JP5238248B2 - ｒＲＮＡを標的とした微生物の定量的解析方法 - Google Patents

Description

本発明は、ｒＲＮＡを標的として行う、微生物、とりわけ生存状態にある微生物を定量・検出する方法に関する。

従来、微生物の定量法としては、予め予測した選択培地において微生物を培養し菌数を計測する方法、選択液体培地中で微生物を培養し濁度や吸光度を測定する方法が主に用いられてきた。また、検体中の微生物の検出に当たって必要となる微生物の同定作業には、形態観察、グラム染色、酸素要求性、糖資化性、培地における生育状態等の菌学的性質により同定する方法、ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試験による判定、微生物表面抗原のモノクローナル抗体による検出方法等が用いられてきた。これらの方法は、時間や熟練が要求され、迅速性や簡便性の観点から問題があった。

近年、ＰＣＲ法をはじめとした遺伝子増幅法が、微量の核酸を検出するための技術として広範な分野で用いられており、検体中の微生物の培養を必須要件とせず、また検体を直接試料として扱うことができるなど、迅速化や簡便化に供しうる利点を有することから、微生物の定量、検出への応用が検討されている。

そして、ＰＣＲ法を微生物の分析に応用した例としては、全ＤＮＡを標的配列としユニバーサルプライマーを用いたＰＣＲ法による細菌の定量方法（特許文献１）が知られている。また、標的として１６ＳｒＤＮＡを用いる方法も実現されており、例えば、１６ＳｒＤＮＡを標的配列としたＰＣＲ法による定量的解析方法（特許文献２）、１６ＳｒＤＮＡを標的配列としたＰＣＲ法による腸内細菌の解析方法（特許文献３）、ビール混濁菌であるラクトバチルス属菌種の検出方法（特許文献４）等が知られている。しかし、これらの方法は、従来用いられてきた培養法ほどの検出感度を得られないため、従来法の代替方法としては用いることができないという問題があった。たとえば、特許文献２で提案されている定量的解析方法は、その実施のためには、微生物数として１０^５個／μｌ以上のものに相当する大量の鋳型ＤＮＡが必要であり、斯かる方法は実用的ではない。なお、この感度の低さは、ＰＣＲ反応の鋳型となる全ＤＮＡあるいは１６ＳｒＤＮＡの微生物中に占めるコピー数（鋳型量）が少ないためであると考えられる。また、ＤＮＡは微生物の死滅後も残存することが知られており、これらの方法は、死滅後の微生物と生存状態の微生物とをあわせて定量・検出するにすぎず、生存状態の微生物を的確に定量・検出することは難しいという問題もあった（非特許文献１）。

また、ＰＣＲ法を微生物の分析に応用した例として、ｍＲＮＡを標的配列として行う試みもなされており、例えば、ｍＲＮＡを標的配列とした糞便中の乳酸菌の定量的解析（非特許文献２）等が知られている。また、検体中の癌細胞特異的なｍＲＮＡを標的配列とした癌細胞の検出方法（特許文献５、６）も知られている。しかし、これらの方法でも、定量法として従来法に代替できるほどの検出感度は得られていなかった。すなわち、非特許文献２で示されている定量的解析の検出限界は、１０^３．５個以上／ｇ・糞便にすぎず、検出感度の観点から従来の培養法の代替として使用することはできなかった。また、これらの方法は、各微生物に特有の遺伝子のｍＲＮＡを標的とする方法であり、プライマー設計の煩雑さ、特異性の低さなどの問題から、多種類の微生物が含まれている被検体の検出には不向きであった。

そこで、ＰＣＲ法等を用いた迅速な方法でありつつも、同時に従来の検出方法と同程度の検出感度が得られ、更に、生存状態の微生物をより的確に定量・検出することができる方法の開発が待たれていた。
感度の改善のためには、標的を、細胞内でより安定に又は細胞内により大量に存在するものへ設計変更することも考えられる。しかし、そのような安定な標的は、死滅後の細胞にも長く残存することが疑われることを考慮すると、生存状態の微生物のみを検出するという目的のためには好ましくはないと考えられる。このように、十分な検出感度の高さと、生存細胞のみを検出することとを同時に達成することは容易ではない。

一方、ｒＲＮＡは細胞内ＲＮＡ含有率の約８５％程度を占め多コピーであること、蛋白質と複合体を形成しているためｍＲＮＡに比べて安定性が高いことが知られていた。また、ｒＲＮＡは死後４８時間程度検出されるとの報告（非特許文献３）もあり、生存状態にある微生物を検出するのに向かないとの考えが一般的であった（非特許文献１）。
特開２００２−２３８５８５号公報 特開２００３−２５９８７９号公報 特開２００１−１１２４８５号公報 特開平１０−２１０９８０号公報 特開平１０−２４８６００号公報 国際公開第００／１７３９５号パンフレット Ｊ Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔ、ｖｏｌ．６７、Ｎｏ．４、８２３−８３２．（２００４） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、ｖｏｌ．２３１、１２５−１３０（２００４） Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、ｖｏｌ．６４、Ｎｏ．１１、４２６４−４２６８（１９９８）

本発明は、従来の培養法の代替となりうるほどの検出感度、及び生存状態にある微生物のより的確な検出を実現できる、微生物の定量的解析方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意検討を行った結果、安定性から生存状態にある微生物を検出するのに向かないとも考えられたｒＲＮＡ（細菌では５Ｓ、１６Ｓ、２３Ｓ、真核生物では５Ｓ、１８Ｓ、２６Ｓ又は２８Ｓ）を標的に用いれば、意外にも、死細胞を反映せずに生存状態にある微生物数を的確に定量・検出することができることを見出し、更に、定量・検出の際にＰＣＲ法を用いれば、従来方法の代替となりうるほどの検出感度を実現できることをも見出し本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、被検体中における目的微生物ｒＲＮＡ量を指標とする目的微生物の定量方法を提供するものである。

また、本発明は、被検体中における目的微生物ｒＲＮＡの存在を指標とする目的微生物の検出方法を提供するものである。

また、本発明は、上記方法に用いられる核酸断片であって、配列番号２、３又は５〜２８記載の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片又はそれらと相同な塩基配列からなり且つ機能的に等価である核酸断片を提供するものである。

更にまた、本発明は、上記方法を実施するためのキットを提供するものである。

本発明のｒＲＮＡを標的とした検出方法を用いれば、標的が多量に存在するため従来の標的に比べて高い検出感度を達成することができるにも関らず、同時に生存状態にある微生物をより的確に検出・定量することもできる。また、斯かる検出においてＰＣＲ法を用いれば、従来の培養法の代替となり得る程の検出感度を実現することができる。更に、ＰＣＲ法を用いた方法であれば、培養法などの従来法に比べて、格段の迅速さかつ簡便さが実現される。すなわち、本発明の方法を用いれば、検出感度の高さと、生存状態にある微生物のより的確な定量・検出と、迅速さ簡便さとを同時に実現することができる。そのため、腸内菌叢の解析や、食品・生体由来試料中に生存する微生物の検出・定量など、微生物を検出・定量することが求められる実用的な場面において用いることができる。

各種微生物の増殖とｒＲＮＡ転写量の相関を示した図である。 定量的ＲＴ−ＰＣＲ法による検量線及び定量的ＰＣＲ法との検出範囲の比較を示した図である。 ヒト糞便からのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（緑膿菌）の検出範囲を示した図である。 ヒト糞便大腸菌群の定量値について、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって求めた場合と培養法によって求めた場合とを比較した図である。 牛乳からのＥ． ｃｏｌｉ（大腸菌）、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）及びＢ． ｃｅｒｅｕｓ（セレウス菌）の検出感度を示した図である。 血液からのＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（緑膿菌）、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）の検出感度を示した図である。 発酵乳製品からのＥ． ｃｏｌｉ（大腸菌）の検出感度を示した図である。

本発明の目的微生物の定量・検出方法は、被検体中における目的微生物ｒＲＮＡの存在量や存在を指標とすることを特徴とするものである。

目的微生物ｒＲＮＡとは、定量・検出することを目的とする微生物が有しうるｒＲＮＡをいい、ｒＲＮＡとしては、例えば、原核生物における５ＳｒＲＮＡ、１６ＳｒＲＮＡ、２３ＳｒＲＮＡ、真核生物における５ＳｒＲＮＡ、５．８ＳｒＲＮＡ、１８ＳｒＲＮＡ、２６ＳｒＲＮＡ、２８ＳｒＲＮＡが挙げられるが、特に、現在の微生物分類の信頼できる指標として主に用いられている点から、１６ＳｒＲＮＡ、２３ＳｒＲＮＡ、１８ＳｒＲＮＡや２６ＳｒＲＮＡが好ましい。また、目的微生物とは、定量・検出する目的である微生物をいい、特に限定されないが、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｍ属、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属、Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｌｕｓ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ属、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属などの微生物、及び後記表２、表３記載の微生物が挙げられる。また、本発明の目的微生物は、１種の菌種からなる微生物のみならず、ある性質を共有する２種以上の菌種の集まりからなるグループ、属及び科を含む概念である。

被検体とは、微生物の存在又は存在量等を調べる対象をいう。被検体としては、例えば、結膜ぬぐい液、歯石、歯垢、喀痰、咽頭ぬぐい液、唾液、鼻汁、肺胞洗浄液、胸水、胃液、胃洗浄液、尿、子宮頸管粘液、膣分泌物、皮膚病巣、糞便、血液、腹水、組織、髄液、関節液、患部ぬぐい液などの生態由来試料、食品、医薬品、化粧品、食品・医薬品・化粧品の中間処理物、微生物培養液、植物、土壌、活性汚泥、排水のような微生物を含有する可能性のある対象が挙げられる。また、被検体試料とは、被検体をもとに摂取又は作製される試料をいい、被検体の微生物の存在又は存在量を反映しうる試料であれば特に限定されるものではないが、例えば、被検体に含まれるヌクレオチドを含む混合物やＲＮＡを含む混合物が挙げられるが、ＰＣＲ法に用いるという観点からは、被検体に含まれるＲＮＡを含む混合物が好ましい。

被検体試料は、例えば、被検体の全部又は一部から、必要に応じて、抽出・分離・精製方法により前処理を行ったのち、適宜公知の方法により取得することができる。例えば、ＲＮＡを含む混合物は、必要に応じて、ろ過、遠心分離、クロマトグラフィー等の公知の方法による前処理を行ったのち、例えば、「グアニジン−塩化セシウム超遠心法」、「酸性グアニジン−フェノールクロロホルム法（ＡＧＰＣ法）」、「磁気ビーズ法」、「シリカカラム法」等の汎用法を用いた抽出により得ることができ、また、市販のキット（ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙ ＫＩｔ、ＴＲＩＺＯＬ等）を用いて行うこともできる。
また、被検体試料としては、分解を防ぎ高い検出感度を維持するという観点からは、微生物中に固定化された状態のＲＮＡを用いることが好ましい。斯かる固定化は、例えば、市販の固定化剤（ＲＮＡｐｒｏｔｅｃｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｒｅｇｅｎｔ、ＲＮＡｌａｔｅｒ等）により行うことができる。また、固定化は、微生物内のＲＮＡ量の変化を避けるという観点から、検体の採取後直ちに行うのが好ましい。

本発明における目的微生物の定量は、被検体中における目的微生物ｒＲＮＡ量を指標とする。ここで、被検体中における目的微生物ｒＲＮＡ量は、例えば、（１）目的微生物ｒＲＮＡに特異的にハイブリダイズしうる核酸断片及び被検体試料を用いてＰＣＲ法による増幅産物量を求めること、（２）目的微生物ｒＲＮＡに特異的にハイブリダイズしうる核酸断片と被検体試料とのハイブリダイズ効率を求めること、又は（３）その他公知の方法を用いた定量方法により求めることができる。

ここで、（１）ＰＣＲ法を用いる場合において、「目的微生物ｒＲＮＡに特異的にハイブリダイズしうる核酸断片」の設計は、目的微生物が有する塩基配列と他の微生物が有する塩基配列とを比較し、目的微生物が有しうるｒＲＮＡに特異的である配列を選ぶことにより行うことができる。ここで、微生物が有しうるｒＲＮＡの塩基配列は、例えば、データベース（ＤＤＢＪ、Ｇｅｎｂａｎｋ等）を参酌することにより得ることができる。また、塩基配列をソフトウェア（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ等）を用いて整列させ、目視等の手段により特異的な配列を見出すことができる。また、目的とする微生物に特異的である配列は、定量の対象である微生物が含まれる範囲の広さを参酌することが好ましい。すなわち、例えば、ある菌種を特異的に定量することを目的とするならば、その菌種特異的な配列を選択することが好ましく、また、ある属を特異的に定量することを目的とするならば、その属特異的な配列を選択することが好ましい。斯かる選択は、公知の方法を用いて適宜行うことができる。

目的微生物ｒＲＮＡにハイブリダイズしうる核酸断片としては、かくして設計される配列のみならず、公知の技術常識にのっとれば適宜想定することができ、当該塩基配列と相補的な塩基配列や目的微生物の定量に同様に用いることができる相同な塩基配列、例えば、ａ）当該塩基配列のうちの１又は数個、好ましくは１乃至１０個の塩基が置換、付加又は欠失した塩基配列、ｂ）当該塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列、ｃ）当該塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列、からなる核酸断片などを用いることもできる。
また、斯かる核酸断片は、その両端又は片端、好ましくは５’端に任意の数、好ましくは１００個、より好ましくは２０個、更に好ましくは１０個以下の塩基が付加された核酸断片の一部であってもよい。

当該核酸断片の長さは、特に制限はないが、５〜５０塩基からなる核酸断片が好ましく、１２〜３５塩基からなる核酸断片がより好ましい。

かくして設計される核酸断片は、例えば、その塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機により人工的に合成することができる。当該断片としては、合成後に、その特異性の確認のなされた断片が好ましく、ここで特異性の確認としては、例えば、目的ｒＲＮＡを鋳型とする場合には、適当な対照と比べて特異的なＰＣＲ増幅産物が得られることを確かめることにより行うことができる。

このような核酸断片としては、例えば、配列番号１〜３０記載の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片、又はそれらと相同な塩基配列からなり且つ機能的に等価である核酸断片が挙げられる。ここで、それらと相同な塩基配列からなり且つ機能的に等価である核酸断片としては、例えば、以下に示す（ａ）〜（ｃ）に示す核酸断片であって、目的微生物ｒＲＮＡの定量・検出に用いることができるものが挙げられる。
（ａ）配列番号１〜３０で示される塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片において、１又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された核酸断片。
（ｂ）配列番号１〜３０で示される塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からな
る核酸断片。
（ｃ）配列番号１〜３０で示される塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる核酸断片。

尚、ここで、塩基配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（Ｒ）のホモロジー解析プログラムを用いることにより算出される。
また、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液及び２５０ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡを含む溶液に４２℃で１６〜２４時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。

目的微生物ｒＲＮＡの定量・検出に用いることができる核酸断片は、例えば、ＰＣＲ法を行い、目的微生物ｒＲＮＡをテンプレートとした場合には増幅産物が得られるのに対し、その他の標的、例えば、その他の微生物ｒＲＮＡや、ｍＲＮＡをテンプレートとした場合には得られない核酸断片を選ぶことにより得ることができる。

そして、（１）配列番号１若しくは２記載の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片、又はそれらと相同な塩基配列からなり且つ機能的に等価である核酸断片は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓを、（２）配列番号３若しくは４記載の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片、又はそれらと相同な塩基配列からなり且つ機能的に等価である核酸断片は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓを、（３）配列番号５若しくは６記載の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片、又はそれらと相同な塩基配列からなり且つ機能的に等価である核酸断片は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅを、（４）配列番号７若しくは８記載の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片、又はそれらと相同な塩基配列からなり且つ機能的に等価である核酸断片は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属を、（５）配列番号９若しくは１０記載の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片、又はそれらと相同な塩基配列からなり且つ機能的に等価である核酸断片は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属を、（６）配列番号１１若しくは１２記載の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片、又はそれらと相同な塩基配列からなり且つ機能的に等価である核酸断片は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属を、（７）配列番号１３若しくは１４記載の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片、又はそれらと相同な塩基配列からなり且つ機能的に等価である核酸断片は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓサブグループを、（８）配列番号１５若しくは１６記載の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片、又はそれらと相同な塩基配列からなり且つ機能的に等価である核酸断片は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｕｍｉｎｉｓサブグループを、（９）配列番号１７若しくは１８記載の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片、又はそれらと相同な塩基配列からなり且つ機能的に等価である核酸断片は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍサブグループを、（１０）配列番号１９若しくは２０記載の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片、又はそれらと相同な塩基配列からなり且つ機能的に等価である核酸断片は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉサブグループを、（１１）配列番号２１若しくは２２記載の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片、又はそれらと相同な塩基配列からなり且つ機能的に等価である核酸断片は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉサブグループを、（１２）配列番号２３若しくは２４記載の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片、又はそれらと相同な塩基配列からなり且つ機能的に等価である核酸断片は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉサブグループを、（１３）配列番号２５若しくは２６記載の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片、又はそれらと相同な塩基配列からなり且つ機能的に等価である核酸断片は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓを、（１４）配列番号２７若しくは２８記載の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片、又はそれらと相同な塩基配列からなり且つ機能的に等価である核酸断片は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓを、（１５）配列番号２９若しくは３０記載の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片、又はそれらと相同な塩基配列からなり且つ機能的に等価である核酸断片は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍを、特異的に定量・検出する用途に用いることができる。

なお、ここで、配列番号１記載の塩基配列からなる核酸断片は、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、ｖｏｌ．２０２、２０９−２１３（２００１）に記載されている公知の核酸断片である。また、配列番号４記載の塩基配列からなる核酸断片は、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｖｏｌ．４６、Ｎｏ．５、３５３−３５８（２００２）に記載されている公知の核酸断片である。また、配列番号２９又は３０記載の塩基配列からなる核酸断片は、特開平１１−１５１０９７号公報に記載されている公知の核酸断片である。一方、配列番号２、３又は５〜２８記載の塩基配列からなる核酸断片は、本発明者らが見出した核酸断片である。

かくして作製される核酸断片及び被検体試料を用いるＰＣＲ法は、「斯かる核酸断片をプライマーとして用いて、被検体試料を含む反応系において、目的微生物ｒＲＮＡを鋳型とするＰＣＲ反応」により行うことができる。斯かるＰＣＲ法としては、目的微生物ｒＲＮＡに由来するヌクレオチド断片を特異的に増幅する反応であれば特に制限されるものではないが、目的微生物ｒＲＮＡを鋳型とし、酵素、好ましくは逆転写酵素などによってｃＤＮＡを作製する工程を含む方法が好ましく、また、斯かる工程に加えて、かくして作製されたｃＤＮＡを鋳型としてヌクレオチドを増幅する工程を含む方法がより好ましい。このようなＰＣＲ法は、例えば、公知のＲＴ−ＰＣＲ反応を用いることにより行うことができる。ここで、ＲＴ−ＰＣＲ反応は、Ｔｗｏ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲやＯｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ等の公知の方法を用いて行うことができるが、特に簡便であり、かつクロスコンタミネーションを防ぐという点からは、Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲが好ましい。

斯かるＯｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ法は、例えば、市販のキットを用いて行うことができる（ＱＩＡＧＥＮ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ等）。ＲＴ反応に使用する逆転写活性を有する酵素としてはＭ−ＭＨＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ等の種々の逆転写酵素を用いることができる。また、ＤＮＡを増幅させるＰＣＲ反応に用いるＤＮＡポリメラーゼは９０℃以上の温度に耐熱性があるものが好ましい。

このようなＰＣＲ反応は、例えば、二本鎖ＤＮＡを一本鎖にする熱変性反応を９０〜９８℃、プライマーを鋳型ｃＤＮＡにハイブリダイズさせるアニーリング反応を３７〜７２℃、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる伸長反応を５０〜７５℃という温度条件で、これを１サイクルとしたものを１〜数十サイクル行うことにより、行うことができる。なお、好ましい反応条件の一例は、熱変性９５℃・３０秒、アニーリング６０℃・３０秒、伸長反応７２℃・６０秒である。

また、ＰＣＲ反応の際は、２種類のプライマーを１組として用いることが好ましく、この場合は両者がリーディング鎖とラギング鎖との組合せになるようにする必要がある。本発明で提供する核酸断片は、ＲＴ−ＰＣＲ反応におけるアニーリング温度をほぼ一定に設定してあるので、複数の微生物の核酸断片を同時に検定することが可能となる。また、プローブとしての使用もでき、他の公知のユニバーサルプライマー、オリゴヌクレオチド等と組合わせても用いることもできる。

また、このＲＴ−ＰＣＲ反応の鋳型となるｒＲＮＡを含む被検体試料としては、ＲＮＡ全体量として１ｐｇ〜１μｇのＲＮＡを含むものが好ましく、１０ｐｇ〜０．１μｇ含むものがより好ましい。

適切なＰＣＲ反応が行われた場合には通常、「ＰＣＲ増幅産物量」、「ＰＣＲサイクル数」と「ＰＣＲの鋳型量」との間には相関関係がある。したがって、かくして行われたＰＣＲ反応により増幅された増幅産物量とＰＣＲサイクル数を参酌して適宜計算すれば、目的微生物ｒＲＮＡ量を求めることができる。

また、後記の実施例図１に示すとおり、かくして求められる「目的微生物ｒＲＮＡ量」と「目的微生物の菌数」との間にも良好な相関関係があることが明らかになった。したがって、かくして求められた「目的微生物ｒＲＮＡ量」を参酌して計算すれば、目的微生物の菌数を求めることができる。また、「目的微生物ｒＲＮＡ量」を計算する過程を経なくても、上述のようにして行われた「ＰＣＲ反応により増幅された増幅産物量」と「ＰＣＲサイクル数」を参酌して適宜計算することによっても、目的微生物の菌数を求めることができる。

ＰＣＲ増幅産物量とＰＣＲサイクル数の知得は、特に限定されず、あらゆる方法により行うことができるが、例えば、任意に設定された一定量のＤＮＡ量に達したときのＰＣＲサイクル数を特定することにより行うことができる。斯かる特定は、例えば、「ＰＣＲ産物を標識するＰＣＲ法に併せて、標識の経時的な計測を行うＰＣＲ法」を用いて、設定した一定の蛍光強度に達する際のＰＣＲサイクル数を特定することにより行うことができる。ここで、一定の蛍光強度は、「増幅産物が対数的に増幅する際に達しうる蛍光強度の範囲内」で設定されるのが、適切な相関関係を反映しうる点から好ましい。斯かる範囲は公知の方法により適宜理解することができる。また、ここで標識としては、例えば、蛍光色素による標識が挙げられ、標識の計測としては、例えば、蛍光強度の計測が挙げられる。またここで、蛍光色素による標識としては、例えば、インターカレーター性蛍光色素による標識が挙げられ、インターカレーター性蛍光色素としては、例えば、ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ Ｉが挙げられる。インターカレーター性色素は、二本鎖核酸にインターカレーションすることで蛍光強度が増強する性質を有することから、増幅したＰＣＲ産物を反映した強度の蛍光が発せられることとなる。また、蛍光色素による標識は、蛍光色素により標識したＴａｑＭａｎプローブやＭｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｂｅａｃｏｎ等の使用により行うこともできる。ＴａｑＭａｎプローブやＭｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｂｅａｃｏｎは、ＰＣＲにより増幅される領域の内部配列と相同性を有するオリゴヌクレオチドに蛍光色素とクエンチャーを結合させたプローブであり、ＰＣＲ反応に共存させて用いる。プローブに結合した蛍光色素とクエンチャーの相互作用でＰＣＲ増幅反応に応じた蛍光を発するため、各ＰＣＲ段階での蛍光強度を測定することにより増幅されるＰＣＲ産物の経時的な観察を行うことができる。ただし、ＴａｑＭａｎプローブやＭｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｂｅａｃｏｎ等では、プローブに適した細菌に特異的な相補配列を見出さなければならず、対象によっては困難な場合がある。

かくして知得された「ＰＣＲ増幅産物量とＰＣＲサイクル数」と、適当な比較実験の結果を参酌すれば、ｒＲＮＡ量を求めることができる。すなわち、例えば、「その量が知られているｒＲＮＡを用いて行った比較実験の結果」を参酌し、上述のように知得された「ＰＣＲ増幅産物量とＰＣＲサイクル数」との対比を適宜行えば、公知の方法によって、目的微生物ｒＲＮＡ量を計算することができる。

そして、かくして計算された「目的微生物ｒＲＮＡ量」と、適当な比較実験の結果を参酌すれば、目的微生物の菌数を求めることができる。すなわち、例えば、「対応するその菌数が知られている被検体試料を用いて行った比較実験の結果」を参酌し、かくして計算された「目的微生物ｒＲＮＡ量」との対比を適宜行えば、公知の方法により、目的微生物の菌数を計算することができる。なお、斯かる対比においては、ＰＣＲの鋳型とする「被検体微生物の菌数」と、一定のＰＣＲ増幅産物量に達したときの「ＰＣＲサイクル数」（以下、Ｃ_Ｔ値と称することもある）との相関関係を示す検量線を用いることが、簡便性の点から好ましい。斯かる検量線は、標的とする微生物の菌数を横軸に、Ｃ_Ｔ値を縦軸にプロットして作成されるのが通常である（図２参照）。検量線作成の際に用いる微生物は、基準株等の公知菌株を用いてもよい。

なお、「対応するその菌数が知られている被検体試料を用いて行った比較実験の結果」と、上述のようにして知得された「ＰＣＲ増幅産物量とＰＣＲサイクル数」とを適宜対比すれば、ｒＲＮＡ量を具体的に計算する過程を経ることなく、直接目的微生物の菌数を計算することもできる。具体的には上述の検量線に、被検体試料から導かれたＣ_Ｔ値を適用すればよい。

また、前述のとおり、被検体中における目的微生物ｒＲＮＡ量は、例えば、（２）目的微生物ｒＲＮＡに特異的にハイブリダイズしうる核酸断片と被検体試料とのハイブリダイズ効率の知得によっても、求めることができる。

ここで、目的微生物ｒＲＮＡに特異的にハイブリダイズしうる核酸断片は、例えば、前述のように設計及び作製されたものを用いることができる。また、斯かる核酸断片としては、標識がなされている核酸断片が好ましい。ここで、標識としては、酵素、常磁性イオン、ビオチン、蛍光色素、発色団、重金属、あるいはラジオアイソトープが挙げられ、より好ましいマーカーとしては酵素が挙げられ、ここで酵素としては、ホースラディッシュペロキシダーゼ又はアルカリフォスファターゼが挙げられる。斯かる標識は、公知の方法により行うことができる。

被検体試料とこのような核酸断片とのハイブリダイズの程度を測定すれば、公知の換算方法により、被検体中における目的微生物ｒＲＮＡ量及び／又は目的微生物の菌数を知得することができる。斯かるハイブリダイズの程度の計測は、特に限定されず、公知の方法に準じて行うことができるが、たとえば核酸断片に付加された標識の計測により行うことができる。すなわち、たとえば、蛍光色素によって標識された核酸断片を用いた場合には、蛍光強度を計測することにより行うことができる。斯かる計測は、適当な対照と並行して行う計測が好ましい。ここで、適当な対照としては、例えば、「用いる核酸断片と特異的なハイブリダイズをしないことが知られている試料」、「含まれる目的微生物菌数が既に知られている被検体に由来する被検体試料」「目的微生物ｒＲＮＡ量が既に知られている被検体から摂取又は作製された被検体試料」などが挙げられる。斯かる対照を参酌することにより、公知の換算方法により、目的微生物ｒＲＮＡ量又は目的微生物菌数を知得することができる。なお、微生物菌数の知得は、かくして計算された目的微生物ｒＲＮＡ量と適当な比較実験結果とを参酌して公知の方法によっても行うことができる。

また、本発明の目的微生物の検出方法は、被検体試料中における目的微生物ｒＲＮＡの存在を指標とするものである。ここで「微生物の検出」とは微生物の同定を含む意である。また、検体中に検出対象微生物が存在することを確認すること、あるいは、検体中に検出対象微生物が存在しないことを確認することも含まれるものである。

本発明の検出方法を用いて、被検体中における目的微生物ｒＲＮＡの存在を確認するには、（１）被検体試料及び目的微生物ｒＲＮＡに特異的にハイブリダイズしうる核酸断片を用いるＰＣＲ法による増幅産物を検出すること、（２）斯かる核酸断片と被検体試料とのハイブリダイズを検出すること、（３）その他公知の方法を用いて目的微生物ｒＲＮＡを検出することなどにより行えばよい。この（１）〜（３）の方法は、既に述べた方法を参酌することにより容易に行うことができる。そして目的微生物ｒＲＮＡの存在は、目的微生物が被検体中に存在していたことを示すので、目的微生物を検出することができる。ただし、非特異的なＰＣＲ産物の増幅や非特異的なハイブリダイズもおこりうるので、適切な対照と比較して行うことが好ましい。

後記の実施例で示すとおり、ｒＲＮＡ量を指標とする定量方法や、ｒＲＮＡの存在を指標とする検出方法は、従来のｒＤＮＡ量を指標とする方法に比べて、高い検出感度を達成することができることが明らかになった。また、後記の実施例で示すとおり、ｒＲＮＡ量を指標とする方法は、死細胞を併せて定量・検出することなく、生存状態にある微生物を正確に定量・検出することができることが明らかになった。

したがって、本発明の定量・検出方法（以下、「本発明の方法」ともいう）を用いれば、従来法よりも高い検出感度で、しかも生存状態にある微生物を特異的に定量・検出することができる。よって、本発明の方法は、例えば、（１）従来法よりも高い検出感度で、被検体に含まれる生存状態にある目的微生物を定量・検出する用途、（２）従来法よりも高い検出感度で、被検体に含まれる死細胞数を定量・検出する用途、（３）従来法よりも高い検出感度で、被検体に含まれる死細胞数と生存状態にある微生物数の比率を計測する用途、（４）従来法よりも高い検出感度で、生存状態にある微生物の存在又は存在量を「確認」する用途、などに用いることができる。ここで、確認としては、例えば、（ａ）生存状態にある微生物数をより厳密に正確に把握する必要がある場合において、生存状態にある微生物の存在又は存在量を把握するために行う定量・検出、（ｂ）「生存状態にある微生物数」がその他の実験系によって計算されている場合において、その実験の精度や、計算された数値の正確さを検討するために行う確認が挙げられる。なお、死細胞数を定量する場合、例えば、死細胞を併せて検出することが知られている公知の方法などによる、死細胞数と生存細胞数との合計数の計測を併せて行うことが好ましい。本発明の方法により計算される生存細胞数を、合計数から除くことにより求めることができる。

また、本発明の方法では、例えば、コロニーを形成しない微生物、液体培養ができない微生物など、従来の培養法では計測することが困難である微生物を定量・検出する方法として用いることもできる。

また、後記の実施例で示すとおり、斯かる定量・検出方法に、ＰＣＲ法を用いた場合には、培養法と同程度の検出感度を実現することができることが明らかになった。したがって、本発明の方法は、培養法と同程度以上の検出感度、すなわち、１０^０個以上／ｇ・検体、あるいは１０^０個以上／ｍＬ・検体の検出感度で微生物を定量・検出する方法として用いることもできる。

また、ＰＣＲ法を用いた場合、培養法と比較して、極めて迅速かつ簡便に微生物の定量・検出を行うことができる。また、ＰＣＲ法を用いた方法によると、検体のＲＮＡの抽出から微生物の定量・検出まで約６時間以内で完了することもできる。したがって、本発明の方法は、短時間（６時間以内）で微生物を検出できる方法として用いることもできる。

本発明の方法で、ＰＣＲ法を用いる方法を用いれば、検出感度の高さと、生存状態にある微生物のより的確な定量・検出と、迅速さ簡便さとを同時に実現することができる。このため、本発明の方法は、例えば、特に迅速かつ感度の高い定量・検出が要求される医療現場や食品産業での「汚染菌、有害菌、病原微生物などの検査」という用途に用いることができる。

本発明の方法は、斯かる方法を実施するためのキットを用いて行うこともできる。ここで、斯かる方法を実施するためのキットとしては、例えば、（１）目的微生物ｒＲＮＡに特異的にハイブリダイズしうる核酸断片、（２）実施方法を記載したプロトコール、及び／又は（３）ＲＮＡの抽出、ＲＮＡの固定若しくはＰＣＲ反応に用いる試薬を含むキットが挙げられるが、本発明のキットはこれらに限定されず、斯かる方法の全部又は一部の工程を行うのに必要なものの全部又は一部を集めたものをいう。ここで、「工程を行うのに必要なもの」は、本明細書の記載を参酌することにより、適宜理解することができる。

以下、実施例によって本発明の内容を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ プライマーの作製
さまざまな細菌種について、１６Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡ ＤＮＡ配列をＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ）より入手した。それらの配列をＣｌｕｓｔａｌ Ｗ プログラムにて整列後、系統樹を作成した。系統樹をもとに各菌種を、科、属、サブグループごとに分類し、分類ごとにプライマーの設計を行った。表１に作成したプライマーの配列と対象としたｒＲＮＡ種を示す。なお、表１の参考文献の欄は、斯かる配列が記載されている文献を示す。また、斯かる欄が空欄であるものは、その配列が、本発明により見出された新規な配列であることを示す。尚、非特許文献４は、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、ｖｏｌ．４６、Ｎｏ．５、３５３−３５８（２００２）を示し、非特許文献５は、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、ｖｏｌ．２０２、２０９−２１３（２００１）を示し、特許文献７は特開平１１−１５１０９７号公報を示す。

実施例２ プライマーの特異性確認
実施例１のプライマーが、実際に特異性を有しているか確認するため、各種細菌に対する特異性を検討した。すなわち、表２（２８菌属５７菌種）及び表３（１８菌属６０菌種）に示した各種細菌懸濁液５０μｌを２倍量のＲＮＡｐｒｏｔｅｃｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）に懸濁し、室温で５分間インキュベートした。５，０００ｇで１０分間遠心分離し上清を除去した後、溶菌バッファー４５０μｌ［ＲＬＴバッファー（ＱＩＡＧＥＮ）３４６．５μｌ、β−メルカプトエタノール３．５μｌ、ＴＥバッファー１００μｌ］及びガラスビーズ３００ｍｇ（直径０．１ｍｍ）を添加し、ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１２０（Ｂｉｏ１０１）にて５，０００ｒｐｍで１分間激しく振とうすることにより菌体を破砕した。破砕液に水飽和フェノール５００μｌを添加し、６０℃で１０分間インキュベートした。クロロホルム／イソアミルアルコール（ＣＩＡ）１００μｌを添加、攪拌した後、１２，０００ｒｐｍ，４℃，５分間の条件で遠心分離操作を行った。回収した上清に等量の水飽和フェノール（水飽和）／クロロホルムを加えて撹拌し、再度同条件にて遠心分離操作を行った。回収した上清に等量のＣＩＡを加えて振とうし、再度同条件にて遠心分離操作を行った。回収した上清４００μｌに、等量のイソプロピルアルコール及び１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムを添加し、転倒混和した後、１５，０００ｒｐｍ，４℃，１０分間の条件で遠心分離操作を行った。上清を取り除いたものに７５％エタノール５００μｌを加えて転倒混和した後、１５，０００ｒｐｍ，４℃，２分間の条件で遠心分離操作を行った。上清を除去し、チューブ内を風乾させた後、５０μｌのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水で沈殿物を溶解させたものを全ＲＮＡ抽出溶液とした。定量的ＲＴ−ＰＣＲ 反応は、ＱＩＡＧＥＮ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いた。反応液（総量２５μｌ）の組成は、２μｌの全ＲＮＡ溶液（２×１０^５ＣＦＵ相当）及び最終濃度として１×ＱＩＡＧＥＮ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ、１／２５量のＱＩＡＧＥＮ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ、１／１００，０００量のＳＹＢＲ（Ｒ） Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、０．７５μＭ各プライマー（表１記載）となるように調整した。また、ＲＴ−ＰＣＲ反応に対して２ｘ１０^５ＣＦＵ相当のＲＮＡを鋳型として用いた。反応液はまず５０℃で３０分間逆転写反応を行い、その後逆転写酵素を失活させるため９５℃で１５分間加熱した。引き続いて、９４℃・２０秒、５５℃又は６０℃・２０秒、７２℃・５０秒を４０〜４５サイクル行い、増幅産物の量をサイクルごとにＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ Ｉの蛍光強度として測定した。これらの一連の反応は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（Ｒ）７９００ＨＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により行った。
その結果、表２に示すようにプライマーＥｎ−ｌｓｕ ３Ｆ／３’Ｒ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ｇ−Ｓｔａｐｈ−Ｆ／Ｒ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属）、ＰＳＤ７Ｆ／Ｒ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属）、ｓ−Ｃｌｐｅｒ−Ｆ／ＣｌＰＥＲ−Ｒ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、Ｓ−Ｓ−Ｂｃ−２００−ａ−Ｓ−１８／Ｂｃ２Ｒ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、ｇ−Ｅｎｃｏｃ Ｆ／Ｒ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属）は、目的とする菌属あるいは菌種のみを特異的に検出できることが明らかとなった。また、表３に示すようにプライマーｓｇ−Ｌａｃｉ−Ｆ／Ｒ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ サブグループ）、ｓｇ−Ｌｓａｋ−Ｆ／Ｒ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ サブグループ）、ｓｇ−Ｌｃａｓ−Ｆ／Ｒ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ サブグループ）、ｓｇ−Ｌｒｕｍ−Ｆ／Ｒ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｕｍｉｎｉｓ サブグループ）、ｓｇ−Ｌｒｅｕ−Ｆ／Ｒ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ サブグループ）、ｓｇ−Ｌｐｌａ−Ｆ／Ｒ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ サブグループ）、ｓ−Ｌｂｒｅ−Ｆ／Ｒ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ｓ−Ｌｆｒｕ−Ｆ／Ｒ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ）、ＬＦｅｒ−１／２（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）は目的とするサブグループあるいは菌種のみを特異的に検出できることが明らかとなった。なお、表２、表３において、＋は特異的検出を行うことができた（Ｃ_Ｔ値が１〜３０）ことを、−はＣ_Ｔ値が３１以降あるいは全く増幅産物が得られなかったことを示す。

実施例３ 各種微生物の生育性状とｒＲＮＡ 転写量の関連性の検討
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）、Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（緑膿菌）の様々な培養期の菌体を用いて、培養法により測定される生菌数と定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により測定されるｒＲＮＡ転写量から導き出したコロニー形成能を有する細菌数の関係を調べた。すなわち、ＢＨＩ培地を用いて３７℃で好気振盪培養開始後、経時的に採取した菌液を用いて、ＢＨＩ寒天培地を用いた培養法（３７℃、２４時間）により菌数を測定した。一方で同様に採取したサンプルよりＲＮＡを抽出し、定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析に供した。菌数が既知の対数増殖後期菌株から抽出したＲＮＡを用い、実施例４に記載の要領で作成した検量線に基づいて、各サンプル中の菌数を算出した。なお、全ＲＮＡ抽出及び定量的ＲＴ−ＰＣＲは実施例２のとおり行った。その結果を図１に示した。図１では、ｒＲＮＡ転写量から算出した菌数を●（黒丸）、培養法による菌数を○（白丸）で示した。解析に供した全菌株に関して、菌液中の培養法による生菌数とｒＲＮＡ転写量から算出した菌数のそれぞれの変動曲線は、対数増殖期から死滅期に至るまで高い関連性が認められた。このことから、ｒＲＮＡの転写量を測定することで、いかなる状態であっても生存状態にある微生物数を測定できることが明らかとなった。

実施例４ 検量線の作成及び定量的ＰＣＲ法との比較
Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＹＩＴ６１０８^Ｔ（基準株）及びＳ． ａｕｒｅｕｓ ＹＩＴ６０７５^Ｔ（基準株）の対数増殖後期の培養菌体を用いて本発明の方法（定量的ＲＴ−ＰＣＲ法）による検量線の作成を行った。また、定量的ＰＣＲ法による検量線を作成し、本発明の方法との比較を行った。それぞれのＢＨＩ培地を用いた純培養菌体について、菌数が１０^５、１０^４、１０^３、１０^２、１０^１、１０^０個となるように分取し、実施例２と同様にＲＮＡを抽出した。それらを表１記載のプライマーを用い実施例２に従って定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。得られたＣ_Ｔ値と実施例３に記載した培養法で求めた菌数の相関を調べた。また、以下に示す方法にて同じサンプルより得たＤＮＡについて、ｒＤＮＡを標的配列としたＰＣＲ法による定量も併せて検討した。具体的には、菌数が１０^５、１０^４、１０^３、１０^２、１０^１、１０^０個となるように分取した菌液に１ｍＬのＰＢＳを加えて攪拌した後、１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間の条件で遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿物に１ｍＬのＰＢＳを加えて攪拌、遠心、上清除去する操作を２回繰り返し行った。このペレットに、溶菌バッファー３００μｌ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳ、ｐＨ９．０）、ＴＥ飽和フェノール５００μｌ及びガラスビーズ３００ｍｇ（直径０．１ｍｍ）を添加し、ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１２０にて、５，０００ｒｐｍで３０秒間激しく振とうすることにより菌体を破砕した。１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間の条件で遠心分離を行い、上清を回収した。上清にフェノール（ＴＥ飽和）／クロロホルム／イソアミルアルコールを加えて、ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ１２０にて４，０００ｒｐｍで４５秒間激しく振とうした後、１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間の条件で遠心操作を行った。分離、回収した上清を用いてアルコール沈殿を行った後、５０μｌのＴＥバッファーに溶解しＤＮＡ溶液とした。引き続き、得られたＤＮＡ溶液を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、総量を２５μｌとし、２μｌ ＤＮＡ溶液及び最終濃度として１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．４５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２００μＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ、１／１００，０００量のＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ Ｉ、１１ｎｇ／μｌ ＴａｑＳｔａｒｔ（Ｒ）ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）、０．０５Ｕ／μｌ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、０．２５μＭ 各プライマー（ＰＳＤ７Ｆ／Ｒ、ｇ−Ｓｔａｐｈ−Ｆ／Ｒ）を含む反応液で行った。反応液は９４℃で５分間加熱した後、９４℃・２０秒、６０℃・２０秒、７２℃・５０秒を４０サイクル行い、その後、７２℃で１０分間反応した。増幅産物の量をサイクルごとにＳＹＢＲ（Ｒ） Ｇｒｅｅｎ Ｉの蛍光強度として測定した。これらの一連の反応は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（Ｒ）７９００ＨＴにより行った。なお、ＲＮＡ及びＤＮＡ抽出量の１／２５を反応に供した。
その結果、図２に示すとおり、両方法ともに微生物数の対数値とＣ_Ｔ値は非常に良好な相関を示した。図２は、Ｃ_Ｔ値を縦軸に、サンプルに供した各菌種の培養法で測定した個数／抽出を横軸にプロットしたものである。定量的ＲＴ−ＰＣＲは●（黒丸）、定量的ＰＣＲは○（白丸）で示す。定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により得られた近似曲線における相関係数Ｒ^２値は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａで０．９９５５、Ｓ．ａｕｒｅｕｓでは０．９９６１であることから、この検量線をもってＣ_Ｔ値から菌数の算出ができることが明らかとなった。また、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法は、抽出したサンプル中に微生物数が１０^０個であることの検出も可能であり、従来用いられている培養法と同等の検出感度を有することから、培養法の代替として、微生物の定量・検出に用いることができることが明らかとなった。ｒＤＮＡを標的配列としたＰＣＲ法と比較すると、本発明の方法の検出感度は約１，０００倍高く、従来から検討されている遺伝子増幅法を用いた微生物定量手段と比較して、格段の検出感度を有していることが明らかとなった。

実施例５ 糞便中の細菌の定量的検出
ヒト糞便に各種濃度のＰ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを添加し、定量的ＰＣＲ法と本発明の方法の検出範囲を比較した。ヒト大便２０ｍｇあたり菌数として１０^１，１０^２，１０^３，１０^４，１０^５，１０^６，１０^７，１０^８個相当のＰ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａをそれぞれ添加したＰ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ添加糞便サンプルを作製した。Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ添加糞便サンプルより全ＲＮＡ抽出を行い、それを鋳型とした本発明の定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。また、同じサンプルよりＤＮＡを抽出し、それを鋳型とした定量的ＰＣＲを行った。更に同じサンプルから培養法にて菌数を測定した。全ＲＮＡの抽出及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ法は実施例２と、培養法は実施例３と、ＤＮＡの抽出、定量的ＰＣＲ法は実施例４と同様に行った。なお、得られた全ＲＮＡ及び全ＤＮＡのうち１／２，５００を定量的ＲＴ−ＰＣＲ及び定量的ＰＣＲに供した。
その結果、図３に示すとおり、Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ添加糞便サンプルにおいて、本発明の方法では糞便１ｇあたり１０^２．９から１０^１０個／ｇ・糞便の範囲で測定値の近似曲線に直線性が認められた。図３は、Ｃ_Ｔ値を縦軸に、サンプルに供したＰ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの培養法で測定した個数／ｇ・糞便を横軸にプロットしたものである。定量的ＲＴ−ＰＣＲは●（黒丸）、定量的ＰＣＲは○（白丸）で示す。本発明の方法のヒト糞便サンプルでの定量限界は１０^２．９個以上／ｇ・糞便であり、１０^２個以上／ｇ・糞便の培養法とほぼ同等であった。また、培養法では１日間の日数を要したのに対し、本発明の方法では、検体のＲＮＡ固定から定量まで約６時間で完了した。一方、定量的ＰＣＲ法による解析では、１０^５．８から１０^１０個／ｇ・糞便の範囲において測定値の近似曲線に直線性が認められ、検出限界は定量的ＲＴ−ＰＣＲ法の約１／１０００であった。

実施例６ 定量的ＲＴ−ＰＣＲ及び培養法によるヒト糞便大腸菌群の解析
大腸菌群特異的プライマーＥｎ−ｌｓｕ３Ｆ／３’Ｒを用いて、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法にてヒト糞便フローラの解析を行った。成人３８名の新鮮排泄便を採取し、嫌気条件下にて輸送培地（グリセリン１０％，システイン５％，ｌａｂ ｌｅｍｃｏ ｐｏｗｄｅｒ １％，ＮａＣｌ ０．０４５％，ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．０２２５％，Ｋ_２ＨＰＯ_４ ０．０２２５％，（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ０．０２２５％，ＣａＣｌ_２ ０．００２２５％，ＭｇＳＯ_４ ０．００２２５％）により１０倍希釈した。この希釈液より２００μｌ（糞便として２０ｍｇ）を分取し、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により用いる全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡの１／２，５００量を鋳型として定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。また、同じ希釈液より培養法（ＤＨＬ選択培地）によるＣＦＵの定量を行った。ＲＮＡの固定及び全ＲＮＡの抽出ならびに定量的ＲＴ−ＰＣＲは実施例２の記載に、培養法は定法に従った。定量的ＲＴ−ＰＣＲによる菌数算出のための検量線にはＥ． ｃｏｌｉ ＹＩＴ ６０４４^Ｔ（基準株）より抽出した全ＲＮＡを用いた。
その結果、図４に示すように本発明のｒＲＮＡを標的とした定量的ＲＴ−ＰＣＲ法と培養法では相関係数が０．９２５５と非常に高い相関関係を示すことが明らかとなった。なお、図４では、縦軸に培養法による定量結果を、横軸には本発明の方法による定量結果を示す。また、培養法では、全操作を行うのに２日間を要したのに対し、本発明の方法では約６時間ですべての操作を完了した。

実施例７ 牛乳の微生物検査
市販の牛乳に、各種濃度のＥ． ｃｏｌｉ、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓを添加し、混釈培養法と本発明の方法の定量値を比較した。市販の牛乳に１０^０、１０^１，１０^２，１０^３，１０^４，１０^５，１０^６個／ｍＬとなるようにＥ． ｃｏｌｉ又はＳ． ａｕｒｅｕｓを添加したものをサンプルとした。各サンプルのうち、１ｍＬを全ＲＮＡ抽出、１ｍＬを混釈培養法（Ｅ． ｃｏｌｉ：デソキシコレイト寒天培地、Ｓ． ａｕｒｅｕｓ、Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ：一般寒天培地、３７℃、２０±２時間）に供した。抽出した全ＲＮＡについて、表１に記載のプライマーを用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲ法による解析を行い、得られたＣ_Ｔ値と混釈培養法で得た菌数の相関を求めた。なお、実施例２に記載する方法で、全ＲＮＡ抽出及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を行い、抽出した全ＲＮＡのうち１／２５を定量的ＲＴ−ＰＣＲに供した。
その結果、図５に示すように何れの菌種でも牛乳１ｍｌあたり１０^０〜１０^６の範囲でＣ_Ｔ値と菌数は相関した。図５は、Ｃ_Ｔ値を縦軸に、サンプルに供したＥ． ｃｏｌｉ（図５左上）Ｓ． ａｕｒｅｕｓ（図５右）及びＢ． ｃｅｒｅｕｓ（図５左下）の混釈培養法で測定した個数／ｍＬ・牛乳を横軸にプロットしたものである。また、本発明の方法の定量限界は１０^０個以上／ｍＬ・牛乳で混釈培養法と同等であることから、乳等省令に記載の公定培地（デソキシコレイト寒天培地、一般寒天培地）を用いた混釈培養法の代替になり得ることが明らかとなった。また、混釈培養法では１日間の日数を要したのに対し、本発明の方法では、検体のＲＮＡ固定から定量まで約６時間で完了した。

実施例８ 血液中の細菌検査
ヒト血液に、各種濃度のＳ． ａｕｒｅｕｓ、Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを添加し、混釈培養法（血液培養法）と本発明の方法の定量値を比較した。抗凝固剤として３．８％クエン酸ナトリウム液を１／１０量添加したヒト血液に１０^０、１０^１，１０^２，１０^３，１０^４，１０^５個／ｍＬとなるようにＳ． ａｕｒｅｕｓ又はＰ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを添加したものをサンプルとした。各サンプルのうち、０．５ｍＬを全ＲＮＡ抽出、０．５ｍＬを混釈培養法（ＢＨＩ寒天培地）に供した。抽出した全ＲＮＡについて、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法による解析を行い得られたＣ_Ｔ値と混釈培養法で得た菌数の相関を求めた。なお、実施例２に記載する方法で、全ＲＮＡ抽出及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を行った。なお、抽出した全ＲＮＡのうち１／２５を定量的ＲＴ−ＰＣＲに供した。
その結果、図６に示すように各菌株で１０^０〜１０^５個／０．５ｍＬの範囲で菌数とＣ_Ｔ値に相関が見られた。図６は、Ｃ_Ｔ値を縦軸に、サンプルに供したＰ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（図６左）及びＳ． ａｕｒｅｕｓ（図６右）の混釈培養法で測定した個数／０．５ｍＬ・血液を横軸にプロットしたものである。また、本発明の方法の定量限界は１０^０個以上／０．５ｍＬ・血液であり、混釈培養法と同程度であることから、混釈培養法の代替となり得ることが示された。更に、混釈培養法では１日間の日数を要したのに対し、本発明の方法では、検体のＲＮＡ固定から定量まで約６時間で完了した。

実施例９ 発酵乳製品の大腸菌検査
市販のヤクルト（（株）ヤクルト本社製）に１０^０、１０^１、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５個／ｍＬの菌数となるようにＥ． ｃｏｌｉを添加したものをサンプルとした。各サンプルのうち、１ｍＬを全ＲＮＡ抽出、１ｍＬをデソキシコレイト寒天培地による混釈培養法（３７℃、２０±２時間）に供した。抽出した全ＲＮＡについて、大腸菌群特異的プライマー Ｅｎ−ｌｓｕ ３Ｆ／３’Ｒを用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲ法による解析を行い、得られたＣ_Ｔ値と混釈培養法で得た菌数の相関を調べた。全ＲＮＡ抽出は、ガラスビーズ添加による菌体破砕を除いた以外は実施例２に記載する方法で行い、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法は実施例２に記載する方法で行った。なお、抽出した全ＲＮＡのうち１／２５を定量的ＲＴ−ＰＣＲに供した。
その結果、図７に示すように、１０^０〜１０^５個／ｍＬの範囲でＣ_Ｔ値と菌数は高く相関した。図７は、Ｃ_Ｔ値を縦軸に、サンプルに供したＥ． ｃｏｌｉの混釈培養法で測定したｌｏｇ_１０個数／ｍＬ・ヤクルトを横軸にプロットしたものである。本発明の方法の定量限界は１０^０個以上／ｍＬ・ヤクルトで、混釈培養法と同等であることから、乳等省令に記載の公定培地（デソキシコレイト寒天培地）を用いた混釈培養法の代替になり得ることが明らかとなった。また、混釈培養法では１日間の日数を要したのに対し、本発明の方法では、検体のＲＮＡ固定から定量まで約６時間で完了した。

実施例１０ 定量的ＲＴ−ＰＣＲ及び培養法によるヒト糞便中の乳酸菌、腸球菌の解析
ヒト糞便中のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の菌数について、表１記載のプライマーを用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲ法と培養法による比較を行った。健常成人４８名の新鮮排泄便を採取し、実施例６に記載の方法で糞便を処理し、実施例２に記載の方法で、ＲＮＡの固定、全ＲＮＡ抽出及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を行った。得られた全ＲＮＡのうち１／２，０００〜１／２００，０００を定量的ＲＴ−ＰＣＲに供した。また、同じ糞便希釈液より培養法（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属：ＬＢＳ培地、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属：ＣＯＢＡ培地、共に３７℃、４８時間）によるＣＦＵの定量を行った。培養法は定法に従い、出現したコロニーは生化学的性状試験（グラム染色、カタラーゼ試験、ＡＰＩ Ｓｔｒｅｐ）により菌種の同定を行った。定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の菌数値は、ｓｇ−Ｌａｃｉ−Ｆ／Ｒ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ サブグループ）、ｓｇ−Ｌｓａｋ−Ｆ／Ｒ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ サブグループ）、ｓｇ−Ｌｃａｓ−Ｆ／Ｒ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ サブグループ）、ｓｇ−Ｌｒｕｍ−Ｆ／Ｒ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｕｍｉｎｉｓ サブグループ）、ｓｇ−Ｌｒｅｕ−Ｆ／Ｒ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ サブグループ）、ｓｇ−Ｌｐｌａ−Ｆ／Ｒ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ サブグループ）、ｓ−Ｌｂｒｅ−Ｆ／Ｒ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ｓ−Ｌｆｒｕ−Ｆ／Ｒ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ）、ＬＦｅｒ−１／２（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）の各プライマーを用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により得た菌数を合算して算出した。
その結果、表４に示すように、ヒト糞便中のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属の菌数は、本発明の方法と培養法でほぼ同等であった。一方、両菌属とも培養法に比べて本発明の方法では検出頻度が高かった。これは、今回の標的としたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属に属しているにもかかわらず、用いた選択培地の選択性が必要以上に強かったために増殖できない菌が存在したか、あるいは、用いた選択培地の選択性が弱かったために、他の大量に存在する標的以外の菌属に属する菌が培地に成育して、標的とする菌属の検出ができなかったためと推察された。以上より、本発明の方法は、培養法と同等の菌数を得ることができるだけでなく、これまで培養法では検出できなかった菌をも検出・定量できることが示唆された。また、培養法では、菌種の同定まで含めた全操作を行うのに７日間を要したのに対し、本発明の方法では約２０時間ですべての操作を完了した。

Claims (9)

1. 被検体中における目的微生物ｒＲＮＡ量を指標とし、当該目的微生物ｒＲＮＡ量と目的微生物の菌数との間の相関関係から、当該目的微生物の菌数を求めることを特徴とする、生存状態にある目的微生物の定量方法。
2. 前記目的微生物ｒＲＮＡ量が、目的微生物ｒＲＮＡに特異的にハイブリダイズしうる核酸断片及び被検体試料を用いて行うＰＣＲ反応による増幅産物を測定することにより求められるものである請求項１記載の方法。
3. 前記増幅産物の測定が、当該増幅産物が一定量に達した時のＰＣＲサイクル数を特定することによりなされるものである請求項２記載の方法。
4. 増幅産物を経時的に計測するものである請求項２又は３記載の方法。
5. 被検体が、糞便、食品又は生体由来試料である請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
6. 被検体試料中における目的微生物ｒＲＮＡが、微生物中で固定化されたものである請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
7. 目的微生物ｒＲＮＡに特異的にハイブリダイズしうる核酸断片が、配列番号２、３又は５〜２８記載の塩基配列若しくはそれと相補的な塩基配列からなる核酸断片である請求項２〜６のいずれか１項記載の方法。
8. 請求項１〜７のいずれか１項記載の方法を実施するためのキット。
9. （１）目的微生物ｒＲＮＡに特異的にハイブリダイズしうる核酸断片、及び／又は（２）ＲＮＡの抽出、ＲＮＡの固定若しくはＰＣＲ反応に用いる試薬を含む請求項８記載のキット。
   

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