JP2006304763A - オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドを用いた真核生物の検出方法及び同定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】安価でかつ迅速確実で容易に真核生物の検出及び同定が可能な新規のオリゴヌクレオチド、このオリゴヌクレオチドを用いた真核生物の検出方法と、このオリゴヌクレオチドを用いた同定方法とを提供する。
【解決手段】真核生物の検出及び真核生物の同定を行うオリゴヌクレオチドであって、特定の塩基配列あるいはその相補鎖の一部又は全部を含有し、当該一部又は全部においてβ−チューブリン遺伝子核酸と特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド。
【選択図】なし

Description

本発明は、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドを用いた真核生物の検出方法及び同定方法に関し、詳しくは真核生物のβ−チューブリン遺伝子の部分領域に特異的にハイブリダイズする配列を含有するオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドを用いた真核生物の検出方法及び真核生物の同定方法に関する。

真菌の一種であるペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属は、アオカビと呼ばれ、食品、抗生物質、酵素の製造など広く利用されている。ペニシリウム属は、４００種を超える菌種が既に発見されている。食品等から検出が多いのはそのうちの約７０種である。ペニシリウム属は家庭内ではハウスダストや食品に多く存在し、家庭環境や工場環境で検出されるカビの２０〜４０％を占め、カビ毒（パツリン、オクラトキシンＡ、シトリニン等）産生能を有する種も存在する。また、真菌の一種であるタラロマイセス（Ｔａｒａｌｏｍｙｃｅｓ）属、ユーペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属等のテレオモルフは、耐熱性でもある。

これらの病原性カビを迅速確実に検出、同定をすることは重要である。特に、ハウスダストや食品に多く存在するペニシリウム属真菌は、カビ毒産生能を有する種が存在する。また、タラロマイセス属、ユーペニシリウム属等のテレオモルフは耐熱性である。これらの病原性カビを迅速確実に検出し、同定をすることは特に重要である。

ペニシリウム属ひとつをとってみても、その分類学的位置は多様であり、菌種は広く分布する。このような背景のもとで、ペニシリウム属真菌等の真核生物がいかなる種に属しているかを同定することは、疾患や食品の変敗等の原因究明あるいは伝播経路の解明等に大きく寄与する。さらに、病原菌の菌種によって適切な抗菌剤を選択する必要があるため、広範囲の病原性菌を迅速確実に検出し、同定することは、疾病に対する薬剤開発を進める上でも重要である。

このため、古くから、肉眼または顕微鏡で形態を観察することによって、菌種の分類（同定）がなされてきた。しかし、形態観察による菌種の同定は、一般に７〜１４日間の培養期間を要し、長いものでは３週間以上の培養期間がかかる。さらに、形態観察による菌種の同定は、経験を積むことによる熟練が不可欠であるために、一般的な技術者にとって容易な方法ではなく、少数の専門家に頼らざるを得ない。このように、形態観察は、人件費などのコストが高く、菌種の迅速な検出や同定をすることが困難であった。このため、形態観察よりもさらに、安価な迅速で容易な真核生物の検出や同定をするためのものが必要とされていた。

遺伝子工学の発展によって、結核菌やクラミジアなど各種病原菌体のＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法（ポリメラーゼチェーンリアクション法）などで増幅された核酸を解析することによって、菌体を検出する方法が開発された。例えば、ＰＣＲ法を用いて増幅された２８ＳｒＲＮＡ遺伝子の核酸塩基配列を解析し、非ウイルス生物を検出するためのオリゴヌクレオチドが開発された（特開平１０−０４２８８０号公報参照）。しかし、このオリゴヌクレオチドを使用しても、その領域に同じ塩基配列を有する菌種が複数存在するため、菌種を同定することはできない。また、ＰＣＲ法を用いてＩＴＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ）領域や、ＩＧＳ（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｓｐａｃｅｒ）領域の核酸塩基配列を解析し非ウイルス生物を検出するためのオリゴヌクレオチドが開発された（特開２００４−１５４０５１号公報参照）。しかし、このオリゴヌクレオチドを使用した場合であっても、解析精度は上昇するが、やはり菌種を確実に同定するまでには至らなかった。

このように、遺伝子工学的手法による真核生物の検出や同定の問題点が解決されていない状態にあっては、真核生物の検出や同定は、従来から行われている形態観察による手法に頼らざるを得ない。真核生物の検出や同定は、疾患や食品の変敗等の原因究明、伝播経路の解明、薬剤開発等に大きく関わる重要性を持つにもかかわらず、真核生物の迅速確実な検出及び同定をするためのオリゴヌクレオチドは、今まで存在していなかった。

本発明は、以上のような課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、安価でかつ迅速確実で容易に真核生物の検出及び同定が可能な新規のオリゴヌクレオチド、このオリゴヌクレオチドを用いた真核生物の検出方法と、このオリゴヌクレオチドを用いた同定方法とを提供することにある。

以上のような目的を達成するために本発明者らは、真核生物の細胞分裂に必要な微小細管、鞭毛、繊毛等を構成するタンパク質の１つで、ほぼ総ての真核生物が保有し、配列保存性は高い一方でｒＲＮＡ遺伝子より可変性に富むことが知られているβ−チューブリン遺伝子に着目した。β−チューブリン遺伝子領域を利用したプライマーの設計はＮ．Ｌｏｕｉｓｅ Ｇｌａｓｓらによって検討され、β−チューブリン遺伝子領域２０００塩基対のうちヌクレオチド番号３５２から８４７までの領域を挟むプライマーＢｔ２ｂ（配列番号３）及びＢｔ２ａ（配列番号４）（いずれも２４塩基長）を用いた核酸の検出及び塩基配列決定がＮ．Ｌｏｕｉｓｅ Ｇｌａｓｓらによって開示されている（著者Ｎ．Ｌｏｕｉｓｅ Ｇｌａｓｓ， Ｇａｒｙ Ｃ． Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ， １９９５， 題名 Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔｓ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＰＣＲ Ｔｏ Ａｍｐｌｉｆｙ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ． 雑誌Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．６１， Ｎｏ．４：Ｐ．１３２３−１３３０）。

しかしこのプライマー対を用いた検出方法は、目的領域の核酸を増幅できなかったり、増幅できても単一な産物とならなかったりする菌が多く存在していた。また、増幅産物の塩基長が約５００塩基対と長いため、１回の配列解析で増幅産物の全塩基配列を決定できないことが多々あり、検出・同定期間が長くなるのみならず、コスト面でも負担となっていた。

そこで、本発明者らは、１回の核酸塩基配列解析で決定できる配列数（約３００塩基程度）であること、決定した塩基配列が属間及び種間において変化に富んでいることを基本条件とし、ペニシリウム属等の真菌を始めとする真核生物に広く共通する塩基配列の発見を試みた。そして、鋭意検討を重ねた結果、ペニシリウム属等真菌を始めとする真核生物の検出や同定に適当な核酸塩基配列を得、その塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドを用いた真核生物の検出方法、同定方法並びにその試薬キットを確立して、本発明を完成するに至った。

より具体的に本発明の内容を示すと、それは以下のようなものである。

（１） 真核生物の検出及び真核生物の同定を行うオリゴヌクレオチドであって、その塩基配列が配列表の配列番号１に示される塩基配列あるいはその相補鎖の一部又は全部を含有し、当該一部又は全部においてβ−チューブリン遺伝子核酸と特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド。

（１）の発明によれば、このオリゴヌクレオチドは、その塩基配列が配列表の配列番号１に示される塩基配列あるいはその相補鎖の一部又は全部を含有し、真核生物のほぼ総てが有するβ−チューブリン遺伝子核酸と特異的にハイブリダイズすることができる。このため、β−チューブリン遺伝子核酸の可変領域を挟むオリゴヌクレオチドとして使用することによって、少数の専門家に頼ることなく、安価で一般技術者でも迅速確実かつ容易に真核生物の同定をすることが可能な遺伝子工学的手法（例えば、ＰＣＲ法など）による真核生物全般の検出、同定を行うことができる。このため、安価でかつ迅速確実で容易に真核生物の検出及び同定が可能な新規のオリゴヌクレオチドを提供することが可能となる。

本明細書における「真核生物」とは、核膜をもつ、つまり核の構造をもつ膜によって仕切られた核構造を細胞内にもつ生物群のことである。真核生物には、例えば、ペニシリウム属、タラロマイセス属，ユーペニシリウム属、パエシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ビソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属、ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属、アブシディア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、ボーベリア（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ）属、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ジオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属等のカビ、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、デッケラ（Ｄｅｋｋｅｒａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ジゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ブレタノマイセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）属、ロドトルーラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属等の酵母、等が含まれる。

また、本明細書において「特異的にハイブリダイズ」とは、オリゴヌクレオチドの解離温度（Ｔｍ値）において、ハイブリダイズさせたい領域以外のゲノムＤＮＡとこのオリゴヌクレオチドとが充分にハイブリダイズしないため、真核生物の検出や同定を確実に行える状態をいう。

また、本明細書において、「遺伝子工学的手法」とは、遺伝子操作や遺伝子解析によりその機能を調べる手法のことであり、例えば、ＰＣＲ法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、配列決定などの手法である。

β−チューブリン遺伝子の核酸配列に特異的にハイブリダイズさせ、検出感度、再現性等を高めるために、配列番号１に示される塩基配列あるいはその相補鎖の一部は、少なくとも５塩基以上、好ましくは１０塩基以上、さらに好ましくは１６塩基以上の長さを有する。オリゴヌクレオチド全体として、１０塩基以上、好ましくは１４塩基以上、さらに好ましくは１８塩基以上の長さを有する。

（２） 真核生物の検出及び真核生物の同定を行うオリゴヌクレオチドであって、その塩基配列が配列表の配列番号２に示される塩基配列あるいはその相補鎖の一部又は全部を含有し、当該一部又は全部においてβ−チューブリン遺伝子核酸と特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド。

（２）の発明によれば、このオリゴヌクレオチドは、その塩基配列が配列表の配列番号２に示される塩基配列あるいはその相補鎖の一部又は全部を含有し、真核生物のほぼ総てが有するβ−チューブリン遺伝子核酸と特異的にハイブリダイズすることができる。このため、β−チューブリン遺伝子核酸の可変領域を挟むオリゴヌクレオチドとして使用することによって、少数の専門家に頼ることなく、安価で一般技術者でも迅速確実かつ容易に真核生物の同定をすることが可能な遺伝子工学的手法（例えば、ＰＣＲ法など）による真核生物全般の検出、同定を行うことができる。このため、安価でかつ迅速確実で容易に真核生物の検出及び同定が可能な新規のオリゴヌクレオチドを提供することが可能となる。

β−チューブリン遺伝子の核酸配列に特異的にハイブリダイズさせ、検出感度、再現性等を高めるために、配列番号２に示される塩基配列あるいはその相補鎖の一部は、少なくとも５塩基以上、好ましくは１０塩基以上、さらに好ましくは１６塩基以上の長さを有する。また、オリゴヌクレオチド全体として、１０塩基以上２３塩基以下、好ましくは１４塩基以上２３塩基以下、さらに好ましくは１８塩基以上２０塩基以下の長さを有する。

（１）又は（２）記載のオリゴヌクレオチドは例えばホスホアミダイト法等の常法の化学合成により調整し得るので、クローン化したオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに比べて、容易に、大量にかつ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドが得られる。合成後のオリゴヌクレオチドをそのまま用いてもよいし、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）等で適宜精製して使用してもよい。

本明細書における「オリゴヌクレオチド」はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）のいずれでもあり得る。ＲＮＡの場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基（Ｕ）と読み替える。任意の位置のＴをＵに換えて合成したＤＮＡもあり得るし、任意の位置のＵをＴに換えて合成したＲＮＡもあり得る。さらにオリゴヌクレオチド中に欠失、挿入又は置換等の改変を行い得ることも容易に予想できるので、改変を施したオリゴヌクレオチドは本発明と同等もしくは均等物として解されるべきである。

（３） 前記真核生物は真菌である（１）又は（２）記載のオリゴヌクレオチド。

（３）の発明によれば、このオリゴヌクレオチドは、その塩基配列が配列表の配列番号１又は配列番号２に示される塩基配列あるいはその相補鎖の一部又は全部を含有し、迅速確実に検出、同定をすることは重要な病原性カビを含む真菌のほぼ総てが有するβ−チューブリン遺伝子核酸と特異的にハイブリダイズすることができる。真菌は、ハウスダストや食品に多く存在し、カビ毒産生能を有する種も存在するペニシリウム属真菌や、テレオモルフが耐熱性タラロマイセス属、ユーペニシリウム属等を含む。このように、（３）記載のオリゴヌクレオチドは、検出、同定が重要である真菌についても、迅速確実に検出、同定することができる。このため、安価でかつ迅速確実で容易に真菌の検出及び同定が可能な新規のオリゴヌクレオチドを提供することが可能となる。

（４） （１）から（３）いずれか記載のオリゴヌクレオチドを含有する標識プローブ。

（４）の発明によれば、（１）から（３）記載のオリゴヌクレオチドは真核生物のほぼ総てが有するβ−チューブリン遺伝子核酸にハイブリダイズする。このため、（４）記載の標識プローブを用いると、ハイブリダイズした標識プローブを検出するだけで、迅速確実かつ完全に、容易に真核生物を検出できる。

本発明の標識プローブとしては、例えば、放射性物質、酵素、蛍光物質、又は発光物質等の標識物によって標識されたオリゴヌクレオチドが用いられ得る。オリゴヌクレオチドの標識方法は末端標識又は配列中の標識のいずれでもあり得る。例えば、リンカーアームを有するヌクレオチドを配列中のオリゴヌクレオチドと置換して酵素標識し得る（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．；１４巻６１１５頁１９８６年）。５位にリンカーアームを有するウリジンを、特表昭６０−５００７１７号公報に開示された合成法によりデオキシウリジンから化学合成し、上記オリゴヌクレオチドに導入し得る。オリゴヌクレオチドの標識方法は例えばオリゴヌクレオチド中の糖、リン酸基、又は塩基部分への標識もあり得る。

本発明のオリゴヌクレオチドは固相担体に結合させて、捕捉プローブとしても用いられ得る。この場合、捕捉プローブと標識プローブとの組み合わせていわゆるサンドイッチ法によってオリゴヌクレオチドの検出を行い得る。試料中の標的β−チューブリン遺伝子の核酸を標識して、捕捉する方法もオリゴヌクレオチドの検出方法として行い得るし、オリゴヌクレオチドをビオチンで標識し、ハイブリダイゼーション後にアビジン結合担体で捕捉する方法もオリゴヌクレオチドの検出方法として用いられ得る。

標識プローブとして使用するオリゴヌクレオチドは、配列番号１又は２記載の塩基配列あるいはその相補鎖の全域を含有する必要は必ずしもなく、使用する核酸ハイブリダイゼーション条件にあわせて解離温度等を計算し、適当な領域を適当な長さで使用し得る。しかし、充分な特異性を有するプローブとするために、配列番号１又は２記載の塩基配列あるいはその相補鎖の一部は少なくとも１０塩基以上、好ましくは１４塩基以上、さらに好ましくは１６塩基以上の長さを有するとよい。

（５） （１）から（３）いずれか記載のオリゴヌクレオチドを含有する核酸プライマー。

（５）の発明によれば、（１）から（３）記載のオリゴヌクレオチドは真核生物のほぼ総てが有するβ−チューブリン遺伝子核酸にハイブリダイズする。このため、（５）記載の核酸プライマーを対になるように使用すれば、真核生物ゲノムＤＮＡを鋳型にして、確実にβ−チューブリン遺伝子の部分領域の核酸を増幅できる核酸を確実に増幅できる。この増幅産物を、後述の実施例に示すように、適宜利用すれば、迅速・確実・完全に、容易に検出でき、迅速・確実・完全に、容易に、安価で真核生物の同定が可能となる。

核酸プライマーとして使用するオリゴヌクレオチドも、前記標識プローブとして使用する場合と同じく、配列番号１又は２記載の塩基配列の適当な長さの一部又は全部を使用し得る。また、使用する条件及び目的等に応じて、オリゴヌクレオチド中に、ある程度の改変を行い得ることは容易に予想できるので、改変を施したオリゴヌクレオチドは本発明と同等もしくは均等物として解されるべきである。

（６） 真核生物の検出を行う方法であって、（１）又は（２）記載のオリゴヌクレオチドを標識プローブとして１つ又は２つ以上選択する選択工程と、前記標識プローブとして選択されたオリゴヌクレオチドと試料とをハイブリダイズさせるハイブリダイズ工程と、前記ハイブリダイズ工程を経てハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの検出をする検出工程と、を含む真核生物の検出方法。

（６）の発明によれば、選択工程において、例えば、配列表の配列番号１に示される塩基配列からなる（１）記載のオリゴヌクレオチドを標識プローブとして選択する。ハイブリダイズ工程において、この標識プローブは、試料である真核生物ゲノムＤＮＡ内のβ−チューブリン遺伝子の部分領域の核酸と特異的にハイブリダイズできる。

従って、ハイブリダイズした標識プローブである両オリゴヌクレオチドを検出するだけで、迅速に真核生物を検出できる。

また、（６）の発明によれば、選択工程において、例えば、配列表の配列番号１に示される塩基配列からなる（１）記載のオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示される塩基配列からなる（２）記載のオリゴヌクレオチドを標識プローブとして選択する。ハイブリダイズ工程において、これらの標識プローブはいずれも、試料である真核生物ゲノムＤＮＡ内のβ−チューブリン遺伝子核酸と特異的にハイブリダイズできる。

従って、ハイブリダイズした標識プローブである両オリゴヌクレオチドを検出するだけで、迅速かつ、より正確に真核生物を検出できる。

このように、（１）又は（２）記載のオリゴヌクレオチドを標識プローブとして選択することで、従来技術によっては遺伝子工学的に検出できなかった真核生物についても迅速かつ確実に検出することができる。

なお、この明細書における「試料」には、例えば、前記単離菌体、培養菌体及び、これらから精製された核酸並びに増幅された核酸が含まれる。

（７） 真核生物の検出を行う方法であって、（１）記載のオリゴヌクレオチドと、（２）記載のオリゴヌクレオチドと、の組み合わせからなる１対のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用い、試料を鋳型として核酸を増幅する増幅工程と、前記増幅工程で増幅した核酸の検出をする検出工程と、を含む真核生物の検出方法。

例えば、配列表の配列番号１に示される塩基配列からなる（１）記載のオリゴヌクレオチドと、配列番号２に示される塩基配列からなる（２）記載のオリゴヌクレオチドと、の組み合わせからなる１対のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いると、ＤＮＡポリメラーゼ等によって行われる核酸増幅（例えばＰＣＲ等）により、試料である真菌等の真核生物ゲノムＤＮＡを鋳型にして、確実にβ−チューブリン遺伝子の部分領域の核酸を増幅できる。この増幅工程の後、例えば電気泳動法等により分画し、例えばエチジウムブロマイド等により増幅産物の核酸の検出をすれば、真菌等の真核生物を迅速・確実かつ高感度に検出することができる。

放射性標識オリゴヌクレオチドを核酸プライマーをとして用い、β−チューブリン遺伝子の核酸を鋳型にしてその部分領域の核酸を増幅すれば、増幅産物の核酸を直接検出し得るため、より迅速に真核生物を検出できる点で好ましい。また、増幅工程において放射性標識ヌクレオチドを基質として取り込ませれば、検出工程では増幅工程を経た物を電気泳動により分画し放射性標識特有のバンドの存否を確認するだけで、増幅産物の核酸の検出ができ、迅速かつ容易に真核生物を検出し得る点で好ましい。

なお、本明細書における「検出」には、例えば、ＰＣＲ法により増幅された核酸に蛍光プローブをハイブリダイズし、その蛍光の有無を視認することによって、菌体の菌種の存在を判定することや、単離及び培養された菌体の菌種の存在を判定することなどが含まれる。「検出」は、菌体の菌種の存在を判定する遺伝子工学的なあらゆる手法であってもよい。

（８） 真核生物の同定を行う方法であって、（１）記載のオリゴヌクレオチドと、（２）記載のオリゴヌクレオチドと、の組み合わせからなる１対のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用い、試料を鋳型として核酸を増幅する増幅工程と、前記増幅工程で増幅した核酸の塩基配列の決定をする配列決定工程と、前記決定された塩基配列を既知の核酸塩基配列と比較する比較工程と、を含む真核生物の同定方法。

（８）の発明によれば、（８）記載の増幅工程において、増幅された産物は約２５０塩基対の長さとなるため、比較決定工程において、１回の配列解析により塩基配列を確実に決定することができる。増幅産物が約５００塩基配列であった従来の方法よりも迅速かつ安価に真核生物の同定をすることができる。また、（８）記載の核酸プライマーを用いて増幅された産物の塩基配列は、株間、属間及び種間において変化に富み、確実に真核生物の同定をすることができる。

（９） 真核生物の検出を行うための試薬キットであって、（４）記載の標識プローブを含む試薬キット。

（１０） 真核生物の検出及び／又は同定を行うための試薬キットであって、（５）記載の核酸プライマーを含む試薬キット。

本発明の「試薬キット」には、前記標識プローブ及び／又は前記プライマーを含み、さらに前記標識プローブ及び／又は前記プライマーの他にも、例えば、前記増幅や核酸配列解析に使用する酵素、緩衝液、基質となるｄＮＴＰが含まれていてもよい。

本発明によれば、安価でかつ迅速確実で容易に真核生物の検出及び同定が可能な新規のオリゴヌクレオチド、このオリゴヌクレオチドを用いた真核生物の検出方法と、このオリゴヌクレオチドを用いた同定方法とを提供することが可能である。

以下、本発明について具体的に説明する。

（実施例１）
＜オリゴヌクレオチドの合成＞
ＤＮＡシンセサイザー３９２型（ＡＢＩ社製）を用いて、ホスホアミダイト法により、配列番号３、配列番号４記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。ＡＢＩ社製のマニュアルの手法に従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護をアンモニア水で５５℃、一夜実施し、精製をＨＰＬＣ用逆相カラム（ベックマン社製）によるＨＰＬＣを用いて実施した。

＜使用した菌種について＞
菌株番号がＩＦＯの菌は財団法人 発酵研究所から、ＮＢＲＣの菌は独立行政法人 製品評価技術基盤機構 生物遺伝資源部門から、ＩＡＭの菌は東京大学 分子細胞生物学研究所 ＩＡＭカルチャーコレクションから、ＡＴＣＣの菌はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから、それぞれ購入した。例えば、後述するＰ．ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｕｍ ＡＴＣＣ９２６０は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した、ペニシリウム属グリセオファルバム種９２６０株を意味する。また、菌株番号ＧＡ，ＧＲ，ＨＯ，Ｔ，Ｓ，Ｗ，Ｍ，ＦＳ，Ｋの菌は各種環境より採取し、形態観察による単離、同定を行った菌株である。具体的には、菌株番号ＧＡ，ＧＲ，ＨＯの菌は一般家庭環境から採取し、菌株番号Ｔ，Ｓ，Ｗ，Ｍの菌株は工場製造環境より採取し、菌株番号ＦＳ，Ｋは製造原料より採取し、それぞれ形態観察により単離し、同定した。

＜被検菌のゲノムＤＮＡの調整＞
単離されている各被検菌について、至適条件下で培養した。培養条件については、ポテトデキストロース培地を用いて２５℃で３〜７日間培養した。なお、以下において、ゲノムＤＮＡの調整は、すべて調整用キット（アマシャムバイオサイエンス社製；商品名ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ又はアプライドバイオシステムズ社製のＰｒｅｐＭａｎ Ｕｌｔｒａ Ｒｅａｇｅｎｔ）を用いて行った。

＜ＰＣＲ法＞
ＰＣＲ使用試薬についてはアマシャムバイオサイエンス社より販売されているｐｕＲｅ Ｔａｑ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ＰＣＲ Ｂｅａｄｓを使用した。２．５ユニットのＰｕｒｅ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ ９．０）、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ｄＮＴＰ）、各５μｌのプライマー（フォワードプライマー１０〜２０ｐｍｏｌ及びリバースプライマー１０〜２０ｐｍｏｌ）、ゲノムＤＮＡ１０ｎｇを含む溶液を１μｌ、滅菌水を加えて２５μｌの溶液とした。

フォワードプライマー（以下、プライマーＦ）は、配列番号３に記載の配列のプライマーを使用した、リバースプライマー（以下、プライマーＲ）は、配列番号４に記載の配列のプライマーを使用した。サーマルサイクラー（ｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−ｒａｄ））をＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ反応条件は、初期変性を９６℃で１０分間行った後、合成反応サイクル（変性９６℃で１分間、アニーリング５０〜６２℃で１分間、伸長反応７２℃で１分間）を２５〜３５回行い、その後７２℃で４分間置いた。

＜増幅産物の検出＞
ＰＣＲ反応後、２．０％アガロースゲル、ＴＡＥ緩衝液を用いて常法のアガロースゲル電気泳動法により増幅産物の検出を行った。５０〜６２℃の範囲で前記アニーリング温度の検討を行ったが、全菌種菌株について増幅される条件は見つからなかった。前記合成反応サイクル数も２５，３０，３５回と試したが、全菌種菌株について増幅される条件は見つからなかった。図１は結果の一部を示した電気泳動図である。図中の各レーンは、図に向かって左から順に、以下の通りの菌株である。
１．Ｐ・グリセオファルバム（Ｐ．ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｕｍ） ＡＴＣＣ９２６０
２．Ｐ・グリセオロセウム（Ｐ．ｇｒｉｓｅｏｒｏｓｅｕｍ） ＩＦＯ８１４０
３．Ｐ・アイランディカム（Ｐ．ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ） ＮＢＲＣ６９６３
４．Ｐ・ワクスマンニ（Ｐ．ｗａｋｓｍａｎｉｉ） ＮＢＲＣ７７３７
５．Ｐ・ヴィリディカタム（Ｐ．ｖｉｒｉｄｉｃａｔｕｍ） ＮＢＲＣ７７３６
６．Ｐ・スクレロティオラム（Ｐ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ） ＮＢＲＣ６１０５
７．Ｐ・コミューン（Ｐ．ｃｏｍｍｕｎｅ） ＮＢＲＣ６２３７
８．Ｐ・ヴェルコッサム（Ｐ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ） ＨＯ２−３

図１に示されるように、レーン３、４、７及び８には目的とする約５００塩基対のバンドが検出されなかった。

被検菌の中で、ＰＣＲ反応により増幅された菌種菌株のβ−チューブリン遺伝子中腹領域核酸塩基配列を、アプライドバイオシステムズ社のＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ及びＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ１．１、Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを用い、常法の核酸塩基配列解析法によって、決定した結果を配列表の配列番号５から５１に示す通りである。核酸塩基配列解析には、バイオシステムズ社のＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ及びＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ１．１、Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを用いた。これらの核酸塩基配列を比較したところ、ヌクレオチド番号６００付近に全菌種にほぼ共通する配列があることを新しく発見した。上記の核酸プライマーによっては増幅されなかった菌種菌株の検出及び同定が、配列表の配列番号１及び２記載のオリゴヌクレオチドをプローブもしくはプライマーとして用いれば、可能となることが強く推測された。

（実施例２）
実施例１と同様の方法によって、配列番号１、配列番号２記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。次いで、ペニシリウム属各菌種菌株のゲノムＤＮＡをＰＣＲ法で増幅させた。ＰＣＲ法は、配列番号１記載の塩基配列のプライマー（プライマーＦ）と、配列番号２に記載の塩基配列のプライマー（プライマーＲ）とを用い、ＰＣＲ反応条件を、初期変性を９６℃で１０分間行った後、合成反応サイクル（変性９６℃で１分間、アニーリング５３℃で１分間、伸長反応７２℃で１分間）を３０回行い、その後７２℃で４分間置き、それ以外の条件は実施例１と同様の条件により行われた。このように、ＰＣＲ法は、１対のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用い、試料を鋳型として核酸を増幅する増幅工程の一例である。図２は、各菌由来ゲノムＤＮＡのＰＣＲ法による増幅産物の検出を行なった結果を示した図である。図２に示す通り、図１においては検出できなかった菌株についても増幅産物を検出できた。即ち、実施例１では目的のバンドが検出されなかったレーン３、４、７及び８においても、実施例２では図２に示す通り、目的とするバンドが検出されている。図中の各レーンは、左から順に、図１と全く同様の菌株である。このように、電気泳動は、増幅工程で増幅した核酸の検出をする検出工程の一例である。

このように、配列番号１記載の塩基配列のオリゴヌクレオチド、配列番号２記載の塩基配列のオリゴヌクレオチドは、真核生物のほぼ総てペニシリウム属真菌が有するβ−チューブリン遺伝子核酸と特異的にハイブリダイズすることができる。このため、β−チューブリン遺伝子核酸の可変領域を挟むオリゴヌクレオチド（プライマー対）として使用することによって、少数の専門家に頼ることなく、安価で一般技術者でも迅速確実かつ容易に真核生物ペニシリウム属真菌の同定をすることが可能な遺伝子工学的手法（例えば、ＰＣＲ法など）による真核生物全般ペニシリウム属真菌の検出、同定を行うことができる。つまり、これらのオリゴヌクレオチドは、従来プライマーとして使用されていた配列番号３記載の塩基配列のオリゴヌクレオチドと、配列番号４記載の塩基配列のオリゴヌクレオチドと、では検出できなかった菌株を検出できる。このため、安価でかつ迅速確実で容易に真核生物ペニシリウム属真菌の検出及び同定が可能な新規のオリゴヌクレオチドを提供することが可能となる。

（実施例３）
＜リンカーアームを有するオリゴヌクレオチドの合成＞
ＤＮＡシンセサイザー３９２型（ＡＢＩ社製）を用いて、ホスホアミダイト法により、配列番号１記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。この合成においては、５位にリンカーアームを有するウリジンを、上記オリゴヌクレオチドに導入した。５位にリンカーアームを有するウリジンは、特表昭６０−５００７１７号公報に開示された合成法によりデオキシウリジンから化学合成して調整した。合成リンカーオリゴヌクレオチドはアンモニア水で５０℃、一夜脱保護処理した後、逆相カラム（ベックマン社製）を用いたＨＰＬＣによって精製した。

＜リンカーオリゴヌクレオチドのアルカリ性ホスファターゼによる標識＞
上記リンカーオリゴヌクレオチドと、そのリンカーアームを介するアルカリ性ホスファターゼとの結合を、文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．；１４巻６１１５頁１９８６年）に従って行った。

リンカーオリゴヌクレオチド１．５（Ａ２６０）を０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液１２．５μｌに溶解し、次いで１０ｍｇ／ｍｌスペリン酸ジスクシニミジル（ＤＳＳ）２５μｌを加えて室温で２分間反応させた。反応液を１ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（アマシャムバイオサイエンス社製）カラム（１ｃｍφ×３０ｃｍ）でゲルろ過して過剰のＤＳＳを除去した。

末端のアミノ基が活性化されたリンカーオリゴヌクレオチドを、さらにモル比で２倍量のベーリンガーマンハイム社製アルカリ性ホスファターゼ（１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム、３Ｍ塩化ナトリウムの水溶液に溶解したもの）と室温で１６時間反応させてアルカリ性ホスファターゼ標識プローブを得た。得られた標識プローブは、ＦＰＬＣ（調整用高速液体クロマトグラフィー、アマシャムバイオサイエンス社製）で陰イオン交換カラムを用いて精製した。標識プローブを含む画分を集め、セントリコン３０Ｋ（アミコン社製）を用いて限外濾過法により濃縮した。

＜試料の調整＞
実施例１と同様の操作で調整した各菌のゲノムＤＮＡを使用した。

＜ドットブロットハイブリダイゼーション＞
実施例１と同様の操作で調整した各菌のゲノムＤＮＡ１μｇをナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋、アマシャムバイオサイエンス社製）に滴下し、０．４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で核酸を変性させてナイロン膜に固定した。この膜を中和後、ハイブリダイゼーションバック（ＢＲＬ社製）に移し、上記アルカリ性ホスファターゼ標識核酸プローブ液をそれぞれ含むハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＣ、０．５％ウシ血清アルブミン、０．５％ポリビニルピロリドン、１％ドデシル硫酸ナトリウム）を加えてポリシーラーでシールし、５０℃で１５分間ハイブリダイゼーションを行った。

膜をハイブリダイゼーションバックから取り出し、洗浄液１（２×ＳＳＣ、１％ドデシル硫酸ナトリウム）で５０℃、１０分間振とうして洗浄した。更に洗浄液２（１×ＳＳＣ、０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で室温、１０分間振とうして洗浄した。最後に洗浄液３（１×ＳＳＣ）で室温、５分間振とうして洗浄した。

膜を新しいハイブリダイゼーションバックに移し、基質液（０．１Ｍ トリスＨＣｌ、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍ塩化マグネシウム、０．３ｍｇ／ｍｌニトロブルーテトラゾリウム、０．３ｍｇ／ｍｌブロムクロロインドフェニルホスフェート（ｐＨ７．５））を加えてポリシーラーでシールし、３７℃で１時間インキュベートした。

この結果、標識プローブは８種の菌株総てと特異的に反応して、紫色色素のスポットが確認され、陽性と判断された。従って、本発明のオリゴヌクレオチドを標識プローブに用いて、真核生物の検出が可能であることが判明した。

（実施例４）
実施例２と同様の条件で、ペニシリウム属各菌種菌株のゲノムＤＮＡをＰＣＲ反応で増幅させた。ＰＣＲ反応後、２．０％アガロースゲル、ＴＡＥ緩衝液を用いて常法のアガロースゲル電気泳動法により増幅産物の検出を行った。図３は、電気泳動の結果を示す。図３中の各レーンは、左から順に、以下の通りの菌株及びマーカーに該当する。
１．Ｐ・ロケフォルティ（Ｐ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｉ） ＮＢＲＣ５４５９
２．Ｐ・コリンビフェラム（Ｐ．ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒｕｍ） ＮＢＲＣ６０９２
３．Ｐ．オーランチオグリセウム（ａｕｒａｎｔｉｏｇｒｉｓｅｕｍ） ＮＢＲＣ６２４０
４．Ｐ・コリロフィラム（Ｐ．ｃｏｒｙｌｏｐｈｉｌｕｍ） ＮＢＲＣ６２２７
５．Ｐ・コミューン（Ｐ．ｃｏｍｍｕｎｅ） ＮＢＲＣ６２３７
６．Ｐ・グリセオファルバム（Ｐ．ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｕｍ） ＮＢＲＣ７０１１
７．Ｐ・グリセオファルバム（Ｐ．ｇｒｉｓｅｏｆｕｌｖｕｍ） ＮＢＲＣ７６４０
８．Ｐ・ジャンチネラム（Ｐ．ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ） ＮＢＲＣ７９０９
９．Ｐ・ヴィリディカタム（Ｐ．ｖｉｒｉｄｉｃａｔｕｍ） ＮＢＲＣ８１７８
１０．Ｐ・ヴィリディカタム（Ｐ．ｖｉｒｉｄｉｃａｔｕｍ） ＮＢＲＣ３０１８１
１１．Ｔ・バシリスポーラス（Ｔ．ｂａｃｉｌｌｉｓｐｏｒｕｓ） ＩＡＭ１４７１８
１２．Ｔ・バシリスポーラス（Ｔ．ｂａｃｉｌｌｉｓｐｏｒｕｓ） ＩＡＭ１４７１８
中心 ＤＮＡ分子量マーカー φＸ１７４ ＨｉｎｃＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（ＴＡＫＡＲＡ）
１３．Ｐ・スピナロサム（Ｐ．ｓｐｉｎｕｌｏｓｕｍ） ＮＢＲＣ５３５９
１４．Ｐ・スピナロサム（Ｐ．ｓｐｉｎｕｌｏｓｕｍ） ＮＢＲＣ６０３５
１５．Ｐ・スピナロサム（Ｐ．ｓｐｉｎｕｌｏｓｕｍ） ＮＢＲＣ６０３８
１６．Ｐ・トミイ（Ｐ．ｔｈｏｍｉｉ） ＮＢＲＣ６０３１
１７．Ｐ・ソッピ（Ｐ．ｓｏｐｐｉ） ＮＢＲＣ６２３２
１８．Ｐ・パープロゲナム バル ルビスクレロティウム（Ｐ．ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ ｖａｒ ｒｕｂｉｓｃｒｅｌｏｔｉｕｍ） ＮＢＲＣ５８５６
１９．Ｐ・ジャンクゼウスキイ（Ｐ．ｊａｎｃｚｅｗｓｋｉｉ） ＮＢＲＣ６１０３
２０．Ｐ・ソッピ（Ｐ．ｓｏｐｐｉ） ＮＢＲＣ７７６６
２１．Ｐ・アダメトジイ（Ｐ．ａｄａｍｅｔｚｉｉ） ＮＢＲＣ７２２３
２２．Ｐ・コミューン（Ｐ．ｃｏｍｍｕｎｅ） ＮＢＲＣ５７６３
２３．Ｐ・コミューン（Ｐ．ｃｏｍｍｕｎｅ） ＮＢＲＣ７２２４
２４．Ｐ・グラブラム（Ｐ．ｇｌａｂｒｕｍ） ＮＢＲＣ５８０３

図３に示されるように、今回被検体となったペニシリウム属全菌種菌株について、目的とする約２５０塩基対のバンドが検出された。従って、ペニシリウム属全菌種菌株の検出に本発明が有効であることが明らかとなった。また、本発明の遺伝子工学的手法という特質から、ペニシリウム属のみならず、遺伝子型がペニシリウム属と同一であるタラロマイセス属やユーペニシリウム属等のテレオモルフも検出できることは明らかである。

（実施例５）
実施例２と同じ条件で、ペニシリウム属以外の菌を被検菌として、ＰＣＲ反応を行った後、２．０％アガロースゲルでＴＡＥ緩衝液を用いて常法のアガロースゲル電気泳動による増幅産物の検出を行った。その結果を示す図４及び図５は、電気泳動による増幅産物の有無を示す。なお、図４、図５中の各レーンは、左から順に、以下の通りの菌株及びマーカーに該当する。

＜図４＞
ＤＮＡ分子量マーカー φＸ１７４ ＨｉｎｃＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（ＴＡＫＡＲＡ）
１．パエシロマイセス・ファルバス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｆｕｌｖｕｓ） Ｋ−６８
２．パエシロマイセス・ヴァリチイ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｔｏｉｉ） ＦＳ−２
３．アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ） ＦＳ−７
４．アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ） Ｓ−９３
５．アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ） Ｓ−１０２
６．アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ） Ｔ９−４
７．アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ） Ｔ−１０
８．アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ） Ｔ−１０４
ＤＮＡ分子量マーカー φＸ１７４ ＨｉｎｃＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（ＴＡＫＡＲＡ）
９．パエシロマイセス・ファルバス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｆｕｌｖｕｓ） Ｍ−９
１０．パエシロマイセス・ファルバス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｆｕｌｖｕｓ） Ｍ−１３
１１．パエシロマイセス・バリオチイ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ） ＩＦＯ３０５９０
１２．パエシロマイセス・ファルバス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｆｕｌｖｕｓ） Ｍ−２７
１３．バイソクラミス・ファルバ（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ ｆｕｌｖａ） ＡＴＣＣ１００９９
１４．パエシロマイセス・ファルバス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｆｕｌｖｕｓ） ＩＦＯ６７５８
１５．パエシロマイセス・ファルバス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｆｕｌｖｕｓ） Ｓ−４０
１６．パエシロマイセス・バリオチイ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ） Ｓ−１９
１７．パエシロマイセス・エスピー（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．） Ｔ−５
１８．パエシロマイセス・バリオチイ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ Ｗ−２０
１９．パエシロマイセス・バリオチイ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｖａｒｉｏｔｉｉ Ｔ−６５
２０．パエシロマイセス・ファルバス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｆｕｌｖｕｓ） Ｋ−６６
２１．パエシロマイセス・ファルバス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｆｕｌｖｕｓ） ＨＯ６−１９
ＤＮＡ分子量マーカー φＸ１７４ ＨｉｎｃＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（ＴＡＫＡＲＡ）

＜図５＞
ＤＮＡ分子量マーカー φＸ１７４ ＨｉｎｃＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（ＴＡＫＡＲＡ）
１．ネオサルトリア・クアドリシンクタ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｑｕａｄｒｉｃｉｎｃｔａ） Ｍ−７
２．ネオサルトリア・フィセリ バル フィセリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ ｖａｒ ｆｉｓｃｈｅｒｉ） ＩＦＯ５８６６
３．ネオサルトリア・フィセリ バル グラブラ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ ｖａｒ ｇｌａｂｒａ） ＩＦＯ８７８１
４．アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ） Ｍ−４３
５．アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ） ＪＣＭ１７３８
右 ＤＮＡ分子量マーカー φＸ１７４ ＨｉｎｃＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（ＴＡＫＡＲＡ）

図４、図５に示すように、本発明の検出方法によれば、ペニシリウム属のみならず、パエシロマイセス属、アスペルギルス属、ビソクラミス属、ネオサルトリア属といった真菌全般に渡る菌について検出することができることが分かった。上述した通り、パエシロマイセス属、アスペルギルス属、ビソクラミス属、ネオサルトリア属それぞれのアナモルフについても、本発明の検出方法は有効である。

（実施例６）
＜塩基配列の決定＞
実施例３及び４において得られた増幅産物を検体とし、アプライドバイオシステムズ社のＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ及びＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ１．１、Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔを用い、常法の核酸塩基配列解析法によって、配列表の配列番号１及び２で示されるプライマーを用いて各菌種菌株のβ−チューブリン部分領域の核酸塩基配列を決定した結果を配列表の配列番号５２から２６２に示す。このように、核酸塩基配列解析法は、増幅工程で増幅した核酸の塩基配列の決定をする配列決定工程の一例である。

＜塩基配列の比較＞
前記決定した核酸配列をプログラム（アプライドバイオシステムズ社製；商品名ＭｉｃｒｏＳｅｑ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により比較したところ、図６に示されるペニシリウム属系統樹が得られた。この系統樹に示される通り、従来の形態観察による分類結果と、本発明の遺伝子工学的手法を用いた分類結果と、は高い相関性を有している。即ち、本発明による真核生物の同定方法、同定に基づく真核生物の分類は高い信頼性を有していることを、この結果は示している。このように、このプログラムにより菌株の系統樹を得る工程は、決定された塩基配列を既知の核酸塩基配列と比較する比較工程の一例である。

さらに、図６に示す通り、ペニシリウム属の４つの亜種であるアスペルギロイデス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｉｄｅｓ）属、フルカタム（Ｆｕｒｃａｔｕｍ）属、ペニシリウム属、ビベルチシリウム（Ｂｉｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属の４つのクラスターを形成することも、新たに分かった。また、ビベルチシリウム属、アスペルギロイデス属においては一部の種内で配列の大きな差があったり、また、異なる種間で同じ配列を持ったりということも判明した。Ｐ・コリロフィリウムは、それぞれＮＢＲＣ６０３０株とＮＢＲＣ６２２８株を中心とした２つのグループを形成していること、また、オキラトキシンＡやサイトリンの産生を既に確認されているＰ・ヴィリディカタムＮＢＲＣ３０１８１株が、Ｐ・ヴェラコサムと同じグループを形成しており、同株が実はＰ・ヴェラコサム属であることも示唆された。

このように、配列番号１記載の塩基配列のオリゴヌクレオチドと配列番号２記載の塩基配列のオリゴヌクレオチドは、真核生物のほぼ総てが有するβ−チューブリン遺伝子核酸と特異的にハイブリダイズすることができる。このため、β−チューブリン遺伝子核酸の可変領域を挟むオリゴヌクレオチド（プライマー対）として使用することによって、少数の専門家に頼ることなく、安価で一般技術者でも迅速確実かつ容易に真核生物の同定をすることが可能な遺伝子工学的手法（例えば、ＰＣＲ法など）による真核生物の検出、同定を行うことができる。つまり、これらのオリゴヌクレオチドは、プライマーとして従来使用されていた配列番号３記載の塩基配列のオリゴヌクレオチドと、配列番号４記載の塩基配列のオリゴヌクレオチドと、では検出できなかった菌株を検出できる。このため、安価でかつ迅速確実で容易に真核生物の検出及び同定が可能な新規のオリゴヌクレオチドを提供することが可能となる。

このように本発明によれば、少数の専門家に頼ることなく、安価で一般技術者でも迅速確実かつ容易に真核生物の同定をすることが可能な遺伝子工学的手法（例えば、ＰＣＲ法など）による真核生物全般の検出、同定を行うことができる。このため、安価でかつ迅速確実で容易に真核生物の検出及び同定が可能な新規のオリゴヌクレオチドを提供することが可能となる。本発明によれば、新規のオリゴヌクレオチド、このオリゴヌクレオチドを用いてペニシリウム属等の真菌を始めとする真核生物を迅速・確実・完全に、容易に検出できる検出方法、迅速・確実・完全に、容易に、安価で同定できる同定方法と、その試薬キットが提供される。更に、本発明により、菌の同定や分類について従来の形態観察だけでは知り得ない知識までもが、今後は得られるようになり、真菌由来の疾患や食品の変敗等の原因究明あるいは伝播経路の解明等に大きく寄与するものである。さらに、本発明によれば、少数の専門家に頼ることなく、安価で一般技術者でも迅速確実かつ容易に真核生物の同定をすることが可能な遺伝子工学的手法（例えば、ＰＣＲ法など）による真核生物全般の検出、同定を行うことができる。このため、安価でかつ迅速確実で容易に真核生物の検出及び同定が可能な新規のオリゴヌクレオチドを提供することが可能となる。

各菌由来ゲノムＤＮＡのＰＣＲ法による増幅産物の検出を行なった結果を示した図である。 各菌由来ゲノムＤＮＡのＰＣＲ法による増幅産物の検出を行なった結果を示した図である。 各菌由来ゲノムＤＮＡのＰＣＲ法による増幅産物の検出を行なった結果を示した図である。 各菌由来ゲノムＤＮＡのＰＣＲ法による増幅産物の検出を行なった結果を示した図である。 各菌由来ゲノムＤＮＡのＰＣＲ法による増幅産物の検出を行なった結果を示した図である。 各菌のβ−チューブリン遺伝子のＤＮＡ塩基配列解析をもとにペニシリウム属の系統樹全体を示した図である。

Claims (10)

1. 真核生物の検出及び真核生物の同定を行うオリゴヌクレオチドであって、その塩基配列が配列表の配列番号１に示される塩基配列あるいはその相補鎖の一部又は全部を含有し、当該一部又は全部においてβ−チューブリン遺伝子核酸と特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド。
2. 真核生物の検出及び真核生物の同定を行うオリゴヌクレオチドであって、その塩基配列が配列表の配列番号２に示される塩基配列あるいはその相補鎖の一部又は全部を含有し、当該一部又は全部においてβ−チューブリン遺伝子核酸と特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド。
3. 前記真核生物は真菌である請求項１又は２記載のオリゴヌクレオチド。
4. 請求項１から３いずれか記載のオリゴヌクレオチドを含有する標識プローブ。
5. 請求項１から３いずれか記載のオリゴヌクレオチドを含有する核酸プライマー。
6. 真核生物の検出を行う方法であって、
   請求項１又は２記載のオリゴヌクレオチドを標識プローブとして１つ又は２つ以上選択する選択工程と、
   前記標識プローブとして選択されたオリゴヌクレオチドと試料とをハイブリダイズさせるハイブリダイズ工程と、
   前記ハイブリダイズ工程を経てハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの検出をする検出工程と、
   を含む真核生物の検出方法。
7. 真核生物の検出を行う方法であって、
   請求項１記載のオリゴヌクレオチドと、請求項２記載のオリゴヌクレオチドと、の組み合わせからなる１対のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用い、試料を鋳型として核酸を増幅する増幅工程と、
   前記増幅工程で増幅した核酸の検出をする検出工程と、
   を含む真核生物の検出方法。
8. 真核生物の同定を行う方法であって、
   請求項１記載のオリゴヌクレオチドと、請求項２記載のオリゴヌクレオチドと、の組み合わせからなる１対のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用い、試料を鋳型として核酸を増幅する増幅工程と、
   前記増幅工程で増幅した核酸の塩基配列の決定をする配列決定工程と、
   前記決定された塩基配列を既知の核酸塩基配列と比較する比較工程と、
   を含む真核生物の同定方法。
9. 真核生物の検出を行うための試薬キットであって、請求項４記載の標識プローブを含む試薬キット。
10. 真核生物の検出及び／又は同定を行うための試薬キットであって、請求項５記載の核酸プライマーを含む試薬キット。