CN117568509A - 一种基于微滴数字pcr技术检测曲霉、青霉和镰刀菌的引物探针组合及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于微滴数字PCR技术检测曲霉、青霉和镰刀菌的引物探针组合及应用，属于生物学技术领域。本发明中的引物探针组合包括曲霉属引物对探针组、镰刀菌属引物对探针组、曲霉属和青霉属共有引物对探针组以及内参基因引物对探针组，该引物对探针组能够同时鉴定较难区分的曲霉属、青霉属和镰刀菌属真菌，且检测特异性好，不仅可做到准确鉴别，而且灵敏度高，此外该引物探针组合中的引物和探针还可灵活组合，因此可广泛应用于科研、医学、环境和食品等多个领域中青霉、曲霉和镰刀菌的检测。

Description

一种基于微滴数字PCR技术检测曲霉、青霉和镰刀菌的引物探 针组合及应用
技术领域
本发明属于生物学技术领域，尤其涉及一种基于微滴数字PCR技术检测曲霉、青霉和镰刀菌的引物探针组合及应用。
背景技术
曲霉菌(Aspergillus)属于腐物寄生性真菌，广泛分布于自然界中，多存在于土壤、腐烂食物和堆肥中。曲霉菌是一种常见的条件致病菌，约有50多种被认为对人类具有致病性，曲霉菌病主要见于原发性和继发性免疫缺陷者，对于白血病、恶性淋巴瘤、肿瘤等患者，以及长期使用抗生素和皮质激素等药物的人群，曲霉菌感染的风险也会增加。曲霉菌可以感染人体的多个组织和部位，其中肺部是曲霉病最常见的感染部位，容易引起急性肺炎，临床上常见的感染肺部的曲霉菌有烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、黄曲霉(Aspergillusflavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、土曲霉(Aspergillus terreus)和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)等。
青霉菌(Penicillium)是一种真菌属，由300多种真菌组成，普遍存在于土壤、植被、空气和各种食品中。马尔尼菲青霉(Talaromyces marneffei)以前属于青霉菌属，是该属中最常见的引起临床感染的物种，后来马尔尼菲青霉和属于双轮亚属(subgenusBiverticillium)的其他青霉菌一起被划为篮状菌属(Talaromyces)，因此，青霉菌目前一般指非马尔尼菲青霉菌。由青霉菌引起的侵袭性感染在临床上较为罕见，一般发生在免疫抑制人群中，特别是血液恶性肿瘤患者，通常在侵袭性肺部真菌感染的情况下引起散播性感染，死亡率高。青霉菌被认为是在世界范围内引起侵袭性真菌感染的新出现的机会性病原体，目前报道的有指状青霉(Penicillium digitatum)、桔青霉(Penicilliumcitrinum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、扩展青霉(Penicillium expansum)和胶囊青霉(Penicillium capsulatum)等。
镰刀菌(Fusarium)是自然界广泛存在的丝状真菌，常见于土壤、植物和水中，可引起植物、动物和人类的感染。镰刀菌通常在免疫功能正常的患者中引起局部皮肤感染，而散播性感染则在免疫功能低下的患者中更为常见，尤其是肺部镰刀菌感染。引起镰刀菌病的主要致病菌有腐皮镰刀菌复合群(Fusarium solanispecies complex,FSSC)、尖孢镰刀菌复合群(Fusarium oxysporum species complex,FOSC)、双孢镰刀复合群(Fusariumdimerum species complex,FDSC)等。
曲霉菌、青霉菌和镰刀菌同属于真菌中的霉菌，在病原菌的检测中较难区分。在组织中，镰刀菌菌丝透明，有锐角分支，这与曲霉菌的形态外观相似，仅从组织病理学角度进行区分有时很困难；此外，肺部镰刀菌感染症状是非特异性的，因此很容易将镰刀菌肺炎误诊为其他疾病，如免疫功能正常的患者的肿瘤性疾病或多发性肉芽肿病，以及免疫功能低下的患者的其他侵袭性真菌肺炎，如曲霉菌肺炎。而用于检测曲霉菌的GM试验也被发现与其他真菌有交叉反应，包括青霉菌，酵母和镰刀菌，因此，一个阳性的GM试验可能表明曲霉的存在，但也有可能是镰刀菌或青霉菌。有学者在19例非马尼菲青霉菌样本中只检测到1例为青霉菌，其余样本被误鉴定为曲霉菌或镰刀菌，或无法鉴定菌种，或未检测到，而这种非马尼菲青霉菌的错误鉴定可能引发对曲霉菌或镰刀菌的治疗干预，因此准确鉴别这三种菌具有重要的意义。
数字PCR(Digital PCR，dPCR)是继real time PCR技术的第三代PCR技术，是一种全新的核酸检测和定量的方法，具有超高灵敏检测的特点，且无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量。数字PCR技术在微生物检测领域具有诸多优势，首先，数字PCR技术可以直接得到病原微生物的绝对定量结果；其次，数字PCR技术具有高灵敏度和特异性的优点，可以检出低拷贝数的病原微生物，并且鉴定细菌真菌耐药突变；此外，数字PCR技术从样本采集到出具检测报告仅需3～4个小时，可以满足不论医学还是食品检测领域对于病原菌快速检测的需求。使用数字PCR技术有望拓展PCR检测技术在多领域中对于曲霉菌、青霉菌和镰刀菌准确鉴别方面的应用。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于微滴数字PCR技术检测曲霉、青霉和镰刀菌的引物探针组合及应用。本发明中的引物探针组合包括曲霉属引物对探针组、镰刀菌属引物对探针组、曲霉属和青霉属共有引物对探针组以及内参基因引物对探针组，该引物对探针组能够同时鉴定较难区分的曲霉属、青霉属和镰刀菌属真菌，且检测特异性好，不仅可做到准确鉴别，而且灵敏度高，此外该引物探针组合中的引物和探针还可灵活组合，因此可广泛应用于科研、医学、环境和食品等多个领域中青霉、曲霉和镰刀菌的检测。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明提供了一种基于微滴数字PCR技术检测曲霉、青霉和镰刀菌的引物探针组合，所述引物探针组合包括曲霉属引物对探针组、镰刀菌属引物对探针组以及曲霉属和青霉属共有引物对探针组；其中：所述曲霉属引物对探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的特异性探针；所述镰刀菌属引物对探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.5所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的特异性探针；所述曲霉属和青霉属共有引物对探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.8所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的特异性探针。
进一步的，所述引物探针组合还包括内参基因引物对探针组，所述内参基因引物对探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.11所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的特异性探针。
进一步的，所述引物探针组合中在特异性探针的5’末端连接有荧光报告基团，3’末端连接有荧光淬灭基团。
更进一步的，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的特异性探针在5＇端标记有荧光报告基团FAM，3＇端标记有荧光淬灭基团MGB；所述核苷酸序列如SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.12所示的特异性探针在5＇端标记有荧光报告基团HEX，3＇端标记有荧光淬灭基团MGB。
本发明中所述引物探针组合的获得步骤主要如下：
1)针对曲霉属、青霉属和镰刀菌属这3个属的ITS基因序列设计扩增引物和探针。在NCBI上尽可能多的下载曲霉属、青霉属和镰刀菌属的不同种的ITS序列，使用ClustalX软件进行多序列比对，并选择特异性扩增区间进行扩增引物的设计，再运用Primer Express3.0.1对引物和探针进行设计。在设计的过程中，由于曲霉属和青霉属的ITS序列同源性较高，难以同时设计出两者的特异性探针，最后选择设计一条检测曲霉属的特异性探针和一条能同时检测曲霉属和青霉属的共有探针，从而达到鉴别曲霉属和青霉属的目的。
2)除了上述曲霉属、青霉属和镰刀菌属的特异性区间外，当本发明应用于检测临床样本时，还需增加一个质控片段，即人基因组片段，由于检测的样本中携带有人基因组背景，因此新增一个人基因组片段用于样本质量以及实验操作的质控。
3)使用Multiple Primer Analyzer网站对设计好的所有引物进行多重引物分析，去除存在严重的引物二聚体或引物3＇端非特异性结合的引物，并重新设计。三种菌的扩增引物和探针可多设计几组，方便后续的筛选和验证。
4)以购买的菌株所提取的DNA为模板，对设计好的扩增引物和探针进行筛选和验证。经过微滴数字PCR实验验证后，最终确定的引物和探针序列如表1所示。
表1引物探针组合详情
本发明还提供了一种使用所述引物探针组合制成的试剂盒。
进一步的，所述试剂盒具体为肺部侵袭性真菌检测试剂盒。
更进一步的，所述侵袭性真菌为曲霉菌、青霉菌和镰刀菌中的至少一种。
本发明还提供了一种基于微滴数字PCR技术，使用所述引物探针组合或所述试剂盒检测曲霉属、青霉属和镰刀菌属的方法。
进一步的，所述微滴数字PCR检测的反应程序如下：
本发明还提供了一种所述引物探针组合、所述试剂盒或所述检测方法在科研、医学、环境和/或食品检测领域中的应用，其中所述医学检测领域不用于疾病诊断和治疗目的。
与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
本发明基于微滴数字PCR技术设计的引物和探针组合能够同时鉴定较难区分的曲霉属、青霉属和镰刀菌属，且检测特异性好，灵敏度高，对引物探针进行灵活组合，可广泛应用于科研、医学、环境和食品检测等领域。
附图说明
图1为本发明实施例1中微滴数字PCR检测曲霉菌、青霉菌和镰刀菌菌株DNA样本的1DAmplitude结果图；
图2为本发明实施例2中微滴数字PCR检测烟曲霉、扩展青霉和尖孢镰刀菌的1DAmplitude结果图；
图3为本发明实施例2中微滴数字PCR检测烟曲霉和扩展青霉混样的2DAmplitude结果图；
图4为本发明实施例2中微滴数字PCR检测烟曲霉和尖孢镰刀菌混样的2DAmplitude结果图；
图5为本发明实施例2中微滴数字PCR检测扩展青霉和尖孢镰刀菌混样的2DAmplitude结果图；
图6为本发明实施例2中微滴数字PCR检测烟曲霉、扩展青霉和尖孢镰刀菌混样的2DAmplitude结果图；
图7为本发明实施例3中微滴数字PCR检测5种不同菌的临床阳性样本的1DAmplitude结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下实施例中使用的试剂、试剂盒和仪器均可由市售获得，实施例中使用的方法如无特别说明，与常规使用的方法一致。
下面结合实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细阐述。
实施例1
本实施例使用于中国普通微生物菌种保藏管理中心购买的6种菌株对引物探针进行性能的检测，所述6种菌株分别为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、黄曲霉(Aspergillusflavus)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、扩展青霉(Penicilliumexpansum)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。
以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明。
1、样本提取
使用核酸提取试剂进行菌株DNA的提取，提取后的DNA样本进行浓度测定并使用纯化水进行稀释，用于后续实验。
2、反应液配制
依据以下表2～表4的配方表配制A液、B液和反应液。
表2A液配方
表3B液配方
表4反应液配方
3、微滴生成
配制8人份的上述反应液，混匀离心后按照每人份18μL的体积分装至八连管中，依次加入2μL纯化水和6个菌株DNA样本，用移液枪吹打混匀，避免产生气泡。
将微滴发生卡(DG8 cartridge)放入适配器(holder)中，在微滴生成卡的样本孔及油孔分别加入20μL上述反应体系及70μL微滴生成油(Droplet Generation Oil forProbes)；微滴发生卡不能留空，样本孔若不足8人份时用1×补充液(Buffer Control Kitfor ddPCR，现用现配)补上；盖上胶垫后于QX200微滴生成仪中进行反应，生成微滴。
运行完成后，轻轻揭开垫片将上述生成的微滴小心吸取转移到96孔板(ddPCRPlates96-Well)，用预热好的PX1TMPCR热封仪对其进行封膜。
将96孔板置于C1000 TouchTM热循环仪中，按以下表5的扩增程序进行PCR扩增。
表5 PCR扩增程序
4、上机检测
扩增结束后将96孔板转移到QX200微滴分析仪中，进行终点荧光检测。
5、结果分析
结果如附图1所示，由图1可知：空白对照无阳性微滴，说明整个实验过程中反应体系无污染。对于烟曲霉和黄曲霉，在1DAmplitude结果图中可以看到两个通道都有阳性微滴；对于两种青霉菌，只有HEX通道有阳性微滴；而两种镰刀菌则只有FAM通道有阳性微滴。由此可以说明，本发明的引物探针可以特异性鉴别曲霉菌、青霉菌和镰刀菌。
实施例2
本实施例主要考察本发明在肺部侵袭性曲霉菌、青霉菌和镰刀菌检测中的应用，除了检测单菌感染样本，还进行多重体系的验证，以考察反应体系在混合感染情况中对于曲霉菌、青霉菌和镰刀菌的鉴别性能。
1、样本处理
选取实施例1中的烟曲霉、扩展青霉和尖孢镰刀菌的DNA样本，使用293T细胞系DNA样本进行稀释，以此模拟阳性临床样本，用于后续实验。
将上述三个稀释后的样本等比例混合，配制出烟曲霉和扩展青霉混样(AP混样)、烟曲霉和尖孢镰刀菌混样(AF混样)、扩展青霉和尖孢镰刀菌混样(PF混样)以及烟曲霉、扩展青霉和尖孢镰刀菌混样(APF混样)。混合好的样本用于后续实验。
2、数字PCR检测
按照实施例1中的配方表2配制A液，B液则增加HPRT1内参的引物和探针，按照以下表6进行配制，再按照实施例1中的配方表4配制反应液，并进行微滴生成和上机检测。
表6B液配方
3、结果分析
结果如图2～6所示。
从图2中可以看出，空白对照无阳性微滴，说明反应体系没有受到污染，阴性对照(293T细胞系DNA样本)只有HEX通道的HPRT1内参有阳性簇(荧光强度在6000左右)，说明HPRT1内参的扩增具有较高的特异性。而烟曲霉、扩展青霉和尖孢镰刀菌样本除了各自特异性阳性簇外，也同样有HPRT1内参的阳性簇，且各个簇之间具有较明显的区分度。
对于同时存在烟曲霉和扩展青霉的双阳性样本(图3)，在2DAmplitude图中HEX通道荧光强度约6000和9500处有两个阳性簇，分别代表内参和扩展青霉，并且，在HEX通道荧光强度约9500以及FAM通道约12000处有一个阳性簇，此为烟曲霉的阳性簇，是两个通道荧光强度的叠加。对于同时存在烟曲霉和尖孢镰刀菌的双阳性样本(图4)，除了内参阳性簇和烟曲霉的叠加阳性簇，在FAM通道荧光强度约6000处有一尖孢镰刀菌阳性簇。同理可分析PF混样和APF混样的结果(图5和图6)。
实验结果显示，无论是单阳性样本、双阳性样本(AP、AF、PF)，还是三阳性样本(APF)，本发明的反应体系都能够较好地区分曲霉菌、青霉菌和镰刀菌，这说明本发明在医学或科研领域都具有一定的应用效益。
实施例3
本实施例收集2例临床阳性样本(1例烟曲霉、1例镰刀菌阳性样本)，3例检测范围外临床结核分枝杆菌、米根霉、新型隐球菌感染的石蜡包埋组织样本，考察体系的准确性、特异性以及实际的应用性能。
1、样本提取
使用美基的石蜡切片DNA提取试剂盒对石蜡包埋组织样本进行核酸提取。所提取的样本DNA使用紫外分光光度计测定样本纯度，要求OD260/OD280应在1.7～2.1范围内；使用荧光计(染料法)测定样本浓度，要求大于5ng/μL。对这5个样本进行本发明方法的检测，每个样本重复检测两次。
2、数字PCR检测
按照实施例2中的配方表配制反应液，再按照实施例1的方法进行微滴生成和上机检测。
3、结果分析
结果如图7所示，检测结果显示，每一例样本在HEX通道都有HPRT1内参的阳性簇，说明样本质量较好。除此之外，烟曲霉感染样本在两个通道都具有阳性簇(2D图中则为叠加簇)，镰刀菌阳性样本在FAM通道荧光强度约6000处有一阳性簇，且两次检测结果一致。而检测范围外的结核分枝杆菌、米根霉和新型隐球菌感染的样本均只检出内参，且两次结果一致。综上说明，本发明的反应体系可以准确检出曲霉菌和镰刀菌，且具有良好的特异性。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种基于微滴数字PCR技术检测曲霉、青霉和镰刀菌的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括曲霉属引物对探针组、镰刀菌属引物对探针组以及曲霉属和青霉属共有引物对探针组；其中：
所述曲霉属引物对探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的特异性探针；
所述镰刀菌属引物对探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.5所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的特异性探针；
所述曲霉属和青霉属共有引物对探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7～SEQ IDNO.8所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的特异性探针。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合还包括内参基因引物对探针组，所述内参基因引物对探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.10～SEQ IDNO.11所示的引物对和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的特异性探针。
3.根据权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合中在特异性探针的5’末端连接有荧光报告基团，3’末端连接有荧光淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的引物探针组合，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6所示的特异性探针在5＇端标记有荧光报告基团FAM，3＇端标记有荧光淬灭基团MGB；所述核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.12所示的特异性探针在5＇端标记有荧光报告基团HEX，3＇端标记有荧光淬灭基团MGB。
5.使用权利要求1～4任一所述的引物探针组合制成的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在所，所述试剂盒具体为肺部侵袭性真菌检测试剂盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述侵袭性真菌为曲霉菌、青霉菌和镰刀菌中的至少一种。
8.一种基于微滴数字PCR技术检测曲霉属、青霉属和镰刀菌属的方法，其特征在于，使用权利要求1～4任一所述的引物探针组合或权利要求5～7任一所述的试剂盒。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述微滴数字PCR检测的反应程序如下：
10.权利要求1～4任一所述的引物探针组合、权利要求5～7任一所述的试剂盒或权利要求8～9任一所述的检测方法在科研、医学、环境和/或食品检测领域中的应用，其特征在于，所述医学检测领域不用于疾病诊断和治疗目的。
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