JP2002034572A - ラクトバチルスカゼイ検出のための塩基配列、および該菌の検出方法 - Google Patents
ラクトバチルスカゼイ検出のための塩基配列、および該菌の検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、ラクトバチルス カゼイ検出のため
の塩基配列、および該菌の検出方法を提供すること。 【解決手段】ビール混濁菌の23S rRNAまたはrDNAの領域
に対して相補的であるか、またはそれにハイブリダイズ
するオリゴヌクレオチドである。詳しくは、配列番号１
〜17に示す配列群中のいずれか８個の連続したオリゴヌ
クレオチドを含む配列の少なくとも90％に対して相同的
であるオリゴヌクレオチドである。本発明はさらに、標
的細菌を含んでいる疑いのあるサンプルを少なくとも１
種類のヌクレオチド断片と接触させる工程を含む検出方
法。
の塩基配列、および該菌の検出方法を提供すること。 【解決手段】ビール混濁菌の23S rRNAまたはrDNAの領域
に対して相補的であるか、またはそれにハイブリダイズ
するオリゴヌクレオチドである。詳しくは、配列番号１
〜17に示す配列群中のいずれか８個の連続したオリゴヌ
クレオチドを含む配列の少なくとも90％に対して相同的
であるオリゴヌクレオチドである。本発明はさらに、標
的細菌を含んでいる疑いのあるサンプルを少なくとも１
種類のヌクレオチド断片と接触させる工程を含む検出方
法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ラクトバチルス カゼ
イの検出、または該細菌の同定、または該細菌の定量に
関する。
イの検出、または該細菌の同定、または該細菌の定量に
関する。
【０００２】
【従来の技術】近年のビール生（なま）化への流れは、
ビール鮮度という新たな価値観をもたらした。こうした
背景から、ビール製造会社にとっては、製造から出荷ま
での時間を劇的に短縮するとともに、ビール混濁菌の汚
染を迅速に正確に判定する必要性が高まっている。ビー
ル混濁を引き起こす細菌の代表的なものの１つが通性嫌
気性菌である乳酸菌である。
ビール鮮度という新たな価値観をもたらした。こうした
背景から、ビール製造会社にとっては、製造から出荷ま
での時間を劇的に短縮するとともに、ビール混濁菌の汚
染を迅速に正確に判定する必要性が高まっている。ビー
ル混濁を引き起こす細菌の代表的なものの１つが通性嫌
気性菌である乳酸菌である。
【０００３】従って、食品業界特にビール業界において
使用できる、乳酸菌の迅速かつ選択的な検出を可能とす
るのに十分特異的で感度の高い細菌診断試験法を開発す
ることは重要である。古典的なビール混濁細菌の同定
は、形態観察、グラム染色性、カタラーゼ試験などの多
くの性状ならびに生化学的試験を行い、最終的に新鮮な
ビールに単離した細菌を再摂取し、その増殖能の観察を
行うことにより決定した。これらの一連の操作は、多く
の時間と労力を要すると同時に正確な判定も困難な場合
が多かった。また最近では、乳酸菌から核酸を抽出して
特定のオリゴヌクレオチドをプライマーあるいはプロー
ブとしてPCR（Polymerase Chain Reaction）（特開平10
-210980, 特開平6-141899, 特開平6-113888）あるいは
ハイブリダイゼーション（特表平8-503620）を行う方法
がある。しかし、これらの方法は菌体からの核酸の抽出
工程を必要とするうえ、個々の菌体を検出することはで
きない。
使用できる、乳酸菌の迅速かつ選択的な検出を可能とす
るのに十分特異的で感度の高い細菌診断試験法を開発す
ることは重要である。古典的なビール混濁細菌の同定
は、形態観察、グラム染色性、カタラーゼ試験などの多
くの性状ならびに生化学的試験を行い、最終的に新鮮な
ビールに単離した細菌を再摂取し、その増殖能の観察を
行うことにより決定した。これらの一連の操作は、多く
の時間と労力を要すると同時に正確な判定も困難な場合
が多かった。また最近では、乳酸菌から核酸を抽出して
特定のオリゴヌクレオチドをプライマーあるいはプロー
ブとしてPCR（Polymerase Chain Reaction）（特開平10
-210980, 特開平6-141899, 特開平6-113888）あるいは
ハイブリダイゼーション（特表平8-503620）を行う方法
がある。しかし、これらの方法は菌体からの核酸の抽出
工程を必要とするうえ、個々の菌体を検出することはで
きない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の１つの目的
は、ビール混濁の原因となる生物のリボゾームRNA（rRN
A）およびリボゾームDNA（rDNA）中の独特の核酸配列に
相補的なオリゴヌクレオチドを提供するものである。本
発明の別の目的は、特異性、感度および速度を併有する
核酸ハイブリダイゼーション下においてアクセス可能と
され得る標的領域にハイブリダイズすることができるオ
リゴヌクレオチドを提供することである。本発明の別の
目的は更に、適当なトレーサーで標識したこれらのオリ
ゴヌクレオチドをプローブとして機能させて、ハイブリ
ダイゼーションを行い、当該細菌個体を選択的に検出同
定ならびに定量する方法を提供することである。
は、ビール混濁の原因となる生物のリボゾームRNA（rRN
A）およびリボゾームDNA（rDNA）中の独特の核酸配列に
相補的なオリゴヌクレオチドを提供するものである。本
発明の別の目的は、特異性、感度および速度を併有する
核酸ハイブリダイゼーション下においてアクセス可能と
され得る標的領域にハイブリダイズすることができるオ
リゴヌクレオチドを提供することである。本発明の別の
目的は更に、適当なトレーサーで標識したこれらのオリ
ゴヌクレオチドをプローブとして機能させて、ハイブリ
ダイゼーションを行い、当該細菌個体を選択的に検出同
定ならびに定量する方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】前記課題を解決するため
本発明は、ラクトバチルス カゼイ（Lactobacillus cas
ei）を選択的に検出するための、ラクトバチルス カゼ
イの23S rRNAおよびDNAを標的とする配列であって、配
列番号１〜17のうちのいずれかの連続した少なくとも８
塩基を有するか少なくとも90%相同であることを特徴と
するオリゴヌクレオチド、または対応する相補鎖オリゴ
ヌクレオチドである。
本発明は、ラクトバチルス カゼイ（Lactobacillus cas
ei）を選択的に検出するための、ラクトバチルス カゼ
イの23S rRNAおよびDNAを標的とする配列であって、配
列番号１〜17のうちのいずれかの連続した少なくとも８
塩基を有するか少なくとも90%相同であることを特徴と
するオリゴヌクレオチド、または対応する相補鎖オリゴ
ヌクレオチドである。
【０００６】また本発明は、ラクトバチルス カゼイの
同定と存在の有無を、少なくとも１種の該細菌の核酸を
含むまたは含み得るサンプルにおいて決定する方法ため
に、前記オリゴヌクレオチドをプローブとして用いるこ
とを特徴とする。細菌リボゾームは5S、16Sおよび23S r
RNAと呼ぶ少なくとも３種類のRNA分子を含む。歴史的に
これらの名前は、沈降速度で決定されるRNA分子の大き
さに関係している。本発明において、細菌のリボゾーム
r RNAは、標的として使用できる。これを使用する利点
の一つは、rRNAが生きている細胞全てに豊富に存在する
ということである。
同定と存在の有無を、少なくとも１種の該細菌の核酸を
含むまたは含み得るサンプルにおいて決定する方法ため
に、前記オリゴヌクレオチドをプローブとして用いるこ
とを特徴とする。細菌リボゾームは5S、16Sおよび23S r
RNAと呼ぶ少なくとも３種類のRNA分子を含む。歴史的に
これらの名前は、沈降速度で決定されるRNA分子の大き
さに関係している。本発明において、細菌のリボゾーム
r RNAは、標的として使用できる。これを使用する利点
の一つは、rRNAが生きている細胞全てに豊富に存在する
ということである。
【０００７】本発明をより詳細に開示する前に、本明細
書で使用する種々の用語を下記のように定義する。「オ
リゴヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド断片」
は天然の（または所望により修飾された）核酸の情報配
列によって特徴づけられ、かつ天然の核酸と同様に、予
め定めた条件下で、相補的または実質的に相補的なヌク
レオチド断片とハイブリダイズ可能であるヌクレオチド
単位の鎖を示す二つの同義用語である。その鎖は天然の
核酸とは異なる構造のヌクレオチド単位を含みうる。例
えば、オリゴヌクレオチドの構成単位である核酸が天然
に存在する核酸に見られるホスホジエステル結合でな
く、他のエステル結合、またはアミド結合（一般にPNA
と呼ばれる）で結合したものであって、標的領域にハイ
ブリダイズできるものであるばよい。オリゴヌクレオチ
ド（または、ヌクレオチド断片）は、例えば、100まで
のヌクレオチド単位を含みうる。一般には、少なくとも
8個のヌクレオチド単位を含み、天然の核酸分子から、
または遺伝子組換えによって、または化学合成によって
得ることができる。
書で使用する種々の用語を下記のように定義する。「オ
リゴヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド断片」
は天然の（または所望により修飾された）核酸の情報配
列によって特徴づけられ、かつ天然の核酸と同様に、予
め定めた条件下で、相補的または実質的に相補的なヌク
レオチド断片とハイブリダイズ可能であるヌクレオチド
単位の鎖を示す二つの同義用語である。その鎖は天然の
核酸とは異なる構造のヌクレオチド単位を含みうる。例
えば、オリゴヌクレオチドの構成単位である核酸が天然
に存在する核酸に見られるホスホジエステル結合でな
く、他のエステル結合、またはアミド結合（一般にPNA
と呼ばれる）で結合したものであって、標的領域にハイ
ブリダイズできるものであるばよい。オリゴヌクレオチ
ド（または、ヌクレオチド断片）は、例えば、100まで
のヌクレオチド単位を含みうる。一般には、少なくとも
8個のヌクレオチド単位を含み、天然の核酸分子から、
または遺伝子組換えによって、または化学合成によって
得ることができる。
【０００８】「ハイブリダイゼーション」は、適切な条
件下で、十分に相補的な配列を有するヌクレオチド断片
同士が、安定かつ特異的な水素結合によって結合して二
本鎖を形成することと理解される。ハイブリダイゼーシ
ョンの条件は、「ストリンジェンシー」すなわち反応条
件の厳しさによって決定される。ハイブリダイゼーショ
ンを行うときのストリンジェンシーが高いほど、特異性
は高い。つまり、適切なハイブリダイゼーション条件と
は、特にプローブ／標的二本鎖核酸の塩基組成、ならび
に両者の核酸配列の間の不一致度から決定され、ハイブ
リダイゼーション溶液に存在するイオン種の濃度および
種類、変性剤の性質および濃度、またはハイブリダイゼ
ーション温度などのハイブリダイゼーション反応パラメ
ーターの関数として表現される。ハイブリダイゼーショ
ン反応を行うときの条件のストリンジェンシーは、特
に、使用するプローブに依存する。これら全てのデータ
は周知であり、適切な条件は、通常の技術者の能力の範
囲内において、ルーチン実験により各ケースで決定され
得る。
件下で、十分に相補的な配列を有するヌクレオチド断片
同士が、安定かつ特異的な水素結合によって結合して二
本鎖を形成することと理解される。ハイブリダイゼーシ
ョンの条件は、「ストリンジェンシー」すなわち反応条
件の厳しさによって決定される。ハイブリダイゼーショ
ンを行うときのストリンジェンシーが高いほど、特異性
は高い。つまり、適切なハイブリダイゼーション条件と
は、特にプローブ／標的二本鎖核酸の塩基組成、ならび
に両者の核酸配列の間の不一致度から決定され、ハイブ
リダイゼーション溶液に存在するイオン種の濃度および
種類、変性剤の性質および濃度、またはハイブリダイゼ
ーション温度などのハイブリダイゼーション反応パラメ
ーターの関数として表現される。ハイブリダイゼーショ
ン反応を行うときの条件のストリンジェンシーは、特
に、使用するプローブに依存する。これら全てのデータ
は周知であり、適切な条件は、通常の技術者の能力の範
囲内において、ルーチン実験により各ケースで決定され
得る。
【０００９】また、「相同である」とは、2個またはそ
れ以上の核酸配列間の類似の度合いを表すことを意味
し、生物間の分類学的な類似度合いを意味するものでは
ない。類似の度合いはパーセンテージで表し、例えば2
個の配列間が90％相同であるとは、第１の配列の塩基の
90％が第2の配列の塩基と同一にマッチすることを意味
する。「プローブ」は、決められた条件下でハイブリダ
イゼーション特異性を有して、本発明の場合は、rRNA、
またはrDNAに含まれるヌクレオチド配列を有する標的核
酸とハイブリダイゼーション複合体を形成する、例え
ば、5~100 個のヌクレオチド単位、特に8~35個のヌクレ
オチド単位を含むヌクレオチド断片である。プローブ
は、検出、同定、定量目的に使用することができる。例
えば、放射性同位体、酵素、特に、色素原性、蛍光性ま
たは発光性基質に作用し得る酵素（特に、ペルオキシダ
ーゼまたはアルカリホスファターゼ）、色素産生化学化
合物、色素原性、蛍光性もしくは発光性化合物、ヌクレ
オチド塩基の類似体およびビオチンなどのリガンドから
選択されるマーカーによって標識できる。
れ以上の核酸配列間の類似の度合いを表すことを意味
し、生物間の分類学的な類似度合いを意味するものでは
ない。類似の度合いはパーセンテージで表し、例えば2
個の配列間が90％相同であるとは、第１の配列の塩基の
90％が第2の配列の塩基と同一にマッチすることを意味
する。「プローブ」は、決められた条件下でハイブリダ
イゼーション特異性を有して、本発明の場合は、rRNA、
またはrDNAに含まれるヌクレオチド配列を有する標的核
酸とハイブリダイゼーション複合体を形成する、例え
ば、5~100 個のヌクレオチド単位、特に8~35個のヌクレ
オチド単位を含むヌクレオチド断片である。プローブ
は、検出、同定、定量目的に使用することができる。例
えば、放射性同位体、酵素、特に、色素原性、蛍光性ま
たは発光性基質に作用し得る酵素（特に、ペルオキシダ
ーゼまたはアルカリホスファターゼ）、色素産生化学化
合物、色素原性、蛍光性もしくは発光性化合物、ヌクレ
オチド塩基の類似体およびビオチンなどのリガンドから
選択されるマーカーによって標識できる。
【００１０】「プライマー」は、例えば8~100 ヌクレオ
チド単位を含み、かつ例えばPCR（ポリメラーゼ連鎖反
応）などの増幅法、配列決定プロセス、逆転写法などに
おける酵素的重合の開始のための決められた条件下でハ
イブリダイゼーション特異性を有するオリゴヌクレオチ
ドである。 本発明に係るオリゴヌクレオチドは、サン
プル中の標的核酸の有無の試験において、公知の全ての
ハイブリダイゼーション技術、特に「ドットブロット」
と呼ばれるフィルター上での点付着の技術(MANIATIS
ら、Molecular Cloning，Cold Spring Harbor，1982)、
「サザンブロット」と呼ばれるDNA分離転写の技術（SOU
THERN E.M.，Mol．Biol.，98，503(1975)）、「ノーザ
ンブロット」と呼ばれるRNA分離転写の技術に従って使
用することができる。
チド単位を含み、かつ例えばPCR（ポリメラーゼ連鎖反
応）などの増幅法、配列決定プロセス、逆転写法などに
おける酵素的重合の開始のための決められた条件下でハ
イブリダイゼーション特異性を有するオリゴヌクレオチ
ドである。 本発明に係るオリゴヌクレオチドは、サン
プル中の標的核酸の有無の試験において、公知の全ての
ハイブリダイゼーション技術、特に「ドットブロット」
と呼ばれるフィルター上での点付着の技術(MANIATIS
ら、Molecular Cloning，Cold Spring Harbor，1982)、
「サザンブロット」と呼ばれるDNA分離転写の技術（SOU
THERN E.M.，Mol．Biol.，98，503(1975)）、「ノーザ
ンブロット」と呼ばれるRNA分離転写の技術に従って使
用することができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明によれば、ラクトバチルス
カゼイと優先的にハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チドが提供される。本発明のオリゴヌクレオチドは、ビ
ールの混濁の原因となる生物の存在を検出するために有
用である。本発明の１つは、ビール混濁菌の23S rRNAま
たはrDNAの領域に対して相補的であるか、またはそれに
ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドについてであ
る。詳しくは、配列番号１〜17に示す配列群中のいずれ
か８個の連続したオリゴヌクレオチドを含む配列の少な
くとも90％に対して相同的であるオリゴヌクレオチドで
ある。本発明のもう一つは、ビール混濁細菌の存在を検
出するための方法である。この方法は、標的細菌を含ん
でいる疑いのあるサンプルを少なくとも１種類のヌクレ
オチド断片と接触させる工程を含む。このヌクレオチド
断片は、ビール混濁の原因となる乳酸菌のrRNAまたはrD
NAと優先的にハイブリダイズする約８〜100塩基を含
む。この方法は、ヌクレオチドプローブが標的rRNAまた
はrDNAと優先的に結合して複合体を形成するようにハイ
ブリダイゼーション条件を試料に付与し、そして標的生
物の存在を指示するものとして複合体を検出する工程を
含む。好ましくは、本ヌクレオチドプローブは配列番号
１〜17に示す配列群から選択される配列中のいずれか８
個の連続したオリゴヌクレオチドを含む配列の少なくと
も90％に対して相同的である。
カゼイと優先的にハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チドが提供される。本発明のオリゴヌクレオチドは、ビ
ールの混濁の原因となる生物の存在を検出するために有
用である。本発明の１つは、ビール混濁菌の23S rRNAま
たはrDNAの領域に対して相補的であるか、またはそれに
ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドについてであ
る。詳しくは、配列番号１〜17に示す配列群中のいずれ
か８個の連続したオリゴヌクレオチドを含む配列の少な
くとも90％に対して相同的であるオリゴヌクレオチドで
ある。本発明のもう一つは、ビール混濁細菌の存在を検
出するための方法である。この方法は、標的細菌を含ん
でいる疑いのあるサンプルを少なくとも１種類のヌクレ
オチド断片と接触させる工程を含む。このヌクレオチド
断片は、ビール混濁の原因となる乳酸菌のrRNAまたはrD
NAと優先的にハイブリダイズする約８〜100塩基を含
む。この方法は、ヌクレオチドプローブが標的rRNAまた
はrDNAと優先的に結合して複合体を形成するようにハイ
ブリダイゼーション条件を試料に付与し、そして標的生
物の存在を指示するものとして複合体を検出する工程を
含む。好ましくは、本ヌクレオチドプローブは配列番号
１〜17に示す配列群から選択される配列中のいずれか８
個の連続したオリゴヌクレオチドを含む配列の少なくと
も90％に対して相同的である。
【００１２】本発明のヌクレオチド断片は、ビール及び
ビール製造途中の半製品または、ビール醸造場や下水な
どの環境下から採取された試料中のビール混濁生物の特
異的検出のためのハイブリダイゼーションアッセイ開発
の基礎を提供する。本発明ヌクレオチド断片はまた、ビ
ール混濁菌の存在を確認するための基礎を提供する。本
発明のプローブの開発に際して最初にとられたステップ
は特異的核酸プローブに対して、標的とするビール混濁
菌の23S rRNA内の特有な領域を同定することであった。
これは、23S rRNA内のどの標的領域が、ビール混濁の原
因となるラクトバチルス カゼイに対して特異的である
かを見いだすことであった。そこで、これらの実現のた
めラクトバチルス カゼイの23S rRNAの配列（配列番号1
8）を公知の実験プロトコールにより決定し、他の細菌
の23Ｓ rRNAの配列と比較した。この結果を基に、ラク
トバチルス カゼイに対して特異的なプローブを配列番
号１〜17のごとく設計した。
ビール製造途中の半製品または、ビール醸造場や下水な
どの環境下から採取された試料中のビール混濁生物の特
異的検出のためのハイブリダイゼーションアッセイ開発
の基礎を提供する。本発明ヌクレオチド断片はまた、ビ
ール混濁菌の存在を確認するための基礎を提供する。本
発明のプローブの開発に際して最初にとられたステップ
は特異的核酸プローブに対して、標的とするビール混濁
菌の23S rRNA内の特有な領域を同定することであった。
これは、23S rRNA内のどの標的領域が、ビール混濁の原
因となるラクトバチルス カゼイに対して特異的である
かを見いだすことであった。そこで、これらの実現のた
めラクトバチルス カゼイの23S rRNAの配列（配列番号1
8）を公知の実験プロトコールにより決定し、他の細菌
の23Ｓ rRNAの配列と比較した。この結果を基に、ラク
トバチルス カゼイに対して特異的なプローブを配列番
号１〜17のごとく設計した。
【００１３】本発明のプローブはfluorescence in situ
hybridization（以下FISHと略す）に用いることができ
る。すなわち、ビール及びビール製造途中の半製品また
は、ビール醸造場や下水などの環境下から採取された試
料を、遠心分離またはビール混濁細菌を捕捉可能なメン
ブレンフィルターで処理し、試料中に存在するかもしれ
ない標的ビール混濁菌と検出プローブとを適切なハイブ
リダイゼーション条件下で接触させる。検出プローブは
標的細菌内の細胞質内に侵入し、そこに存在する23S rR
NA内の標的部位に適切なハイブリダイゼーション条件下
でアクセスし、ハイブリダイズする。この際に、検出プ
ローブを、放射性同位元素、蛍光物質、化学発光物質等
のトレーサー標識をすることで特異的なハイブリダイゼ
ーションの現象を適当な手法によってモニタリングする
ことができる。たとえば、検出プローブが放射性同位元
素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等
の方法によってアッセイを実施し、蛍光物質で標識され
ている場合には蛍光顕微鏡等でアッセイを実施し、化学
発光物質で標識されている場合には感光フィルムを用い
た解析やCCDカメラを用いたデジタル解析を実施し、標
的生物の存在の有無を判定することができる。
hybridization（以下FISHと略す）に用いることができ
る。すなわち、ビール及びビール製造途中の半製品また
は、ビール醸造場や下水などの環境下から採取された試
料を、遠心分離またはビール混濁細菌を捕捉可能なメン
ブレンフィルターで処理し、試料中に存在するかもしれ
ない標的ビール混濁菌と検出プローブとを適切なハイブ
リダイゼーション条件下で接触させる。検出プローブは
標的細菌内の細胞質内に侵入し、そこに存在する23S rR
NA内の標的部位に適切なハイブリダイゼーション条件下
でアクセスし、ハイブリダイズする。この際に、検出プ
ローブを、放射性同位元素、蛍光物質、化学発光物質等
のトレーサー標識をすることで特異的なハイブリダイゼ
ーションの現象を適当な手法によってモニタリングする
ことができる。たとえば、検出プローブが放射性同位元
素で標識されている場合にはオートラジオグラフィー等
の方法によってアッセイを実施し、蛍光物質で標識され
ている場合には蛍光顕微鏡等でアッセイを実施し、化学
発光物質で標識されている場合には感光フィルムを用い
た解析やCCDカメラを用いたデジタル解析を実施し、標
的生物の存在の有無を判定することができる。
【００１４】また、上記で定義したオリゴヌクレオチド
は公知の方法で耐熱性ポリメラーゼの存在下、ラクトバ
チルス カゼイの23S rDNAもしくは23S rRNAを増幅合成
するための特異的プライマーとして使用することができ
る（PCR, RT-PCRなど）。使用するプライマーの組み合
わせと適切な反応プラグラムの設定により、目的とする
核酸が増幅されるかどうかの結果から標的細菌の存在の
有無もまた判定可能である。
は公知の方法で耐熱性ポリメラーゼの存在下、ラクトバ
チルス カゼイの23S rDNAもしくは23S rRNAを増幅合成
するための特異的プライマーとして使用することができ
る（PCR, RT-PCRなど）。使用するプライマーの組み合
わせと適切な反応プラグラムの設定により、目的とする
核酸が増幅されるかどうかの結果から標的細菌の存在の
有無もまた判定可能である。
【００１５】
【実施例】本発明を下記実施例により説明するが、本発
明はこれらに限定されるものではない。 実施例１ FISH法によるビール混濁細菌の検出・同定 ビール及びビール製造途中の半製品または、ビール醸造
場や下水などの環境下から採取された試料からの細菌の
捕集は以下の２つの手法を用いて行った。 (1) 遠心分離法による捕集 供試サンプル50 mlを遠心チューブに入れ、遠心分離（1
0,000×g、10分間、４℃）を行い、上清液を捨て細菌ペ
レットを回収後、さらに30 mlのPBS溶液で懸濁し同条件
で遠心分離し洗浄を行った。洗浄後、細菌ペレットを１
mlの固定液（50%エタノールを含むPBS）に再懸濁した。
これらの細菌液をゼラチンでコーティングしたスライド
ガラス上に一滴のせ風乾後、50%エタノール液、80%エタ
ノール液、続いて99%エタノール液中にそれぞれ２分間
静置して脱水処理を行い、FISHに供する試験標本とし
た。FISHに用いるプローブは、5’端をFITC標識した蛍
光プローブを使用した。FISHは、50 pmolの蛍光プロー
ブを含むハイブリダイゼーション液（0.9M NaCl, 0.05%
SDS, 20mM Tris, 5mM EDTA, 10%ホルムアミド, pH 7.
6）20μlを上述した試験標本に接触させ、高湿度を保っ
たチャンバー内で44℃、１時間行った。洗浄は、以下の
通り行った。46℃の上述したハイブリダイゼーション液
中に20分間、試験標本を静置後、常温の滅菌蒸留水です
すぎ、余分な蛍光プローブを除去した。このハイブリダ
イゼーションと洗浄を終えた試験標本を風乾後、褪色防
止剤（ProLong（登録商標）；Molecular Probe社）を滴
下し、蛍光顕微鏡で観察した。
明はこれらに限定されるものではない。 実施例１ FISH法によるビール混濁細菌の検出・同定 ビール及びビール製造途中の半製品または、ビール醸造
場や下水などの環境下から採取された試料からの細菌の
捕集は以下の２つの手法を用いて行った。 (1) 遠心分離法による捕集 供試サンプル50 mlを遠心チューブに入れ、遠心分離（1
0,000×g、10分間、４℃）を行い、上清液を捨て細菌ペ
レットを回収後、さらに30 mlのPBS溶液で懸濁し同条件
で遠心分離し洗浄を行った。洗浄後、細菌ペレットを１
mlの固定液（50%エタノールを含むPBS）に再懸濁した。
これらの細菌液をゼラチンでコーティングしたスライド
ガラス上に一滴のせ風乾後、50%エタノール液、80%エタ
ノール液、続いて99%エタノール液中にそれぞれ２分間
静置して脱水処理を行い、FISHに供する試験標本とし
た。FISHに用いるプローブは、5’端をFITC標識した蛍
光プローブを使用した。FISHは、50 pmolの蛍光プロー
ブを含むハイブリダイゼーション液（0.9M NaCl, 0.05%
SDS, 20mM Tris, 5mM EDTA, 10%ホルムアミド, pH 7.
6）20μlを上述した試験標本に接触させ、高湿度を保っ
たチャンバー内で44℃、１時間行った。洗浄は、以下の
通り行った。46℃の上述したハイブリダイゼーション液
中に20分間、試験標本を静置後、常温の滅菌蒸留水です
すぎ、余分な蛍光プローブを除去した。このハイブリダ
イゼーションと洗浄を終えた試験標本を風乾後、褪色防
止剤（ProLong（登録商標）；Molecular Probe社）を滴
下し、蛍光顕微鏡で観察した。
【００１６】(2) メンブレンフィルターによる捕集 供試サンプル150 mlをポリカーボネート製のメンブレラ
ンフィルター（直径47mm、孔径0.4μｍ）で吸引濾過し
た後、50 mlのPBSで２回洗浄した。続いて10 mlのハイ
ブイダイゼーションバッファー（0.9M NaCl, 0.05% SD
S, 20mM Tris, 5mM EDTA, 10%ホルムアミド, pH 7.6）
で洗浄し、FISHに供した。 FISHは、50 pmolの蛍光プロ
ーブを含むハイブリダイゼーション液（0.9M NaCl, 0.0
5% SDS, 20mM Tris, 5mM EDTA, 10%ホルムアミド, pH
7.6）200μlをプラスチックシャーレに滴下し、この上
に菌体の捕捉されている面が上になるようにフィルター
を接触させ、高湿度を保ったチャンバー内で44℃、1時
間行った。洗浄は、以下の通り行った。ハイブリダイゼ
ーションの終わったフィルターを吸引濾過装置にセット
し、46℃のハイブリダイゼーションバッファー100 ｍ
l、続いて常温のフィルター濾過した滅菌水50 mlを用い
て吸引洗浄した。ハイブリダイゼーションと洗浄を終え
たメンブランフィルターを無菌的に風乾後、無蛍光スラ
イドグラス上に細菌捕捉面を上にしてのせ、さらにこの
面に褪色防止剤（ProLong（登録商標）；Molecular Pro
be社）を滴下し、カバーグラスでフィルターを覆い蛍光
顕微鏡で観察した。観察画像を図１に示す。
ンフィルター（直径47mm、孔径0.4μｍ）で吸引濾過し
た後、50 mlのPBSで２回洗浄した。続いて10 mlのハイ
ブイダイゼーションバッファー（0.9M NaCl, 0.05% SD
S, 20mM Tris, 5mM EDTA, 10%ホルムアミド, pH 7.6）
で洗浄し、FISHに供した。 FISHは、50 pmolの蛍光プロ
ーブを含むハイブリダイゼーション液（0.9M NaCl, 0.0
5% SDS, 20mM Tris, 5mM EDTA, 10%ホルムアミド, pH
7.6）200μlをプラスチックシャーレに滴下し、この上
に菌体の捕捉されている面が上になるようにフィルター
を接触させ、高湿度を保ったチャンバー内で44℃、1時
間行った。洗浄は、以下の通り行った。ハイブリダイゼ
ーションの終わったフィルターを吸引濾過装置にセット
し、46℃のハイブリダイゼーションバッファー100 ｍ
l、続いて常温のフィルター濾過した滅菌水50 mlを用い
て吸引洗浄した。ハイブリダイゼーションと洗浄を終え
たメンブランフィルターを無菌的に風乾後、無蛍光スラ
イドグラス上に細菌捕捉面を上にしてのせ、さらにこの
面に褪色防止剤（ProLong（登録商標）；Molecular Pro
be社）を滴下し、カバーグラスでフィルターを覆い蛍光
顕微鏡で観察した。観察画像を図１に示す。
【００１７】FITC標識した特異的プローブを用いてFISH
解析を行い、蛍光顕微鏡下で観察するとターゲットとな
る菌全体が蛍光を発しているのが見える。例えば、FITC
標識した配列番号３の相補鎖プローブを用いてin situ
ハイブリダイゼーションを行うと、図１に示すようにラ
クトバチルス カゼイは蛍光標識されて検出されるが、
大腸菌等は検出されない。上述した２つの手法の結果は
完全に一致し、その結果、FISH法でのプローブの特異性
は表１の通りであった。
解析を行い、蛍光顕微鏡下で観察するとターゲットとな
る菌全体が蛍光を発しているのが見える。例えば、FITC
標識した配列番号３の相補鎖プローブを用いてin situ
ハイブリダイゼーションを行うと、図１に示すようにラ
クトバチルス カゼイは蛍光標識されて検出されるが、
大腸菌等は検出されない。上述した２つの手法の結果は
完全に一致し、その結果、FISH法でのプローブの特異性
は表１の通りであった。
【００１８】
【表１】
【００１９】ビールに混入する可能性のある細菌と本発
明に示すプローブとのFISHによる特異性。○：反応性あ
り ×：反応性なし △：弱い反応
明に示すプローブとのFISHによる特異性。○：反応性あ
り ×：反応性なし △：弱い反応
【００２０】また、複数のプローブを同時に用いる手法
もある。例えば、プローブ１とプローブ２を同時にFISH
解析に供試すると、プローブ１とプローブ２はそれぞれ
23SrRNA内の標的領域が異なるため、加算的にシグナル
の増強ができた。このように、本発明によって得たプロ
ーブを検出したい標的目標に応じて、組み合わせて用い
ることは有用であった。
もある。例えば、プローブ１とプローブ２を同時にFISH
解析に供試すると、プローブ１とプローブ２はそれぞれ
23SrRNA内の標的領域が異なるため、加算的にシグナル
の増強ができた。このように、本発明によって得たプロ
ーブを検出したい標的目標に応じて、組み合わせて用い
ることは有用であった。
【００２１】実施例２ FISH法によるラクトバチルス
カゼイの定量 試料中のラクトバチルス カゼイの定量は下記の通り行
った。実施例１のごとく試料中の細菌を捕集する直前
に、バクトメーターを用いて直接計数管理した対照細菌
を試料中に添加し、FISH解析結果を分析することにより
得た。例えば、ラクトバチルス カゼイに汚染されたビ
ールに対し、直接計数法によって管理した大腸菌（C
個）を混入させ、ラクトバチルス カゼイの23S rRNAに
特異的な配列番号３に示す蛍光標識プローブを用いて実
施例１のごとくFISH解析を行った後、10mg/mlのDAPIを
含む褪色防止剤（ProLong（登録商標）； Molecular Pr
obe社）を滴下して全細菌を染色した。得られる蛍光画
像から、図２のごとくDAPIに染まった菌数（A）とFITC
標識された菌数（B）を決定し、ビール中に存在したラ
クトバチルス カゼイの数を推定できる。すなわち、試
験に供したビール中に存在したラクトバチルス カゼイ
数（N）は以下の関係式で表すことができる。
カゼイの定量 試料中のラクトバチルス カゼイの定量は下記の通り行
った。実施例１のごとく試料中の細菌を捕集する直前
に、バクトメーターを用いて直接計数管理した対照細菌
を試料中に添加し、FISH解析結果を分析することにより
得た。例えば、ラクトバチルス カゼイに汚染されたビ
ールに対し、直接計数法によって管理した大腸菌（C
個）を混入させ、ラクトバチルス カゼイの23S rRNAに
特異的な配列番号３に示す蛍光標識プローブを用いて実
施例１のごとくFISH解析を行った後、10mg/mlのDAPIを
含む褪色防止剤（ProLong（登録商標）； Molecular Pr
obe社）を滴下して全細菌を染色した。得られる蛍光画
像から、図２のごとくDAPIに染まった菌数（A）とFITC
標識された菌数（B）を決定し、ビール中に存在したラ
クトバチルス カゼイの数を推定できる。すなわち、試
験に供したビール中に存在したラクトバチルス カゼイ
数（N）は以下の関係式で表すことができる。
【００２２】N ＝Ｂ×Ｃ/ (Ａ−Ｂ) 蛍光顕微鏡観察により、蛍光を発しない細胞と発する細
胞の比率からラクトバチルス カゼイを定量できる。例
えば、ラクトバチルス カゼイ単独に汚染された試料に1
07個の大腸菌を添加して回収した検体に対し、蛍光標識
した配列番号3の相補鎖プローブを用いてFISH解析を行
った場合、蛍光標識されない大腸菌1000個に対し、蛍光
標識された細胞（ Lactobacillus casei）が10個認めら
れると、ラクトバチルス カゼイはもとの試料中に105個
存在したことになる。
胞の比率からラクトバチルス カゼイを定量できる。例
えば、ラクトバチルス カゼイ単独に汚染された試料に1
07個の大腸菌を添加して回収した検体に対し、蛍光標識
した配列番号3の相補鎖プローブを用いてFISH解析を行
った場合、蛍光標識されない大腸菌1000個に対し、蛍光
標識された細胞（ Lactobacillus casei）が10個認めら
れると、ラクトバチルス カゼイはもとの試料中に105個
存在したことになる。
【００２３】実施例３ ドットブロットによるラクトバ
チルス・カゼイの同定 市販品として入手可能なニトロセルロース、ナイロン、
PVDF等のフィルター上に細菌試料から公知の手法により
抽出した核酸を固定化した。目的に応じて、プローブは
ロシュ・ダイアグノスティックス社のDIGオリゴヌクレ
オチドテイリングキットを用いて標識し、ハイブリダイ
ゼーションに供した。検出は、ロシュ・ダイアグノステ
ィックス社のDIG発光検出キットを用い、その手順書に
従って行い、最終的にフィルターを適当な時間X線フィ
ルムに露光し、ハイブリダイゼーションシグナルの有無
から、ラクトバチルス・カゼイ同定を行った。ドットブ
ロットの結果を表２に示す。
チルス・カゼイの同定 市販品として入手可能なニトロセルロース、ナイロン、
PVDF等のフィルター上に細菌試料から公知の手法により
抽出した核酸を固定化した。目的に応じて、プローブは
ロシュ・ダイアグノスティックス社のDIGオリゴヌクレ
オチドテイリングキットを用いて標識し、ハイブリダイ
ゼーションに供した。検出は、ロシュ・ダイアグノステ
ィックス社のDIG発光検出キットを用い、その手順書に
従って行い、最終的にフィルターを適当な時間X線フィ
ルムに露光し、ハイブリダイゼーションシグナルの有無
から、ラクトバチルス・カゼイ同定を行った。ドットブ
ロットの結果を表２に示す。
【００２４】
【表２】
【００２５】ビールに混入する可能性のある細菌と本発
明に示すプローブとのドットブロットハイブリダイゼー
ションによる特異性。○：反応性あり ×：反応性なし
△：弱い反応
明に示すプローブとのドットブロットハイブリダイゼー
ションによる特異性。○：反応性あり ×：反応性なし
△：弱い反応
【００２６】
【配列表】 <110> Asahi Breweries Ltd. <120> Nucleotide sequences for detecting Lactobacillus casei and the method for detecting these bacteria. <130> 2000-37P <160> 17 <210> 1 <210> 27 <211> DNA <212> Lactobacillus casei <400> 1 ctgacaagca atacactgat gtgtact 27 <210> 2 <210> 20 <211> DNA <212> Lactobacillus casei <400> 2 tctgccgccg gccagctatg 20 <210> 3 <210> 34 <211> DNA <212> Lactobacillus casei <400> 3 agggctttca ccttctgtgg cgcagctttc cagc 34 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Lactobacillus casei <400> 4 acggctccga cttttcatct taa 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Lactobacillus casei <400> 5 tctacatctg cttactcatt 20 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Lactobacillus casei <400> 6 ggcgcacatt tccagccgtg cgctttcctt agcctc 36 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Lactobacillus casei <400> 7 tgtccttaag actgcaggca tttcactcgc tgtca 35 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Lactobacillus casei <400> 8 tgcggctgac cttgcggtca 20 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Lactobacillus casei <400> 9 tgacttcgac tacgtcggac tttg 24 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Lactobacillus casei <400> 10 gacggagggt tcgacgtttc gct 23 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Lactobacillus casei <400> 11 cctcgcaagc aaacgtaact 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Lactobacillus casei <400> 12 cggagtaaga tcgatggtat 20 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Lactobacillus casei <400> 13 accgcgcacc cttacgggtg cac 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Lactobacillus casei <400> 14 cgtcctcacg atcgaccttc aac 23 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Lactobacillus casei <400> 15 cgcttaaaca aaataaacta gtg 23 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Lactobacillus casei <400> 16 tttcgctccc catcacagct 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Lactobacillus casei <400> 17 ggcttcaatt ctgggcttcg 20 <210> 18 <211> 2751 <212> DNA <213> Lactobacillus casei <400> 18 gaattcggct tctaggagcc gatgaaggac ggaactaata ccgatatgct tcggggagct 60 ataagtaagc tttgatccgg agatttccga atgggggaac ccagtacaca tcagtgtatt 120 gcttgtcagt gaatacatag ctggccggcg gcagacgcgg ggaactgaaa catctcagta 180 cccgcaggaa gagaaagaaa actcgattcc catagtagcg gcgagcgaag tgggaagagc 240 ccaaaccgag aagcttgctt ctcggggttg taggactgga cattggagtt accaaagtcc 300 gacgtagtcg aagtcagctg gaaagctgcg ccacagaagg tgaaagccct gtaagcgaaa 360 cgtcgaaccc tccgtccagg atcctgagta cggcggaaca cgtgaaattc cgtcggaatc 420 cgggaggacc atctcccaag gctaaatact ccctagtgac cgatagtgaa ccagtaccgt 480 gagggaaagg tgaaaagcac cccggaaggg gagtgaaacc gtgtgcctac aattagtcaa 540 agcccgttaa tgggtaatgg cgtgcctttt gtagaatgaa ccggcgagtt acgtttgctt 600 gcgaggttaa gatgaaaagt cggagccgta gcgaaagcga gtctgaacag ggcgaatgag 660 taagcagatg tagacccgaa accaagtgac ctacccatga ccaggttgaa ggtgtggtga 720 aacacactgg aggaccgaac ccatgtatgt tgaaaaatgc tgggatgagt tgtgggtagc 780 ggtgaaattc caaacgaact tggagatagc tggttctctc cgaaatagct ttagggttag 840 cctcggagga tggatcatgg aggtagagca ctgtttgaac taggggccca tcaagggtta 900 ctgaattcag ataaactccg aataccatcg atcttactcc gggagtcaga cagtgagcga 960 taaggtccat tgtcgaaagg ggaacagccc agatcaccag ttaaggtccc taaatttatg 1020 ctaagtggaa aaggatgtgg cgttgcacag acaactagga tgttctcaga agcagccacc 1080 atttaagagt gcgtaatagc tcactagtcg agtggcactg cgccgaaaat ataccggggc 1140 taagcataat accgaaactg tgggtgcacc cgtaagggtg cgcggtagga gagcgttcta 1200 agggcgttga aggtcgatcg tgaggacggc tggagcgctt agaagtgaga atgccggcat 1260 gagtagcgaa agatcagtga gaatctgatc caccgtatga ctaaggcttc ctggggaagg 1320 ctcgtcctcc cagggttagt cgggatctaa ggcgaggccg agaggcgtag tcgatgacaa 1380 gcaggttgag attcctgcac tagtttattt tgtttaagcg atggagggac gcaggaggct 1440 aaggaaagcg cacggctgga aatgtgcgcc caagcagcaa gtctgacagc gagtgaaatg 1500 cctgcagtct taaggacaag ctgtgatggg gagcgaaatt atagtagcga agttcctgat 1560 gtcacactgc caagaaaagc ttctagtgag aaataaacta cccgtaccgc aaaccgacac 1620 aggtagtcga ggagagtatc ctcaggtgag cgagcgaact ctcgttaagg aactcggcaa 1680 aatgaccccg taacttcgga agaaggggtg ctgaccgcaa ggtcagccgc agtgaatagg 1740 cccaaacaac tgtttatcaa aaacacaggt ctctgctaaa tcgtaagatg atgtataggg 1800 gctgacgcct gcccggtgct ggaaggttaa gaggatgagt tagcgcaagc gaagcccaga 1860 attgaagccc cagtaaacgg cggccgtaac tataacggtc ctaaggtagc gaaattcctt 1920 gtcgggtaag ttccgacccg cacgaaaggc gtaatgattt gggcactgtc tcaacgagag 1980 actcggtgaa attatagtac ccgtgaagat gcgggttacc cgcgacagga cggaaagacc 2040 ccatggagct ttactgtagc ttgatattga gtgtttgtac cgcttgtaca ggataggtag 2100 gagccgtaga gatcggaacg ctagtttcga tggaggcgtt ggtgggatac taccctagct 2160 gtatgaacac tctaacccgc gccactaatc gtggcgggag acagtgtcag gtaggcagtt 2220 tgactggggc ggtcgcctcc taaaatgtaa cggaggcgcc caaaggttcc ctcagaatgg 2280 ttggaaatca ttcgcagagt gtaaaggtat aagggagctt gactgcgaga ctgacaagtc 2340 gagcagggac gaaagtcggg cttagtgatc cggtggttcc gtatggaagg gccatcgctc 2400 aacggataaa agctaccctg gggataacag gcttatctcc cccaagagtc cacatcgacg 2460 gggaggtttg gcacctcgat gtcggctcat cgcatcctgg ggctgtagtc ggtcccaagg 2520 gttgggctgt tcgcccatta aagcggtacg cgagctgggt tcagaacgtc gtgagacagt 2580 tcggtcccta tccgtcgcgg gcgcaggaaa tttgagagga gctgtcctta gtacgagagg 2640 accgggatgg acgttccgct ggtgtaccag ttgtgccgcc aggcgcatcg ctgggtagct 2700 atgaacggca gggataaacg ctgaaagcat ctaagtgtga aagccgaatt c 2751
【図１】蛍光顕微鏡下でのFISH法によるラクトバチルス
カゼイの検出を示す図。
カゼイの検出を示す図。
【図２】蛍光顕微鏡観察によるラクトバチルス カゼイ
の定量を示す図。
の定量を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 本山 靖朗 茨城県北相馬郡守谷町緑１−１−21 アサ ヒビール株式会社酒類研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA05 AA11 CA01 CA09 CA11 DA05 HA13 4B063 QA01 QQ06 QQ42 QR08 QR56 QR62 QS16 QS25 QS34 QS36 QX02
Claims (7)
- 【請求項１】 ラクトバチルス カゼイ（Lactobacillus
casei）を選択的に検出するための、ラクトバチルス カ
ゼイの23S rRNAおよびDNAを標的とする配列であって、
配列番号１〜17のうちのいずれかの連続した少なくとも
８塩基を有するか少なくとも90%相同であることを特徴
とするオリゴヌクレオチド、または対応する相補鎖オリ
ゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 トレーサーで標識されていることを特徴
とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 固体支持体上に固定化されていることを
特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４】 ラクトバチルス カゼイの同定と存在の有
無を、少なくとも１種の該細菌の核酸を含むまたは含み
得るサンプルにおいて決定する方法であって、該サンプ
ルを少なくとも１個のオリゴヌクレオチドプローブと適
当なハイブリダイゼーション条件下に接触させ、次い
で、該プローブとサンプルの核酸との間のハイブリダイ
ゼーション複合体の形成または形成がないことを自体公
知の方法で決定する方法において、該プローブが請求項
１に記載のものから選択されるオリゴヌクレオチドであ
ることを特徴とする方法。 - 【請求項５】 請求項４に記載の方法において、ラクト
バチルス カゼイの定量を、少なくとも１種の該細菌の
核酸を含むまたは含み得るサンプルにおいて決定する方
法であって、数的に管理した対照細菌を該サンプル中に
意図的に混入させ、ここでのハイブリダイゼーション条
件下では該プローブと対照細菌の核酸の間にハイブリダ
イゼーション複合体形成がないが、ラクトバチルス カ
ゼイの核酸の間にハイブリダイゼーション複合体形成が
あることを特徴とする方法。 - 【請求項６】 請求項１記載の塩基配列を一部あるいは
全部を含むオリゴヌクレオチドをポリメラーゼ存在下で
の核酸増幅のためのプライマーとして使用する方法。 - 【請求項７】 請求項６に記載の方法で増幅させた核酸
を、電気泳動法および核酸染色法により検出する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000228084A JP2002034572A (ja) | 2000-07-28 | 2000-07-28 | ラクトバチルスカゼイ検出のための塩基配列、および該菌の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002034572A true JP2002034572A (ja) | 2002-02-05 |
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ID=18721444
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| JP2000228084A Pending JP2002034572A (ja) | 2000-07-28 | 2000-07-28 | ラクトバチルスカゼイ検出のための塩基配列、および該菌の検出方法 |
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|---|---|
| JP (1) | JP2002034572A (ja) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06311894A (ja) * | 1993-04-30 | 1994-11-08 | Asahi Breweries Ltd | 乳酸菌に特異的なモノクローナル抗体およびこれを用いた乳酸菌の検出法 |
| JPH08503620A (ja) * | 1993-09-10 | 1996-04-23 | アモコ・コーポレーション | Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属およびｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の細菌の検出のための核酸プローブ、および麦酒腐敗の原因となる細菌物質の検出方法 |
| JPH10210980A (ja) * | 1997-01-29 | 1998-08-11 | Asahi Breweries Ltd | 乳酸菌検出用オリゴヌクレオチド及び該菌の検出方法 |
| JPH10313899A (ja) * | 1997-05-20 | 1998-12-02 | Asahi Breweries Ltd | 微生物の同定法 |
-
2000
- 2000-07-28 JP JP2000228084A patent/JP2002034572A/ja active Pending
Patent Citations (4)
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| JPH08503620A (ja) * | 1993-09-10 | 1996-04-23 | アモコ・コーポレーション | Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ属およびｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の細菌の検出のための核酸プローブ、および麦酒腐敗の原因となる細菌物質の検出方法 |
| JPH10210980A (ja) * | 1997-01-29 | 1998-08-11 | Asahi Breweries Ltd | 乳酸菌検出用オリゴヌクレオチド及び該菌の検出方法 |
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070612 |
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100601 |
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