CN114645096A

CN114645096A - 一种用于检测腐皮镰孢菌的微滴式数字pcr试剂盒

Info

Publication number: CN114645096A
Application number: CN202110875681.6A
Authority: CN
Inventors: 杨莉; 王春雨; 刘翠晶; 林红梅; 聂丹丹; 于俐; 杜立财; 杨利民
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2021-07-30
Filing date: 2021-07-30
Publication date: 2022-06-21

Abstract

本发明公开了一种用于检测腐皮镰孢菌的微滴式数字PCR试剂盒。所述试剂盒包括目的片段的扩增引物和探针，目的片段的扩增引物的序列如SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4所示，目的片段的探针的序列如SEQ ID No.5所示。本发明提供的试剂盒具有高灵敏度、高准确度和精确度，能够用于在复杂的土壤及植物微生物背景下区分人参主要真菌病害(科间)，还可实现腐皮镰孢菌与近缘种的良好区分，其特异性鉴定能力可达到种间水平。从而有助于病害的早期防控。

Description

一种用于检测腐皮镰孢菌的微滴式数字PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于检测根腐病病原菌腐皮镰孢菌的微滴式数字PCR试剂盒。

背景技术

我国人参药材的供给主要依赖于集约化的人工种植，而农田栽参常伴随多种真菌病害混合发生，这也是导致栽培人参减产及品质降低的重要原因。其中根部病害发病率高、难察觉、易传染、危害大，减产率达80％以上。腐皮镰孢菌(Fusarium solani)是植物根腐病的主要致病菌。目前，病害的监测与检测已成为人参栽培过程中的重要环节，有效的病害检测方法与预警系统不仅可及时阻止病害发展和蔓延，对减少农业损失、保证药材质量也具有重要意义。但遗憾的是，目前以根腐病为代表的人参重大根际病害监测尚未见相关报道。

目前，植物病害的检测方法有很多种，概括起来可以分为传统的平板检测法、机器视觉、红外热成像技术、光谱学方法及基于PCR的分子生物学方法。传统的平板涂布结合形态学鉴定是最直接的方法，但缺点是该检测方法周期较长、操作复杂、灵敏度不高，并且生态环境中存在多种在人工培养基上不能生长的病原菌，无法用传统方法分离鉴定。另外检测结果还受到实验人员的分类鉴定水平、经验积累程度等诸多主观因素的限制，可能会产生较大的误差。综上可见，利用常规分离培养和一般的光谱学方法，无法实现对寄主中病原菌、土壤中病原菌以及不可培养状态细菌进行定量检测。

基于PCR的分子生物学方法是目前病原菌检测中最为精准的方法，可以不通过病原菌的分离培养直接提取植物组织或土壤DNA，特异性检测单位重量样本中目标病原菌的数量，从而实现病原菌的定量测定。目前相关检测技术已在小麦、水稻、玉米、油菜、菠菜、柑橘、梨等多种作物中得到了较为系统的开发与研究。实时荧光定量PCR技术是在常规PCR基础上加入特定的荧光结合物质或者荧光探针，可实时监测荧光量的变化，实现植物病原菌定性、定量的同步分析，其检测样本包括但不限于植物组织，对空气中、土壤中病原菌的定量检测也取得了良好的效果，具有快速、灵敏、特异性强等特点。但由于不同实验室PCR平台间缺少统一的检测执行标准，无论是样本类型、DNA提取方法、检测的DNA片段、质量控制、检测设备、检测极限值等均缺乏统一标准，导致同一份样本在不同的实验室的检测结果，存在较大差异，出现实验结果无法重复，甚至结果互相矛盾的状况。且依赖于Cq值仍然是目前荧光定量PCR最大的技术瓶颈，在这个意义上所谓的“定量”也只是相对的，并且在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微的条件下，其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。

微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)是近年来兴起的一种新的核酸绝对定量技术，又称为第三代PCR技术。ddPCR技术通过将微量样品极度稀释实现理论上的单分子扩增。与qPCR相比，ddPCR不需要通过CT值来计算目的基因的拷贝数，所以扩增效率并不会对结果产生影响。通过相应仪器对反应结果进行测量后，可以直接通过计数的方法或者使用泊松分布的统计学方法来得到样本的具体浓度。该技术的提出仅仅只有十几年的光景，但是它的进步与发展却相当迅速。ddPCR兼具qPCR方法的优点，其相对qPCR具有更高的灵敏度和更多元分析的能力。因此，提供一种用于腐皮镰孢菌的微滴式数字PCR检测方法，并具有高度特异性与准确性，成为本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

为克服现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度和精确度，可实现针对根腐病病原菌腐皮镰孢菌精确定量的基于微滴式数字PCR检测方法和数字PCR检测试剂盒。能够用于在复杂的土壤及植物微生物背景下区分人参主要真菌病害，还可实现腐皮镰孢菌与近缘种的良好区分，其特异性鉴定能力可达到种间水平，从而有助于病害的早期防控。

为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：

第一方面，提供用于检测腐皮镰孢菌的特异性引物和探针组合，包括1对特异性引物和与引物配合使用的荧光标记探针，其核苷酸序列分别为：

Forward primer：5’GGAACAGACGGCCCTGTAA 3’(Seq ID No:3)；

Reverse primer：5’TTTCGCTGCGTTCTTCATCG 3’(Seq ID No:4)；

Probe:5’CCGCCAGAGGACCCCTAACTCTGTT3’(Seq ID No:5)；

所述荧光标记探针Probe的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。

优选地，所述探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。

第二方面，提供了上述特异性引物和探针组合在制备腐皮镰孢菌检测试剂盒或检测试剂中的应用。

第三方面，提供了一种含有上述特异性引物和探针组合的腐皮镰孢菌检测试剂盒。

优选地，所述试剂盒为微滴式数字PCR绝对定量检测试剂盒。

作为本发明的一个实施方案，所述微滴式数字PCR绝对定量检测试剂盒还包含QX200^TMdd PCR^TM

Supermix，微滴发生油，阴性对照和阳性对照；

阳性对照为标准菌株腐皮镰孢菌(由吉林农业大学植保实验室分离鉴定保存)；

阴性对照为ddH₂O。

根据上述微滴式数字PCR绝对定量检测试剂盒，其工作程序为：

1)获取样本的总DNA；

2)按照预设的反应数配置微滴式数字PCR的反应混合液的总体积；

3)按照预设的反应数制备各个反应体系；

4)将各个反应体系分别进行微液滴处理；

5)对各个经过微液滴处理的反应体系进行微滴式数字PCR扩增之后，根据扩增结果计算各个样本的核酸浓度。

作为本发明的一个实施方案，所述工作程序中的步骤3)中，示例性地，20μL微滴式数字PCR反应体系为：Forward primer和Reverse primer各0.1μL，引物的原始浓度为10μM，Probe 0.1μL，探针原始浓度为10μM，QX200^TMdd PCR^TM

Supermix 10μL，灭菌超纯水9.2μL，加入0.5μL样本DNA(原始浓度为10ng/μL)。

作为本发明的一个实施方案，所述工作程序中的步骤4)中，将各个反应体系进行微液滴处理时，每个反应体系的总微液滴数大于或等于12000，则确认微液滴生成有效。

作为本发明的一个实施方案，所述工作程序中的步骤5)中PCR的扩增程序为94℃预变性5min，95℃变性30s，64℃退火延伸60s，50个循环，98℃加热10min结束反应，每步都设置2℃/s的降温速度。

第四方面，提供上述试剂盒在人参根腐病检测和预防中的应用。

与现有技术相比较，本申请具有如下优势：

(1)具有高特异性：植物根际每克土壤中细菌、真菌、放线菌数量分别达10⁹、10⁶、10⁷个，具有极高的微生物多样性，在复杂背景下设计和优化出具有高特异性的引物是病原菌检测方法建立的基础。本发明选取了人参真菌病害病原菌4株(人参核盘菌、强壮土赤壳、人参链格孢菌、灰葡萄孢菌)、腐皮镰孢菌近缘种3株(尖孢镰刀菌、禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌)作为阴性菌株，根据其与目标菌株的碱基差异区设计了特异性引物，经qPCR及ddPCR验证，该引物具有良好的特异性，不仅能够区分人参主要真菌病害(科间)，还可实现腐皮镰孢菌与近缘种的良好区分，其特异性鉴定能力可达到种间水平。同时，本发明设计的特异性引物构建的ddPCR检测体系，可操作性强，结果稳定性好，精确度高。

(2)具有高灵敏度：本发明ddPCR的检测最低检测限度为10^-5ng/μl，即0.97copies/μl，可对土壤样品中目标菌种进行快速准确的定量分析。同时，本发明ddPCR的检测线性范围为0.001-10μg/μl。

(3)可直接定量，无需标准曲线：与传统的检测方法相比，本发明微滴式数字PCR试剂盒可直接定量，无需标准曲线，操作简便、准确无误，更加适合现场检测，有效预防根腐病的大规模爆发。

因此建立可靠的人参地下部分病原菌微滴式数字PCR定量检测方法，有利于病原菌的种群数量的控制，是提高人参病害预测能力的重要措施和途径，可为进一步构建人参病虫害预警与绿色防控技术体系，保障药材品质，促进人参产业发展奠定基础。

附图说明

图1.腐皮镰孢菌鉴定

A.腐皮镰孢菌菌落形态，B.腐皮镰孢菌孢子形态；

图2.将土壤样品中分离纯化得到的病原菌株测序获得的序列信息与NCBI数据库中已知种序列进行比对的结果；

图3.腐皮镰孢菌的实时荧光定量PCR特异性检测；

图中扩增曲线为腐皮镰孢菌，无扩增曲线的为阴性菌株及NTC；

图4.腐皮镰孢菌的微滴式数字PCR特异性检测；

A04-C04为腐皮镰刀菌DNA，D10～H11为阴性菌株：人参核盘菌[(Sclerotiniaginseng)2孔]、强壮土赤壳[(Ilyonectria robusta)2孔]、人参链格孢菌在[(Alternariapanax)2孔]、灰葡萄孢菌[(Botrytis cinerea)2孔]以及腐皮镰刀菌的近缘种：尖孢镰刀菌[(Fusarium oxysporum)2孔]、禾谷镰刀菌[(Fusarium graminearum)2孔]、串珠镰刀菌[(Fusarium moniliforme)1孔]DNA。

图5.腐皮镰孢菌的实时荧光定量PCR灵敏度检测；

图中扩增曲线左→右依次为10、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5ng/μl；

图6.腐皮镰孢菌的微滴式数字PCR灵敏度检测；

图中散点图左→右依次为10、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5ng/μl；

图7.腐皮镰孢菌的微滴式数字PCR标准曲线；

图8.腐皮镰孢菌的实时荧光定量PCR重复性检测；

图9.腐皮镰孢菌的微滴式数字PCR重复性检测；

图10.人参根际腐皮镰孢菌数量动态与发病率检测结果图；

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

实施例中“QX200^TMdd PCR^TM

Supermix”试剂由Bio-Rad公司提供；QX100^TMDroplet Digital ^TM PCR System(QX100数字微滴PCR系统)实验设备由Bio-Ra d中国公司提供。荧光定量PCR仪器为Agilent Mx3000P，试剂为Fast Probe Mixture，由上海生工生物股份有限公司提供。

实施例1：人参根腐病病原菌鉴定

1.1人参根腐病病原菌形态学鉴定

采用培养基培养分离纯化不同产区来源的人参根腐病病株携带的真菌，将土壤样品中分离纯化得到的病原菌株接种于PDA平板上，25±3℃培养3d左右，观察其形态特征，结果如图1所示。由图1可知，菌丝体呈絮状，背面淡黄色。腐皮镰孢菌菌株的菌丝为白色，病原菌菌株的大型分生孢子呈镰刀形或柱形，小型分生孢子呈卵形。参照《真菌鉴定手册》通过观察菌株的菌落形态、菌丝和孢子形态特征进行菌株鉴定。判定该病原菌为瘤座孢科(Tuberculariaceae)镰刀菌属(Fusarium)的腐皮镰孢菌(Fusarium solani)。

1.2人参根腐病病原菌分子生物学鉴定

将病原菌在PDA培养中培养7d，采用索莱宝真菌DNA提取试剂盒进行提取，即可得高质量的基因组DNA。

采用菌种鉴定通用引物(表1)对中提取得到的DNA进行扩增。PCR反应体系(20μl)：Mix10μl，引物1.0μl，DNA模板1.0μl，ddH₂O补足。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，40个循环；72℃延伸10min。PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司进行纯化和测序。

表1 真菌通用引物序列

将测序获得的序列信息与NCBI数据库中已知种序列进行比对，结果如图2所示。由图2可见该菌株与序列相似度达100％，结果证明该菌株为腐皮镰孢菌(Fusarium solani)。

实施例2.腐皮镰孢菌分子检测方法的建立

2.1人参根腐病特异性引物设计

将实施例1的腐皮镰孢菌测序结果与GenBank数据库中腐皮镰孢菌ITS的基因及其近缘种序列进行多重同源性比较，基于比对结果选取序列差异位点，设计特异性引物及探针(3对)，探针5’端标记FAM荧光信号基团，3’端标记荧光淬灭基团BHQ1。采用NCBI-Blast初步验证引物的理论特异性，引物和探针由上海生工生物工程股份有限公司合成，实验室最终确定引物1(如表2所示)特异性好，引物2或3有其余近缘种的扩增。

表2 特异性引物探针序列

2.2荧光定量PCR(qPCR)检测方法的建立

对引物退火温度以及反应体系进行优化，反应程序为：94℃预变性5min，95℃变性30s，58℃、60℃、62℃和64℃退火延伸60s，40个循环。通过对退火温度进行梯度qPCR检测，最终确定最佳退火温度为64℃，因此后期使用64℃作为退火温度进行PCR检测。

通过对反应体系中引物探针及DNA含量的优化，20μL体系中加入Fast ProbeMixture 10μL(Bio-Rad美国伯乐)，最终确定引物0.1μL，DNA0.5μL的反应体系进行PCR检测。

反应体系见表3，反应程序为：94℃预变性5min，95℃变性30s，64℃退火延伸60s，40个循环。

表3 荧光定量PCR反应体系

2.3微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法的建立

反应体系见表4，PCR扩增程序为：94℃预变性5min，95℃变性30s，64℃退火延伸60s，50个循环，98℃加热10min；扩增结束后，进行微滴荧光读取；采用FAM双通道荧光采集微滴信号，并通过热点图确定荧光阈值限及阴性微滴生成数和阳性微滴生成数。

表4 微滴式数字PCR反应体系

2.4荧光定量PCR、微滴式数字PCR检测方法的特异性检测

采用真菌DNA提取试剂盒提取样品DNA，以目标菌株：实施例1鉴定的腐皮镰孢菌(Fusarium solani)，阴性菌株((购于中国微生物菌种保藏中心)：人参核盘菌(Sclerotinia ginseng)、强壮土赤壳(Ilyonectria robusta)、人参链格孢菌(Alternariapanax)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)；腐皮镰孢菌近缘种：尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)DNA为模板，每种菌株设置3个重复的反应体系，对引物进行特异性验证，标准菌株腐皮镰孢菌(由吉林农业大学植保实验室分离鉴定保存)作为阳性对照，以ddH₂O为阴性对照(NTC)。

采用2.2建立的荧光定量PCR检测方法，该方法的特异性检测结果如图3所示。由图3可见仅有实施例1鉴定的腐皮镰孢菌及阳性对照出现扩增曲线，证明该对引物特异性好。

采用2.3建立的微滴式数字PCR检测方法，该方法的特异性检测结果如图4所示。由图4可见扩增微滴的生成数>12000，表示微滴生成正常。由图4可见，仅有腐皮镰孢菌DNA及阳性对照出现荧光信号，其他阴性菌株以及ddH₂O均无荧光信号，表明该引物在微滴式数字PCR中具有较高的特异性。

2.5荧光定量PCR、微滴式数字PCR检测方法的灵敏度检测

用微量核酸分析仪检测实施例1鉴定的腐皮镰孢菌基因组DNA，测定后并按照10倍梯度进行稀释，稀释至10^-5，置于-20℃冰箱备用。用2.2优化好的荧光定量PCR反应体系和2.3微滴式数字PCR反应体系进行检测，以确定荧光定量PCR和微滴式数字PCR检测体系的最低检测限点。以ddH₂O作为对照，测定特异性引物灵敏度。

采用2.2建立的荧光定量PCR检测方法，结果发现(图5)在大于10^-2ng/μL浓度下荧光定量PCR都能检测到明显的阳性扩增，而低于10^-2的DNA表现为阴性扩增，无荧光信号的增加，由此可见，所建立的qPCR方法的灵敏度为10^-2ng/μL。

采用2.3建立的微滴式数字PCR检测方法，结果发现(图6)DNA含量小于10^-5时RSD为0.48～0.54，表明ddPCR的最低检测限度为10^-5ng/μL，即0.97copies/μL，其灵敏度远高于qPCR的最低检测浓度。图7为本发明微滴式数字PCR的标准曲线，其线性范围为0.001-10μg/μl。

2.6荧光定量PCR、微滴式数字PCR检测方法的重复性试验

将实施例1鉴定的腐皮镰孢菌DNA在2.2和2.3的条件下进行荧光定量PCR和微滴式数字PCR含量检测，重复检测3-8次，验证该方法的可重复性。

采用2.2建立的荧光定量PCR检测方法，结果发现(图8)，实施例1鉴定的腐皮镰孢菌Ct值RSD＝0.31，三条扩增曲线基本一致，表明建立的检测方法可重复性高，可以用于后续样本的检测。

采用2.3建立的微滴式数字PCR检测方法，结果发现(图9)，8次检测结果中阳性微滴数基本一致，RSD＝0.35，表明建立的检测方法可重复性高，可用于后续样本的定性定量检测。

实施例3.罹病人参根际土壤中病原菌数量的动态检测

人参根腐病是一种真菌性病害，主要危害3-6年龄参的根部，土壤和带菌种苗均能传病。采用实施例2中2.3建立的微滴式数字PCR法研究腐皮镰孢菌在土壤中的数量动态。将三年生人参种苗移栽于花盆中(Φ＝23.5cm)每盆3株，放置于吉林农业大学药植园遮荫棚内，其余田间管理同大田。经人参种苗适应盆栽环境后，选取大小一致的人参进行试验。

诱病组：收集PDA培养的腐皮镰孢菌的菌丝体，振荡过滤后制成孢子悬液，调整浓度为3×10⁴孢子囊/mL。于2020.07.15日采用灌根法将孢子悬液接入三年生盆栽人参中(每棵人参50ml)；农药组：添加病原菌3d后根施多加菌灵250倍液，用量为每棵人参50ml；CK：老参地土壤为对照，老参地土壤取样时间从2020.07.15日开始，后续取样时间与诱病组、农药组一致。取样方法，人参根际土壤采集后放置于冰盒中迅速带回实验室，-80℃冰箱保存，采用土壤基因组DNA提取试剂盒进行提取，进行ddPCR检测。

采用DPS 9.50版和Origin2018版处理试验数据，对有关数据进行显著性分析。

分析不同处理下人参根腐病病原菌在土壤中变化趋势如图10，由图可见，CK对照老参地土壤中该菌数量为927.50～8470copies/g，在8月15日病原菌数量达到最高。诱病组外源添加病原菌后其变化趋势为双峰型，峰值分别出现在7月25日、8月15日，处理40天内该菌数量均与对照有显著差异(p＜0.05)，为对照的1.72～7.41倍，最高可达62765.50copies/g。农药组与诱病组病原菌数量变化趋势基本一致，表现为双峰型，其峰值分别出现在7月25日，8月15日。相较于诱病组其病原菌数量平均降低了37.94％，尤其是在8月15日病原菌爆发期，相较于诱病组降低了86.92％，为8207.50copies/g，与诱病组差异显著(p＜0.05)。综合上述分析，老参地土壤中存在一定数量的根腐病病原菌，8月中旬为该病原菌的数量高峰期，多菌灵对该病原菌控制作用较显著，处理后土壤中病原菌降至2152.50copies/g。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 吉林农业大学

<120> 一种用于检测腐皮镰孢菌的微滴式数字PCR试剂盒

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaacagacg gccctgtaa 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttcgctgcg ttcttcatcg 20

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgccagagg acccctaact ctgtt 25

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaagaacgca gcgaaatgcg 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aggcatgccc gccagaata 19

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tttgaacgca cattgcgccc gcca 24

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cacacgccgt ccctcaaata c 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gctctccagt tgcgaggtgt 20

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgccgcagct tccattgcgt agtagct 27

Claims

1.一种用于检测腐皮镰孢菌的特异性引物和探针组合，其特征在于，包括1对特异性引物和与引物配合使用的荧光标记探针，其核苷酸序列分别为：

Forward primer：5’GGAACAGACGGCCCTGTAA 3’(Seq ID No:3)；

Reverse primer：5’TTTCGCTGCGTTCTTCATCG 3’(Seq ID No:4)；

Probe:5’CCGCCAGAGGACCCCTAACTCTGTT3’(Seq ID No:5)；

2.根据权利要求1所述的用于检测腐皮镰孢菌的特异性引物和探针组合，其特征在于，所述探针Probe的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。

3.一种含有权利要求1或2所述的特异性引物和探针组合的腐皮镰孢菌检测试剂盒。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为微滴式数字PCR绝对定量检测试剂盒。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述微滴式数字PCR绝对定量检测试剂盒还包含QX200^TMdd PCR^TM

Supermix，微滴发生油，阴性对照和阳性对照；优选地，所述阳性对照为标准菌株腐皮镰孢菌，阴性对照为ddH₂O。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的工作程序为：

1)获取样本的总DNA；

3)按照预设的反应数制备各个反应体系；

4)将各个反应体系分别进行微液滴处理；

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述工作程序中的步骤3)中20μL微滴式数字PCR反应体系为：Forward primer和Reverse primer各0.1μL，引物的原始浓度为10μM，Probe 0.1μL，探针原始浓度为10μM，QX200^TMdd PCR^TM

Supermix 10μL，灭菌超纯水9.2μL，加入0.5μL原始浓度为10ng/μL的样本DNA。

8.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述工作程序中的步骤4)中；将各个反应体系进行微液滴处理时，每个反应体系的总微液滴数大于或等于12000，则确认微液滴生成有效。

9.根据权利要求6-8任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述工作程序中的步骤5)中PCR的扩增程序为94℃预变性5min，95℃变性30s，64℃退火延伸60s，50个循环，98℃加热10min结束反应，每步都设置2℃/s的降温速度。

10.权利要求3-9任一项所述的试剂盒在人参根腐病检测和预防中的应用。