CN112852988A - 一种同时检测青霉和镰刀菌的微滴数字pcr检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于同时检测青霉和镰刀菌的引物、探针。本发明还涉及用于测定食品中青霉和镰刀菌的双重微滴数字PCR检测方法，所述方法包括使用针对青霉和镰刀菌检测的特异性寡核苷酸引物及探针。本发明还涉及用于食品中青霉和镰刀菌的双重微滴数字PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括特异性寡核苷酸引物及探针。使用本发明的双重微滴数字PCR检测方法，能够简单、快速、特异且灵敏地同时检测青霉和镰刀菌。

Description

一种同时检测青霉和镰刀菌的微滴数字PCR检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于高特异、高灵敏度的快速检测青霉和镰刀菌的寡核苷酸引物和探针以及包含所述引物对和探针的双重微滴数字PCR检测试剂盒，用于测定青霉和镰刀菌的双重微滴数字PCR检测方法，以及所述引物对和探针或试剂盒在快速检测青霉和镰刀菌中的应用。
背景技术
青霉，一般是指青霉属（Penicillium），和曲霉属（AsPergillus）有亲缘关系，有二百几十种，代表种是灰绿青霉，从土壤或空气中很易分离。分枝成帚状的分生孢子从菌丝体伸向空中，各顶端的小梗产生链状的青绿—褐色的分生孢子，根据分生孢子顶端的膨大与否，与曲霉属（AsPergillus）相区别。自从弗莱明（A．Fleming，1929）发现特异青霉（Penicillium notatum）产生抑制细菌生长物质青霉素以来，已对该属菌的很多种进行了研究。特异青霉已被用于制造青霉素，但不具这种机能的种还很多，同时很多青霉甚至产生毒枝菌素。
镰刀菌为一种重要的植物病原真菌，在自然界中营寄生或腐生生活。到目前为止已鉴定的镰刀菌有 40 多种，其中以禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、串珠镰刀菌（Fusarium verticillioides）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）分布最为广泛且危害严重。赤霉病主要分布于气候温暖、湿润的温带地区，受生态环境、寄主范围以及生物因素等影响，镰刀菌的分布呈现地域性特征。
产毒真菌的分类鉴别一般采用形态学方法，主要按照真菌的形态、生理特点、抗原构造等特征加以区分。但是，常规的形态学检测方法存在一定的缺陷，如菌的种类较多、形态特征复杂、部分形态特征和生理生化指标随环境的变化而不稳定、种的水平上鉴别不准确、耗时长等，国内外研究者业已研发出系列以免疫亲和柱等前处理产品结合色谱-质谱联用的多元化毒素精准检测体系，有效地改善了食品及饲料中真菌毒素的检测能力。尽管如此，现有仪器法仅靶向于毒素本身，无法在毒素形成前或早期预测样品产毒潜能，有效前置化干预毒素危害。总体而言，若毒素已能从食品或饲料中检测出，其污染已十分严重，受感染的产品仅能毁灭处置，无法挽回经济损失及对受污染产品摄入者的危害。因此，提前监测产毒真菌的存在与否对避免潜在毒素危害意义卓著。
本发明基于以数字PCR为基础的分子生物学技术，以青霉和镰刀菌的核酸为检测基础，青霉的β-微管蛋白编码区、镰刀菌LS rRNA序列为靶基因设计引物及探针，利用数字PCR法检测青霉和镰刀菌。建立的双重微滴数字PCR检测方法，能同时检测两种真菌，突破现有仪器法仅靶向于毒素本身，无法在毒素形成前或早期预测样品产毒潜能，提前监测青霉和镰刀菌的存在与否，实现有效防控毒素污染和危害，为青霉和镰刀菌的诊断添加快速、精准的技术手段。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供快速检测青霉和镰刀菌的特异性寡核苷酸引物及探针。
本发明的另一个目的在于，提供快速测定青霉和镰刀菌的微滴数字PCR检测方法。
本发明提供青霉和镰刀菌的特异性寡核苷酸引物和探针在检测食品中青霉和镰刀菌的应用。
针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明以青霉和镰刀菌的核酸为检测基础，根据青霉的β-微管蛋白编码区、镰刀菌LS rRNA序列为靶基因设计引物及探针，利用数字PCR法检测青霉和镰刀菌。
在一个实施方案中，本发明提供用于通过微滴数字PCR方法检测青霉和镰刀菌的寡核苷酸引物对及探针，所述引物对及探针是根据青霉的β-微管蛋白编码区、镰刀菌LSrRNA序列中保守性强的区域而设计的。
在一个实施方案中，所使用的引物对序列为：
Pen-F：CGACAATACCACTCGAA；
Pen-R：ACTGACCGAAGACGAAGTTGT；
ITS -F：GGATACTTTTGATGCGGTGCCT；
ITS -R：TACTTGTGCGCTATCGGTC；
探针序列为：
Pen-P：CY5-ATGTAAGTTGCGTGTCCAGTCAA-BHQ3；
ITS -P：FAM-TGCTGCTCTAAATGGGAGG-BHQ1；
在一个实施方式中，所述探针为Taqman探针。
在一个实施方式中，在探针的3’端连接有荧光淬灭基团，5’端连接有荧光报告基团。
在本发明，所述荧光淬灭基团可以为本领域通常使用的荧光淬灭基团，例如BHQ3、BHQ1、BHQ2或TAMRA等；所述荧光报告基团可以为本领域通常使用的荧光报告基团，例如FAM、HEX或VIC等。
在一个实施方式中，在探针的5’端连接有FAM，3’端连接有BHQ1；
在一个实施方式中，在探针的5’端连接有VIC，3’端连接有BHQ1；
一方面，本发明提供了用于通过微滴数字PCR方法检测青霉和镰刀菌的试剂盒，其中，所述试剂盒包括本发明的引物对和探针。
另一方面，本发明提供了通过微滴数字PCR方法检测青霉和镰刀菌的方法，所述方法包括使用本发明的引物对和探针或者本发明的试剂盒。
在一个实施方式中，所述数字PCR反应条件为：95°C预变性30 s; 95°C 15 s、60°C退火及延伸60 s，共进行40个循环；98°C加热10 min使酶失去活性；4°C保存。
在一个实施方式中，所述检测方法包括步骤：
(a) 微滴数字PCR体系配置；
(b) 提供微滴数字PCR反应的条件；
(c) 使用本发明的引物对和探针或试剂盒，通过微滴数字PCR方法进行核酸扩增反应和检测扩增产物。
数字PCR是一种基于单分子扩增以及原始反应分割的一种PCR扩增手段。数字PCR通过将原始的反应体系进行有限的大量分割，将参与扩增的组分和体系中的模板分配到单个的反应小体系中。通过PCR的扩增,当小的反应体系中存在有目标分子时，会产生扩増产物并释放荧光信号，反之，当体系中不存在目标分子时，该小反应体系为阴性。数字PCR技术作为一种新型的分子扩増方法,与实时荧光PCR相比，稳定性好，灵敏度更高。可实现对低丰度的基因组样品的精准检测。因此数字PCR可作为定性检测的一种有效的高灵敏度的检测手段。
本发明的数字PCR检测方法为微滴式数字PCR，该技术是基于油包水原理，将含有核酸分子的反应体系生成数万至数百万个微滴，经PCR扩增后，采用微滴分析仪对每个微滴进行检测，确定阳性微滴。本发明的方法巧妙地运用了PCR技术的核酸高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，具有很高的灵敏度、稳定性和重复性。使用本发明的双重微滴数字PCR检测方法，其简单、快速、特异且灵敏的特点适合用于食品等样品中青霉和镰刀菌的检测。
附图说明
图1、2是显示微滴数字PCR特异性扩增青霉（Pen反应体系）和镰刀菌（Fus反应体系）的结果。
图3是显示双重微滴数字PCR检测的结果。
图4、图5是灵敏度检测结果，Pen、Fus的检出限LOD分别为161 copies/反应、29copies/反应。
具体实施方式
通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。
实施例1
本实施例通过如下实验对青霉和镰刀菌的引物和探针进行了特异性验证。
所使用的主要检测仪器：
微量移液器(10 µL、100 µL、1000 µL，EpPendorf)、Electronic Pipette移液器（RAININ ），离心机(5804R，EpPendorf)，核酸蛋白分析仪(DU640，Beckman)，微滴数字PCR仪器（Bio-rad）等。
检测用主要试剂：
脑心浸液肉汤（BHI）（北京陆桥技术股份有限公司），Droplet Generation Oilfor Probes（Bio-rad），ddPCRTMSupermix for probes（Bio-rad），引物探针由生工生物工程股份有限公司合成。
检测主要步骤：
（1）体系配置
微滴数字PCR扩增体系：Bio-Rad数字PCR平台反应体系总体积为20 µL，包括ddPCRTMSupermix for probes10 µL、上下游引物各1.8 µL及探针0.5 µL、模板质粒DNA2 µL和ddH2O3.9 µL。
（2）检测用的引物对及探针
Pen-F：CGACAATACCACTCGAA；
Pen-R：ACTGACCGAAGACGAAGTTGT；
ITS -F：GGATACTTTTGATGCGGTGCCT；
ITS -R：TACTTGTGCGCTATCGGTC；
探针序列为：
Pen-P：CY5-ATGTAAGTTGCGTGTCCAGTCAA-BHQ3；
ITS -P：FAM-TGCTGCTCTAAATGGGAGG-BHQ1。
（3）微滴生成
使用RAININ Electronic Pipette移液器调至20 µL将（1）中所述的反应体系转移至Droplet Generator Cartridge(微滴生成卡)的Sample排孔中，并在oil排孔中加入70 µL的Droplet Generation Oil for Probes(微滴生成专用油)，加样过程中尽量避免产生气泡。完成后将微滴生成卡转移至QX200TM Droplet Generator(微滴生成仪)中自动完成微滴的生成。
（4）微滴的PCR扩增
使用RAININ Electronic Pipette移液器调至40 µL将（3）中生成的微滴转移至96孔板中并在PX1TM PCR Plate Sealer(热封膜仪)完成封膜后，转移至T100TMThermalCycler中进行PCR扩增，反映参数为：95°C预变性30 s; 95°C 15 s、60°C 退火及延伸60 s，共进行40个循环；98°C加热10 min使酶失去活性；4°C保存。
（5）微滴荧光信号的读取
将（4）中的96孔板取出，置于QX200TM Droplet Reader进行微滴的读取计数，分析热点图确定荧光阈值来计算阳性微滴数和阴性微滴数。
如图1所示，实验结果显示空白对照有极少量扩增，说明体系没有受到污染，且每个样品生成的微滴数量大于12000，符合泊松分布计算的需要。阴性对照有极少量的扩增，表明该微滴数字PCR体系的引物及探针特异性良好，可以用于后续的实验。本方案建立的微滴数字PCR方法仅能够特异性扩增青霉和镰刀菌。
实施例 2
本实施例以青霉和镰刀菌的核酸为检测基础，通过如下实验对多重体系进行了筛选。
通过调整引物探针浓度、退火温度等条件，可以确定本双重微滴数字PCR方法的反应体系。
所使用的特异性引物对及探针序列与实施例1相同。
所使用的主要检测仪器和检测用主要试剂与实施例1相同。
实验步骤：
（1）将2组引物按照上游引物：下游引物：探针=18∶18∶5的比例，分别混合为F/R/P预混液1；
（2）将Pen/Fus的质粒按1∶1的比例混合为DNA预混液2；
（3）将（1）中预混液1按照Pen/Fus分别为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3的比例再次混合成预混液3；
（4）配置ddPCR反应体系
ddPCRTMSupermix for probes10 µL、上下游引物各1.8 µL及探针0.5 µL、模板质粒DNA2 µL、Hind Ⅲ0.2 µL和ddH2O3.7 µL；
反映参数为：95°C预变性30 s; 95°C 15 s、双重体系的退火温度分别为60°C、61°C、62°C、63°C、64°C，退火及延伸60 s，共进行40个循环；98°C加热10 min使酶失去活性；4°C保存。
扩增结果如图2所示，通过调整引物探针比例添加量建立的双重体系实验数据经微滴荧光值聚类分析后，最终确定Pen/Fus双重体系的引物探针比例为3：1，退火温度61°C，此时Pen/Fus双重体系扩增两种目的基因的阳性微滴和阴性微滴荧光平均差值相近且较大；在以上反应条件下，双重反应体系的荧光报告值高，阴性微滴和阳性微滴微滴荧光值集聚在同一值附近；阳性微滴和阴性微滴平均差值两两之间都比较大；微滴生成数量达到微滴数字PCR实验要求。
实施例 3
本发明的发明人通过如下步骤对多重体系灵敏度和重复性进行实验。
将两种质粒DNA模板按照Pen/Fus体系中的比例混合制成浓度为20 ng/µL的预混液后，按预混液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9共10个梯度进行稀释，并在已经优化筛选出的双重微滴数字PCR反应体系中扩增，详细步骤同实施案例2。此外为了考察优化体系的稳定性，设置3组平行试验。同时为了评价人员操作对实验结果造成的差异，进行人员间的重复试验。
扩增结果如图3所示，使用已确定的最优双重体系参数进行灵敏度实验，实验结果表明本双重反应体系的荧光报告值高，阴性微滴和阳性微滴微滴荧光值集聚在同一值附近并且区分明显，微滴生成数量达到实验要求，经泊松分布计算并消除空白气溶胶污染得到Pen、Fus的检出限LOD分别为161 copies/反应、29 copies/反应，相较于实时荧光PCR反应检测限提升了3个数量级，大大提高了反应的效率和灵敏度。经过两次以上的实验并更换实验人员后，得到的实验结果与预期一致，重现性好。

Claims (8)

1.用于双重微滴数字PCR方法检测青霉和镰刀菌的核酸引物对及探针
其中所述引物对选自以下引物对：
Pen-F：CGACAATACCACTCGAA；
Pen-R：ACTGACCGAAGACGAAGTTGT；
ITS -F：GGATACTTTTGATGCGGTGCCT；
ITS -R：TACTTGTGCGCTATCGGTC；
探针序列为：
Pen-P：CY5-ATGTAAGTTGCGTGTCCAGTCAA-BHQ3；
ITS -P：FAM-TGCTGCTCTAAATGGGAGG-BHQ1。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸引物对及探针，其中所述数字PCR方法为微滴数字PCR法。
3.权利要求1所述的引物对和探针，其中，在探针的3’末端连接有荧光淬灭基团，5’末端连接有荧光报告基团。
4.权利要求3所述的引物对和探针，其中，所述荧光淬灭基团为BHQ、BHQ1、BHQ2或TAMRA，所述荧光报告基团为FAM、HEX或VIC。
5.用于通过双重微滴数字PCR方法检测青霉和镰刀菌的试剂盒，其中所述试剂盒包括权利要求1-4任一项所述的引物对和探针。
6.通过双重微滴数字PCR方法检测青霉和镰刀菌的方法，所述方法包括使用权利要求1-4任一项所述的引物对和探针或者权利要求5中所述的试剂盒，所述方法不用于疾病诊断和治疗目的。
7.权利要求6所述的方法，包括：
(a) 提供双重微滴数字PCR反应的条件；
(b) 使用权利要求1-4任一项所述的引物对和探针或权利要求5中所述的试剂盒，通过双重微滴数字PCR方法进行核酸扩增反应和检测扩增产物。
8.权利要求1-4任一项所述的引物和探针或者权利要求5中所述的试剂盒在检测青霉和镰刀菌的应用，所述应用不用于疾病诊断和治疗目的。
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