JP2007505638A - 飲料腐敗性微生物の特異的な迅速検出方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる、飲料腐敗性微生物の特異的な迅速検出方法に関する。本発明はまた、この検出方法の過程で用いる特異的なオリゴヌクレオチドプローブ、およびこれらオリゴヌクレオチドプローブを含むキットにも関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる、飲料腐敗性微生物の特異的な迅速検出方法に関する。さらに、本発明はこの検出方法の過程で用いる特異的なオリゴヌクレオチドプローブ、およびこれらのオリゴヌクレオチドプローブを含むキットに関する。
一般的な節「非アルコール性飲料」の下には、果汁、フルーツネクター、果実濃縮物、潰した果実、ソフトドリンクおよび水などの飲料群が集約されている。
基本的に、非アルコール性飲料は、その栄養素および増殖刺激物質の組成が多様／可変的であるために、多様多種の微生物の増殖によって潜在的に危険に曝されていると分類することができる。
現在の知見によると、主に酵母、カビ、乳酸菌、酢酸菌、バチルスおよびアリシクロバチルスが非アルコール性飲料中に見つかり、したがってこれらは「飲料腐敗性」微生物と言われている。
一般に、これら微生物による汚染は消費者の健康異常はもたらさないが、濁り、最終製品の味および香りの変化に関連しており、それに基づくイメージの損傷によって製造業界に高度な経済的損失をもたらす。
果汁およびフルーツネクター中では果実酸が自然に高い濃度であり、それに対応してｐＨ値が低いこと（２．５〜４．５のｐＨ範囲）に基づくと、好酸性または耐酸性微生物（乳酸菌、アリシクロバチルス、酸耐性酵母およびカビ種など）のみが増殖して、その結果これら飲料の変質をもたらすことができる。
微生物による腐敗を制限する一手段は飲料の炭酸化である。この方法はソフトドリンクの製造で一般的に用いられている。ＣＯ２を加えることにより、製品中にほぼ嫌気的な状況が生じ、微好気性、条件的嫌気性および嫌気性の微生物（乳酸菌、酢酸菌および酵母など）のみがこの環境に耐えることができる。
非炭酸飲料は、これら製品の長期間の安定性および品質を保証するために、ほとんどの場合低温殺菌されている。低温殺菌により、すべての植物性の微生物が可能な限り包括的な様式で死滅するはずである。しかし、バチルスまたはアリシクロバチルスによって形成される胞子はこの手段によっては除去されない。さらに、一部のカビ種は障害を受けることなしにこのプロセスに耐えることができ、その後製品に損傷を与える。
飲料の生物学的な品質を保証するために重要な因子は、汚染の原因を調査して、最終的にはそれを除去することである。一般に、２通りの汚染が識別されている：汚染は、原材料によって、またはプロセス内での汚染によって微生物がプロセス内に導入された場合に、一次汚染と特徴づけられる。
二次汚染は、飲料の実際の製造後、充填区域で現れる汚染である。
微生物学的な品質管理におけるこれら様々な要素によって生じる挑戦は、製品中に存在するすべての細胞を包括的かつ迅速に同定して、対応する対抗手段を可能な限り早く開始することにある。
これまで、飲料腐敗性微生物の従来の検出は、数日間かけて選択的培地中で試料を濃縮し、次いで光学顕微鏡観察することによって行われている。さらに、飲料腐敗性微生物の正確な同定には、さらなる生理的試験（グラム染色、糖消費試験など）を実施する必要がある。
この専ら培養に基づいた方法の不利点は分析期間が長いことであり、これは飲料製造企業において顕著なロジスティック費用を生じさせる。さらに、微生物学的な発見が明白に提示されていなかった製品の配送後に汚染が現実に起こり、腐敗した製品バッチのリコール措置が必要となった場合に、前記企業への顕著なイメージ損傷の恐れがある。
以下に、飲料腐敗性微生物およびそれらの最先端の検出を詳述する。
酵母およびカビ：
熱処理を生き延び、その後飲料において問題を引き起こすことができる微生物は、主にカビＢｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ ｆｕｌｖａおよびＢ．ｎｉｖｅａ、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉおよびＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｕｓならびに一部の酵母である。炭酸飲料では、酵母の主に酸耐性の発酵性メンバー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の種、Ｄｅｋｋｅｒａ属の種およびＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ）が優勢である。これら「発酵性酵母」によって引き起こされる味の変化および濁りに基づいた製品損傷の恐れ以外に、充填した瓶が時折破裂するという潜在的な危険性が存在する。
酵母およびカビの検出は、現在対応する培養培地（たとえばＳＳＬブイヨン、ＯＦＳ培地、麦芽−デキストロース培地、ワート寒天）上での培養によって行っており、２〜７日間を必要とする。属の検出、または種レベルでさえも検出するのは非常に時間がかかり、通常は行われない。
乳酸菌
乳酸菌のメンバーは、非常に高い栄養要求（とりわけビタミン、アミノ酸、プリンおよびピリミジン）によって特徴づけられているグラム陽性、非胞子形成、カタラーゼ陰性桿菌および球菌である。名称によって示されるように、すべての乳酸菌が発酵産物として乳酸を産生することができる。
その嫌気性増殖により、かつ嫌気性微生物では非定型の酸素に対する高い耐性非感受性により、これらは耐気性嫌気性微生物と言われる。
これまでに、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ属およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属が「乳酸菌」と呼ばれている。
乳酸菌は食品業界において相反する役割を果たしている。一方では、その存在は望まれており、たとえばザウアークラウトの製造などの一部のプロセスに不可欠である。他方では、ビールや果汁中のその存在により製品の変質がもたらされることがある。これらの細菌の増殖は、主に濁り、酸性化ならびにガスおよびスライムの形成によって表れる。
非アルコール性飲料の業界では、主に細菌のＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ属およびＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属が汚染物質として関連している。乳酸菌は、ＭＲＳ寒天上、２５℃での５〜７日間のインキュベーションによって検出される（ｐＨ５．７）。
酢酸菌
Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属、ＧｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒおよびＡｃｉｄｏｍｏｎａｓ属の細菌は慣用名「酢酸菌」と呼ばれる。これらの属の細菌はグラム陰性、絶対好気性、およびオキシダーゼ陰性の桿菌であり、至適増殖温度は３０℃である。酢酸菌は２．２〜３．０のｐＨ値でも増殖することができ、したがって、このｐＨ値を有する飲料中で製品の損傷を生じることができる。
系統学的には、この属の細菌はＡｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａのメンバーである。
製品損傷は主に、酢酸およびグルコン酸の形成による濁りおよび味の変化に付随する。酢酸菌の検出には、主にＡＣＭ寒天（インキュベーション時間：１４日間）およびＤＳＭ寒天（インキュベーション時間：３〜５日間）が認められている。
バチルス：
バチルスは、グラム陽性の好気性、部分的に条件的な嫌気性、大部分はカタラーゼ陽性の胞子形成桿菌である。これまでは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓが非アルコール性飲料の業界において腐敗性微生物として主に同定されている。
検出は、試料をデキストロース−カゼイン−ペプトン寒天または酵母抽出物−ペプトンデキストロースデンプン寒天に植え、次いで５５℃でインキュベーションすることによって行う（インキュベーション時間：３日間）。それぞれ胞子を活性化させ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓの胞子の発芽を果たすには、実際のインキュベーションの前に８０℃で１０分間の試料の熱処理が推奨される。
アリシクロバチルス：
アリシクロバチルスは、グラム陽性、好気性、好熱性およびカタラーゼ陽性の胞子形成桿菌である。この属のメンバーは、ω−脂環式脂肪酸を主たる脂肪酸として産生する。これまで、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓが、非アルコール性飲料の業界において腐敗生物として主に同定されている。稀な事例で、Ａ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓおよびＡ．ａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｓも腐敗した飲料中で同定されている。
Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属菌の増殖温度の至適範囲は２６〜５５℃である。この属の細菌が増殖することができるｐＨ範囲は２．２〜５．８である。
Ａ．ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓの増殖は果汁の腐敗をもたらし、これはギアコール（ｇｕｉａｃｏｌ）およびジブロモフェノールの形成による臭いおよび味の変化として示される。この生物による汚染はほとんどはっきり見えない様式で進行し、これは、感染した飲料で濁りが見られるのは稀な事例であることを意味する。
アリシクロバチルスは、４４〜４６℃で、オレンジセラム寒天、ジャガイモデキストロース寒天、Ｋ寒天、ＹＳＧ寒天またはＢＡＭ寒天上で数日間培養することによって検出することができる。さらに、発見を正確に確認するためには、一組の生理的試験が必要である。それぞれ胞子を活性化させ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属菌の胞子の発芽を果たすためには、実際のインキュベーションの前に８０℃で１０分間の試料の熱処理が推奨される。
これまでに用いられている飲料腐敗性微生物の日常的な検出方法は非常に長引き、部分的に不正確すぎるので、汚染した製品を救うための迅速かつ有効な対抗手段が妨げられる。検出の不正確さは属および／または種レベルまでの区別が存在しないことから生じる。
飲料腐敗性微生物を検出するための従来の培養方法によって提示される困難の論理的帰結として、核酸に基づいた検出方法が非アルコール性飲料中の腐敗性微生物の迅速、安全かつ特異的な同定に適している。
ＰＣＲ、すなわちポリメラーゼ連鎖反応では、それぞれの細菌ゲノムの特徴的な一片を特異的なプライマーと共に増幅する。プライマーの標的部位が見つかった場合は、遺伝物質の一片が百万倍に増幅される。以下の分析、たとえばＤＮＡ断片を分離するアガロースゲルでは、定性的な評価を行うことができる。これは、最も単純な場合で、用いたプライマーの標的部位が試験した試料中に存在していたという結論がもたらされる。さらなる結論は不可能であり、これらの標的部位は生細菌および死細菌のどちらにも、または裸ＤＮＡに由来することができる。ＰＣＲ反応は死細菌または裸ＤＮＡの存在下でも陽性であるので、これはしばしば偽陽性の結果をもたらす。この技法のさらなる改良は、存在する細菌の量と増幅したＤＮＡの量との相関を確立することを目的とする定量的ＰＣＲである。ＰＣＲの利点は、その特異性が高いこと、その応用が容易であること、およびその消費時間が少ないことである。その主な不利点は、その汚染に対する脆弱性が高いこと、およびそれにより偽陽性結果が起こりやすいこと、ならびに前述の、生細胞と死細胞と、および裸ＤＮＡとをそれぞれ識別する可能性がないことである。
ＰＣＲなどの分子生物学的方法の特異性と抗体による方法に提供される細菌を可視化する可能性とを組み合わせる独特の手法は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション方法である（ＦＩＳＨ；Ｒ．Ｉ．Ａｍａｎｎ、Ｗ．ＬｕｄｗｉｇおよびＫ．−Ｈ．Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ、１９９５．培養を行わない個々の微生物細胞の系統学的同定およびｉｎ ｓｉｔｕ検出（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｓｉｔｕ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ．）．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９、１４３〜１６９ページ）。この方法を用いて、細菌種、属または群を高い特異性で同定および可視化することができる。
ＦＩＳＨ技法は、微生物の細胞の中には、その本質的な機能が理由で、進化の過程でわずかにしか変異しなかった特定の分子が存在するという事実に基づいている。これらは、１６Ｓおよび２３Ｓリボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）である。これらはどちらもリボソームの構成要素であり、タンパク質生合成部位であり、その遍在的分布、その大きさならびにその構造的および機能的恒常性により、特異的マーカーとして役割を果たすことができる（Ｗｏｅｓｅ，Ｃ．Ｒ．、１９８７．細菌の進化（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５１、２２１〜２７１ページ）。比較配列分析に基づくと、これらのデータのみから系統学的な関係を確立することができる。この目的のためには、配列データのアラインメントを行わなければならない。これら巨大分子の二次構造および三次構造についての知識に基づいているアラインメントでは、リボソーム核酸の相同位置を互いに整列させて並べる。
これらのデータに基づいて、系統学的な計算を行うことができる。最新のコンピュータ技術を用いることにより、大スケールの計算さえも迅速かつ有効に行うことが可能となり、また、１６Ｓ、１８Ｓ、２３Ｓおよび２６Ｓ ｒＲＮＡのアラインメント配列を含む大きなデータベースを設定することも可能となる。このデータ材料に迅速にアクセスするので、新しく獲得した配列を短時間内に系統学的に分析することができる。これらのｒＲＮＡデータベースを用いて、種特異的なおよび属特異的な遺伝子プローブを設計することができる。この結果、すべての利用可能なｒＲＮＡ配列を互いに比較し、特定配列部位に対するプローブを設計し、これは細菌の特異的な種、属または群を特異的に標的とする。
ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）技法では、リボソーム標的配列上の特定の領域に相補的なこれら遺伝子プローブを細胞内に導入する。遺伝子プローブは一般に小さく、１６〜２０塩基長の一本鎖デオキシリボ核酸片であり、細菌種または細菌群に特徴的な標的領域に対して向けられている。蛍光標識した遺伝子プローブが微生物の細胞内にその標的配列を見つけた場合は、プローブはそれに結合し、細胞はその蛍光により蛍光顕微鏡を用いて検出することができる。
細菌の評価は高エネルギー光で照射することによって可視化される、すなわち可視性を与えられるので、ＦＩＳＨ分析は常にスライド上で行う。しかしここには、従来のＦＩＳＨ分析の不利点が１つ存在する。定義上、スライド上では比較的少量しか分析することができないので、この方法の感度が十分でなく、信頼性のある分析には不十分である。
したがって、本発明は従来のＦＩＳＨ分析の利点を培養の利点と組み合わせる。比較的短い培養ステップにより、特異的ＦＩＳＨを用いて細菌を検出する前に、検出する細菌が十分な数存在することが確実になる。
したがって、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｄｅｋｋｅｒａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ属、具体的には種Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ、Ｚ．ｍｅｌｌｉｓ、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ、Ｚ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｚ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｚ．ｍｉｃｒｏｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ ｕｖａｒｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｃ．ｃｒｕｓｅｉ（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｎａａｒｄｅｎｅｎｓｉｓ、Ｄｅｋｋｅｒａ ａｎｏｍａｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐ．ｍｉｎｕｔａ、Ｐ．ａｎｏｍａｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｘｉｇｕｕｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ ｌｕｄｗｉｇｉｉの飲料腐敗性酵母を特異的に検出するため、またはＭｕｃｏｒ属、Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ属、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属およびＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属、具体的には種Ｍｕｃｏｒ ｒａｃｅｍｏｓｕｓ、Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ ｎｉｖｅａ、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓおよびＡ．ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔ．ｂａｃｉｌｌｉｓｐｏｒｕｓならびにＴ．ｆｌａｖｕｓの飲料腐敗性カビを特異的に検出するため、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、ＢａｃｉｌｌｕｓおよびＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、具体的には種Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌ．ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｅｎｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ａ．ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ａ．ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓおよびＡ．ｈｅｒｂａｒｉｕｓの飲料腐敗性細菌を特異的に検出するための本出願中に記載の方法の実施は、
−分析する試料中に存在する飲料腐敗性微生物を培養するステップと
−試料中に存在する飲料腐敗性微生物を固定するステップと
−ハイブリダイゼーションを果たすために、固定した飲料腐敗性微生物を少なくとも１つの核酸プローブと共に、および任意選択で競合プローブと組み合わせてインキュベートするステップと
−ハイブリダイズしていない核酸プローブを除去するまたは洗い流すステップと
−核酸プローブ分子にハイブリダイズした飲料腐敗性微生物を検出するステップと
を含む。
本発明中では、「培養」とは、適切な培養培地中での、試料中に存在する微生物の増殖を意味すると理解されたい。
酵母およびカビの検出には、培養は、たとえばＳＳＬブイヨン中で、２４時間、２５℃で行い得る。乳酸菌の検出には、培養は、たとえばＭＲＳブイヨン中で、４８時間、３０℃で行い得る。酢酸菌の検出には、培養は、たとえばＤＳＭ寒天上で、４８時間、２８℃で行い得る。バチルス、具体的にはＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓの検出には、培養は、たとえばデキストロース−カゼイン−ペプトン寒天上で、４８時間、５５℃で行い得る。アリシクロバチルスの検出には、培養は、たとえばＢＡＭブイヨン中で、４８時間、４４℃で行い得る。
どのような場合にせよ、当業者は、分析するそれぞれ各微生物および各微生物群について適切な培養方法を従来技術から見出すことができる。
本発明中で、微生物の「固定」とは、核酸プローブが微生物の外被を透過できるようにする処理として理解される。固定化には、通常エタノールが用いられる。これらの技法を用いたにもかかわらず核酸プローブが細胞壁を透過することができない場合は、当業者は同じ結果をもたらすさらなる技術を十分に知っているであろう。これらには、たとえば、メタノール、アルコール混合物、低いパーセンテージのパラホルムアルデヒド溶液または希釈したホルムアルデヒド溶液、酵素処理などが含まれる。
本発明の方法の特に好ましい実施形態では、微生物の完全な細胞崩壊を引き起こすために酵素ステップを続けて行ってもよい。したがってこのステップに用いることができる酵素は、たとえばリゾチーム、プロテイナーゼＫ、およびムタノリシンである。当業者は適切な技術を十分知っており、特定の微生物の細胞崩壊に特に適している手段が何であるかを容易に見出せるであろう。
本発明中では、固定した微生物を「ハイブリダイゼーション」のために蛍光標識した核酸プローブと共にインキュベートする。これらの核酸プローブは、固定後、細胞壁を透過して核酸プローブに対応する細胞内の標的配列に結合することができる。結合とは、相補的な核酸片間の水素結合の形成と理解されたい。
このような場合、核酸プローブは染色体またはエピソームＤＮＡに相補的であることができるが、検出する微生物ｍＲＮＡまたはｒＲＮＡに相補的であることもできる。検出する微生物内の複数のコピー中に存在する領域に相補的である核酸プローブを選択することが有利である。検出する配列は、好ましくは１個の細胞あたり５００〜１００，０００個のコピー、特に好ましくは１，０００〜５０，０００個のコピーが存在する。この理由から、タンパク質生合成部位としてのリボソームはそれぞれの活性細胞中に数千倍存在するので、ｒＲＮＡの配列を標的部位として用いることが好ましい。
本発明の意味において核酸プローブとは、通常は１２〜１００個のヌクレオチド、好ましくは１５〜５０、さらには１７〜２５個のヌクレオチドを含むＤＮＡまたはＲＮＡプローブであり得る。核酸プローブの選択は、相補的配列が検出する微生物中に存在するかどうかを考慮に入れて行う。定義された配列のこの選択によって、微生物の種、微生物の属、または微生物群の全体を検出し得る。１５個のヌクレオチドからなるプローブでは、配列は１００％相補的であるべきである。１５個を超えるヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの場合は、オリゴヌクレオチドの長さに応じて、１つまたは複数の不一致が許容される。
核酸プローブの特異性を高めるためには、競合プローブを用いることができる。本発明中では、競合プローブとは、具体的には核酸プローブの望ましくない可能性のある結合をブロッキングするオリゴヌクレオチド、したがって、それぞれ微生物の標的の属および種に比べて、それぞれ微生物の標的でない属および種に対してより高い配列類似性を示すオリゴヌクレオチドを意味すると理解される。競合プローブを用いることによって、核酸プローブが微生物の標的でない属または種の核酸配列に結合することを妨げることができ、したがって偽シグナルがもたらされない。常に非標識の競合プローブを標識したオリゴヌクレオチドプローブと組み合わせて用いる。
競合プローブは、それぞれ検出する微生物の属および種の核酸配列に高い配列類似性を有する核酸配列に対して相補的であるべきである。特に好ましい実施形態では、競合プローブは、それぞれ微生物の標的でない属および種のｒＲＮＡに相補的である。
本発明の意味において競合プローブとは、通常は１２〜１００個のヌクレオチド、好ましくは１５〜５０、特に好ましくは１７〜２５個のヌクレオチドを含むＤＮＡまたはＲＮＡ配列である。定義された配列を選択することによって、細菌の種、細菌の属または細菌群の全体をブロッキングし得る。１５個のヌクレオチドからなるプローブはブロッキングする核酸配列に１００％相補的であるべきである。１５個を超えるヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドの場合は、オリゴヌクレオチドの長さに応じて、１つまたは複数の不一致が許容される。
本発明の方法中では、本発明の核酸プローブ分子は以下の長さおよび配列を有する（すべての核酸プローブ分子は５’−３’の方向で記載した）。
本発明の核酸プローブ分子は、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｄｅｋｋｅｒａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ属、具体的には種Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ、Ｚ．ｍｅｌｌｉｓ、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ、Ｚ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｚ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｚ．ｍｉｃｒｏｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ ｕｖａｒｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｃ．ｃｒｕｓｅｉ（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｎａａｒｄｅｎｅｎｓｉｓ、Ｄｅｋｋｅｒａ ａｎｏｍａｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐ．ｍｉｎｕｔａ、Ｐ．ａｎｏｍａｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｘｉｇｕｕｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ ｌｕｄｗｉｇｉｉの飲料腐敗性酵母を特異的に検出するため、またはＭｕｃｏｒ属、Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ属、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ属、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓおよびＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属、具体的には種Ｍｕｃｏｒ ｒａｃｅｍｏｓｕｓ、Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ ｎｉｖｅａ、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓおよびＡ．ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔ．ｂａｃｉｌｌｉｓｐｏｒｕｓならびにＴ．ｆｌａｖｕｓの飲料腐敗性カビを特異的に検出するため、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、ＢａｃｉｌｌｕｓおよびＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、具体的には種Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌ．ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｅｎｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ａ．ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ａ．ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓおよびＡ．ｈｅｒｂａｒｉｕｓの飲料腐敗性細菌を特異的に検出するために有用であり、本発明による検出方法中で相応に用いられている。
本発明中では、異なる微生物の同時検出を可能にするために、異なる微生物種を検出するプローブを組み合わせて用いることができる。同様に、これによりこの検出方法のスピードの増加がもたらされる。
ａ）飲料腐敗性酵母を特異的に検出する核酸分子：
配列番号1: 5'-GTTTGACCAGATTCTCCGCTC
配列番号１の配列は、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の微生物の検出に特に有用である。
配列番号2: 5'-GTTTGACCAGATTTTCCGCTCT
配列番号3: 5'-GTTTGACCAAATTTTCCGCTCT
配列番号4: 5'-GTTTGTCCAAATTCTCCGCTCT
配列番号２から配列番号４に記載の核酸分子は、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の微生物を検出するための非標識の競合プローブとして、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属のメンバーに特異的な標識した核酸プローブとＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属のメンバーに特異的でない核酸配列との結合を妨げるために、配列番号１に記載の核酸プローブと組み合わせて用いる。
配列番号5: 5'-CCCGGTCGAATTAAAACC
配列番号6: 5'-GCCCGGTCGAATTAAAAC
配列番号7: 5'-GGCCCGGTCGAATTAAAA
配列番号8: 5'-AGGCCCGGTCGAATTAAA
配列番号9: 5'-AAGGCCCGGTCGAATTAA
配列番号10: 5'- ATATTCGAGCGAAACGCC
配列番号11: 5'- AAAGATCCGGACCGGCCG
配列番号12 5'-GGAAAGATCCGGACCGGC
配列番号13 5'-GAAAGATCCGGACCGGCC
配列番号14 5'-GATCCGGACCGGCCGACC
配列番号15 5'-AGATCCGGACCGGCCGAC
配列番号16 5'-AAGATCCGGACCGGCCGA
配列番号17 5'-GAAAGGCCCGGTCGAATT
配列番号18 5'-AAAGGCCCGGTCGAATTA
配列番号19 5'-GGAAAGGCCCGGTCGAAT
配列番号20 5'-AGGAAAGGCCCGGTCGAA
配列番号21 5'-AAGGAAAGGCCCGGTCGA
配列番号５から配列番号２１の配列は、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉの検出に特に適している。
配列番号22: 5'- ATAGCACTGGGATCCTCGCC
配列番号２２の配列は、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉの検出に特に適している。
配列番号23: 5'- CCAGCCCCAAAGTTACCTTC
配列番号24: 5'- TCCTTGACGTAAAGTCGCAG
配列番号２３から配列番号２４の配列は、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍｉｃｒｏｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｓの検出に特に適している。
配列番号25: 5'- GGAAGAAAACCAGTACGC
配列番号26: 5'- CCGGTCGGAAGAAAACCA
配列番号27: 5'- GAAGAAAACCAGTACGCG
配列番号28: 5'- CCCGGTCGGAAGAAAACC
配列番号29: 5'- CGGTCGGAAGAAAACCAG
配列番号30: 5'- GGTCGGAAGAAAACCAGT
配列番号31: 5'- AAGAAAACCAGTACGCGG
配列番号32: 5'- GTACGCGGAAAAATCCGG
配列番号33: 5'- AGTACGCGGAAAAATCCG
配列番号34: 5'- GCGGAAAAATCCGGACCG
配列番号35: 5'- CGGAAGAAAACCAGTACG
配列番号36: 5'- GCCCGGTCGGAAGAAAAC
配列番号37: 5'- CGCGGAAAAATCCGGACC
配列番号38: 5'- CAGTACGCGGAAAAATCC
配列番号39: 5'- AGAAAACCAGTACGCGGA
配列番号40: 5'- GGCCCGGTCGGAAGAAAA
配列番号41: 5'- ATAAACACCACCCGATCC
配列番号42: 5'- ACGCGGAAAAATCCGGAC
配列番号43: 5'- GAGAGGCCCGGTCGGAAG
配列番号44: 5'- AGAGGCCCGGTCGGAAGA
配列番号45: 5'- GAGGCCCGGTCGGAAGAA
配列番号46: 5'- AGGCCCGGTCGGAAGAAA
配列番号47: 5'- CCGAGTGGGTCAGTAAAT
配列番号48: 5'- CCAGTACGCGGAAAAATC
配列番号49: 5'- TAAACACCACCCGATCCC
配列番号50: 5'- GGAGAGGCCCGGTCGGAA
配列番号51: 5'- GAAAACCAGTACGCGGAA
配列番号52: 5'- TACGCGGAAAAATCCGGA
配列番号53: 5'- GGCCACAGGGACCCAGGG
配列番号54: 5'- TCACCAAGGGCCACAGGG
配列番号55: 5'- GGGCCACAGGGACCCAGG
配列番号56: 5'- TTCACCAAGGGCCACAGG
配列番号57: 5'- ACAGGGACCCAGGGCTAG
配列番号58: 5'- AGGGCCACAGGGACCCAG
配列番号59: 5'- GTTCACCAAGGGCCACAG
配列番号60: 5'- GCCACAGGGACCCAGGGC
配列番号61: 5'- CAGGGACCCAGGGCTAGC
配列番号62: 5'- AGGGACCCAGGGCTAGCC
配列番号63: 5'- ACCAAGGGCCACAGGGAC
配列番号64: 5'- CCACAGGGACCCAGGGCT
配列番号65: 5'- CACAGGGACCCAGGGCTA
配列番号66: 5'- CACCAAGGGCCACAGGGA
配列番号67: 5'- GGGACCCAGGGCTAGCCA
配列番号68: 5'- AGGAGAGGCCCGGTCGGA
配列番号69: 5'- AAGGAGAGGCCCGGTCGG
配列番号70: 5'- GAAGGAGAGGCCCGGTCG
配列番号71: 5'- AGGGCTAGCCAGAAGGAG
配列番号72: 5'- GGGCTAGCCAGAAGGAGA
配列番号73: 5'- AGAAGGAGAGGCCCGGTC
配列番号74: 5'- CAAGGGCCACAGGGACCC
配列番号75: 5'- CCAAGGGCCACAGGGACC
配列番号２５から配列番号７５の配列は、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍｅｌｌｉｓの検出に特に適している。
配列番号76: 5'- GTCGGAAAAACCAGTACG
配列番号77: 5'- GCCCGGTCGGAAAAACCA
配列番号78: 5'- CCGGTCGGAAAAACCAGT
配列番号79: 5'- CCCGGTCGGAAAAACCAG
配列番号80: 5'- TCGGAAAAACCAGTACGC
配列番号81: 5'- CGGAAAAACCAGTACGCG
配列番号82: 5'- GGAAAAACCAGTACGCGG
配列番号83: 5'- GTACGCGGAAAAATCCGG
配列番号84: 5'- AGTACGCGGAAAAATCCG
配列番号85: 5'- GCGGAAAAATCCGGACCG
配列番号86: 5'- GGTCGGAAAAACCAGTAC
配列番号87: 5'- ACTCCTAGTGGTGCCCTT
配列番号88: 5'- GCTCCACTCCTAGTGGTG
配列番号89: 5'- CACTCCTAGTGGTGCCCT
配列番号90: 5'- CTCCACTCCTAGTGGTGC
配列番号91: 5'- TCCACTCCTAGTGGTGCC
配列番号92: 5'- CCACTCCTAGTGGTGCCC
配列番号93: 5'- GGCTCCACTCCTAGTGGT
配列番号94: 5'- AGGCTCCACTCCTAGTGG
配列番号95: 5'- GGCCCGGTCGGAAAAACC
配列番号96: 5'- GAAAAACCAGTACGCGGA
配列番号97: 5'- CGCGGAAAAATCCGGACC
配列番号98: 5'- CAGTACGCGGAAAAATCC
配列番号99: 5'- CGGTCGGAAAAACCAGTA
配列番号100: 5'- AAGGCCCGGTCGGAAAAA
配列番号101: 5'- CAGGCTCCACTCCTAGTG
配列番号102: 5'- CTCCTAGTGGTGCCCTTC
配列番号103: 5'- TCCTAGTGGTGCCCTTCC
配列番号104: 5'- GCAGGCTCCACTCCTAGT
配列番号105: 5'- AGGCCCGGTCGGAAAAAC
配列番号106: 5'- ACGCGGAAAAATCCGGAC
配列番号107: 5'- CCAGTACGCGGAAAAATC
配列番号108: 5'- CTAGTGGTGCCCTTCCGT
配列番号109: 5'- GAAAGGCCCGGTCGGAAA
配列番号110: 5'- AAAGGCCCGGTCGGAAAA
配列番号111: 5'- TACGCGGAAAAATCCGGA
配列番号112: 5'- GGAAAGGCCCGGTCGGAA
配列番号113: 5'- ATCTCTTCCGAAAGGTCG
配列番号114: 5'- CATCTCTTCCGAAAGGTC
配列番号115: 5'- CTCTTCCGAAAGGTCGAG
配列番号116: 5'- CTTCCGAAAGGTCGAGAT
配列番号117: 5'- TCTCTTCCGAAAGGTCGA
配列番号118: 5'- TCTTCCGAAAGGTCGAGA
配列番号119: 5'- CCTAGTGGTGCCCTTCCG
配列番号120: 5'- TAGTGGTGCCCTTCCGTC
配列番号121: 5'- AGTGGTGCCCTTCCGTCA
配列番号122: 5'- GCCAAGGTTAGACTCGTT
配列番号123: 5'- GGCCAAGGTTAGACTCGT
配列番号124: 5'- CCAAGGTTAGACTCGTTG
配列番号125: 5'- CAAGGTTAGACTCGTTGG
配列番号126: 5'- AAGGTTAGACTCGTTGGC
配列番号７６から配列番号１２６の配列は、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉの検出に特に適している。
配列番号127: 5'- CTCGCCTCACGGGGTTCTCA
配列番号１２７の配列は、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍｅｌｌｉｓおよびＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉの同時検出に特に適している。
配列番号128: 5'- GGCCCGGTCGAAATTAAA
配列番号129: 5'- AGGCCCGGTCGAAATTAA
配列番号130: 5'- AAGGCCCGGTCGAAATTA
配列番号131: 5'- AAAGGCCCGGTCGAAATT
配列番号132: 5'- GAAAGGCCCGGTCGAAAT
配列番号133: 5'- ATATTCGAGCGAAACGCC
配列番号134: 5'- GGAAAGGCCCGGTCGAAA
配列番号135: 5'- AAAGATCCGGACCGGCCG
配列番号136: 5'- GGAAAGATCCGGACCGGC
配列番号137: 5'- GAAAGATCCGGACCGGCC
配列番号138: 5'- GATCCGGACCGGCCGACC
配列番号139: 5'- AGATCCGGACCGGCCGAC
配列番号140: 5'- AAGATCCGGACCGGCCGA
配列番号141: 5'- AGGAAAGGCCCGGTCGAA
配列番号142: 5'- AAGGAAAGGCCCGGTCGA
配列番号１２８から配列番号１４２の配列は、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓの検出に特に適している。
配列番号143: 5'- CGAGCAAAACGCCTGCTTTG
配列番号144: 5'- CGCTCTGAAAGAGAGTTGCC
配列番号１４３および配列番号１４４の配列は、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ ｕｖａｒｕｍの検出に特に適している。
配列番号145: 5'- AGTTGCCCCCTACACTAGAC
配列番号146: 5'- GCTTCTCCGTCCCGCGCCG
配列番号１４５および配列番号１４６の配列は、Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａの検出に特に適している。
配列番号147: 5'- AGATTYTCCGCTCTGAGATGG
配列番号１４７に記載の核酸プローブ分子は、Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａを検出するための非標識の競合プローブとして、Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａに特異的な標識したオリゴヌクレオチドプローブとＣａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａに特異的でない核酸配列との結合を妨げるために、配列番号１４６に記載のオリゴヌクレオチドプローブと組み合わせて用いる。
配列番号148: 5'- CCTGGTTCGCCAAAAAGGC
配列番号１４８の配列は、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓの検出に特に適している。
配列番号149: 5'- GATTCTCGGCCCCATGGG
配列番号１４９の配列は、Ｃａｎｄｉｄａ ｃｒｕｓｅｉ（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）の検出に特に適している。
配列番号150: 5'- ACCCTCTACGGCAGCCTGTT
配列番号１５０の配列は、Ｄｅｋｋｅｒａ ａｎｏｍａｌａおよびＢｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ（Ｄｅｋｋｅｒａ） ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓの検出に特に適している。
配列番号151: 5'- GATCGGTCTCCAGCGATTCA
配列番号１５１の配列は、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ（Ｄｅｋｋｅｒａ） ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓの検出に特に適している。
配列番号152: 5'- ACCCTCCACGGCGGCCTGTT
配列番号１５２の配列は、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ（Ｄｅｋｋｅｒａ） ｎａａｒｄｅｎｅｎｓｉｓの検出に特に適している。
配列番号153: 5'- GATTCTCCGCGCCATGGG
配列番号１５３の配列は、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓの検出に特に適している。
配列番号154: 5'- TCATCAGACGGGATTCTCAC
配列番号１５４の配列は、Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａおよびＰｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａの同時検出に特に適している。
配列番号155: 5'- CTCATCGCACGGGATTCTCACC
配列番号156: 5'- CTCGCCACACGGGATTCTCACC
配列番号１５５および配列番号１５６に記載の核酸プローブ分子は、Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａおよびＰｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａを同時に検出するための非標識の競合プローブとして、Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａおよびＰｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａに特異的な標識したオリゴヌクレオチドプローブとＰｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａおよびＰｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａに特異的でない核酸配列との結合を妨げるために、配列番号１５４に記載のオリゴヌクレオチドプローブと組み合わせて用いる。
配列番号157: 5'- AGTTGCCCCCTCCTCTAAGC
配列番号１５７の配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｘｉｇｕｕｓの検出に特に適している。
配列番号158: 5'- CTGCCACAAGGACAAATGGT
配列番号159: 5'- TGCCCCCTCTTCTAAGCAAAT
配列番号１５８および配列番号１５９の配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｌｕｄｗｉｇｉｉの検出に特に適している。
配列番号160: 5'- CCCCAAAGTTGCCCTCTC
配列番号１６０の配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの検出に特に適している。
配列番号161: 5'- GCCGCCCCAAAGTCGCCCTCTAC
配列番号162: 5'- GCCCCAGAGTCGCCTTCTAC
配列番号１６１および配列番号１６２に記載の核酸プローブ分子は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを検出するための非標識の競合プローブとして、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに特異的な標識したオリゴヌクレオチドプローブとＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに特異的でない核酸配列との結合を妨げるために、配列番号１６０に記載のオリゴヌクレオチドプローブと組み合わせて用いる。
ｂ）飲料腐敗性カビを特異的に検出する核酸プローブ分子：
配列番号163: 5'- AAGACCAGGCCACCTCAT
配列番号１６３の配列は、Ｍｕｃｏｒ ｒａｃｅｍｏｓｕｓの検出に特に適している。
配列番号164: 5'- CATCATAGAACACCGTCC
配列番号１６４の配列は、Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ ｎｉｖｅａの検出に特に適している。
配列番号165: 5'- CCTTCCGAAGTCGAGGTTTT
配列番号１６５の配列は、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉの検出に特に適している。
配列番号166: 5'- GGGAGTGTTGCCAACTC
配列番号１６６の配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓおよびＡ．ｆｉｓｃｈｅｒｉの同時検出に特に適している。
配列番号167: 5'- AGCGGTCGTTCGCAACCCT
配列番号１６７の配列は、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｕｓの検出に特に適している。
配列番号168: 5'- CCGAAGTCGGGGTTTTGCGG
配列番号１６８の配列は、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｃｉｌｌｉｓｐｏｒｕｓおよびＴ．ｆｌａｖｕｓの同時検出に特に適している。
ｃ）飲料腐敗性乳酸菌を特異的に検出する核酸プローブ分子
配列番号169: 5'- GATAGCCGAAACCACCTTTC
配列番号170: 5'- GCCGAAACCACCTTTCAAAC
配列番号171: 5'- GTGATAGCCGAAACCACCTT
配列番号172: 5'- AGTGATAGCCGAAACCACCT
配列番号173: 5'- TTTAACGGGATGCGTTCGAC
配列番号174: 5'- AAGTGATAGCCGAAACCACC
配列番号175: 5'- GGTTGAATACCGTCAACGTC
配列番号176: 5'- GCACAGTATGTCAAGACCTG
配列番号177: 5'- CATCCGATGTGCAAGCACTT
配列番号178: 5'- TCATCCGATGTGCAAGCACT
配列番号179: 5'- CCGATGTGCAAGCACTTCAT
配列番号180: 5'- CCACTCATCCGATGTGCAAG
配列番号181: 5'- GCCACAGTTCGCCACTCATC
配列番号182: 5'- CCTCCGCGTTTGTCACCGGC
配列番号183: 5'- ACCAGTTCGCCACAGTTCGC
配列番号184: 5'- CACTCATCCGATGTGCAAGC
配列番号185: 5'- CCAGTTCGCCACAGTTCGCC
配列番号186: 5'- CTCATCCGATGTGCAAGCAC
配列番号187: 5'- TCCGATGTGCAAGCACTTCA
配列番号188: 5'- CGCCACTCATCCGATGTGCA
配列番号189: 5'- CAGTTCGCCACAGTTCGCCA
配列番号190: 5'- GCCACTCATCCGATGTGCAA
配列番号191: 5'- CGCCACAGTTCGCCACTCAT
配列番号192: 5'- ATCCGATGTGCAAGCACTTC
配列番号193: 5'- GTTCGCCACAGTTCGCCACT
配列番号194: 5'- TCCTCCGCGTTTGTCACCGG
配列番号195: 5'- CGCCAGGGTTCATCCTGAGC
配列番号196: 5'- AGTTCGCCACAGTTCGCCAC
配列番号197: 5'- TCGCCACAGTTCGCCACTCA
配列番号198: 5'- TTAACGGGATGCGTTCGACT
配列番号199: 5'- TCGCCACTCATCCGATGTGC
配列番号200: 5'- CCACAGTTCGCCACTCATCC
配列番号201: 5'- GATTTAACGGGATGCGTTCG
配列番号202: 5'- TAACGGGATGCGTTCGACTT
配列番号203: 5'- AACGGGATGCGTTCGACTTG
配列番号204: 5'- CGAAGGTTACCGAACCGACT
配列番号205: 5'- CCGAAGGTTACCGAACCGAC
配列番号206: 5'- CCCGAAGGTTACCGAACCGA
配列番号207: 5'- TTCCTCCGCGTTTGTCACCG
配列番号208: 5'- CCGCCAGGGTTCATCCTGAG
配列番号209: 5'- TCCTTCCAGAAGTGATAGCC
配列番号210: 5'- CACCAGTTCGCCACAGTTCG
配列番号211: 5'- ACGGGATGCGTTCGACTTGC
配列番号212: 5'- GTCCTTCCAGAAGTGATAGC
配列番号213: 5'- GCCAGGGTTCATCCTGAGCC
配列番号214: 5'- ACTCATCCGATGTGCAAGCA
配列番号215: 5'- ATCATTGCCTTGGTGAACCG
配列番号216: 5'- TCCGCGTTTGTCACCGGCAG
配列番号217: 5'- TGAACCGTTACTCCACCAAC
配列番号218: 5'- GAAGTGATAGCCGAAACCAC
配列番号219: 5'- CCGCGTTTGTCACCGGCAGT
配列番号220: 5'- TTCGCCACTCATCCGATGTG
配列番号221: 5'- CATTTAACGGGATGCGTTCG
配列番号222: 5'- CACAGTTCGCCACTCATCCG
配列番号223: 5'- TTCGCCACAGTTCGCCACTC
配列番号224: 5'- CTCCGCGTTTGTCACCGGCA
配列番号225: 5'- ACGCCGCCAGGGTTCATCCT
配列番号226: 5'- CCTTCCAGAAGTGATAGCCG
配列番号227: 5'- TCATTGCCTTGGTGAACCGT
配列番号228: 5'- CACAGTATGTCAAGACCTGG
配列番号229: 5'- TTGGTGAACCGTTACTCCAC
配列番号230: 5'- CTTGGTGAACCGTTACTCCA
配列番号231: 5'- GTGAACCGTTACTCCACCAA
配列番号232: 5'- GGCTCCCGAAGGTTACCGAA
配列番号233: 5'- GAAGGTTACCGAACCGACTT
配列番号234: 5'- TGGCTCCCGAAGGTTACCGA
配列番号235: 5'- TAATACGCCGCGGGTCCTTC
配列番号236: 5'- GAACCGTTACTCCACCAACT
配列番号237: 5'- TACGCCGCGGGTCCTTCCAG
配列番号238: 5'- TCACCAGTTCGCCACAGTTC
配列番号239: 5'- CCTTGGTGAACCGTTACTCC
配列番号240: 5'- CTCACCAGTTCGCCACAGTT
配列番号241: 5'- CGCCGCCAGGGTTCATCCTG
配列番号242: 5'- CCTTGGTGAACCATTACTCC
配列番号243: 5'- TGGTGAACCATTACTCCACC
配列番号244: 5'- GCCGCCAGGGTTCATCCTGA
配列番号245: 5'- GGTGAACCATTACTCCACCA
配列番号246: 5'- CCAGGGTTCATCCTGAGCCA
配列番号247: 5'- AATACGCCGCGGGTCCTTCC
配列番号248: 5'- CACGCCGCCAGGGTTCATCC
配列番号249: 5'- AGTTCGCCACTCATCCGATG
配列番号250: 5'- CGGGATGCGTTCGACTTGCA
配列番号251: 5'- CATTGCCTTGGTGAACCGTT
配列番号252: 5'- GCACGCCGCCAGGGTTCATC
配列番号253: 5'- CTTCCTCCGCGTTTGTCACC
配列番号254: 5'- TGGTGAACCGTTACTCCACC
配列番号255: 5'- CCTTCCTCCGCGTTTGTCAC
配列番号256: 5'- ACGCCGCGGGTCCTTCCAGA
配列番号257: 5'- GGTGAACCGTTACTCCACCA
配列番号258: 5'- GGGTCCTTCCAGAAGTGATA
配列番号259: 5'- CTTCCAGAAGTGATAGCCGA
配列番号260: 5'- GCCTTGGTGAACCATTACTC
配列番号261: 5'- ACAGTTCGCCACTCATCCGA
配列番号262: 5'- ACCTTCCTCCGCGTTTGTCA
配列番号263: 5'- CGAACCGACTTTGGGTGTTG
配列番号264: 5'- GAACCGACTTTGGGTGTTGC
配列番号265: 5'- AGGTTACCGAACCGACTTTG
配列番号266: 5'- ACCGAACCGACTTTGGGTGT
配列番号267: 5'- TTACCGAACCGACTTTGGGT
配列番号268: 5'- TACCGAACCGACTTTGGGTG
配列番号269: 5'- GTTACCGAACCGACTTTGGG
配列番号１６９から配列番号２６９の配列は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓの検出に特に適している。
配列番号270: 5'- CCTTTCTGGTATGGTACCGTC
配列番号271: 5'- TGCACCGCGGAYCCATCTCT
配列番号２７０から配列番号２７１の配列は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属のメンバーの検出に特に適している。
配列番号272: 5'- AGTTGCAGTCCAGTAAGCCG
配列番号273: 5'- GTTGCAGTCCAGTAAGCCGC
配列番号274: 5'- CAGTTGCAGTCCAGTAAGCC
配列番号275: 5'- TGCAGTCCAGTAAGCCGCCT
配列番号276: 5'- TCAGTTGCAGTCCAGTAAGC
配列番号277: 5'- TTGCAGTCCAGTAAGCCGCC
配列番号278: 5'- GCAGTCCAGTAAGCCGCCTT
配列番号279: 5'- GTCAGTTGCAGTCCAGTAAG
配列番号280: 5'- CTCTAGGTGACGCCGAAGCG
配列番号281: 5'- ATCTCTAGGTGACGCCGAAG
配列番号282: 5'- TCTAGGTGACGCCGAAGCGC
配列番号283: 5'- TCTCTAGGTGACGCCGAAGC
配列番号284: 5'- CCATCTCTAGGTGACGCCGA
配列番号285: 5'- CATCTCTAGGTGACGCCGAA
配列番号286: 5'- TAGGTGACGCCGAAGCGCCT
配列番号287: 5'- CTAGGTGACGCCGAAGCGCC
配列番号288: 5'- CTTAGACGGCTCCTTCCTAA
配列番号289: 5'- CCTTAGACGGCTCCTTCCTA
配列番号290: 5'- ACGTCAGTTGCAGTCCAGTA
配列番号291: 5'- CGTCAGTTGCAGTCCAGTAA
配列番号292: 5'- ACGCCGAAGCGCCTTTTAAC
配列番号293: 5'- GACGCCGAAGCGCCTTTTAA
配列番号294: 5'- GCCGAAGCGCCTTTTAACTT
配列番号295: 5'- CGCCGAAGCGCCTTTTAACT
配列番号296: 5'- GTGACGCCGAAGCGCCTTTT
配列番号297: 5'- TGACGCCGAAGCGCCTTTTA
配列番号298: 5'- AGACGGCTCCTTCCTAAAAG
配列番号299: 5'- ACGGCTCCTTCCTAAAAGGT
配列番号300: 5'- GACGGCTCCTTCCTAAAAGG
配列番号301: 5'- CCTTCCTAAAAGGTTAGGCC
配列番号２７２から配列番号３０１の配列は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓおよびＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓの同時検出に特に適している。
配列番号302: 5'- GGTGACGCCAAAGCGCCTTT
配列番号303: 5'- AGGTGACGCCAAAGCGCCTT
配列番号304: 5'- TAGGTGACGCCAAAGCGCCT
配列番号305: 5'- CTCTAGGTGACGCCAAAGCG
配列番号306: 5'- TCTAGGTGACGCCAAAGCGC
配列番号307: 5'- CTAGGTGACGCCAAAGCGCC
配列番号308: 5'- ACGCCAAAGCGCCTTTTAAC
配列番号309: 5'- CGCCAAAGCGCCTTTTAACT
配列番号310: 5'- TGACGCCAAAGCGCCTTTTA
配列番号311: 5'- TCTCTAGGTGACGCCAAAGC
配列番号312: 5'- GTGACGCCAAAGCGCCTTTT
配列番号313: 5'- GACGCCAAAGCGCCTTTTAA
配列番号314: 5'- ATCTCTAGGTGACGCCAAAG
配列番号315: 5'- CATCTCTAGGTGACGCCAAA
配列番号316: 5'- TCCATCTCTAGGTGACGCCA
配列番号317: 5'- CCATCTCTAGGTGACGCCAA
配列番号318: 5'- CTGCCTTAGACGGCTCCCCC
配列番号319: 5'- CCTGCCTTAGACGGCTCCCC
配列番号320: 5'- GTGTCATGCGACACTGAGTT
配列番号321: 5'- TGTGTCATGCGACACTGAGT
配列番号322: 5'- CTTTGTGTCATGCGACACTG
配列番号323: 5'- TTGTGTCATGCGACACTGAG
配列番号324: 5'- TGCCTTAGACGGCTCCCCCT
配列番号325: 5'- AGACGGCTCCCCCTAAAAGG
配列番号326: 5'- TAGACGGCTCCCCCTAAAAG
配列番号327: 5'- GCCTTAGACGGCTCCCCCTA
配列番号328: 5'- GCTCCCCCTAAAAGGTTAGG
配列番号329: 5'- GGCTCCCCCTAAAAGGTTAG
配列番号330: 5'- CTCCCCCTAAAAGGTTAGGC
配列番号331: 5'- TCCCCCTAAAAGGTTAGGCC
配列番号332: 5'- CCCTAAAAGGTTAGGCCACC
配列番号333: 5'- CCCCTAAAAGGTTAGGCCAC
配列番号334: 5'- CGGCTCCCCCTAAAAGGTTA
配列番号335: 5'- CCCCCTAAAAGGTTAGGCCA
配列番号336: 5'- CTTAGACGGCTCCCCCTAAA
配列番号337: 5'- TTAGACGGCTCCCCCTAAAA
配列番号338: 5'- GGGTTCGCAACTCGTTGTAT
配列番号339: 5'- CCTTAGACGGCTCCCCCTAA
配列番号340: 5'- ACGGCTCCCCCTAAAAGGTT
配列番号341: 5'- GACGGCTCCCCCTAAAAGGT
配列番号３０２から配列番号３４１の配列は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓの検出に特に適している。
配列番号342: 5'- ACGCCGCAAGACCATCCTCT
配列番号343: 5'- CTAATACGCCGCAAGACCAT
配列番号344: 5'- TACGCCGCAAGACCATCCTC
配列番号345: 5'- GTTACGATCTAGCAAGCCGC
配列番号346: 5'- AATACGCCGCAAGACCATCC
配列番号347: 5'- CGCCGCAAGACCATCCTCTA
配列番号348: 5'- GCTAATACGCCGCAAGACCA
配列番号349: 5'- ACCATCCTCTAGCGATCCAA
配列番号350: 5'- TAATACGCCGCAAGACCATC
配列番号351: 5'- AGCCATCCCTTTCTGGTAAG
配列番号352: 5'- ATACGCCGCAAGACCATCCT
配列番号353: 5'- AGTTACGATCTAGCAAGCCG
配列番号354: 5'- AGCTAATACGCCGCAAGACC
配列番号355: 5'- GCCGCAAGACCATCCTCTAG
配列番号356: 5'- TTACGATCTAGCAAGCCGCT
配列番号357: 5'- GACCATCCTCTAGCGATCCA
配列番号358: 5'- TTGCTACGTCACTAGGAGGC
配列番号359: 5'- ACGTCACTAGGAGGCGGAAA
配列番号360: 5'- TTTGCTACGTCACTAGGAGG
配列番号361: 5'- GCCATCCCTTTCTGGTAAGG
配列番号362: 5'- TACGTCACTAGGAGGCGGAA
配列番号363: 5'- CGTCACTAGGAGGCGGAAAC
配列番号364: 5'- AAGACCATCCTCTAGCGATC
配列番号365: 5'- GCACGTATTTAGCCATCCCT
配列番号366: 5'- CTCTAGCGATCCAAAAGGAC
配列番号367: 5'- CCTCTAGCGATCCAAAAGGA
配列番号368: 5'- CCATCCTCTAGCGATCCAAA
配列番号369: 5'- GGCACGTATTTAGCCATCCC
配列番号370: 5'- TACGATCTAGCAAGCCGCTT
配列番号371: 5'- CAGTTACGATCTAGCAAGCC
配列番号372: 5'- CCGCAAGACCATCCTCTAGC
配列番号373: 5'- CCATCCCTTTCTGGTAAGGT
配列番号374: 5'- AGACCATCCTCTAGCGATCC
配列番号375: 5'- CAAGACCATCCTCTAGCGAT
配列番号376: 5'- GCTACGTCACTAGGAGGCGG
配列番号377: 5'- TGCTACGTCACTAGGAGGCG
配列番号378: 5'- CTACGTCACTAGGAGGCGGA
配列番号379: 5'- CCTCAACGTCAGTTACGATC
配列番号380: 5'- GTCACTAGGAGGCGGAAACC
配列番号381: 5'- TCCTCTAGCGATCCAAAAGG
配列番号382: 5'- TGGCACGTATTTAGCCATCC
配列番号383: 5'- ACGATCTAGCAAGCCGCTTT
配列番号384: 5'- GCCAGTCTCTCAACTCGGCT
配列番号385: 5'- AAGCTAATACGCCGCAAGAC
配列番号386: 5'- GTTTGCTACGTCACTAGGAG
配列番号387: 5'- CGCCACTCTAGTCATTGCCT
配列番号388: 5'- GGCCAGCCAGTCTCTCAACT
配列番号389: 5'- CAGCCAGTCTCTCAACTCGG
配列番号390: 5'- CCCGAAGATCAATTCAGCGG
配列番号391: 5'- CCGGCCAGTCTCTCAACTCG
配列番号392: 5'- CCAGCCAGTCTCTCAACTCG
配列番号393: 5'- TCATTGCCTCACTTCACCCG
配列番号394: 5'- GCCAGCCAGTCTCTCAACTC
配列番号395: 5'- CACCCGAAGATCAATTCAGC
配列番号396: 5'- GTCATTGCCTCACTTCACCC
配列番号397: 5'- CATTGCCTCACTTCACCCGA
配列番号398: 5'- ATTGCCTCACTTCACCCGAA
配列番号399: 5'- CGAAGATCAATTCAGCGGCT
配列番号400: 5'- AGTCATTGCCTCACTTCACC
配列番号401: 5'- TCGCCACTCTAGTCATTGCC
配列番号402: 5'- TTGCCTCACTTCACCCGAAG
配列番号403: 5'- CGGCCAGTCTCTCAACTCGG
配列番号404: 5'- CTGGCACGTATTTAGCCATC
配列番号405: 5'- ACCCGAAGATCAATTCAGCG
配列番号406: 5'- TCTAGCGATCCAAAAGGACC
配列番号407: 5'- CTAGCGATCCAAAAGGACCT
配列番号408: 5'- GCACCCATCGTTTACGGTAT
配列番号409: 5'- CACCCATCGTTTACGGTATG
配列番号410: 5'- GCCACTCTAGTCATTGCCTC
配列番号411: 5'- CGTTTGCTACGTCACTAGGA
配列番号412: 5'- GCCTCAACGTCAGTTACGAT
配列番号413: 5'- GCCGGCCAGTCTCTCAACTC
配列番号414: 5'- TCACTAGGAGGCGGAAACCT
配列番号415: 5'- AGCCTCAACGTCAGTTACGA
配列番号416: 5'- AGCCAGTCTCTCAACTCGGC
配列番号417: 5'- GGCCAGTCTCTCAACTCGGC
配列番号418: 5'- CAAGCTAATACGCCGCAAGA
配列番号419: 5'- TTCGCCACTCTAGTCATTGC
配列番号420: 5'- CCGAAGATCAATTCAGCGGC
配列番号421: 5'- CGCAAGACCATCCTCTAGCG
配列番号422: 5'- GCAAGACCATCCTCTAGCGA
配列番号423: 5'- GCGTTTGCTACGTCACTAGG
配列番号424: 5'- CCACTCTAGTCATTGCCTCA
配列番号425: 5'- CACTCTAGTCATTGCCTCAC
配列番号426: 5'- CCAGTCTCTCAACTCGGCTA
配列番号427: 5'- TTACCTTAGGCACCGGCCTC
配列番号428: 5'- ACAAGCTAATACGCCGCAAG
配列番号429: 5'- TTTACCTTAGGCACCGGCCT
配列番号430: 5'- TTTTACCTTAGGCACCGGCC
配列番号431: 5'- ATTTTACCTTAGGCACCGGC
配列番号432: 5'- GATTTTACCTTAGGCACCGG
配列番号433: 5'- CTCACTTCACCCGAAGATCA
配列番号434: 5'- ACGCCACCAGCGTTCATCCT
配列番号435: 5'- GCCAAGCGACTTTGGGTACT
配列番号436: 5'- CGGAAAATTCCCTACTGCAG
配列番号437: 5'- CGATCTAGCAAGCCGCTTTC
配列番号438: 5'- GGTACCGTCAAGCTGAAAAC
配列番号439: 5'- TGCCTCACTTCACCCGAAGA
配列番号440: 5'- GGCCGGCCAGTCTCTCAACT
配列番号441: 5'- GGTAAGGTACCGTCAAGCTG
配列番号442: 5'- GTAAGGTACCGTCAAGCTGA
配列番号443: 5'- CCGCAAGACCATCCTCTAGG
配列番号444: 5'- ATTTAGCCATCCCTTTCTGG
配列番号３４２から配列番号４４４の配列は、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｅｎｉの検出に特に適している。
配列番号445: 5'- AACCCTTCATCACACACG
配列番号446: 5'- CGAAACCCTTCATCACAC
配列番号447: 5'- ACCCTTCATCACACACGC
配列番号448: 5'- TACCGTCACACACTGAAC
配列番号449: 5'- AGATACCGTCACACACTG
配列番号450: 5'- CACTCAAGGGCGGAAACC
配列番号451: 5'- ACCGTCACACACTGAACA
配列番号452: 5'- CGTCACACACTGAACAGT
配列番号453: 5'- CCGAAACCCTTCATCACA
配列番号454: 5'- CCGTCACACACTGAACAG
配列番号455: 5'- GATACCGTCACACACTGA
配列番号456: 5'- GGTAAGATACCGTCACAC
配列番号457: 5'- CCCTTCATCACACACGCG
配列番号458: 5'- ACAGTGTTTTACGAGCCG
配列番号459: 5'- CAGTGTTTTACGAGCCGA
配列番号460: 5'- ACAAAGCGTTCGACTTGC
配列番号461: 5'- CGGATAACGCTTGGAACA
配列番号462: 5'- AGGGCGGAAACCCTCGAA
配列番号463: 5'- GGGCGGAAACCCTCGAAC
配列番号464: 5'- GGCGGAAACCCTCGAACA
配列番号465: 5'- TGAGGGCTTTCACTTCAG
配列番号466: 5'- AGGGCTTTCACTTCAGAC
配列番号467: 5'- GAGGGCTTTCACTTCAGA
配列番号468: 5'- ACTGCACTCAAGTCATCC
配列番号469: 5'- CCGGATAACGCTTGGAAC
配列番号470: 5'- TCCGGATAACGCTTGGAA
配列番号471: 5'- TATCCCCTGCTAAGAGGT
配列番号472: 5'- CCTGCTAAGAGGTAGGTT
配列番号473: 5'- CCCTGCTAAGAGGTAGGT
配列番号474: 5'- CCCCTGCTAAGAGGTAGG
配列番号475: 5'- TCCCCTGCTAAGAGGTAG
配列番号476: 5'- ATCCCCTGCTAAGAGGTA
配列番号477: 5'- CCGTTCCTTTCTGGTAAG
配列番号478: 5'- GCCGTTCCTTTCTGGTAA
配列番号479: 5'- AGCCGTTCCTTTCTGGTA
配列番号480: 5'- GCACGTATTTAGCCGTTC
配列番号481: 5'- CACGTATTTAGCCGTTCC
配列番号482: 5'- GGCACGTATTTAGCCGTT
配列番号483: 5'- CACTTTCCTCTACTGCAC
配列番号484: 5'- CCACTTTCCTCTACTGCA
配列番号485: 5'- TCCACTTTCCTCTACTGC
配列番号486: 5'- CTTTCCTCTACTGCACTC
配列番号487: 5'- TAGCCGTTCCTTTCTGGT
配列番号488: 5'- TTAGCCGTTCCTTTCTGG
配列番号489: 5'- TTATCCCCTGCTAAGAGG
配列番号490: 5'- GTTATCCCCTGCTAAGAG
配列番号491: 5'- CCCGTTCGCCACTCTTTG
配列番号492: 5'- AGCTGAGGGCTTTCACTT
配列番号493: 5'- GAGCTGAGGGCTTTCACT
配列番号494: 5'- GCTGAGGGCTTTCACTTC
配列番号495: 5'- CTGAGGGCTTTCACTTCA
配列番号４４５から配列番号４９５の配列は、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ属の細菌の検出に特に適している。
配列番号496: 5' CCCGTGTCCCGAAGGAAC
配列番号497: 5' GCACGAGTATGTCAAGAC
配列番号498: 5' GTATCCCGTGTCCCGAAG
配列番号499: 5' TCCCGTGTCCCGAAGGAA
配列番号500: 5' ATCCCGTGTCCCGAAGGA
配列番号501: 5' TATCCCGTGTCCCGAAGG
配列番号502: 5' CTTACCTTAGGAAGCGCC
配列番号503: 5' TTACCTTAGGAAGCGCCC
配列番号504: 5' CCTGTATCCCGTGTCCCG
配列番号505: 5' CCACCTGTATCCCGTGTC
配列番号506: 5' CACCTGTATCCCGTGTCC
配列番号507: 5' ACCTGTATCCCGTGTCCC
配列番号508: 5' CTGTATCCCGTGTCCCGA
配列番号509: 5' TGTATCCCGTGTCCCGAA
配列番号510: 5' CACGAGTATGTCAAGACC
配列番号511: 5' CGGTCTTACCTTAGGAAG
配列番号512: 5' TAGGAAGCGCCCTCCTTG
配列番号513: 5' AGGAAGCGCCCTCCTTGC
配列番号514: 5' TTAGGAAGCGCCCTCCTT
配列番号515: 5' CTTAGGAAGCGCCCTCCT
配列番号516: 5' CCTTAGGAAGCGCCCTCC
配列番号517: 5' ACCTTAGGAAGCGCCCTC
配列番号518: 5' TGCACACAATGGTTGAGC
配列番号519: 5' TACCTTAGGAAGCGCCCT
配列番号520: 5' ACCACCTGTATCCCGTGT
配列番号521: 5' GCACCACCTGTATCCCGT
配列番号522: 5' CACCACCTGTATCCCGTG
配列番号523: 5' GCGGTTAGGCAACCTACT
配列番号524: 5' TGCGGTTAGGCAACCTAC
配列番号525: 5' TTGCGGTTAGGCAACCTA
配列番号526: 5' GGTCTTACCTTAGGAAGC
配列番号527: 5' GCTAATACAACGCGGGAT
配列番号528: 5' CTAATACAACGCGGGATC
配列番号529: 5' ATACAACGCGGGATCATC
配列番号530: 5' CGGTTAGGCAACCTACTT
配列番号531: 5' TGCACCACCTGTATCCCG
配列番号532: 5' GAAGCGCCCTCCTTGCGG
配列番号533: 5' GGAAGCGCCCTCCTTGCG
配列番号534: 5' CGTCCCTTTCTGGTTAGA
配列番号535: 5' AGCTAATACAACGCGGGA
配列番号536: 5' TAGCTAATACAACGCGGG
配列番号537: 5' CTAGCTAATACAACGCGG
配列番号538: 5' GGCTATGTATCATCGCCT
配列番号539: 5' GAGCCACTGCCTTTTACA
配列番号540: 5' GTCGGCTATGTATCATCG
配列番号541: 5' GGTCGGCTATGTATCATC
配列番号542: 5' CAGGTCGGCTATGTATCA
配列番号543: 5' CGGCTATGTATCATCGCC
配列番号544: 5' TCGGCTATGTATCATCGC
配列番号545: 5' GTCTTACCTTAGGAAGCG
配列番号546: 5' TCTTACCTTAGGAAGCGC
配列番号４９６から配列番号５４６の配列は、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌の検出に特に適している。
ｄ）飲料腐敗性酢酸菌を特異的に検出する核酸分子：
配列番号547: 5'- GTACAAACCGCCTACACGCC
配列番号548: 5'- TGTACAAACCGCCTACACGC
配列番号549: 5'- GATCAGCACGATGTCGCCAT
配列番号550: 5'- CTGTACAAACCGCCTACACG
配列番号551: 5'- GAGATCAGCACGATGTCGCC
配列番号552: 5'- AGATCAGCACGATGTCGCCA
配列番号553: 5'- ATCAGCACGATGTCGCCATC
配列番号554: 5'- TCAGCACGATGTCGCCATCT
配列番号555: 5'- ACTGTACAAACCGCCTACAC
配列番号556: 5'- CCGCCACTAAGGCCGAAACC
配列番号557: 5'- CAGCACGATGTCGCCATCTA
配列番号558: 5'- TACAAACCGCCTACACGCCC
配列番号559: 5'- AGCACGATGTCGCCATCTAG
配列番号560: 5'- CGGCTTTTAGAGATCAGCAC
配列番号561: 5'- TCCGCCACTAAGGCCGAAAC
配列番号562: 5'- GACTGTACAAACCGCCTACA
配列番号563: 5'- GTCCGCCACTAAGGCCGAAA
配列番号564: 5'- GGGGATTTCACATCTGACTG
配列番号565: 5'- CATACAAGCCCTGGTAAGGT
配列番号566: 5'- ACAAGCCCTGGTAAGGTTCT
配列番号567: 5'- ACAAACCGCCTACACGCCCT
配列番号568: 5'- CTGACTGTACAAACCGCCTA
配列番号569: 5'- TGACTGTACAAACCGCCTAC
配列番号570: 5'- ACGATGTCGCCATCTAGCTT
配列番号571: 5'- CACGATGTCGCCATCTAGCT
配列番号572: 5'- CGATGTCGCCATCTAGCTTC
配列番号573: 5'- GCACGATGTCGCCATCTAGC
配列番号574: 5'- GATGTCGCCATCTAGCTTCC
配列番号575: 5'- ATGTCGCCATCTAGCTTCCC
配列番号576: 5'- TGTCGCCATCTAGCTTCCCA
配列番号577: 5'- GCCATCTAGCTTCCCACTGT
配列番号578: 5'- TCGCCATCTAGCTTCCCACT
配列番号579: 5'- CGCCATCTAGCTTCCCACTG
配列番号580: 5'- GTCGCCATCTAGCTTCCCAC
配列番号581: 5'- TACAAGCCCTGGTAAGGTTC
配列番号582: 5'- GCCACTAAGGCCGAAACCTT
配列番号583: 5'- ACTAAGGCCGAAACCTTCGT
配列番号584: 5'- CTAAGGCCGAAACCTTCGTG
配列番号585: 5'- CACTAAGGCCGAAACCTTCG
配列番号586: 5'- AAGGCCGAAACCTTCGTGCG
配列番号587: 5'- CCACTAAGGCCGAAACCTTC
配列番号588: 5'- TAAGGCCGAAACCTTCGTGC
配列番号589: 5'- AGGCCGAAACCTTCGTGCGA
配列番号590: 5'- TCTGACTGTACAAACCGCCT
配列番号591: 5'- CATCTGACTGTACAAACCGC
配列番号592: 5'- ATCTGACTGTACAAACCGCC
配列番号593: 5'- CTTCGTGCGACTTGCATGTG
配列番号594: 5'- CCTTCGTGCGACTTGCATGT
配列番号595: 5'- CTCTCTAGAGTGCCCACCCA
配列番号596: 5'- TCTCTAGAGTGCCCACCCAA
配列番号597: 5'- ACGTATCAAATGCAGCTCCC
配列番号598: 5'- CGTATCAAATGCAGCTCCCA
配列番号599: 5'- CGCCACTAAGGCCGAAACCT
配列番号600: 5'- CCGAAACCTTCGTGCGACTT
配列番号601: 5'- GCCGAAACCTTCGTGCGACT
配列番号602: 5'- AACCTTCGTGCGACTTGCAT
配列番号603: 5'- CGAAACCTTCGTGCGACTTG
配列番号604: 5'- ACCTTCGTGCGACTTGCATG
配列番号605: 5'- GAAACCTTCGTGCGACTTGC
配列番号606: 5'- GGCCGAAACCTTCGTGCGAC
配列番号607: 5'- AAACCTTCGTGCGACTTGCA
配列番号608: 5'- CACGTATCAAATGCAGCTCC
配列番号５４７から配列番号６０８の配列は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属およびＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属の細菌の同時検出に特に適している。
配列番号609: 5'- GCTCACCGGCTTAAGGTCAA
配列番号610: 5'- CGCTCACCGGCTTAAGGTCA
配列番号611: 5'- TCGCTCACCGGCTTAAGGTC
配列番号612: 5'- CTCACCGGCTTAAGGTCAAA
配列番号613: 5'- CCCGACCGTGGTCGGCTGCG
配列番号614: 5'- GCTCACCGGCTTAAGGTCAA
配列番号615: 5'- CGCTCACCGGCTTAAGGTCA
配列番号616: 5'- TCGCTCACCGGCTTAAGGTC
配列番号617: 5'- CTCACCGGCTTAAGGTCAAA
配列番号618: 5'- CCCGACCGTGGTCGGCTGCG
配列番号619: 5'- TCACCGGCTTAAGGTCAAAC
配列番号620: 5'- CAACCCTCTCTCACACTCTA
配列番号621: 5'- ACAACCCTCTCTCACACTCT
配列番号622: 5'- CCACAACCCTCTCTCACACT
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配列番号725: 5'- CGGCTTAAGGTCAAACCAAC
配列番号726: 5'- CCGGCTTAAGGTCAAACCAA
配列番号727: 5'- CACCGGCTTAAGGTCAAACC
配列番号728: 5'- ACCGGCTTAAGGTCAAACCA
配列番号729: 5'- ACCCAACATCCAGCACACAT
配列番号730: 5'- TCGCTGACCCGACCGTGGTC
配列番号731: 5'- CGCTGACCCGACCGTGGTCG
配列番号732: 5'- GACCCGACCGTGGTCGGCTG
配列番号733: 5'- GCTGACCCGACCGTGGTCGG
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配列番号735: 5'- CAGGCGACTTGCGCCTTTGA
配列番号736: 5'- TCATGCGGTATTAGCTCCAG
配列番号737: 5'- ACTAGCTAATCGAACGCAGG
配列番号738: 5'- CATGCGGTATTAGCTCCAGT
配列番号739: 5'- CGCAGGCTCCTCCACAGGCG
配列番号740: 5'- ACGCAGGCTCCTCCACAGGC
配列番号741: 5'- CTCAGGTGTCATGCGGTATT
配列番号742: 5'- CGCCTTTGACCCTCAGGTGT
配列番号743: 5'- ACCCTCAGGTGTCATGCGGT
配列番号744: 5'- CCTCAGGTGTCATGCGGTAT
配列番号745: 5'- TTTGACCCTCAGGTGTCATG
配列番号746: 5'- GACCCTCAGGTGTCATGCGG
配列番号747: 5'- TGACCCTCAGGTGTCATGCG
配列番号748: 5'- GCCTTTGACCCTCAGGTGTC
配列番号749: 5'- TTGACCCTCAGGTGTCATGC
配列番号750: 5'- CCCTCAGGTGTCATGCGGTA
配列番号751: 5'- CCTTTGACCCTCAGGTGTCA
配列番号752: 5'- CTTTGACCCTCAGGTGTCAT
配列番号753: 5'- AGTTATCCCCCACCCATGGA
配列番号754: 5'- CCAGCTATCGATCATCGCCT
配列番号755: 5'- ACCAGCTATCGATCATCGCC
配列番号756: 5'- CAGCTATCGATCATCGCCTT
配列番号757: 5'- AGCTATCGATCATCGCCTTG
配列番号758: 5'- GCTATCGATCATCGCCTTGG
配列番号759: 5'- CTATCGATCATCGCCTTGGT
配列番号760: 5'- TTCGTGCGACTTGCATGTGT
配列番号761: 5'- TCGATCATCGCCTTGGTAGG
配列番号762: 5'- ATCGATCATCGCCTTGGTAG
配列番号763: 5'- CACAGGCGACTTGCGCCTTT
配列番号764: 5'- CCACAGGCGACTTGCGCCTT
配列番号765: 5'- TCCACAGGCGACTTGCGCCT
配列番号766: 5'- TCCTCCACAGGCGACTTGCG
配列番号767: 5'- CCTCCACAGGCGACTTGCGC
配列番号768: 5'- CTCCACAGGCGACTTGCGCC
配列番号769: 5'- ACAGGCGACTTGCGCCTTTG
配列番号770: 5'- TCACCGGCTTAAGGTCAAAC
配列番号771: 5'- CAACCCTCTCTCACACTCTA
配列番号772: 5'- ACAACCCTCTCTCACACTCT
配列番号773: 5'- CCACAACCCTCTCTCACACT
配列番号774: 5'- AACCCTCTCTCACACTCTAG
配列番号775: 5'- CACAACCCTCTCTCACACTC
配列番号776: 5'- TCCACAACCCTCTCTCACAC
配列番号777: 5'- TTCCACAACCCTCTCTCACA
配列番号778: 5'- ACCCTCTCTCACACTCTAGT
配列番号779: 5'- GAGCCAGGTTGCCGCCTTCG
配列番号780: 5'- AGGTCAAACCAACTCCCATG
配列番号781: 5'- ATGAGCCAGGTTGCCGCCTT
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配列番号790: 5'- TGACCCGACCGTGGTCGGCT
配列番号791: 5'- CCCTCTCTCACACTCTAGTC
配列番号792: 5'- GAATTCCACAACCCTCTCTC
配列番号793: 5'- AGCCAGGTTGCCGCCTTCGC
配列番号794: 5'- GCCAGGTTGCCGCCTTCGCC
配列番号795: 5'- GGAATTCCACAACCCTCTCT
配列番号796: 5'- GGGAATTCCACAACCCTCTC
配列番号797: 5'- AACGCAGGCTCCTCCACAGG
配列番号798: 5'- CGGCTTAAGGTCAAACCAAC
配列番号799: 5'- CCGGCTTAAGGTCAAACCAA
配列番号800: 5'- CACCGGCTTAAGGTCAAACC
配列番号801: 5'- ACCGGCTTAAGGTCAAACCA
配列番号802: 5'- ACCCAACATCCAGCACACAT
配列番号803: 5'- TCGCTGACCCGACCGTGGTC
配列番号804: 5'- CGCTGACCCGACCGTGGTCG
配列番号805: 5'- GACCCGACCGTGGTCGGCTG
配列番号806: 5'- GCTGACCCGACCGTGGTCGG
配列番号807: 5'- CTGACCCGACCGTGGTCGGC
配列番号808: 5'- CAGGCGACTTGCGCCTTTGA
配列番号809: 5'- TCATGCGGTATTAGCTCCAG
配列番号810: 5'- ACTAGCTAATCGAACGCAGG
配列番号811: 5'- CATGCGGTATTAGCTCCAGT
配列番号812: 5'- CGCAGGCTCCTCCACAGGCG
配列番号813: 5'- ACGCAGGCTCCTCCACAGGC
配列番号814: 5'- CTCAGGTGTCATGCGGTATT
配列番号815: 5'- CGCCTTTGACCCTCAGGTGT
配列番号816: 5'- ACCCTCAGGTGTCATGCGGT
配列番号817: 5'- CCTCAGGTGTCATGCGGTAT
配列番号818: 5'- TTTGACCCTCAGGTGTCATG
配列番号819: 5'- GACCCTCAGGTGTCATGCGG
配列番号820: 5'- TGACCCTCAGGTGTCATGCG
配列番号821: 5'- GCCTTTGACCCTCAGGTGTC
配列番号822: 5'- TTGACCCTCAGGTGTCATGC
配列番号823: 5'- CCCTCAGGTGTCATGCGGTA
配列番号824: 5'- CCTTTGACCCTCAGGTGTCA
配列番号825: 5'- CTTTGACCCTCAGGTGTCAT
配列番号826: 5'- AGTTATCCCCCACCCATGGA
配列番号827: 5'- CCAGCTATCGATCATCGCCT
配列番号828: 5'- ACCAGCTATCGATCATCGCC
配列番号829: 5'- CAGCTATCGATCATCGCCTT
配列番号830: 5'- AGCTATCGATCATCGCCTTG
配列番号831: 5'- GCTATCGATCATCGCCTTGG
配列番号832: 5'- CTATCGATCATCGCCTTGGT
配列番号833: 5'- TTCGTGCGACTTGCATGTGT
配列番号834: 5'- TCGATCATCGCCTTGGTAGG
配列番号835: 5'- ATCGATCATCGCCTTGGTAG
配列番号836: 5'- CACAGGCGACTTGCGCCTTT
配列番号837: 5'- CCACAGGCGACTTGCGCCTT
配列番号838: 5'- TCCACAGGCGACTTGCGCCT
配列番号839: 5'- TCCTCCACAGGCGACTTGCG
配列番号840: 5'- CCTCCACAGGCGACTTGCGC
配列番号841: 5'- CTCCACAGGCGACTTGCGCC
配列番号842: 5'- ACAGGCGACTTGCGCCTTTG
配列番号６０９から配列番号８４２の配列は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属およびＧｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の細菌の同時検出に特に適している。
ｅ）飲料腐敗性バチルスを特異的に検出する核酸プローブ分子：
配列番号843: 5'- AGCCCCGGTTTCCCGGCGTT
配列番号844: 5'- CGCCTTTCCTTTTTCCTCCA
配列番号845: 5'- GCCCCGGTTTCCCGGCGTTA
配列番号846: 5'- GCCGCCTTTCCTTTTTCCTC
配列番号847: 5'- TAGCCCCGGTTTCCCGGCGT
配列番号848: 5'- CCGGGTACCGTCAAGGCGCC
配列番号849: 5'- AAGCCGCCTTTCCTTTTTCC
配列番号850: 5'- CCCCGGTTTCCCGGCGTTAT
配列番号851: 5'- CCGGCGTTATCCCAGTCTTA
配列番号852: 5'- AGCCGCCTTTCCTTTTTCCT
配列番号853: 5'- CCGCCTTTCCTTTTTCCTCC
配列番号854: 5'- TTAGCCCCGGTTTCCCGGCG
配列番号855: 5'- CCCGGCGTTATCCCAGTCTT
配列番号856: 5'- GCCGGGTACCGTCAAGGCGC
配列番号857: 5'- GGCCGGGTACCGTCAAGGCG
配列番号858: 5'- TCCCGGCGTTATCCCAGTCT
配列番号859: 5'- TGGCCGGGTACCGTCAAGGC
配列番号860: 5'- GAAGCCGCCTTTCCTTTTTC
配列番号861: 5'- CCCGGTTTCCCGGCGTTATC
配列番号862: 5'- CGGCGTTATCCCAGTCTTAC
配列番号863: 5'- GGCGTTATCCCAGTCTTACA
配列番号864: 5'- GCGTTATCCCAGTCTTACAG
配列番号865: 5'- CGGGTACCGTCAAGGCGCCG
配列番号866: 5'- ATTAGCCCCGGTTTCCCGGC
配列番号867: 5'- AAGGGGAAGGCCCTGTCTCC
配列番号868: 5'- GGCCCTGTCTCCAGGGAGGT
配列番号869: 5'- AGGCCCTGTCTCCAGGGAGG
配列番号870: 5'- AAGGCCCTGTCTCCAGGGAG
配列番号871: 5'- GCCCTGTCTCCAGGGAGGTC
配列番号872: 5'- CGTTATCCCAGTCTTACAGG
配列番号873: 5'- GGGTACCGTCAAGGCGCCGC
配列番号874: 5'- CGGCAACAGAGTTTTACGAC
配列番号875: 5'- GGGGAAGGCCCTGTCTCCAG
配列番号876: 5'- AGGGGAAGGCCCTGTCTCCA
配列番号877: 5'- GCAGCCGAAGCCGCCTTTCC
配列番号878: 5'- TTCTTCCCCGGCAACAGAGT
配列番号879: 5'- CGGCACTTGTTCTTCCCCGG
配列番号880: 5'- GTTCTTCCCCGGCAACAGAG
配列番号881: 5'- GGCACTTGTTCTTCCCCGGC
配列番号882: 5'- GCACTTGTTCTTCCCCGGCA
配列番号883: 5'- CACTTGTTCTTCCCCGGCAA
配列番号884: 5'- TCTTCCCCGGCAACAGAGTT
配列番号885: 5'- TTGTTCTTCCCCGGCAACAG
配列番号886: 5'- ACTTGTTCTTCCCCGGCAAC
配列番号887: 5'- TGTTCTTCCCCGGCAACAGA
配列番号888: 5'- CTTGTTCTTCCCCGGCAACA
配列番号889: 5'- ACGGCACTTGTTCTTCCCCG
配列番号890: 5'- GTCCGCCGCTAACCTTTTAA
配列番号891: 5'- CTGGCCGGGTACCGTCAAGG
配列番号892: 5'- TCTGGCCGGGTACCGTCAAG
配列番号893: 5'- TTCTGGCCGGGTACCGTCAA
配列番号894: 5'- CAATGCTGGCAACTAAGGTC
配列番号895: 5'- CGTCCGCCGCTAACCTTTTA
配列番号896: 5'- CGAAGCCGCCTTTCCTTTTT
配列番号897: 5'- CCGAAGCCGCCTTTCCTTTT
配列番号898: 5'- GCCGAAGCCGCCTTTCCTTT
配列番号899: 5'- AGCCGAAGCCGCCTTTCCTT
配列番号900: 5'- ACCGTCAAGGCGCCGCCCTG
配列番号901: 5'- CCGTGGCTTTCTGGCCGGGT
配列番号902: 5'- GCTTTCTGGCCGGGTACCGT
配列番号903: 5'- GCCGTGGCTTTCTGGCCGGG
配列番号904: 5'- GGCTTTCTGGCCGGGTACCG
配列番号905: 5'- CTTTCTGGCCGGGTACCGTC
配列番号906: 5'- TGGCTTTCTGGCCGGGTACC
配列番号907: 5'- GTGGCTTTCTGGCCGGGTAC
配列番号908: 5'- CGTGGCTTTCTGGCCGGGTA
配列番号909: 5'- TTTCTGGCCGGGTACCGTCA
配列番号910: 5'- GGGAAGGCCCTGTCTCCAGG
配列番号911: 5'- CGAAGGGGAAGGCCCTGTCT
配列番号912: 5'- CCGAAGGGGAAGGCCCTGTC
配列番号913: 5'- GAAGGGGAAGGCCCTGTCTC
配列番号914: 5'- GGCGCCGCCCTGTTCGAACG
配列番号915: 5'- AGGCGCCGCCCTGTTCGAAC
配列番号916: 5'- AAGGCGCCGCCCTGTTCGAA
配列番号917: 5'- CCCGGCAACAGAGTTTTACG
配列番号918: 5'- CCCCGGCAACAGAGTTTTAC
配列番号919: 5'- CCATCTGTAAGTGGCAGCCG
配列番号920: 5'- TCTGTAAGTGGCAGCCGAAG
配列番号921: 5'- CTGTAAGTGGCAGCCGAAGC
配列番号922: 5'- CCCATCTGTAAGTGGCAGCC
配列番号923: 5'- TGTAAGTGGCAGCCGAAGCC
配列番号924: 5'- CATCTGTAAGTGGCAGCCGA
配列番号925: 5'- ATCTGTAAGTGGCAGCCGAA
配列番号926: 5'- CAGCCGAAGCCGCCTTTCCT
配列番号927: 5'- GGCAACAGAGTTTTACGACC
配列番号928: 5'- CCGGCAACAGAGTTTTACGA
配列番号929: 5'- TTCCCCGGCAACAGAGTTTT
配列番号930: 5'- CTTCCCCGGCAACAGAGTTT
配列番号931: 5'- TCCCCGGCAACAGAGTTTTA
配列番号932: 5'- CCGTCCGCCGCTAACCTTTT
配列番号８４３から配列番号９３２の配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓの検出に特に適している。
ｆ）飲料腐敗性アリシクロバチルスを特異的に検出する核酸プローブ分子：
配列番号933: 5'- CTTCCTCCGACTTACGCCGG
配列番号934: 5'- CCTCCGACTTACGCCGGCAG
配列番号935: 5'- TTCCTCCGACTTACGCCGGC
配列番号936: 5'- TCCTCCGACTTACGCCGGCA
配列番号937: 5'- TCCGACTTACGCCGGCAGTC
配列番号938: 5'- CCGACTTACGCCGGCAGTCA
配列番号939: 5'- GCCTTCCTCCGACTTACGCC
配列番号940: 5'- CCTTCCTCCGACTTACGCCG
配列番号941: 5'- GCTCTCCCCGAGCAACAGAG
配列番号942: 5'- CTCTCCCCGAGCAACAGAGC
配列番号943: 5'- CGCTCTCCCCGAGCAACAGA
配列番号944: 5'- CTCCGACTTACGCCGGCAGT
配列番号945: 5'- TCTCCCCGAGCAACAGAGCT
配列番号946: 5'- CGACTTACGCCGGCAGTCAC
配列番号947: 5'- TCGGCACTGGGGTGTGTCCC
配列番号948: 5'- GGCACTGGGGTGTGTCCCCC
配列番号949: 5'- CTGGGGTGTGTCCCCCCAAC
配列番号950: 5'- CACTGGGGTGTGTCCCCCCA
配列番号951: 5'- ACTGGGGTGTGTCCCCCCAA
配列番号952: 5'- GCACTGGGGTGTGTCCCCCC
配列番号953: 5'- TGGGGTGTGTCCCCCCAACA
配列番号954: 5'- CACTCCAGACTTGCTCGACC
配列番号955: 5'- TCACTCCAGACTTGCTCGAC
配列番号956: 5'- CGGCACTGGGGTGTGTCCCC
配列番号957: 5'- CGCCTTCCTCCGACTTACGC
配列番号958: 5'- CTCCCCGAGCAACAGAGCTT
配列番号959: 5'- ACTCCAGACTTGCTCGACCG
配列番号960: 5'- CCCATGCCGCTCTCCCCGAG
配列番号961: 5'- CCATGCCGCTCTCCCCGAGC
配列番号962: 5'- CCCCATGCCGCTCTCCCCGA
配列番号963: 5'- TCACTCGGTACCGTCTCGCA
配列番号964: 5'- CATGCCGCTCTCCCCGAGCA
配列番号965: 5'- ATGCCGCTCTCCCCGAGCAA
配列番号966: 5'- TTCGGCACTGGGGTGTGTCC
配列番号967: 5'- TGCCGCTCTCCCCGAGCAAC
配列番号968: 5'- TTCACTCCAGACTTGCTCGA
配列番号969: 5'- CCCGCAAGAAGATGCCTCCT
配列番号970: 5'- AGAAGATGCCTCCTCGCGGG
配列番号971: 5'- AAGAAGATGCCTCCTCGCGG
配列番号972: 5'- CGCAAGAAGATGCCTCCTCG
配列番号973: 5'- AAGATGCCTCCTCGCGGGCG
配列番号974: 5'- CCGCAAGAAGATGCCTCCTC
配列番号975: 5'- GAAGATGCCTCCTCGCGGGC
配列番号976: 5'- CCCCGCAAGAAGATGCCTCC
配列番号977: 5'- CAAGAAGATGCCTCCTCGCG
配列番号978: 5'- TCCTTCGGCACTGGGGTGTG
配列番号979: 5'- CCGCTCTCCCCGAGCAACAG
配列番号980: 5'- TGCCTCCTCGCGGGCGTATC
配列番号981: 5'- GACTTACGCCGGCAGTCACC
配列番号982: 5'- GGCTCCTCTCTCAGCGGCCC
配列番号983: 5'- CCTTCGGCACTGGGGTGTGT
配列番号984: 5'- GGGGTGTGTCCCCCCAACAC
配列番号985: 5'- GCCGCTCTCCCCGAGCAACA
配列番号986: 5'- AGATGCCTCCTCGCGGGCGT
配列番号987: 5'- CACTCGGTACCGTCTCGCAT
配列番号988: 5'- CTCACTCGGTACCGTCTCGC
配列番号989: 5'- GCAAGAAGATGCCTCCTCGC
配列番号990: 5'- CTCCAGACTTGCTCGACCGC
配列番号991: 5'- TTACGCCGGCAGTCACCTGT
配列番号992: 5'- CTTCGGCACTGGGGTGTGTC
配列番号993: 5'- CTCGCGGGCGTATCCGGCAT
配列番号994: 5'- GCCTCCTCGCGGGCGTATCC
配列番号995: 5'- ACTCGGTACCGTCTCGCATG
配列番号996: 5'- GATGCCTCCTCGCGGGCGTA
配列番号997: 5'- GGGTGTGTCCCCCCAACACC
配列番号998: 5'- ACTTACGCCGGCAGTCACCT
配列番号999: 5'- CTTACGCCGGCAGTCACCTG
配列番号1000: 5'- ATGCCTCCTCGCGGGCGTAT
配列番号1001: 5'- GCGCCGCGGGCTCCTCTCTC
配列番号1002: 5'- GGTGTGTCCCCCCAACACCT
配列番号1003: 5'- GTGTGTCCCCCCAACACCTA
配列番号1004: 5'- CCTCGCGGGCGTATCCGGCA
配列番号1005: 5'- CCTCACTCGGTACCGTCTCG
配列番号1006: 5'- TCCTCACTCGGTACCGTCTC
配列番号1007: 5'- TCGCGGGCGTATCCGGCATT
配列番号1008: 5'- TTTCACTCCAGACTTGCTCG
配列番号1009: 5'- TACGCCGGCAGTCACCTGTG
配列番号1010: 5'- TCCAGACTTGCTCGACCGCC
配列番号1011: 5'- CTCGGTACCGTCTCGCATGG
配列番号1012: 5'- CGCGGGCGTATCCGGCATTA
配列番号1013: 5'- GCGTATCCGGCATTAGCGCC
配列番号1014: 5'- GGGCTCCTCTCTCAGCGGCC
配列番号1015: 5'- TCCCCGAGCAACAGAGCTTT
配列番号1016: 5'- CCCCGAGCAACAGAGCTTTA
配列番号1017: 5'- CCGAGCAACAGAGCTTTACA
配列番号1018: 5'- CCATCCCATGGTTGAGCCAT
配列番号1019: 5'- GTGTCCCCCCAACACCTAGC
配列番号1020: 5'- GCGGGCGTATCCGGCATTAG
配列番号1021: 5'- CGAGCGGCTTTTTGGGTTTC
配列番号1022: 5'- CTTTCACTCCAGACTTGCTC
配列番号1023: 5'- TTCCTTCGGCACTGGGGTGT
配列番号1024: 5'- CCGCCTTCCTCCGACTTACG
配列番号1025: 5'- CCCGCCTTCCTCCGACTTAC
配列番号1026: 5'- CCTCCTCGCGGGCGTATCCG
配列番号1027: 5'- TCCTCGCGGGCGTATCCGGC
配列番号1028: 5'- CATTAGCGCCCGTTTCCGGG
配列番号1029: 5'- GCATTAGCGCCCGTTTCCGG
配列番号1030: 5'- GGCATTAGCGCCCGTTTCCG
配列番号1031: 5'- GTCTCGCATGGGGCTTTCCA
配列番号1032: 5'- GCCATGGACTTTCACTCCAG
配列番号1033: 5'- CATGGACTTTCACTCCAGAC
配列番号９３３から配列番号１０３３の配列は、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の細菌の検出に特に適している。
配列番号1034: 5'- CCTTCCTCCGGCTTACGCCGGC
配列番号1035: 5'- CCTTCCTCCGACTTGCGCCGGC
配列番号1036: 5'- CCTTCCTCCGACTTTCACCGGC
配列番号１０３４から配列番号１０３６に記載の核酸プローブ分子は、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の細菌を検出するための非標識の競合プローブとして、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の細菌に特異的な標識したオリゴヌクレオチドプローブとＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の細菌に特異的でない核酸配列との結合を妨げるために、配列番号９３３に記載のオリゴヌクレオチドプローブと組み合わせて用いる。
配列番号1037: 5'- ACCGTCTCACAAGGAGCTTT
配列番号1038: 5'- TACCGTCTCACAAGGAGCTT
配列番号1039: 5'- GTACCGTCTCACAAGGAGCT
配列番号1040: 5'- GCCTACCCGTGTATTATCCG
配列番号1041: 5'- CCGTCTCACAAGGAGCTTTC
配列番号1042: 5'- CTACCCGTGTATTATCCGGC
配列番号1043: 5'- GGTACCGTCTCACAAGGAGC
配列番号1044: 5'- CGTCTCACAAGGAGCTTTCC
配列番号1045: 5'- TCTCACAAGGAGCTTTCCAC
配列番号1046: 5'- TACCCGTGTATTATCCGGCA
配列番号1047: 5'- GTCTCACAAGGAGCTTTCCA
配列番号1048: 5'- ACCCGTGTATTATCCGGCAT
配列番号1049: 5'- CTCGGTACCGTCTCACAAGG
配列番号1050: 5'- CGGTACCGTCTCACAAGGAG
配列番号1051: 5'- ACTCGGTACCGTCTCACAAG
配列番号1052: 5'- CGGCTGGCTCCATAACGGTT
配列番号1053: 5'- ACAAGTAGATGCCTACCCGT
配列番号1054: 5'- TGGCTCCATAACGGTTACCT
配列番号1055: 5'- CAAGTAGATGCCTACCCGTG
配列番号1056: 5'- CACAAGTAGATGCCTACCCG
配列番号1057: 5'- GGCTCCATAACGGTTACCTC
配列番号1058: 5'- ACACAAGTAGATGCCTACCC
配列番号1059: 5'- CTGGCTCCATAACGGTTACC
配列番号1060: 5'- GCTGGCTCCATAACGGTTAC
配列番号1061: 5'- GGCTGGCTCCATAACGGTTA
配列番号1062: 5'- GCTCCATAACGGTTACCTCA
配列番号1063: 5'- AAGTAGATGCCTACCCGTGT
配列番号1064: 5'- CTCCATAACGGTTACCTCAC
配列番号1065: 5'- TGCCTACCCGTGTATTATCC
配列番号1066: 5'- TCGGTACCGTCTCACAAGGA
配列番号1067: 5'- CTCACAAGGAGCTTTCCACT
配列番号1068: 5'- GTAGATGCCTACCCGTGTAT
配列番号1069: 5'- CCTACCCGTGTATTATCCGG
配列番号1070: 5'- CACTCGGTACCGTCTCACAA
配列番号1071: 5'- CTCAGCGATGCAGTTGCATC
配列番号1072: 5'- AGTAGATGCCTACCCGTGTA
配列番号1073: 5'- GCGGCTGGCTCCATAACGGT
配列番号1074: 5'- CCAAAGCAATCCCAAGGTTG
配列番号1075: 5'- TCCATAACGGTTACCTCACC
配列番号1076: 5'- CCCGTGTATTATCCGGCATT
配列番号1077: 5'- TCTCAGCGATGCAGTTGCAT
配列番号1078: 5'- CCATAACGGTTACCTCACCG
配列番号1079: 5'- TCAGCGATGCAGTTGCATCT
配列番号1080: 5'- GGCGGCTGGCTCCATAACGG
配列番号1081: 5'- AAGCAATCCCAAGGTTGAGC
配列番号1082: 5'- TCACTCGGTACCGTCTCACA
配列番号1083: 5'- CCGAGTGTTATTCCAGTCTG
配列番号1084: 5'- CACAAGGAGCTTTCCACTCT
配列番号1085: 5'- ACAAGGAGCTTTCCACTCTC
配列番号1086: 5'- TCACAAGGAGCTTTCCACTC
配列番号1087: 5'- CAGCGATGCAGTTGCATCTT
配列番号1088: 5'- CAAGGAGCTTTCCACTCTCC
配列番号1089: 5'- CCAGTCTGAAAGGCAGATTG
配列番号1090: 5'- CAGTCTGAAAGGCAGATTGC
配列番号1091: 5'- CGGCGGCTGGCTCCATAACG
配列番号1092: 5'- CCTCTCTCAGCGATGCAGTT
配列番号1093: 5'- CTCTCTCAGCGATGCAGTTG
配列番号1094: 5'- TCTCTCAGCGATGCAGTTGC
配列番号1095: 5'- CTCTCAGCGATGCAGTTGCA
配列番号1096: 5'- CAATCCCAAGGTTGAGCCTT
配列番号1097: 5'- AATCCCAAGGTTGAGCCTTG
配列番号1098: 5'- AGCAATCCCAAGGTTGAGCC
配列番号1099: 5'- CTCACTCGGTACCGTCTCAC
配列番号1100: 5'- GCAATCCCAAGGTTGAGCCT
配列番号1101: 5'- GCCTTGGACTTTCACTTCAG
配列番号1102: 5'- CATAACGGTTACCTCACCGA
配列番号1103: 5'- CTCCTCTCTCAGCGATGCAG
配列番号1104: 5'- TCGGCGGCTGGCTCCATAAC
配列番号1105: 5'- AGTCTGAAAGGCAGATTGCC
配列番号1106: 5'- TCCTCTCTCAGCGATGCAGT
配列番号1107: 5'- CCCAAGGTTGAGCCTTGGAC
配列番号1108: 5'- ATAACGGTTACCTCACCGAC
配列番号1109: 5'- TCCCAAGGTTGAGCCTTGGA
配列番号1110: 5'- ATTATCCGGCATTAGCACCC
配列番号1111: 5'- CTACGTGCTGGTAACACAGA
配列番号1112: 5'- GCCGCTAGCCCCGAAGGGCT
配列番号1113: 5'- CTAGCCCCGAAGGGCTCGCT
配列番号1114: 5'- CGCTAGCCCCGAAGGGCTCG
配列番号1115: 5'- AGCCCCGAAGGGCTCGCTCG
配列番号1116: 5'- CCGCTAGCCCCGAAGGGCTC
配列番号1117: 5'- TAGCCCCGAAGGGCTCGCTC
配列番号1118: 5'- GCTAGCCCCGAAGGGCTCGC
配列番号1119: 5'- GCCCCGAAGGGCTCGCTCGA
配列番号1120: 5'- ATCCCAAGGTTGAGCCTTGG
配列番号1121: 5'- GAGCCTTGGACTTTCACTTC
配列番号1122: 5'- CAAGGTTGAGCCTTGGACTT
配列番号1123: 5'- GAGCTTTCCACTCTCCTTGT
配列番号1124: 5'- CCAAGGTTGAGCCTTGGACT
配列番号1125: 5'- CGGGCTCCTCTCTCAGCGAT
配列番号1126: 5'- GGAGCTTTCCACTCTCCTTG
配列番号1127: 5'- GGGCTCCTCTCTCAGCGATG
配列番号1128: 5'- TCTCCTTGTCGCTCTCCCCG
配列番号1129: 5'- TCCTTGTCGCTCTCCCCGAG
配列番号1130: 5'- AGCTTTCCACTCTCCTTGTC
配列番号1131: 5'- CCACTCTCCTTGTCGCTCTC
配列番号1132: 5'- GGCTCCTCTCTCAGCGATGC
配列番号1133: 5'- CCTTGTCGCTCTCCCCGAGC
配列番号1134: 5'- CACTCTCCTTGTCGCTCTCC
配列番号1135: 5'- ACTCTCCTTGTCGCTCTCCC
配列番号1136: 5'- CTCTCCTTGTCGCTCTCCCC
配列番号1137: 5'- GCGGGCTCCTCTCTCAGCGA
配列番号1138: 5'- GGCTCCATCATGGTTACCTC
配列番号１０３７から配列番号１１３８の配列は、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓの検出に特に適している。
配列番号1139: 5'- CCGTCTCCTAAGGAGCTTTCCA
配列番号１１３９に記載の核酸プローブ分子は、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓを検出するための非標識の競合プローブとして、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓに特異的な標識したオリゴヌクレオチドプローブとＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓに特異的でない核酸配列との結合を妨げるために、配列番号１０４４に記載のオリゴヌクレオチドプローブと組み合わせて用いる。
配列番号1140: 5'- TCCCTCCTTAACGGTTACCTCA
配列番号1141: 5'- TGGCTCCATAA(A/T)GGTTACCTCA
配列番号１１４０から配列番号１１４１に記載の核酸プローブ分子は、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓを検出するための非標識の競合プローブとして、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓに特異的な標識したオリゴヌクレオチドプローブとＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓに特異的でない核酸配列との結合を妨げるために、配列番号１０５７に記載のオリゴヌクレオチドプローブと組み合わせて用いる。
配列番号1142: 5'- CTTCCTCCGGCTTGCGCCGG
配列番号1143: 5'- CGCTCTTCCCGA(G/T)TGACTGA
配列番号1144: 5'- CCTCGGGCTCCTCCATC(A/T)GC
配列番号１１４２から配列番号１１４４の配列は、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓおよびＡ．ｈｅｒｂａｒｉｕｓの同時検出に特に適している。
本発明のさらなる目的は、配列および／または長さのずれにもかかわらずそれぞれの微生物の標的核酸配列に対して特異的ハイブリダイゼーションを示し、その結果本発明による方法での使用に適しており、かつそれぞれの微生物の特異的検出を確実にする、上記オリゴヌクレオチド配列の誘導体である。このような誘導体には特に以下のものが含まれる：
ａ）（ｉ）塩基に関して、上記オリゴヌクレオチド配列（配列番号１、５から１４６、１４８から１５４、１５７から１６０、１６３から１０３３、１０３７から１１３８、１１４２から１１４４）のうち１つに少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９２％、９４％、９６％同一である核酸分子、あるいは（ｉｉ）１つもしくは複数の欠失および／または付加によって上記オリゴヌクレオチド配列と異なり、かつＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｄｅｋｋｅｒａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ属の飲料腐敗性酵母、具体的には種Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ、Ｚ．ｍｅｌｌｉｓ、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ、Ｚ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｚ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｚ．ｍｉｃｒｏｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ ｕｖａｒｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｃ．ｃｒｕｓｅｉ（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｎａａｒｄｅｎｅｎｓｉｓ、Ｄｅｋｋｅｒａ ａｎｏｍａｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐ．ｍｉｎｕｔａ、Ｐ．ａｎｏｍａｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｘｉｇｕｕｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ ｌｕｄｗｉｇｉｉまたはＭｕｃｏｒ属、Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ属、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属およびＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属の飲料腐敗性カビ、具体的には種Ｍｕｃｏｒ ｒａｃｅｍｏｓｕｓ、Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ ｎｉｖｅａ、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓおよびＡ．ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔ．ｂａｃｉｌｌｉｓｐｏｒｕｓならびにＴ．ｆｌａｖｕｓまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属およびＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の飲料腐敗性細菌、具体的には種Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌ．ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｅｎｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ａ．ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ａ．ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓおよびＡ．ｈｅｒｂａｒｉｕｓの核酸配列との特異的ハイブリダイゼーション可能にする核酸分子。このような文脈において、「特異的ハイブリダイゼーション」とは、本明細書中に記載した、またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術に関して当業者に知られているハイブリダイゼーション条件下では、標的生物のリボソームＲＮＡのみがオリゴヌクレオチドに結合し、標的でない微生物のｒＲＮＡは結合しないことを意味する。
ｂ）ストリンジェントな条件下で、ａ）に記載した核酸分子または配列番号１、５から１４６、１４８から１５４、１５７から１６０、１６３から１０３３、１０３７から１１３８、１１４２から１１４４のプローブのうち１つに相補的な配列に特異的にハイブリダイズする核酸分子。
ｃ）配列番号１、５から１４６、１４８から１５４、１５７から１６０、１６３から１０３３、１０３７から１１３８、１１４２から１１４４のオリゴヌクレオチド配列、またはａ）もしくはｂ）に記載の核酸分子の配列を含み、かつそれぞれａ）もしくはｂ）に記載した配列およびその誘導体に加えて少なくとも１つのさらなるヌクレオチドを有し、標的生物の核酸配列との特異的ハイブリダイゼーションを可能にする核酸分子。
また、本発明のさらなる目的は、配列および／または長さのばらつきにもかかわらずそれぞれの標的でない属および種の標的核酸配列のそれぞれに対して特異的ハイブリダイゼーションを示し、その結果オリゴヌクレオチドプローブとそれぞれ上記属および種の核酸配列と結合を妨げて検出されないようにする、上記競合プローブ配列の誘導体である。これらは、本発明による方法での使用に適しており、かつそれぞれの微生物の特異的検出を確実にする。このような誘導体には特に以下のものが含まれる。
ａ）（ｉ）塩基に関して、上記オリゴヌクレオチド配列（配列番号２から４、１４７、１５５から１５６、１６１から１６２、１０３４から１０３６、１１３９から１１４１）のうち１つに少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９２％、９４％、９６％同一である核酸分子、あるいは（ｉｉ）１つもしくは複数の欠失および／または付加によって上記オリゴヌクレオチド配列と異なり、かつ特異的オリゴヌクレオチドプローブと検出されるべきでない微生物の核酸配列との特異的ハイブリダイゼーションを阻害する核酸分子。
ｂ）ａ）に記載した核酸分子または配列番号２から４、１４７、１５５から１５６、１６１から１６２、１０３４から１０３６、１１３９から１１４１のプローブの１つに相補的な配列に、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする核酸分子。
ｃ）配列番号２から４、１４７、１５５から１５６、１６１から１６２、１０３４から１０３６、１１３９から１１４１のオリゴヌクレオチド配列、またはａ）もしくはｂ）に記載の核酸分子の配列を含み、かつそれぞれａ）またはｂ）に記載した配列およびその誘導体に加えて少なくとも１つのさらなるヌクレオチドを有し、特異的オリゴヌクレオチドプローブと標的でない微生物の核酸配列との結合を妨げる核酸分子。
核酸プローブ分子と配列番号１から配列番号１１４４を有するオリゴヌクレオチドプローブとの配列同一性の度合いは、通常のアルゴリズムを用いて決定することができる。このことに関しては、たとえばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ（このページ中、たとえば「標準のヌクレオチド−ヌクレオチドＢＬＡＳＴ（Ｓｔａｎｄａｒｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＬＡＳＴ）［ｂｌａｓｔｎ］」のリンク）の下で利用可能な配列同一性の決定プログラムが適している。
本発明では、「ハイブリダイゼーション」は「相補的」と同じ意味を持つことができる。本発明はまた、配列番号１から配列番号１１４４の本発明の誘導体を含めた、本発明のオリゴヌクレオチドのうち１つの（理論上の）アンチセンス鎖にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドも含む。
用語「ストリンジェントな条件」とは、一般に、その下では核酸配列がその標的配列に優先的にハイブリダイズし、明らかにより少ない程度で他の配列にハイブリダイズする、またはまったくハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は部分的に配列依存性であり、異なる状況下で変化する。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、確定したイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度における特異的配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低い温度であるように選択される。Ｔｍとは、（確定したイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）標的配列に相補的なプローブ分子の５０％が定常状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。
本発明の核酸プローブ分子は、検出方法中で様々なハイブリダイゼーション溶液と共に用い得る。様々な有機溶媒を０〜８０％の濃度で用い得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を保つことによって、核酸プローブ分子が実際に標的配列にハイブリダイズすることが保証される。本発明の意味において中程度の条件とは、下述のように、たとえばハイブリダイゼーション緩衝液中０％のホルムアミドである。本発明の意味においてストリンジェントな条件とは、たとえばハイブリダイゼーション緩衝液中２０％〜８０％のホルムアミドである。
本発明による方法では、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｄｅｋｋｅｒａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ属の酵母、具体的には種Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ、Ｚ．ｍｅｌｌｉｓ、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ、Ｚ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｚ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｚ．ｍｉｃｒｏｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ ｕｖａｒｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｃ．ｃｒｕｓｅｉ（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｎａａｒｄｅｎｅｎｓｉｓ、Ｄｅｋｋｅｒａ ａｎｏｍａｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐ．ｍｉｎｕｔａ、Ｐ．ａｎｏｍａｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｘｉｇｕｕｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ ｌｕｄｗｉｇｉｉの特異的検出には、標準的なハイブリダイゼーション溶液は０％〜８０％のホルムアミド、好ましくは２０％〜６０％のホルムアミド、特に好ましくは４０％のホルムアミドを含む。さらに、これは０．１ｍｏｌ／ｌ〜１．５ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．７ｍｏｌ／ｌ〜１．０ｍｏｌ／ｌ、特に好ましくは０．９ｍｏｌ／ｌの塩濃度を有し、塩は好ましくは塩化ナトリウムである。また、ハイブリダイゼーション溶液は通常、たとえばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの洗剤を、０．００１％〜０．２％の濃度で、好ましくは０．００５％〜０．０５％の濃度で、特に好ましくは０．０１％の濃度で含む。ハイブリダイゼーション溶液の緩衝を行うためには、トリス−ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳなどの様々な化合物を用いてよく、これは通常０．０１〜０．１ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０１〜０．０５ｍｏｌ／ｌの濃度、６．０〜９．０、好ましくは７．０〜８．０のｐＨ範囲で用いる。本発明によるハイブリダイゼーション溶液の特に好ましい実施形態は、０．０２ｍｏｌ／ｌのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含む。
本発明による方法では、Ｍｕｃｏｒ属、Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ属、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属およびＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属のカビ、具体的には種Ｍｕｃｏｒ ｒａｃｅｍｏｓｕｓ、Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ ｎｉｖｅａ、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓおよびＡ．ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔ．ｂａｃｉｌｌｉｓｐｏｒｕｓならびにＴ．ｆｌａｖｕｓの特異的検出には、標準的なハイブリダイゼーション溶液は０％〜８０％のホルムアミド、好ましくは１０％〜６０％のホルムアミド、特に好ましくは２０％のホルムアミドを含む。さらに、これは０．１ｍｏｌ／ｌ〜１．５ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．７ｍｏｌ／ｌ〜１．０ｍｏｌ／ｌ、特に好ましくは０．９ｍｏｌ／ｌの塩濃度を有し、塩は好ましくは塩化ナトリウムである。また、ハイブリダイゼーション溶液は通常、たとえばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの洗剤を、０．００１％〜０．２％の濃度で、好ましくは０．００５〜０．０５％の濃度で、特に好ましくは０．０１％の濃度で含む。ハイブリダイゼーション溶液の緩衝を行うためには、トリス−ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳなどの様々な化合物を用いてよく、これは通常０．０１〜０．１ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０１〜０．０５ｍｏｌ／ｌの濃度、６．０〜９．０、好ましくは７．０〜８．０のｐＨ範囲で用いる。本発明によるハイブリダイゼーション溶液の特に好ましい実施形態は、０．０２ｍｏｌ／ｌのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含む。
本発明による方法では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属およびＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の細菌、具体的には種Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌ．ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｅｎｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ａ．ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ａ．ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓおよびＡ．ｈｅｒｂａｒｉｕｓの特異的検出には、標準的なハイブリダイゼーション溶液は０％〜８０％のホルムアミド、好ましくは１０％〜６０％のホルムアミド、特に好ましくは２０％のホルムアミドを含む。さらに、これは０．１ｍｏｌ／ｌ〜１．５ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．７ｍｏｌ／ｌ〜１．０ｍｏｌ／ｌ、特に好ましくは０．９ｍｏｌ／ｌの塩濃度を有し、塩は好ましくは塩化ナトリウムである。また、ハイブリダイゼーション溶液は通常、たとえばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの洗剤を、０．００１％〜０．２％の濃度で、好ましくは０．００５％〜０．０５％の濃度で、特に好ましくは０．０１％の濃度で含む。ハイブリダイゼーション溶液の緩衝を行うためには、トリス−ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳなどの様々な化合物を用いてよく、これは通常０．０１〜０．１ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０１〜０．０５ｍｏｌ／ｌの濃度、６．０〜９．０、好ましくは７．０〜８．０のｐＨ範囲で用いる。本発明によるハイブリダイゼーション溶液の特に好ましい実施形態は、０．０２ｍｏｌ／ｌのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含む。
当業者はハイブリダイゼーション反応の所望するストリンジェンシーが得られるように、ハイブリダイゼーション緩衝液の構成成分の特定の濃度を選択することができることを理解されよう。特に好ましい実施形態は、ストリンジェントから特にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に関連している。これらのストリンジェントな条件を用いて、当業者は特定の核酸分子により標的生物の核酸配列の特異的検出が可能となるかどうか、およびその結果それを本発明中で信頼して用い得るかどうかを決定することができる。
ハイブリダイゼーション緩衝液中の核酸プローブの濃度は、標識の種類および標的構造の数に依存する。迅速かつ効率的なハイブリダイゼーションを可能にするためには、核酸プローブ分子の数は標的構造の数を数桁上回るべきである。しかし、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）では、蛍光標識した核酸プローブ分子のレベルが高すぎるとバックグラウンド蛍光の増加が生じることを考慮しなければならない。したがって、核酸プローブ分子の濃度は０．５〜５００ｎｇ／μｌの範囲であるべきである。本発明の方法中では、好ましい核酸プローブ濃度は、ハイブリダイゼーション溶液１μｌあたりに用いるそれぞれの核酸プローブ分子について１．０〜１０ｎｇである。用いるハイブリダイゼーション溶液の体積は８μｌ〜１００ｍｌであるべきであり、本発明の方法の特に好ましい実施形態では３０μｌである。
ハイブリダイゼーション緩衝液中の競合プローブの濃度は、標的構造の数に依存する。迅速かつ効率的なハイブリダイゼーションを可能にするためには、競合プローブの数は標的構造の数を数桁上回るべきである。したがって、競合プローブ分子の濃度は０．５〜５００ｎｇ／μｌの範囲であるべきである。本発明の方法中では、好ましい濃度は、ハイブリダイゼーション溶液１μｌあたりに用いるそれぞれの競合プローブ分子について１．０〜１０ｎｇである。用いるハイブリダイゼーション溶液の体積は８μｌ〜１００ｍｌであるべきであり、本発明の方法の特に好ましい実施形態では３０μｌである。
ハイブリダイゼーションは通常１０分間〜１２時間持続し、好ましくは、ハイブリダイゼーションは約１．５時間持続する。ハイブリダイゼーション温度は好ましくは４４℃〜４８℃、特に好ましくは４６℃であり、ハイブリダイゼーション温度のパラメータならびにハイブリダイゼーション溶液中の塩および洗剤の濃度は、核酸プローブに応じて、特にその長さおよび検出する細胞中の標的配列に対してそれが相補的な度合いに応じて最適化し得る。当業者は適切な計算に精通しているであろう。
ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしていない過剰の核酸プローブ分子を除去するまたは洗い流すべきであり、これは通常、従来の洗浄溶液によって行う。この洗浄溶液は、所望する場合は０．００１〜０．１％、好ましくは０．００５〜０．０５％、特に好ましくは０．０１％のＳＤＳなどの洗剤、ならびに０．００１〜０．１ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０１〜０．０５ｍｏｌ／ｌ、特に好ましくは０．０２ｍｏｌ／ｌの濃度のトリス−ＨＣｌを含んでよく、トリス−ＨＣｌのｐＨ値は６．０〜９．０、好ましくは７．０〜８．０、特に好ましくは８．０の範囲内である。洗剤を含めてもよいが、これは必ずしも必要ではない。さらに、洗浄溶液は通常ＮａＣｌを含み、その濃度は要するストリンジェンシーに応じて０．００３ｍｏｌ／ｌ〜０．９ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．０１ｍｏｌ／ｌ〜０．９ｍｏｌ／ｌである。また、洗浄溶液はＥＤＴＡを含んでもよく、その濃度は好ましくは０．００５ｍｏｌ／ｌである。洗浄溶液はさらに、専門家に知られている保存料を適切な量で含んでもよい。
一般に、洗浄ステップでは原理的にはハイブリダイゼーション緩衝液（緩衝塩化ナトリウム溶液）に非常に類似していることができる緩衝溶液を用いるが、洗浄ステップは通常、それぞれより低い塩濃度の緩衝液を用いてより高い温度で行う。ハイブリダイゼーション条件の理論上の推定には、以下の式を用い得る。
Ｔｄ＝８１．５＋１６．６ｌｇ［Ｎａ＋］＋０．４×（％ＧＣ）−８２０／ｎ−０．５×（％ＦＡ）
Ｔｄ＝解離温度（℃）
［Ｎａ＋］＝ナトリウムイオンのモル濃度
％ＧＣ＝全塩基数に対するグアニンおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージ
ｎ＝ハイブリッドの長さ
％ＦＡ＝ホルムアミド含有率
この式を用いて、洗浄緩衝液のホルムアミド含有率（これは、ホルムアミドの毒性により可能な限り低いべきである）をたとえばこれに対してより低い塩化ナトリウム含有率で置き換え得る。しかし、当業者は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション方法に関する広範な文献から、記載した含有率を変更できること、およびその方法も知っている。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに関しては、ハイブリダイゼーション緩衝液について上に示した概要が当てはまる。
結合していない核酸プローブ分子を「洗い流す」ステップは、通常４４℃〜５２℃の範囲、好ましくは４４℃〜５０℃の範囲、特に好ましくは４６℃の温度で、１０〜４０分間、好ましくは１５分間行う。
その後、特異的にハイブリダイズした核酸プローブ分子をそれぞれの細胞中で検出することができるが、これは、核酸プローブ分子が、たとえば共有結合によって核酸プローブ分子がマーカーに連結することによって検出可能であることが条件である。検出可能なマーカー、たとえば蛍光基としては、たとえばＣＹ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、米国Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓから入手可能）、ＣＹ３（これもＡｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能）、ＣＹ５（これもＡｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能）、ＦＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．、米国Ｅｕｇｅｎｅ）、ＦＬＵＯＳ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、ドイツ国マンハイムから入手可能）、ＴＲＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．、米国Ｅｕｇｅｎｅから入手可能）、６−ＦＡＭまたはＦＬＵＯＳ−ＰＲＩＭＥなどを用い、これらは当業者に周知である。また、化学マーカー、放射性マーカーまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ、酸ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素マーカーも用い得る。これら酵素のそれぞれについていくつかの色素原が知られており、天然の基質の代わりにこれらが変換され、呈色または蛍光産物のいずれかに変換され得る。このような色素原の例を以下の表に示す。
Figure 2007505638
最後に、ハイブリダイゼーションに適した別の核酸配列がその５’または３’末端に存在するように核酸プローブ分子を設計することが可能である。この核酸配列は同様に、約１５〜１００個、好ましくは１５〜５０個のヌクレオチドを含む。この第２の核酸領域は同様に、上述の薬剤のうち１つによって検出可能である核酸プローブ分子によって検出し得る。
別の可能性は、検出可能な核酸プローブ分子をハプテンとカップリングさせることであり、次いでこれを、そのハプテンを認識する抗体と接触させ得る。このようなハプテンの例としては、ジゴキシゲニンを挙げ得る。言及したものに加えて、他の例が当業者に周知である。
用いたプローブの標識の種類に応じて、最終的な評価は、とりわけ光学顕微鏡、落射蛍光顕微鏡、化学発光光度計、蛍光光度計を用いて可能である。
上述の検出方法と比較した、本出願中に記載したＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｄｅｋｋｅｒａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ属の飲料腐敗性酵母、具体的には種Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ、Ｚ．ｍｅｌｌｉｓ、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ、Ｚ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｚ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｚ．ｍｉｃｒｏｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ ｕｖａｒｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｃ．ｃｒｕｓｅｉ（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｎａａｒｄｅｎｅｎｓｉｓ、Ｄｅｋｋｅｒａ ａｎｏｍａｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐ．ｍｉｎｕｔａ、Ｐ．ａｎｏｍａｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｘｉｇｕｕｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ ｌｕｄｗｉｇｉｉを特異的に検出するため、またはＭｕｃｏｒ属、Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ属、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属およびＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属の飲料腐敗性カビ、具体的には種Ｍｕｃｏｒ ｒａｃｅｍｏｓｕｓ、Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ ｎｉｖｅａ、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓおよびＡ．ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔ．ｂａｃｉｌｌｉｓｐｏｒｕｓならびにＴ．ｆｌａｖｕｓを特異的に検出するため、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属およびＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の飲料腐敗性細菌、具体的には種Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌ．ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｅｎｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ａ．ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ａ．ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓおよびＡ．ｈｅｒｂａｒｉｕｓを特異的に検出するための方法の重要な利点は、異例な速さである。１０日間までの時間を必要とする従来の培養方法と比較して、本発明による方法を用いた場合は結果が２４〜４８時間以内に得られる。
別の利点は、検出する飲料腐敗性微生物の正確な識別が行われることである。これまでの常法では、属または種レベルまでの微生物の識別は実施されていなかった。これは、識別がまったく不可能であったか、時間がかかりすぎたからである。
別の利点は、これらの方法の特異性である。用いた核酸プローブ分子では、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｄｅｋｋｅｒａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ属の飲料腐敗性酵母、具体的には種Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉ、Ｚ．ｍｅｌｌｉｓ、Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ、Ｚ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｚ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｚ．ｍｉｃｒｏｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ ｕｖａｒｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｃ．ｃｒｕｓｅｉ（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｎａａｒｄｅｎｓｉｓ、Ｄｅｋｋｅｒａ ａｎｏｍａｌａ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐ．ｍｉｎｕｔａ、Ｐ．ａｎｏｍａｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｘｉｇｕｕｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ ｌｕｄｗｉｇｉｉ、またはＭｕｃｏｒ属、Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ属、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属およびＴａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属の飲料腐敗性カビ、具体的には種Ｍｕｃｏｒ ｒａｃｅｍｏｓｕｓ、Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ ｎｉｖｅａ、Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓおよびＡ．ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔ．ｂａｃｉｌｌｉｓｐｏｒｕｓならびにＴ．ｆｌａｖｕｓ、またはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属およびＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の飲料腐敗性細菌、具体的には種Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌ．ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｅｎｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属菌、Ａ．ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ａ．ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓおよびＡ．ｈｅｒｂａｒｉｕｓを特異性の高い様式で検出することができる。微生物の可視化により、視覚的な対照を同時に行い得る。したがって、ポリメラーゼ連鎖反応でしばしば起こるものなどの偽陽性結果は排除される。
本発明による方法の別の利点は、その使用が容易なことである。したがって、この方法を用いて、言及した微生物の存在について多数の試料を容易に試験することができる。
最後に、最新技術と比較した重要な利点は、それぞれのプローブの混合物を用いることによる、言及した微生物の数種を同時検出する可能性である。この手法に従うことで、飲料腐敗性微生物に関連するすべての操作を少ない試験で検出することができる。
様々な検出された微生物が容易かつ信頼性のある様式で識別され得る様に、本発明中では異なるプローブを異なる標識にカップリングし得る。たとえば、第１のオリゴヌクレオチドを緑色蛍光色素で特異的に標識してよく、これは微生物の特定の属または種の検出に役立つ。第２のオリゴヌクレオチドも、たとえば赤色蛍光色素で特異的に標識し、これは第２の微生物の属または種の検出に役立つ。競合プローブと呼ばれるオリゴヌクレオチドは非標識のままであり、第１および／または第２のオリゴヌクレオチドプローブと検出する属または種に属さない細菌との結合を妨げる。これらの異なる標識、たとえば一端での緑色蛍光色素および他端での赤色蛍光色素は、たとえば蛍光顕微鏡観察で異なるフィルターを用いることによって、容易に区別し得る。
本発明による方法は、様々な方法で用い得る。
たとえば、非アルコール性飲料（たとえば果汁、フルーツネクター、果実濃縮物、潰した果実、ソフトドリンクおよび水）を、検出する微生物の存在について試験し得る。
また、たとえば環境試料も、検出する微生物の存在について試験することができる。これらの試料は、たとえば土壌または植物の一部分から採取し得る。
本発明による方法はさらに、下水試料またはサイレージ試料の試験に使用し得る。
本発明による方法はさらに、医学的試料、たとえば糞便試料、血液培養物、痰、組織試料（切片も）、創傷からの物質、尿、ならびに気道、移植片およびカテーテル表面からの試料の試験に使用し得る。
本発明による方法の別の使用分野は、食品管理である。好ましい実施形態では、食品試料は乳もしくは乳製品（ヨーグルト、チーズ、カード、バター、バターミルク）、飲料水、アルコール飲料（ビール、ワイン、蒸留酒）、ベーカリー製品または肉製品から得る。
本発明による方法のさらなる使用分野は、医薬品および化粧品、たとえば軟膏、クリーム、チンキ剤、ジュース剤、液剤、ドロップなどの分析である。
さらに、本発明によると、それぞれの方法を行うためのキットが提供される。これらのキットに含まれるハイブリダイゼーション用装置は、たとえばドイツ特許出願１００ ６１ ６５５．０号に記載されている。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用装置に関して、この文書に含まれる開示で明確な参照が行われている。
記載されたハイブリダイゼーション用装置（ＶＩＴ反応器と呼ばれる）以外に、キットの最も重要な構成成分はそれぞれのハイブリダイゼーション溶液（ＶＩＴ溶液と呼ばれる）であり、これは検出する微生物に特異的な核酸プローブ分子を含み、上述されている（ＶＩＴ溶液）。さらに、それぞれのハイブリダイゼーション緩衝液（溶液Ｃ）およびそれぞれの洗浄溶液の濃縮物（溶液Ｄ）が含まれる。また、任意選択で固定化溶液（溶液Ａおよび溶液Ｂ）、ならびに任意選択で包埋溶液（仕上剤）も含まれる。任意選択で、平行して陽性対照および陰性対照を行うための溶液が含まれる。
以下の実施例は、本発明を限定せずに例示することを意図する。
試料中の飲料腐敗性微生物の特異的な迅速検出
試料を２０〜４８時間、適切な様式で培養する。酵母およびカビの検出には、培養は、たとえばＳＳＬブイヨン中で、２４時間、２５℃で行い得る。乳酸菌の検出には、培養は、たとえばＭＲＳブイヨン中で、４８時間、３０℃で行い得る。酢酸菌の検出には、培養は、たとえばＤＳＭ寒天上で、４８時間、２８℃で行い得る。バチルス、具体的にはＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓの検出には、培養は、たとえばデキストロース−カゼイン−ペプトン寒天上で、４８時間、５５℃で行い得る。アリシクロバチルスの検出には、培養は、たとえばＢＡＭブイヨン中で、４８時間、４４℃で行い得る。
培養物のアリコートに、同体積の固定化溶液（溶液Ｂ、純エタノール）を加える。あるいは、培養物のアリコートを遠心分離（４０００ｇ、５分間、室温）してもよく、上清を廃棄した後、ペレットを４滴の固定化溶液（溶液Ｂ）に溶かし得る。
ハイブリダイゼーションを行うために、固定した細胞の適切なアリコート（好ましくは５μｌ）をスライドに塗り、乾燥させる（４６℃、３０分間または完全に乾燥するまで）。あるいは、細胞を他の担体材料に塗ってもよい（たとえばマイクロタイタープレートまたはフィルター）。その後、再度固定化溶液（溶液Ｂ）を加えることによって乾燥させた細胞を完全に脱水する。スライドを再度乾燥させる（室温、３分間または完全に乾燥するまで）。
その後、検出する微生物に特異的な上述の核酸プローブ分子を含むハイブリダイゼーション溶液（ＶＩＴ溶液、標識したプローブ分子を含むハイブリダイゼーション緩衝液）を、固定および脱水した細胞に塗る。好ましい体積は４０μｌである。その後、ハイブリダイゼーション緩衝液（溶液Ｃ）で湿らせたチャンバ、好ましくはＶＩＴ反応器（ＤＥ１００ ６１ ６５５．０参照）中でスライドをインキュベートする（４６℃、９０分間）。
その後、スライドをチャンバから取り出し、チャンバに洗浄溶液（溶液Ｄ、蒸留水で１：１０に希釈した）を満たし、スライドをチャンバ内でインキュベートする（４６℃、１５分間）。
その後、チャンバに蒸留水を満たし、スライドを簡単に浸し、横にして空気乾燥させる（４６℃、３０分間または完全に乾燥するまで）。
その後、スライドを適切な培地中に包埋する（仕上剤）。
最後に、蛍光顕微鏡を用いて試料を分析する。

Claims (56)

  1. 以下からなる群から選択された核酸配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって検出を実施する、試料中の飲料腐敗性微生物を検出する方法（すべての配列は５’→３’の方向である）：
    配列番号1: 5'-GTTTGACCAGATTCTCCGCTC
    配列番号5: 5'-CCCGGTCGAATTAAAACC
    配列番号6: 5'-GCCCGGTCGAATTAAAAC
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    配列番号1056: 5'- CACAAGTAGATGCCTACCCG
    配列番号1057: 5'- GGCTCCATAACGGTTACCTC
    配列番号1058: 5'- ACACAAGTAGATGCCTACCC
    配列番号1059: 5'- CTGGCTCCATAACGGTTACC
    配列番号1060: 5'- GCTGGCTCCATAACGGTTAC
    配列番号1061: 5'- GGCTGGCTCCATAACGGTTA
    配列番号1062: 5'- GCTCCATAACGGTTACCTCA
    配列番号1063: 5'- AAGTAGATGCCTACCCGTGT
    配列番号1064: 5'- CTCCATAACGGTTACCTCAC
    配列番号1065: 5'- TGCCTACCCGTGTATTATCC
    配列番号1066: 5'- TCGGTACCGTCTCACAAGGA
    配列番号1067: 5'- CTCACAAGGAGCTTTCCACT
    配列番号1068: 5'- GTAGATGCCTACCCGTGTAT
    配列番号1069: 5'- CCTACCCGTGTATTATCCGG
    配列番号1070: 5'- CACTCGGTACCGTCTCACAA
    配列番号1071: 5'- CTCAGCGATGCAGTTGCATC
    配列番号1072: 5'- AGTAGATGCCTACCCGTGTA
    配列番号1073: 5'- GCGGCTGGCTCCATAACGGT
    配列番号1074: 5'- CCAAAGCAATCCCAAGGTTG
    配列番号1075: 5'- TCCATAACGGTTACCTCACC
    配列番号1076: 5'- CCCGTGTATTATCCGGCATT
    配列番号1077: 5'- TCTCAGCGATGCAGTTGCAT
    配列番号1078: 5'- CCATAACGGTTACCTCACCG
    配列番号1079: 5'- TCAGCGATGCAGTTGCATCT
    配列番号1080: 5'- GGCGGCTGGCTCCATAACGG
    配列番号1081: 5'- AAGCAATCCCAAGGTTGAGC
    配列番号1082: 5'- TCACTCGGTACCGTCTCACA
    配列番号1083: 5'- CCGAGTGTTATTCCAGTCTG
    配列番号1084: 5'- CACAAGGAGCTTTCCACTCT
    配列番号1085: 5'- ACAAGGAGCTTTCCACTCTC
    配列番号1086: 5'- TCACAAGGAGCTTTCCACTC
    配列番号1087: 5'- CAGCGATGCAGTTGCATCTT
    配列番号1088: 5'- CAAGGAGCTTTCCACTCTCC
    配列番号1089: 5'- CCAGTCTGAAAGGCAGATTG
    配列番号1090: 5'- CAGTCTGAAAGGCAGATTGC
    配列番号1091: 5'- CGGCGGCTGGCTCCATAACG
    配列番号1092: 5'- CCTCTCTCAGCGATGCAGTT
    配列番号1093: 5'- CTCTCTCAGCGATGCAGTTG
    配列番号1094: 5'- TCTCTCAGCGATGCAGTTGC
    配列番号1095: 5'- CTCTCAGCGATGCAGTTGCA
    配列番号1096: 5'- CAATCCCAAGGTTGAGCCTT
    配列番号1097: 5'- AATCCCAAGGTTGAGCCTTG
    配列番号1098: 5'- AGCAATCCCAAGGTTGAGCC
    配列番号1099: 5'- CTCACTCGGTACCGTCTCAC
    配列番号1100: 5'- GCAATCCCAAGGTTGAGCCT
    配列番号1101: 5'- GCCTTGGACTTTCACTTCAG
    配列番号1102: 5'- CATAACGGTTACCTCACCGA
    配列番号1103: 5'- CTCCTCTCTCAGCGATGCAG
    配列番号1104: 5'- TCGGCGGCTGGCTCCATAAC
    配列番号1105: 5'- AGTCTGAAAGGCAGATTGCC
    配列番号1106: 5'- TCCTCTCTCAGCGATGCAGT
    配列番号1107: 5'- CCCAAGGTTGAGCCTTGGAC
    配列番号1108: 5'- ATAACGGTTACCTCACCGAC
    配列番号1109: 5'- TCCCAAGGTTGAGCCTTGGA
    配列番号1110: 5'- ATTATCCGGCATTAGCACCC
    配列番号1111: 5'- CTACGTGCTGGTAACACAGA
    配列番号1112: 5'- GCCGCTAGCCCCGAAGGGCT
    配列番号1113: 5'- CTAGCCCCGAAGGGCTCGCT
    配列番号1114: 5'- CGCTAGCCCCGAAGGGCTCG
    配列番号1115: 5'- AGCCCCGAAGGGCTCGCTCG
    配列番号1116: 5'- CCGCTAGCCCCGAAGGGCTC
    配列番号1117: 5'- TAGCCCCGAAGGGCTCGCTC
    配列番号1118: 5'- GCTAGCCCCGAAGGGCTCGC
    配列番号1119: 5'- GCCCCGAAGGGCTCGCTCGA
    配列番号1120: 5'- ATCCCAAGGTTGAGCCTTGG
    配列番号1121: 5'- GAGCCTTGGACTTTCACTTC
    配列番号1122: 5'- CAAGGTTGAGCCTTGGACTT
    配列番号1123: 5'- GAGCTTTCCACTCTCCTTGT
    配列番号1124: 5'- CCAAGGTTGAGCCTTGGACT
    配列番号1125: 5'- CGGGCTCCTCTCTCAGCGAT
    配列番号1126: 5'- GGAGCTTTCCACTCTCCTTG
    配列番号1127: 5'- GGGCTCCTCTCTCAGCGATG
    配列番号1128: 5'- TCTCCTTGTCGCTCTCCCCG
    配列番号1129: 5'- TCCTTGTCGCTCTCCCCGAG
    配列番号1130: 5'- AGCTTTCCACTCTCCTTGTC
    配列番号1131: 5'- CCACTCTCCTTGTCGCTCTC
    配列番号1132: 5'- GGCTCCTCTCTCAGCGATGC
    配列番号1133: 5'- CCTTGTCGCTCTCCCCGAGC
    配列番号1134: 5'- CACTCTCCTTGTCGCTCTCC
    配列番号1135: 5'- ACTCTCCTTGTCGCTCTCCC
    配列番号1136: 5'- CTCTCCTTGTCGCTCTCCCC
    配列番号1137: 5'- GCGGGCTCCTCTCTCAGCGA
    配列番号1138: 5'- GGCTCCATCATGGTTACCTC
    配列番号1142: 5'- CTTCCTCCGGCTTGCGCCGG
    配列番号1143: 5'- CGCTCTTCCCGA(G/T)TGACTGA
    配列番号1144: 5'- CCTCGGGCTCCTCCATC(A/T)GC。
  2. Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｅｒｏｍｙｃｅｓ属に属する飲料腐敗性微生物が、配列番号１のオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  3. 飲料腐敗性微生物Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｅｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｉｌｉｉが、配列番号５から配列番号２１からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  4. 飲料腐敗性微生物Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉが、配列番号２２のオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  5. 飲料腐敗性微生物Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍｉｃｒｏｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｓが、配列番号２３から配列番号２４からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  6. 飲料腐敗性微生物Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍｅｌｌｉｓが、配列番号２５から配列番号７５からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  7. 飲料腐敗性微生物Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｅｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉが、配列番号７６から配列番号１２６からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  8. 飲料腐敗性微生物Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍｅｌｌｉｓおよびＺｙｇｏｓａｃｃｈａｅｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉが、配列番号１２７のオリゴヌクレオチドプローブを用いて同時に検出される、請求項１に記載の方法。
  9. 飲料腐敗性微生物Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｅｒｏｍｙｃｅｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓが、配列番号１２８から配列番号１４２からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  10. 飲料腐敗性微生物Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ ｕｖａｒｕｍが、配列番号１４３から配列番号１４４からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  11. 飲料腐敗性微生物Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａが、配列番号１４５から配列番号１４６からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  12. 飲料腐敗性微生物Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓが、配列番号１４８のオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  13. 飲料腐敗性微生物Ｃａｎｄｉｄａ ｃｒｕｓｅｉ（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）が、配列番号１４９のオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  14. 飲料腐敗性微生物Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ（Ｄｅｋｋｅｒａ） ａｎｏｍａｌａおよびＤｅｋｋｅｒａ ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓが、配列番号１５０のオリゴヌクレオチドプローブを用いて同時に検出される、請求項１に記載の方法。
  15. 飲料腐敗性微生物Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ（Ｄｅｋｋｅｒａ） ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓが、配列番号１５１のオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  16. 飲料腐敗性微生物Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ（Ｄｅｋｋｅｒａ） ｎａａｒｄｅｎｅｎｓｉｓが、配列番号１５２のオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  17. 飲料腐敗性微生物Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓが、配列番号１５３のオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  18. 飲料腐敗性微生物Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａおよびＰｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａが、配列番号１５４のオリゴヌクレオチドプローブを用いて同時に検出される、請求項１に記載の方法。
  19. 飲料腐敗性微生物Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｘｉｇｕｕｓが、配列番号１５７のオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  20. 飲料腐敗性微生物Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ ｌｕｄｗｉｇｉｉが、配列番号１５８から配列番号１５９からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  21. 飲料腐敗性微生物Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが、配列番号１６０のオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  22. 飲料腐敗性微生物Ｍｕｃｏｒ ｒａｃｅｍｏｓｕｓが、配列番号１６３のオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  23. 飲料腐敗性微生物Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ ｎｉｖｅａが、配列番号１６４のオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  24. 飲料腐敗性微生物Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ｆｉｓｃｈｅｒｉが、配列番号１６５のオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  25. 飲料腐敗性微生物Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓおよびＡ．ｆｉｓｃｈｅｒｉが、配列番号１６６のオリゴヌクレオチドプローブを用いて同時に検出される、請求項１に記載の方法。
  26. 飲料腐敗性微生物Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｆｌａｖｕｓが、配列番号１６７のオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  27. 飲料腐敗性微生物Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｃｉｌｌｉｓｐｏｒｕｓおよびＴ．ｆｌａｖｕｓが、配列番号１６８のオリゴヌクレオチドプローブを用いて同時に検出される、請求項１に記載の方法。
  28. 飲料腐敗性微生物Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓが、配列番号１６９から配列番号２６９からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  29. Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属の飲料腐敗性微生物が、配列番号２７０から配列番号２７１からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  30. 飲料腐敗性微生物Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓおよびＬ．ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓが、配列番号２７２から配列番号３０１からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて同時に検出される、請求項１に記載の方法。
  31. 飲料腐敗性微生物Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｐｓｅｕｄｏｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓが、配列番号３０２から配列番号３４１からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  32. 飲料腐敗性微生物Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｅｎｉｓが、配列番号３４２から配列番号４４４からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  33. Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ属の飲料腐敗性微生物が、配列番号４４５から配列番号４９５からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  34. Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属の飲料腐敗性微生物が、配列番号４９６から配列番号５４６からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  35. Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属およびＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属の飲料腐敗性微生物が、配列番号５４７から配列番号６０８からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて同時に検出される、請求項１に記載の方法。
  36. Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ属およびＧｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の飲料腐敗性微生物が、配列番号６０９から配列番号８４２からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて同時に検出される、請求項１に記載の方法。
  37. 飲料腐敗性微生物Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓが、配列番号８４３から配列番号９３２からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  38. Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｕｓ属の飲料腐敗性微生物が、配列番号９３３から配列番号１０３３からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  39. 飲料腐敗性微生物Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓが、配列番号１０３７から配列番号１１３８からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される、請求項１に記載の方法。
  40. 飲料腐敗性微生物Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｎｉｃｕｓおよびＡ．ｈｅｒｂａｒｉｕｓが、配列番号１１４２から配列番号１１４４からなる群から選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて同時に検出される、請求項１に記載の方法。
  41. 少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを１つまたは複数の競合プローブと組み合わせて用いることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
  42. 配列番号１のオリゴヌクレオチドプローブを配列番号２から配列番号４からなる群から選択される１つまたは複数の競合プローブと組み合わせて用いることを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
  43. 少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを１つまたは複数の競合プローブと組み合わせて用いることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
  44. 配列番号１４６のオリゴヌクレオチドプローブを配列番号１４７の競合プローブと組み合わせて用いることを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
  45. 少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを１つまたは複数の競合プローブと組み合わせて用いることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
  46. 配列番号１５４のオリゴヌクレオチドプローブを配列番号１５５から配列番号１５６からなる群から選択される１つまたは複数の競合プローブと組み合わせて用いることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
  47. 少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを１つまたは複数の競合プローブと組み合わせて用いることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
  48. 配列番号１６０のオリゴヌクレオチドプローブを配列番号１６１から配列番号１６２からなる群から選択される１つまたは複数の競合プローブと組み合わせて用いることを特徴とする、請求項４７に記載の方法。
  49. 少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを１つまたは複数の競合プローブと組み合わせて用いることを特徴とする、請求項３８に記載の方法。
  50. 配列番号９３３のオリゴヌクレオチドプローブを配列番号１０３４から配列番号１０３６からなる群から選択される１つまたは複数の競合プローブと組み合わせて用いることを特徴とする、請求項４９に記載の方法。
  51. 少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを１つまたは複数の競合プローブと組み合わせて用いることを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
  52. 配列番号１０４４のオリゴヌクレオチドプローブを配列番号１１３９の競合プローブと組み合わせて用いることを特徴とする、請求項５１に記載の方法。
  53. 配列番号１０５７のオリゴヌクレオチドプローブを配列番号１１４０から配列番号１１４１からなる群から選択される１つまたは複数の競合プローブと組み合わせて用いることを特徴とする、請求項５１に記載の方法。
  54. ａ）試料中に含まれる飲料腐敗性微生物を培養するステップと、
    ｂ）試料中に含まれる飲料腐敗性微生物を固定するステップと、
    ｃ）固定した微生物を少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブと、任意選択で競合プローブと組み合わせてインキュベートするステップと、
    ｄ）ハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドプローブを除去するステップと、
    ｅ）ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブを用いて飲料腐敗性微生物を検出および可視化、ならびに任意選択で定量するステップと
    を含むことを特徴とする、請求項１〜５３のいずれかに記載の方法。
  55. 前記試料が非アルコール性飲料由来の試料であることを特徴とする、請求項１〜５４のいずれかに記載の方法。
  56. 請求項１に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜５５のいずれかに記載の方法を行うためのキット。
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