddH2O补足至20μl。PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃40s；58℃40s；72℃90s；30个循环；72℃10min。
表1本实验所用引物
引物名称 引物序列(5'-3')
Fonq-2F GTTGCTTACGGTTCTAACTGTGC
Fonq-2R GGTACTTGGAAGGAATTGTGGG
Fon-4F CCCGCTGGCTACTAATCTTTGA
Fon-4R ATGTAGTGGCGATACTTCCTTG
Fonp-R CTGGTACGGAATGGCCGATCAG
FonqM-2F <u>GACTAGTC</u>GTTGCTTACGGTTCTAACTGTGC
FonqM-2R <u>AAGGGCCCTT</u>GGTACTTGGAAGGAATTGTGGG
注:划线部分为添加的酶切位点及保护碱基区域。
1.2.3荧光定量PCR标准曲线的建立及引物灵敏度检测
利用引物对FonqM-2F/FonqM-2R从尖孢镰刀菌西瓜专化型基因组中扩增出具有SpeI和ApaI酶切位点的西瓜枯萎病菌特异性片段。通过核酸限制性内切酶酶切连接的方法，将该片段连接到质粒pKn上。提取重组质粒，经引物对Fonq-2F/Fonq-2RPCR检测后，将阳性质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，确认序列无误后，使用紫外分光光度仪测定重组质粒的浓度，按照下列公式计算质粒拷贝数。质粒拷贝数＝质粒浓度×6.023×023/MW，MW＝(克隆载体长度+目的片段长度)×324×2。其中质粒浓度单位为g/μl，MW单位为g/mol，克隆载体长度和目的片段长度单位为bp。
将已知浓度的重组质粒进行10倍梯度稀释，作为标准样品。以各梯度的标准样品为模板，用引物Fonq-2F/Fonq-2R进行普通PCR和荧光定量PCR，检测引物灵敏度，并以拷贝数对数值为横坐标轴，以Ct值为轴，建立标准曲线。荧光定量PCR反应体系为： Tip green qPCR SuperMix 10μl；引物各0.5μl；模板1μl。
1.2.4土壤中荧光定量PCR标准曲线的建立
由于我国南方大多采用水稻和西瓜轮作的方式种植西瓜，因此本发明采用水稻田作为西瓜枯萎病的背景土壤。从连作5年以上的水稻田中采取土壤，烘干至重量无变化后，用研钵将土壤磨碎备用。
利用PDA液体培养基对尖孢镰刀菌1号生理小种进行液体摇培，5天后用4层纱布过滤去除菌丝，得到孢子悬浮液。利用离心机对孢子悬浮液进行离心，进一步提高孢子液的浓度。充分混匀后，利用显微镜和血球计数板确定孢子悬浮液的浓度，并对孢子液进行10倍梯度的稀释。
用2ml离心管称取2g备好的水稻土7份，分别加入100μl各浓度孢子液和100μl的ddH2O，配制成含水量约为33％的标准带菌土，标准带菌土的含菌量分别为1.5个/g，1.5×10个/g，1.5×102个/g，1.5×103个/g，1.5×104个/g，1.5×105个/g，1.5×106个/g利用改良的MOBIO Powersoil@DNA Isolation Kit试剂盒提取标准含菌土的总DNA。
普通PCR预扩增：以土壤DNA为模板，利用引物对Fonq-2F/Fonp-R进行PCR，反应条件为：94℃预变性4min；94℃40s；58℃40s；72℃90s；18个循环；72℃10min。普通PCR预扩增体系包括：10×Easy DNA Polymerase buffer 2.0μl；活性酶浓度为5U/ml的Easy DNA Polymerase 0.4μl；浓度为10pmol/μl的引物各0.8μl；DNA模板1μl；加ddH2O补足至20μl。
取预扩增PCR产物1ul为模板，利用引物对Fonq‐2F/Fonq‐2R进行荧光定量PCR，反应条件为：94℃预变性30s；94℃5s；60℃30s；45个循环。实时荧光定量PCR扩增体系包括：2× Tip green qPCR SuperMix 10μl；引物各0.5μl；模板1μl；ddH2O8.5μl。
每个样设置3个重复，绘制标准曲线。
2.结果：
2.1.1引物特异性检测结果
以引物对Fon-4F/Fon-4R为对照，检测引物对Fonq-2F/Fonq-2R特异性的结果表明：引物对Fon-4F/Fon-4R和Fonq-2F/Fonq-2R均能将西瓜枯萎病菌的三个生理小种和尖孢镰刀菌甜瓜专化型，尖孢镰刀菌番茄专化型区分开来，但是Fon-4F/Fon-4R未能将水稻恶苗病的病原菌串珠镰刀菌和西瓜枯萎病菌分开，而引物对Fonq-2F/Fonq-2R能很好的将其区分，且以水稻土壤总DNA为模板，无非特异性扩增产物，结果说明引物对Fonq-2F/Fonq-2R的特异性高，可用于土壤西瓜枯萎病菌的PCR检测。
2.1.2引物灵敏度检测和标准曲线的建立
利用荧光定量PCR对拷贝数为4.4×102到4.4×108的10倍稀释的的重组质粒进行检测，并绘制标准曲线。得到的标准曲线为y＝﹣3.293x+39.206，回归系数的质粒DNA浓度的对数(x)与对应的Ct值(y)之间具有良好的线性关系(R2＝0.993)，引物扩增效率E为101.2％，说明引物的扩增性好(图2)。荧光定量PCR扩增溶解曲线仅出现一个特异性单峰(图3)，说明该引物特异性良好,可以保证SYBR Green Ⅰ染料定量PCR检测的特异性。
2.2土壤病原菌数量的荧光定量PCR标准曲线的建立
以土壤DNA直接进行荧光定量PCR构建标准曲线的定量检测下限为104个孢子每克土，见图4，图中A：当标准曲线的制作只计算104-107个孢子每克土的检测数据时，相关系数R2达0.963；图中B：当标准曲线的制作引入103个孢子每克土的检测数据时，相关性显著下降，且数据未能落在曲线上，因此以土壤DNA直接进行荧光定量PCR定量检测下限为104个孢子每克土。
为了提高qPCR的检测灵敏度，降低qCPR检测下限，本实验采用MOBIO Powersoil@DNA Isolation Kit试剂盒进行各浓度梯度土壤样品总DNA的提取，先进行一次常规PCR预扩增，然后以预扩增产物为模板DNA进行qPCR标准曲线的构建(图5)。
检测结果表明，土壤含菌为1.5×102个/g，1.5×103个/g，1.5×104个/g，1.5×105个/g，1.5×106个/g样品的孢子量对数值与扩增Ct值具有良好的线性关系，标准曲线为y＝-2.685+31.033，回归系数R2＝0.940；有效检测下限为1×102个/g，较未引入常规PCR方法前的qPCR检测灵敏度提高了100倍。
实施例二：利用实施例一的方法检测土壤样品中西瓜枯萎病菌的数量
1、样品采集：土壤样品采自湖南省农科院高桥基地的不同西瓜土壤。
2、DNA提取及检测方法与实施例一相同。
3、检测结果：
表2各土壤中西瓜枯萎病菌的检测数量
利用构建好的体系对南省农科院高桥基地的不同作物土壤中西瓜枯萎病病原菌数量的检测结果为：样品一：0.6×103个/g，样品二：3.4×103个/g，样品三：7.6×103个/g，样品四：10.6×103个/g；这说明不同西瓜土壤中，西瓜枯萎病菌的含量是不一样的，可能与西瓜地的种植品种、药剂处理等因素相关。
西瓜枯萎病是目前西瓜生产上最常见的土传真菌病害，在西瓜种植区普遍发生。而且经常与蔓枯病、根腐病等土传病害混合发生，早期均可引起根部或茎基部变褐，症状相似，通过直接的症状判断很难直接区分，更无法准确定量。因此需要建立快速，准确定量检测技术，监测田间病害的发生发展动态，指导西瓜枯萎病科学合理防控。利用分子生物学技术，特别是PCR和real-timePCR技术进行农作物病害病原菌检测、病害预测预报，指导防治已经越来越受到关注。其中real-time PCR不仅能进行定量检测，且较普通PCR技术具有更高的灵敏性，可满足病原菌快速定性定量检测的需求。而特异性引物是制约该项技术应用于病害检测的关键，本发明根据西瓜枯萎病菌的特异性序列片段设计的特异引物Fonq-2F/Fonq-2R，表现出对西瓜枯萎病菌的高度特异扩增，不仅能鉴定区分蔓枯病、根腐病等常见土传病害，以及尖孢镰刀菌的其他专化型；而且在以具有复杂背景的自然农作物土壤为模板进行扩增时仍能进行特异扩增。利用该引物建立了实时荧光定量PCR检测体系，对质粒的定量检测灵敏度为4.4×102copies/μL，同时用该引物构建了反映土壤含菌浓度与扩增循环阈值间关系的标准曲线，建立了实时荧光定量PCR检测土壤西瓜枯萎病菌数量体系，通过预PCR优化后的定量检测下限为100个孢子每克土壤，并将该体系应用于评估枯萎病药剂的防治效果。
结论
本发明建立的基于real-time PCR技术的土壤西瓜枯病菌快速检测方法，具有操作步骤简单、灵敏度高、结果稳定可靠的特点。在定量检测土壤西瓜枯萎病菌数量结果标准化后，不仅可为西瓜枯病菌的研究提供简便快速的方法，还可以用于分析土壤中病原的含量，结合环境条件，西瓜植株抗、感病程度等条件，预测未来的发病情况，对枯萎病菌药剂药效的评估、指导西瓜枯萎病的预测预报和制定综合防治措施具有重要的理论指导和实际应用价值。

Claims (10)

1.一种实时荧光定量PCR检测土壤西瓜枯萎病菌的方法，其特征在于，该方法是利用如下序列的引物进行的：
Fonq-2F：GTTGCTTACGGTTCTAACTGTGC
Fonq-2R：GGTACTTGGAAGGAATTGTGGG。
2.根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测土壤西瓜枯萎病菌的方法，其特征在于，在实时荧光定量PCR之前进行普通PCR预扩增，然后以预扩增产物为模板DNA进行实时荧光定量PCR。
3.根据权利要求2所述的实时荧光定量PCR检测土壤西瓜枯萎病菌的方法，其特征在于，普通PCR预扩增的引物序列：
Fonq-2F：GTTGCTTACGGTTCTAACTGTGC，
Fonp-R：5’–CTGGTACGGAATGGCCGATCAG-3’。
4.根据权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测土壤西瓜枯萎病菌的方法，其特征在于，待检测样品为种植西瓜的土壤。
5.根据权利要求4所述的实时荧光定量PCR检测土壤西瓜枯萎病菌的方法，其特征在于，待检测样品为与水稻轮作的种植西瓜的土壤。
6.根据权利要求3所述的实时荧光定量PCR检测土壤西瓜枯萎病菌的方法，其特征在于，
普通PCR预扩增的过程：以土壤DNA为模板，利用引物对进行PCR，反应条件为：94℃预变性4min；94℃40s；58℃40s；72℃90s；18个循环；72℃10min。
7.根据权利要求6所述的实时荧光定量PCR检测土壤西瓜枯萎病菌的方法，其特征在于，普通PCR预扩增体系包括： DNA Polymerase buffer 2.0μl；活性酶浓度为5U/ml的Easy DNA Polymerase 0.4μl；浓度为10pmol/μl的引物各0.8μl；DNA模板1μl；加ddH2O补足至20μl。
8.根据权利要求1-7任一项所述的实时荧光定量PCR检测土壤西瓜枯萎病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
取普通预扩增PCR产物1ul为模板，利用引物对Fonq-2F/Fonq-2R进行荧光定量PCR，反应条件为：94℃预变性30s；94℃5s；60℃30s；45个循环。
9.根据权利要求8所述的实时荧光定量PCR检测土壤西瓜枯萎病菌的方法，其特征在于，实时荧光定量PCR扩增体系包括： Tip green qPCR SuperMix 10μl；引物各0.5μl；模板1μl；ddH2O8.5μl。
10.一种用于实时荧光定量PCR检测土壤西瓜枯萎病菌的引物，其特征在于，序列如下：
Fonq-2F：GTTGCTTACGGTTCTAACTGTGC
Fonq-2R：GGTACTTGGAAGGAATTGTGGG。
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