JPH10210980A

JPH10210980A - 乳酸菌検出用オリゴヌクレオチド及び該菌の検出方法

Info

Publication number: JPH10210980A
Application number: JP9028259A
Authority: JP
Inventors: Wataru Funabashi; 亙船橋
Original assignee: Asahi Breweries Ltd
Current assignee: Asahi Breweries Ltd
Priority date: 1997-01-29
Filing date: 1997-01-29
Publication date: 1998-08-11

Abstract

(57)【要約】【課題】ビール混濁菌であるラクトバチルス属の菌、
特にラクトバチルスブレビス菌、ラクトバチルスカ
ゼイ菌、ラクトバチルスコリニフォルミス菌、ラクト
バチルスプランタラム菌、ラクトバチルススピーシ
ーズ AB No.７４菌を検出するためのオリゴヌクレオチ
ド、及びこれを用いる該菌の検出方法を提供する。【解決手段】乳酸菌であるラクトバチルス属由来の１
６ＳｒＲＮＡ遺伝子と選択的にハイブリダイズするヌ
クレオチド配列または該配列に対する相補的配列を有す
ることを特徴とするヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ビール混濁菌であるラ
クトバチルス属の菌、特にラクトバチルスブレビス菌、
ラクトバチルスカゼイ菌、ラクトバチルスコリニフ
ォルミス菌、ラクトバチルスプランタラム菌、ラクト
バチルススピーシーズ AB No.７４菌を検出するため
のオリゴヌクレオチド、及びこれを用いる該菌の検出方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】現
在、ビール製造における微生物検査では、菌種を同定す
るには、増殖培養を経て、菌を単離しなければならず、
少なくとも７日は要する。その後、単離した菌を増殖さ
せ、形態観察、グラム染色性、カタラーゼ試験、糖資化
性などの多くの性状試験を行うことにより同定を行って
いる。また、これら一般に行われている同定試験のほか
に、単離した菌からＤＮＡを抽出し、それを膜上あるい
は他の支持体上に固定し、標準菌のＤＮＡをプローブと
してハイブリダイゼーション試験を行うことにより菌種
を同定する方法がある。しかし、この方法も数日を要
し、さらに十分な検出感度および選択性を得るのが難し
い。

【０００３】より迅速な検出方法として、最近では、J.
Am.Soc.Brew.Chem.:52(1) 19-23, 1994 に報告されてい
る生物ルミネッセンスを利用したＡＴＰ発光法により生
菌の検出を行う方法があるが、菌種を問わずに検出する
ため、同定には利用できない。また、ビールに有害な一
部の乳酸菌、例えば、Lactobacillus brevis、Lactobac
illus casei、Lactobacillus plantarum、Lactobacillu
s coryniformis等については、特開平６−４６８１１及
び特開平６−３１１８９４に開示されているように乳酸
菌に特異的な抗体を使用することによって、比較的早期
の同定が可能となっている。しかし、この方法を適用す
るためには、菌を単離するまでの操作が必要なために、
その分日数を要し、さらに十分な検出感度および選択性
を得るのが難しい。

【０００４】そこで、さらに迅速な検出法が検討され、
最近では、特開平５−１５４００、特開平６−１４１８
９９、特開平７−２８９２９５、または J.Am.Soc.Bre
w.Chem.:52(3) 95-99, 1994 に報告されているように、
検体となる乳酸菌のＤＮＡを抽出し、このＤＮＡに相補
的なオリゴヌクレオチドをプライマーとして機能させた
ＰＣＲ法を用いた乳酸菌の検出する方法がある。

【０００５】なお、特開平５−１５４００および特開平
６−１４１８９９では、ラクトバチルスブレビスの５
ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を標的とし、そのヌクレオチ
ド配列と相補的となるように化学合成されたオリゴヌク
レオチドを利用した乳酸菌の検出方法であるが、本発明
は、ラクトバチルスブレビスの５ＳリボソームＲＮＡ
遺伝子を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的とな
るように化学合成したオリゴヌクレオチドを用いるもの
であり、その遺伝子配列の基本的な違いから、ラクトバ
チルスブレビスの検出の特異性が前記公報の技術とは
異なるものである。

【０００６】また、特開平７−２８９２９５では乳酸菌
は、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されてい
る Lactobacillus sp.DA1. という乳酸菌の遺伝子配列
を用い、既知のプライマーでは検出できない乳酸菌を検
出することを目的としており、本発明で検出の特異性を
検討しようとする乳酸菌とは種が異なっている。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、乳酸菌である
ラクトバチルス属由来の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と選択
的にハイブリダイズするヌクレオチド配列または該配列
に対する相補的配列を有するヌクレオチドに関する。さ
らに詳しくは、検体中に存在するラクトバチルス属菌に
属するラクトバチルスブレビス（Lactobacillus brev
is）菌、ラクトバチルスカゼイ（Lactobacillus case
i）菌、ラクトバチルスチルスコリニフォルミス（Lac
tobacillus coryniformis）菌、ラクトバチルスプラ
ンタラム（Lactobacillus plantarum）菌、ラクトバチ
ルススピーシーズ（Lactobacillus sp.）AB No.７４
菌を選択的に検出し、同時に同定できる方法を提供す
る。

【０００８】なお、ラクトバチルススピーシーズ AB
No.７４菌は、国内のビール醸造場から単離された乳酸
桿菌で、上記乳酸菌又は特開平7-289295記載のラクトバ
チルススピーシーズＤＡ１（Lactobacillus sp.ＤＡ
１）の何れとも異なる菌であり、また、ビールを培地と
して生育できる特徴をもつ。遺伝子増幅に関する技術は
すでに公知であり、Saiki らが開発したPolymeraseChai
n Reaction 法（以下、ＰＣＲ法と略す；Science 230,
13-50, 1985）を基に行うことができる。この方法は、
特定の遺伝子配列を増幅させる反応で、迅速・高感度で
高い特異性を持ち、かつ簡便であることから、遺伝学的
研究のみならず、近年は、医療分野における病原菌の迅
速判定や、食品分野における有害菌の迅速検出にも応用
が試みられてきている。ＰＣＲ法を行うことにより、検
体中の僅かな量しか標的配列が存在していなくても、２
つのプライマーが挟む標的ヌクレオチド配列は何百万倍
にも増幅され、検出が可能までに大量にそのコピーが産
生される。また、ＰＣＲ法を行うには、検体中に存在す
る菌から核酸成分を遊離させる必要があるが、ＰＣＲは
標的配列が数分子以上存在すれば増幅反応が進むので、
溶菌酵素や界面活性剤を用いた簡便な前処理をするだけ
で十分に試験に供することができる。そのため、従来の
最近検出法に比べ、利用価値が非常に高い。

【０００９】

【発明の実施の形態】これらのことを利用すべく、本発
明では、ラクトバチルス属菌に属するラクトバチルス
ブレビス（Lactobacillus brevis）菌、ラクトバチルス
カゼイ（Lactobacillus casei）菌、ラクトバチルス
コリニフォルミス（Lactobacillus coryniformis）
菌、ラクトバチルスプランタラム（Lactobacillus pl
antarum)菌、ラクトバチルススピーシーズ（Lactobac
illus sp.）AB No.７４菌の各菌の１６Ｓリボソーム遺
伝子と特異的にハイブリダイズするように作成したオリ
ゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ法を行い、認
識されるべき配列の検出を行うことにより、検体中に該
菌が存在するか否かを迅速、高感度、特異的に判定す
る。検体は、ビール及びビール製造途中の半製品、また
は、下水などの嫌気的環境下から採取されたサンプルで
もよい。また、プライマーに用いるオリゴヌクレオチド
は化学合成されたものでも天然のものでも、いずれの使
用でも可能である。ＰＣＲ反応に用いるＤＮＡポリメラ
ーゼは、９０℃以上の温度に耐熱性があればよい。ＰＣ
Ｒ反応における温度条件は、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にす
る熱変性反応で９０〜９８℃、プライマーを鋳型ＤＮＡ
にハイブリダイズさせるアニーリング反応で３７〜６５
℃、ＤＮＡポリメラーゼを作用させる鎖長反応で５０〜
７５℃で行い、これを１サイクルとしたものを数十サイ
クル行わせることにより、標的配列を増幅させることが
できる。

【００１０】ＰＣＲ反応後、反応物を電気泳動により分
離し、臭化エチジウム等で核酸染色を行い、増幅された
ヌクレオチド配列の塩基長が、上述の標的配列の塩基長
と等しければ、検体中にラクトバチルスブレビス（La
ctobacillus brevis）菌、ラクトバチルスカゼイ（La
ctobacillus casei）菌、ラクトバチルスチルスコリ
ニフォルミス（Lactobacillus coryniformis）菌、ラク
トバチルスプランタラム（Lactobacillus plantaru
m）菌、ラクトバチルススピーシーズ（Lactobacillus
sp.）AB No.７４菌の各菌の存在を判定できる。増幅さ
れたヌクレオチド配列の検出には、クロマトグラフィー
も有効である。

【００１１】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明する。１．ラクトバチルススピーシーズ（Lactobacillus s
p.）AB No.７４菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列の決
定 Lactobacillus sp. AB No.７４菌からのDNA抽出まず、Lactobacillus sp. AB No.７４菌からDNAを抽出
した。ＤＮＡの抽出は次のように行った。供試菌の菌液
1mlを15Krpmで5分間、4℃にて遠心分離した後、上清を
捨てた。1ml滅菌水を加えて懸濁し、再び15Krpmで5分
間、4℃にて遠心分離し上清を捨てた後、200μlの細胞
壁溶解液（10mM Tris-HCl、1mM EDTA、0.35M Sucrose p
H8.0に Lysozyme を1mg/ml、 N-Acetylmuramidaseを50
μg/mlになるように添加）に懸濁し、37℃、30分間保温
した。400μlの蛋白質分解溶液（100mM Tris-HCl、1.5M
NaCl、20mM EDTA、2%CTAB、2%2-Mercaptoethanol pH8.
0 にProteaseKを120μg/mlになるように添加）を加え、
50℃、60分間保温した後、400μlのフェノール・クロロ
ホルムを加え、攪拌した後に15Krpmで5分間、25℃にて
遠心分離し、上清400μlを新しいエッペンチューブに移
した。300μlの2-propanolを加え、攪拌した後に−80℃
にて10分間静置し、15Krpmで15分間、4℃にて遠心分離
して沈殿を得た。冷70％エタノール200μlを加え、15Kr
pmで5分間、4℃にて遠心分離し、上清を捨てた。残渣を
50μlの滅菌水に懸濁し、DNA溶液とした。

【００１２】 Lactobacillus sp. AB No.７４菌の１
６ＳｒＲＮＡの増幅次に、Lactobacillus sp. AB No.７４菌の１６ＳｒＲＮ
Ａの増幅を行った。前述のＤＮＡ溶液から得たＤＮＡ約
20ngをテンプレートとし、表１に示す１６ＳｒＲＮＡ遺
伝子シーケンシングプライマーの1及び11を用いて、PCR
を行った。PCRは、供試DNA溶液5μl、10×PCRバッファ
ー（100mM Tris-HCl(pH9.0)、500mM KCl、1%TritonX-10
0）5μl、25mM MgCl₂ 4μl、20mM dNTP混合液0.5μl、
プライマー１ 0.5μl、プライマー１１ 0.5μl、Taq DN
A polymerase（東洋紡；TAP-101）0.25μl及び滅菌蒸留
水34.25μlを混合し、PCR条件は変性は90〜98℃にて1分
間、アニーリングは37〜60℃にて2分間、伸長は70〜75
℃にて2分間で30サイクル行った。反応液5μlを1×TBE
バッファーを用いた1.2%アガロースゲル電気泳動に供
し、エチジウムブロマイドにて20分程度染色を行った
後、紫外線を照射することによりPCR産物の観察を行っ
た。

【００１３】アガロース電気泳動の後、エチジウムブロ
マイドにて染色し、目的とする約1.5KbpのDNA分子を含
むアガロースゲルを剃刀等を用いて切り出した。宝酒造
（株）のSUPRECTM-01（DNA回収用フィルター付き遠心チ
ューブ）に移した後、ミクロスパーテル等を用いてゲル
を細かく砕き、−80℃にて10分間静置し凍結させた。滅
菌水300μlを加えて、5krpmで10分間遠心分離し、遠心
チューブ底に溜まったDNA溶液を回収した。得られた溶
液300μlに対して等量のフェノール・クロロホルムを加
えて15Krpmで5分間、25℃にて遠心分離し、上清200μl
を新しいエッペンチューブに移した。約400μlの冷エタ
ノールを加え、−80℃にて10分間静置した後に15Krpmで
5分間、4℃にて遠心分離し、上清を捨てた。冷70%エタ
ノール約150μlを加えた後、15Krpmで5分間、4℃にて遠
心分離した。上清を捨てた後、減圧乾燥し、50μl滅菌
蒸留水に懸濁して16SrDNA溶液とした。

【００１４】シーケンス反応用テンプレートの調製上記の16SrDNA約20ngをテンプレートとし、表１に示す
各種１６ＳｒＲＮＡ遺伝子Sシーケンシングプライマー
を2と3、1と4、6と7、5と8、10と11、9と12、2と7、1と
8、6と13、5と14の計10通りの組み合わせで用い、PCR条
件は90〜98℃にて1分間、37〜60℃にて2分間、70〜75℃
にて2分間で30サイクル行った。増幅した目的長のDNA分
子を、上記と同様の方法で精製し、シーケンシング反応
に供した。

【００１５】

【表１】但し、表中Mは、M13のForward(-29)プライマーの配列：(T)CACGACGTTGTAAAACGAC を示す。

【００１６】シーケンシング上記DNAをテンプレートとし、IRD41標識M13 Forward（-
29）primerを用いて、LI-COR社DNAシーケンサー取り扱
い説明書に従って、シーケンシング反応を行った。同説
明書に従って電気泳動及び解析を行った。DNA配列の編
集及びデータ解析はDNAsis（日立ソフトウエアー）を用
いて行った。

【００１７】２．特異的プライマーの決定ラクトバチルスブレビス（Lactobacillus brevis）
菌、ラクトバチルスカゼイ（Lactobacillus casei）
菌、ラクトバチルスチルスコリニフォルミス（Lactob
acillus coryniformis）菌、ラクトバチルスプランタ
ラム（Lactobacillus plantarum）菌の各乳酸菌の16SrD
NA塩基配列に関しては、ＥＭＢＬのＤＮＡデータベース
から情報を得、ラクトバチルススピーシーズ（Lactob
acillus sp.）AB No.７４菌については前記１．で得ら
れた配列について、その多様性の認められる領域（菌種
により塩基配列が異なる領域で、塩基配列番号1〜500番
目の領域に相当する）を図１に並列して示した。

【００１８】特異的上流プライマーは、図１や特開平７
−２８９２９５等の公知の塩基配列情報を参考にして、
それぞれの菌に特異的と考えられる20bp程度の塩基配列
を選び出し作成した。下流プライマーに関しては、全て
の菌に共通なものとして、16Sr RNA遺伝子の907番目付
近の配列を用いて作成し、ユニバーサルプライマー（以
下、ＵＮＶ１と略す）とした。以上作成したプライマー
を表２に示した。

【００１９】

【表２】各種のプライマーであるオリゴヌクレオチドは公知の方
法にて化学合成した。プライマーは滅菌水で１００μＭ
に調製してＰＣＲ反応に用いた。

【００２０】次に前記のプライマーの中からそれぞれの
菌種に特異性の高いものを選択するため試験した。L.br
evis（JCM 1059）、 L.casei（ATCC334) 、L.plantarum
(JCM1149）、L.coryniformis（JCM1164) 、L.lindneri
（DSM20690）、L.sp. AB No.７４菌より前述の方法にて
DNAを抽出し、これをテンプレートとして、各乳酸菌DNA
に対する、上記にて作成した上流プライマーの反応性を
調査した。また、下流プライマーとしてはUNV1を用い
た。

【００２１】結果を表３に示すが、上流プライマーとし
てLBP2、LCP1、LOP4、LPP1及びL74p4-3を用いた場合、
それぞれ対応する乳酸菌DNAのみに反応し、特異性が高
いことが確認された。

【００２２】

【表３】

【００２３】以上の結果から最終的には、 LBP2、LCP
1、LPP1、LOP4及びL74p4-3を特異的な上流プライマーと
して選択した。

【００２４】３．検出特異性の確認試験次に、選択プライマーの対応する各種保存菌に対する反
応を調査した。保存しているL.brevis 3株、L.casei 5
株、L.coryniformis 2株、L.plantarum3株よりDNAを抽
出し、各菌DNAをテンプレートとした時の対応する特異
プライマーの反応を調査した。

【００２５】結果を表４に示すが、各菌について、保存
リスト記載の菌株名とPCRの結果が一致しており、充分
な信頼性の検出法であることがわかった。

【００２６】

【表４】

【００２７】

【発明の効果】従来法では、乳酸菌の菌種を同定するま
でに約１０日近くかかっていたが、本発明を用いること
により、１〜３日以内で迅速かつ明確に、検体中のラク
トバチルスブレビス菌、ラクトバチルスカゼイ菌、
ラクトバチルスコリニフォルミス菌、ラクトバチルス
プランタラム菌、ラクトバチルススピーシーズ ABN
o.７４菌の各菌を検出し、同時に同定することが可能で
ある。

【００２８】しかも、ＰＣＲ法は、検体の前処理も含め
て操作が簡便で、使用する薬品、器具、装置も安価であ
ることから、作業者の熟練を要せず、低コストで信頼性
の高い検査が可能となる。

【００２９】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：1524 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：Lactobacillus sp. 株名： AB No.74 特徴を決定した方法：E 配列 TGATCCTGGC TCAGGATGAA CGCTGGCGGC GTGCCTAATA CATGCAAGTC 50 GAACGCATCC CGTTAAATGA AGTGCTTGCA CATCGGATGA GTGGCGAACT 100 GTGGCGAACT GGTGAGTAAC ACGTGGGTAA CCTGCCCAGA AGCAGGGGAT 150 AACACTTGGA AACAGGTGCT AATACCGTAT AACAACAAAA ACCGCATGGT 200 TTTTGTTTGA AAGGTGGTTT CGGCTATCAC TTCTGGAAGG ACCCGCGGCG 250 TATTAGCTAG TTGGTGGAGT AACGGTTCAC CAAGGCAATG ATACGTAGCC 300 GACCTGAGAG GGTAATCGGC CACATTGGGA CTGAGACACG GCCCAAACTC 350 CTACGGGAGG CAGCAGTAGG GAATCTTCCA CAATGGACGA AAGTCTGATG 400 GAGCAACGCC GCGTGAGTGA AGAAGGTTTT CGGATCGTAA AACTCTGTTG 450 TTGAAGAAGA ACACGTTTGA GAGTAACTGT TCAGACGTTG ACGGTATTCA 500 ACCAGAAAGC CACGGCTAAC TACGTGCCAG CAGCCGCGGT AATACGTAGG 550 TGGCAAGCGT TATCCGGATT TATTGGGCGT AAAGCGAGCG CAGGCGGTTA 600 CTTAAGTCTG ATGTGAAAGC CTTCGGCTTA ACCGGAGAAG TGCATCGGAA 650 ACTGGGTAAC TTGAGTGCAG AAGAGGACAG TGGAACTCCA TGTGTAGCGG 700 TGAAATGCGT AGATATATGG AAGAACACCA GTGGCGAAGG CGGCTGTCTG 750 GTCTGTAACT GACGCTGAGG CTCGAAAGCA TGGGTAGCGA ACAGGATTAG 800 ATACCCTGGT AGTCCATGCC GTAAACGATG AATGCTAGGT GTTGGAGGGT 850 TTCCGCCCTT CAGTGCCGCA GCTAACGCAT TAAGCATTCC GCCTGGGGAG 900 TACGACCGCA AGTTGAAACT CAAAGGAATT GACGGGGGCC CGCACAAGCG 950 GTGGAGCATG TGGTTTAATT CGAAGCTACG CGAAGAACCT TACCAGGTCT 1000 TGACATACTG TGCTAACCTA AGAGATTAGG CGTTCCCTTC GGGGACGCAG 1050 ATACAGGTGG TGCATGGCTG TCGTCAGCTC GTGTCGTGAG ATGTTGGGTT 1100 AAGTCCCGCA ACGAGCGCAA CCCTTATTGT CAGTTGCCAG CATTTAGTTG 1150 GGCACTCTGG CGAGACTGCC GGTGACAAAC CGGAGGAAGG TGGGGATGAC 1200 GTCAAGTCAT CATGCCCCTT ATGACCTGGG CTACACACGT GCTACAATGG 1250 ATGGTACAAC GAGTTGCGAA CTCGCGAGAG CAAGCTAATC TCTTAAAGCC 1300 ATTCTCAGTT CGGACTGTAG GCTGCAACTC GCCTACACGA AGTCGGAATC 1350 GCTAGTAATC GCGGATCAGC ATGCCGCGGT GAATACGTTC CCGGGCCTTG 1400 TACACACCGC CCGTCACACC ATGAGAGTTT GCAACACCCA AAGTCGGTTC 1450 GGTAACCTTC GGGAGCCAGC CGCCTAAGGT GGGGCAGATG ATTAGGGTGA 1500 AGTCGTAACA AGGTAGCCGT AGAG 1524

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:225）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】乳酸菌であるラクトバチルス属由来の１
６ＳｒＲＮＡ遺伝子と選択的にハイブリダイズするヌ
クレオチド配列または該配列に対する相補的配列を有す
ることを特徴とするヌクレオチド。
【請求項２】検体中に存在するラクトバチルス属菌に
属するラクトバチルスブレビス（Lactobacillus brev
is）菌を選択的に検出するため、ラクトバチルスブレ
ビス菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子をコードするヌ
クレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列の一
部を含むオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレ
オチドが次の配列５’−ＣＴＧＡＴＴＴＣＡＡＣＡＡＴＧＡＡＧＣ−３’ を有するか、または対応する相補的配列を有することを
特徴とする乳酸菌検出用オリゴヌクレオチド。
【請求項３】検体中に存在するラクトバチルス属菌に
属するラクトバチルスカゼイ（Lactobacillus case
i）菌を選択的に検出するため、ラクトバチルスカゼ
イ菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子をコードするヌク
レオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列の一部
を含むオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオ
チドが次の配列５’−ＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＣＴＴ
ＧＧＣ−３’ を有するか、または対応する相補的配列を有することを
特徴とする乳酸菌検出用オリゴヌクレオチド。
【請求項４】検体中に存在するラクトバチルス属菌に
属するラクトバチルスコリニフォルミス（Lactobacil
lus coryniformis）菌を選択的に検出するため、ラクト
バチルスコリニフォルミス菌の１６ＳリボソームＲＮ
Ａ遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とし、そ
のヌクレオチド配列の一部を含むオリゴヌクレオチドで
あって、該オリゴヌクレオチドが次の配列５’−ＧＧＧＡＣＴＡＧＡＧＴＡＡＣＴＧＴＴＡＧＴＣ
Ｃ−３’ を有するか、または対応する相補的配列を有することを
特徴とする乳酸菌検出用オリゴヌクレオチド。
【請求項５】検体中に存在するラクトバチルス属菌に
属するラクトバチルスプランタラム（Lactobacillus
plantarum）菌を選択的に検出するため、ラクトバチル
スプランタラム菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を
コードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオ
チド配列の一部を含むオリゴヌクレオチドであって、該
オリゴヌクレオチドが次の配列５’−ＴＧＧＡＣＣＧＣＡＴＧＧＴＣＣＧＡＧＣ−３’ を有するか、または対応する相補的配列を有することを
特徴とする乳酸菌検出用オリゴヌクレオチド。
【請求項６】検体中に存在するラクトバチルス属菌に
属するラクトバチルススピイーシーズ（Lactobacillu
s sp.）AB No.７４菌を選択的に検出するため、ラクト
バチルススピイーシーズ（Lactobacillus sp.）AB N
o.７４菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子をコードする
ヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列の
一部を含むオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌク
レオチドが配列番号１に記載されるオリゴヌクレオチド
配列の内、５０番目から２００番目までに記載される配
列の一部又は全部の配列を有するか、または対応する相
補的配列を有することを特徴とする乳酸菌検出用オリゴ
ヌクレオチド。
【請求項７】検体中に存在するラクトバチルス属菌に
属するラクトバチルススピイーシーズ（Lactobacillu
s sp.）AB No.７４菌を選択的に検出するため、ラクト
バチルススピイーシーズ（Lactobacillus sp.）AB N
o.７４菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子をコードする
ヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列の
一部を含むオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌク
レオチドが配列番号１に記載されるオリゴヌクレオチド
配列の内、１番目から５００番目までに記載される配列
の一部又は全部の配列を有するか、または対応する相補
的配列を有することを特徴とする乳酸菌検出用オリゴヌ
クレオチド。
【請求項８】検体中に存在するラクトバチルス属菌に
属するラクトバチルススピイーシーズ（Lactobacillu
s sp.）AB No.７４菌を選択的に検出するため、ラクト
バチルススピイーシーズ（Lactobacillus sp.）AB N
o.７４菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子をコードする
ヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列の
一部を含むオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌク
レオチドが配列番号１に記載されるオリゴヌクレオチド
配列の一部又は全部の配列を有するか、または対応する
相補的配列を有することを特徴とする乳酸菌検出用オリ
ゴヌクレオチド。
【請求項９】検体中に存在するラクトバチルス属菌に
属するラクトバチルススピイーシーズ（Lactobacillu
s sp.）AB No.７４菌を選択的に検出するため、ラクト
バチルススピイーシーズ（Lactobacillus sp.）AB N
o.７４菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子をコードする
ヌクレオチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列の
一部を含むオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌク
レオチドが次の配列５’−ＴＴＴＴＡＡＣＡＴＣＧＧＡＴＧＧＡＧ−３’ を有するか、または対応する相補的配列を有することを
特徴とする乳酸菌検出用オリゴヌクレオチド。
【請求項１０】請求項２、３、４、５または９に記載
されたオリゴヌクレオチドの配列のうち、少なくとも連
続した１０塩基以上を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】請求項２、３、４、５または９に記載
されたオリゴヌクレオチド配列を鎖長反応のプライマー
として機能させ、標的のヌクレオチド配列を増幅させる
方法。
【請求項１２】請求項１１に記載の方法で増幅された
ヌクレオチド配列を、電気泳動、またはクロマトグラフ
ィーで分離し、その結果、認識されるべき配列が存在し
ているか否かを判定することで検体中のラクトバチルス
属菌の検出を行う方法。
【請求項１３】請求項１１に記載の方法で増幅された
ヌクレオチド配列を、ゲル電気泳動および核酸染色法に
より検出する方法。
【請求項１４】請求項２、３、４、５または９記載の
オリゴヌクレオチドをＤＮＡ検出用プローブとして機能
させる方法。
【請求項１５】請求項２、３、４、５または６記載の
オリゴヌクレオチド配列が標識物により修飾されたオリ
ゴヌクレオチド。