JP2003061674A - ザイモフィラス属菌検出のための核酸プローブ、およびビール混濁細菌の検出方法 - Google Patents
ザイモフィラス属菌検出のための核酸プローブ、およびビール混濁細菌の検出方法Info
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- JP2003061674A JP2003061674A JP2001255769A JP2001255769A JP2003061674A JP 2003061674 A JP2003061674 A JP 2003061674A JP 2001255769 A JP2001255769 A JP 2001255769A JP 2001255769 A JP2001255769 A JP 2001255769A JP 2003061674 A JP2003061674 A JP 2003061674A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ビール有害菌であるザイモフィラス属菌（Zymo
philus）の検出、または該細菌の同定、または該細菌の
定量法を提供すること。 【解決手段】特定の配列に示される塩基配列の一部また
は全部を含む該細菌の16S rRNAをコードする遺伝子の遺
伝子配列。該菌を選択的に検出するため、該菌の16S rD
NA ならびに16S rRNAを標的とする配列であって、該オ
リゴヌクレオチドが特定の配列を有するか、または対応
する相補鎖を有することを特徴とする一本鎖オリゴヌク
レオチド。
philus）の検出、または該細菌の同定、または該細菌の
定量法を提供すること。 【解決手段】特定の配列に示される塩基配列の一部また
は全部を含む該細菌の16S rRNAをコードする遺伝子の遺
伝子配列。該菌を選択的に検出するため、該菌の16S rD
NA ならびに16S rRNAを標的とする配列であって、該オ
リゴヌクレオチドが特定の配列を有するか、または対応
する相補鎖を有することを特徴とする一本鎖オリゴヌク
レオチド。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ビール有害菌であ
るザイモフィラス属菌の検出、または該細菌の同定、ま
たは該細菌の定量に関する。
るザイモフィラス属菌の検出、または該細菌の同定、ま
たは該細菌の定量に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】近年
のビールの生（なま）化への流れは、ビール鮮度という
新たな価値観をもたらした。こうした背景から、ビール
製造会社にとっては、製品製造から出荷までの時間が劇
的に短縮するとともに、ビール有害菌の汚染を迅速に正
確に判定する必要性が高まっている。偏性嫌気性菌であ
るビール有害菌として、ペクチネータス（Pectinatus）
属菌とその進化的近縁細菌であるメガスフェラ（Megasp
haera）属菌が知られており、特にペクチネータス属菌
は1990年代に入り発生した幾つかの製品事故の原因菌と
して同定されている。一方、セレノモナス（Selenomona
s）属菌、ザイモフィラス（Zymophilus）属菌は、遺伝
学的背景はPectinatus属菌に極めて近く、その形態も似
ているがビール中での生育能はほとんどなく、ビール混
濁を起こさない細菌と認識されている。
のビールの生（なま）化への流れは、ビール鮮度という
新たな価値観をもたらした。こうした背景から、ビール
製造会社にとっては、製品製造から出荷までの時間が劇
的に短縮するとともに、ビール有害菌の汚染を迅速に正
確に判定する必要性が高まっている。偏性嫌気性菌であ
るビール有害菌として、ペクチネータス（Pectinatus）
属菌とその進化的近縁細菌であるメガスフェラ（Megasp
haera）属菌が知られており、特にペクチネータス属菌
は1990年代に入り発生した幾つかの製品事故の原因菌と
して同定されている。一方、セレノモナス（Selenomona
s）属菌、ザイモフィラス（Zymophilus）属菌は、遺伝
学的背景はPectinatus属菌に極めて近く、その形態も似
ているがビール中での生育能はほとんどなく、ビール混
濁を起こさない細菌と認識されている。
【０００３】従って、ペクチネータス属菌やメガスフェ
ラ属菌の迅速かつ選択的な検出を可能とするために、ザ
イモフィラス属菌やセレノモナス属菌と上述した細菌を
区別できる、十分特異的で感度の高い細菌診断試験法を
開発することは重要である。古典的なビール有害細菌の
同定は、形態観察、グラム染色性、カタラーゼ試験など
の多くの性状ならびに生化学的試験を行い、最終的に新
鮮なビールに単離した細菌を再摂取し、その増殖能の観
察を行うことにより決定した。これらの一連の操作は、
多くの時間と労力を要すると同時に正確な判定も困難な
場合が多かった。また、最近では、特定の種の菌のより
迅速な検出・同定法についてはいくつか検討されてお
り、例えば抗原抗体反応を利用した特異的細菌の検出法
や細菌からDNAを抽出して特定のオリゴヌクレオチドを
プライマーとしてPCR（Polymerase Chain Reaction）を
行い、標的配列を増幅させた後、標的細菌特有の核酸の
有無を判定する方法がある。
ラ属菌の迅速かつ選択的な検出を可能とするために、ザ
イモフィラス属菌やセレノモナス属菌と上述した細菌を
区別できる、十分特異的で感度の高い細菌診断試験法を
開発することは重要である。古典的なビール有害細菌の
同定は、形態観察、グラム染色性、カタラーゼ試験など
の多くの性状ならびに生化学的試験を行い、最終的に新
鮮なビールに単離した細菌を再摂取し、その増殖能の観
察を行うことにより決定した。これらの一連の操作は、
多くの時間と労力を要すると同時に正確な判定も困難な
場合が多かった。また、最近では、特定の種の菌のより
迅速な検出・同定法についてはいくつか検討されてお
り、例えば抗原抗体反応を利用した特異的細菌の検出法
や細菌からDNAを抽出して特定のオリゴヌクレオチドを
プライマーとしてPCR（Polymerase Chain Reaction）を
行い、標的配列を増幅させた後、標的細菌特有の核酸の
有無を判定する方法がある。
【０００４】しかし、これらの方法は抗原、または標的
核酸が存在すれば陽性に判定させるものであり、既に生
育性がないか、もしくは活性の著しく弱い細菌と生育能
を依然として保持している細菌とを区別できない。ま
た、PCR法で再現よく、十分な感度を得るには、必要最
小量の細菌核酸を獲得するための適当な培養と核酸抽出
ならびに遺伝子増幅という予備工程を必要とする。なぜ
ならば、細菌の核酸量は極めて微量であり、非常に低濃
度の核酸は効率よく抽出できないこと、または標的核酸
は１細菌ゲノムあたり数コピーでしか存在しないからで
ある。
核酸が存在すれば陽性に判定させるものであり、既に生
育性がないか、もしくは活性の著しく弱い細菌と生育能
を依然として保持している細菌とを区別できない。ま
た、PCR法で再現よく、十分な感度を得るには、必要最
小量の細菌核酸を獲得するための適当な培養と核酸抽出
ならびに遺伝子増幅という予備工程を必要とする。なぜ
ならば、細菌の核酸量は極めて微量であり、非常に低濃
度の核酸は効率よく抽出できないこと、または標的核酸
は１細菌ゲノムあたり数コピーでしか存在しないからで
ある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明の１つの目的は、
ビール混濁の原因となるが混濁しないビールには存在し
ない生物のリボゾームRNA（rRNA）およびリボゾームDNA
（rDNA）中の独特の核酸配列に相補的なオリゴヌクレオ
チドを提供するものである。本発明の別の目的は、上記
で挙げた欠点を、特異性、感度および速度を併有する核
酸ハイブリダイゼーション下においてアクセス可能とさ
れ得る標的領域にハイブリダイズすることができる核酸
オリゴヌクレオチドを提供することである。本発明の別
の目的は更に、適当なトレーサーで標識したこれらのオ
リゴヌクレオチドをプローブとして機能させて、ハイブ
リダイゼーションを行い、当該細菌を選択的に検出同定
ならびに定量する方法を提供することである。細菌リボ
ゾームは5S、16Sおよび23S rRNAと呼ぶ少なくとも３種
類のＲＮＡ分子を含む。歴史的にこれらの名前は、沈降
速度で決定されるＲＮＡ分子の大きさに関係している。
本発明において、細菌のリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）
は、標的として使用できる。この使用の利点の一つは、
ｒＲＮＡが生きている細胞全てに豊富に存在するという
ことである。
ビール混濁の原因となるが混濁しないビールには存在し
ない生物のリボゾームRNA（rRNA）およびリボゾームDNA
（rDNA）中の独特の核酸配列に相補的なオリゴヌクレオ
チドを提供するものである。本発明の別の目的は、上記
で挙げた欠点を、特異性、感度および速度を併有する核
酸ハイブリダイゼーション下においてアクセス可能とさ
れ得る標的領域にハイブリダイズすることができる核酸
オリゴヌクレオチドを提供することである。本発明の別
の目的は更に、適当なトレーサーで標識したこれらのオ
リゴヌクレオチドをプローブとして機能させて、ハイブ
リダイゼーションを行い、当該細菌を選択的に検出同定
ならびに定量する方法を提供することである。細菌リボ
ゾームは5S、16Sおよび23S rRNAと呼ぶ少なくとも３種
類のＲＮＡ分子を含む。歴史的にこれらの名前は、沈降
速度で決定されるＲＮＡ分子の大きさに関係している。
本発明において、細菌のリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）
は、標的として使用できる。この使用の利点の一つは、
ｒＲＮＡが生きている細胞全てに豊富に存在するという
ことである。
【０００６】本発明をより詳細に開示する前に、説明お
よび請求の範囲で使用する種々の用語を下記のように定
義する。「オリゴヌクレオチド」または「オリゴヌクレ
オチド断片」は天然の（または所望により修飾された）
核酸の情報配列によって特徴づけられ、かつ天然の核酸
と同様に、予め定めた条件下で、相補的または実質的に
相補的なヌクレオチド断片とハイブリダイズ可能である
ヌクレオチド単位の鎖を示す二つの同義用語である。そ
の鎖は天然の核酸とは異なる構造のヌクレオチド単位を
含みうる。例えば、オリゴヌクレオチドの構成単位であ
る核酸が天然に存在する核酸に見られるホスホジエステ
ルでなく、他のエステル結合、またはアミド結合（一般
にＰＮＡと呼ばれる）で結合したものであって、標的領
域にハイブリダイズできるものであればよい。オリゴヌ
クレオチド（または、ヌクレオチド断片）は、例えば、
100までのヌクレオチド単位を含みうる。一般には、少
なくとも10個のヌクレオチド単位を含み、天然の核酸分
子から、または遺伝子組換えによって、または化学合成
によって得ることができる。
よび請求の範囲で使用する種々の用語を下記のように定
義する。「オリゴヌクレオチド」または「オリゴヌクレ
オチド断片」は天然の（または所望により修飾された）
核酸の情報配列によって特徴づけられ、かつ天然の核酸
と同様に、予め定めた条件下で、相補的または実質的に
相補的なヌクレオチド断片とハイブリダイズ可能である
ヌクレオチド単位の鎖を示す二つの同義用語である。そ
の鎖は天然の核酸とは異なる構造のヌクレオチド単位を
含みうる。例えば、オリゴヌクレオチドの構成単位であ
る核酸が天然に存在する核酸に見られるホスホジエステ
ルでなく、他のエステル結合、またはアミド結合（一般
にＰＮＡと呼ばれる）で結合したものであって、標的領
域にハイブリダイズできるものであればよい。オリゴヌ
クレオチド（または、ヌクレオチド断片）は、例えば、
100までのヌクレオチド単位を含みうる。一般には、少
なくとも10個のヌクレオチド単位を含み、天然の核酸分
子から、または遺伝子組換えによって、または化学合成
によって得ることができる。
【０００７】「ハイブリダイゼーション」は、適切な条
件下で、十分に相補的な配列を有するヌクレオチド断片
同士が、安定かつ特異的な水素結合によって結合して二
本鎖を形成することと理解される。ハイブリダイゼーシ
ョンの条件は、「ストリンジェンシー」すなわち反応条
件の厳しさによって決定される。ハイブリダイゼーショ
ンを行うときのストリンジェンシーが高いほど、特異性
は高い。つまり、適切なハイブリダイゼーション条件と
は、特にプローブ／標的二本鎖の塩基組成、ならびに２
個の核酸の間の不一致度から決定され、ハイブリダイゼ
ーション溶液に存在するイオン種の濃度および種類、変
性剤の性質および濃度、またはハイブリダイゼーション
温度などのハイブリダイゼーション反応パラメーターの
関数として表現される。ハイブリダイゼーション反応を
行うときの条件のストリンジェンシーは、特に、使用す
るプローブに依存する。これら全てのデータは周知であ
り、適切な条件は、通常の技術者の能力の範囲内におい
て、ルーチン実験により各ケースで決定され得る。
件下で、十分に相補的な配列を有するヌクレオチド断片
同士が、安定かつ特異的な水素結合によって結合して二
本鎖を形成することと理解される。ハイブリダイゼーシ
ョンの条件は、「ストリンジェンシー」すなわち反応条
件の厳しさによって決定される。ハイブリダイゼーショ
ンを行うときのストリンジェンシーが高いほど、特異性
は高い。つまり、適切なハイブリダイゼーション条件と
は、特にプローブ／標的二本鎖の塩基組成、ならびに２
個の核酸の間の不一致度から決定され、ハイブリダイゼ
ーション溶液に存在するイオン種の濃度および種類、変
性剤の性質および濃度、またはハイブリダイゼーション
温度などのハイブリダイゼーション反応パラメーターの
関数として表現される。ハイブリダイゼーション反応を
行うときの条件のストリンジェンシーは、特に、使用す
るプローブに依存する。これら全てのデータは周知であ
り、適切な条件は、通常の技術者の能力の範囲内におい
て、ルーチン実験により各ケースで決定され得る。
【０００８】また、「相同である」とは、２個またはそ
れ以上の核酸配列間の類似の度合いを表すことを意味
し、生物間の分類学的な類似度合いを意味するものでは
ない。類似の度合いはパーセンテージで表し、例えば２
個の配列間が90％相同であるとは、第１の配列の塩基の
90％が第２の配列の塩基と同一にマッチすることを意味
する。「プローブ」は、決められた条件下でハイブリダ
イゼーション特異性を有して、本発明の場合は、リボソ
ームＲＮＡ、またはリボゾームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）に含
まれるヌクレオチド配列を有する標的核酸とハイブリダ
イゼーション複合体を形成する、例えば、10〜100 個の
ヌクレオチド単位、特に12〜35個のヌクレオチド単位を
含むヌクレオチド断片である。プローブは、検出、同
定、定量目的に使用することができる。例えば、放射性
同位体、酵素、特に、色素原性、蛍光性または発光性基
質に作用し得る酵素（特に、ペルオキシダーゼまたはア
ルカリホスファターゼ）、色素産生化学化合物、色素原
性、蛍光性もしくは発光性化合物、ヌクレオチド塩基の
類似体およびビオチンなどのリガンドから選択されるマ
ーカーによって標識できる。
れ以上の核酸配列間の類似の度合いを表すことを意味
し、生物間の分類学的な類似度合いを意味するものでは
ない。類似の度合いはパーセンテージで表し、例えば２
個の配列間が90％相同であるとは、第１の配列の塩基の
90％が第２の配列の塩基と同一にマッチすることを意味
する。「プローブ」は、決められた条件下でハイブリダ
イゼーション特異性を有して、本発明の場合は、リボソ
ームＲＮＡ、またはリボゾームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）に含
まれるヌクレオチド配列を有する標的核酸とハイブリダ
イゼーション複合体を形成する、例えば、10〜100 個の
ヌクレオチド単位、特に12〜35個のヌクレオチド単位を
含むヌクレオチド断片である。プローブは、検出、同
定、定量目的に使用することができる。例えば、放射性
同位体、酵素、特に、色素原性、蛍光性または発光性基
質に作用し得る酵素（特に、ペルオキシダーゼまたはア
ルカリホスファターゼ）、色素産生化学化合物、色素原
性、蛍光性もしくは発光性化合物、ヌクレオチド塩基の
類似体およびビオチンなどのリガンドから選択されるマ
ーカーによって標識できる。
【０００９】「プライマー」は、例えば10〜100 ヌクレ
オチド単位を含み、かつ例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連
鎖反応）などの増幅法、配列決定プロセス、逆転写法な
どにおける酵素的重合の開始のための決められた条件下
でハイブリダイゼーション特異性を有するオリゴヌクレ
オチドである。 本発明に係るオリゴヌクレオチドは、
サンプル中の標的核酸の有無の試験において、公知の全
てのハイブリダイゼーション技術、特に「ドット−ブロ
ット」と呼ばれるフィルター上での点付着の技術 (MANI
ATIS ら、Molecular Cloning，Cold Spring Harbor，19
82)、「サザンブロット」と呼ばれるＤＮＡ移動の技術
（SOUTHERN E.M.，Mol．Biol.，98，503(1975)）、「ノ
ーザンブロット」と呼ばれるＲＮＡ移動の技術に従って
使用することができる。
オチド単位を含み、かつ例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連
鎖反応）などの増幅法、配列決定プロセス、逆転写法な
どにおける酵素的重合の開始のための決められた条件下
でハイブリダイゼーション特異性を有するオリゴヌクレ
オチドである。 本発明に係るオリゴヌクレオチドは、
サンプル中の標的核酸の有無の試験において、公知の全
てのハイブリダイゼーション技術、特に「ドット−ブロ
ット」と呼ばれるフィルター上での点付着の技術 (MANI
ATIS ら、Molecular Cloning，Cold Spring Harbor，19
82)、「サザンブロット」と呼ばれるＤＮＡ移動の技術
（SOUTHERN E.M.，Mol．Biol.，98，503(1975)）、「ノ
ーザンブロット」と呼ばれるＲＮＡ移動の技術に従って
使用することができる。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明によれば、他の属と比較し
て、ザイモフィラス属菌に優先的にハイブリダイズする
約10〜100のヌクレオチド断片が提供される。本発明の
ヌクレオチド断片は、ビールの混濁の原因となる生物の
存在を検出するために有用である。上記ヌクレオチドの
少なくとも10個の連続した核酸に対して相補的である
か、またはそれと少なくとも90％相同であるプローブも
また、本発明事項に含む。本発明の１つは、ビール混濁
有害菌の16S rRNAまたは16S rDNAの領域に対して相補的
であるか、またはそれにハイブリダイズするオリゴヌク
レオチドおよびプローブについてである。詳しくは、そ
の核酸組成物は配列番号１〜８に示すプローブ群により
定義される配列の群から選択される配列中のいずれか10
個の連続したオリゴヌクレオチドを含む配列の少なくと
も90％に対して相同的であるかまたはそれと相同であ
る。
て、ザイモフィラス属菌に優先的にハイブリダイズする
約10〜100のヌクレオチド断片が提供される。本発明の
ヌクレオチド断片は、ビールの混濁の原因となる生物の
存在を検出するために有用である。上記ヌクレオチドの
少なくとも10個の連続した核酸に対して相補的である
か、またはそれと少なくとも90％相同であるプローブも
また、本発明事項に含む。本発明の１つは、ビール混濁
有害菌の16S rRNAまたは16S rDNAの領域に対して相補的
であるか、またはそれにハイブリダイズするオリゴヌク
レオチドおよびプローブについてである。詳しくは、そ
の核酸組成物は配列番号１〜８に示すプローブ群により
定義される配列の群から選択される配列中のいずれか10
個の連続したオリゴヌクレオチドを含む配列の少なくと
も90％に対して相同的であるかまたはそれと相同であ
る。
【００１１】本発明のもう一つは、ビール混濁細菌の存
在を検出するためのものである。この方法は、標的細菌
を含んでいる疑いのあるサンプルを少なくとも１種類の
核酸と接触させる工程を含む。この核酸は、ザイモフィ
ラス属菌のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡと優先的にハイブリ
ダイズする約10〜100ヌクレオチドを有する。この方法
は、核酸プローブが標的ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡと優先
的に結合して核酸複合体を形成するようにハイブリダイ
ゼーション条件を試料に付与し、そして標的生物（１ま
たは２以上）の存在を指示するものとして複合体を検出
する工程を含む。好ましくは、本核酸プローブは配列番
号１〜８に示すプローブ群により定義される配列の群か
ら選択される配列中のいずれか10個の連続したオリゴヌ
クレオチドを含む配列の少なくとも90％に対して相同的
であるかまたはそれと相同である。
在を検出するためのものである。この方法は、標的細菌
を含んでいる疑いのあるサンプルを少なくとも１種類の
核酸と接触させる工程を含む。この核酸は、ザイモフィ
ラス属菌のｒＲＮＡまたはｒＤＮＡと優先的にハイブリ
ダイズする約10〜100ヌクレオチドを有する。この方法
は、核酸プローブが標的ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡと優先
的に結合して核酸複合体を形成するようにハイブリダイ
ゼーション条件を試料に付与し、そして標的生物（１ま
たは２以上）の存在を指示するものとして複合体を検出
する工程を含む。好ましくは、本核酸プローブは配列番
号１〜８に示すプローブ群により定義される配列の群か
ら選択される配列中のいずれか10個の連続したオリゴヌ
クレオチドを含む配列の少なくとも90％に対して相同的
であるかまたはそれと相同である。
【００１２】本発明のプローブは、ビール及びビール製
造途中の半製品または、ビール醸造場や下水などの環境
下から採取された試料中の細菌の特異的検出のための核
酸ハイブリダイゼーションアッセイ開発の基礎を提供す
る。本発明のプローブはまた、ビール混濁有害菌の存在
を確認するための基礎を提供する。本発明のプローブの
開発に際して最初にとられたステップは特異的核酸プロ
ーブに対して、標的とするビール有害菌の16S rRNA内の
特有な領域を同定することであった。これは、16S rRNA
内のどの標的領域が、ビール混濁の原因となるペクチネ
イタス（Pectinatus）属菌とメガスフェラ（Megasphaer
a）属菌等のビール混濁原因菌に対してザイモフィラス
属菌に特異的であるかを見いだすことであった。そこ
で、これらの実現のためザイモフィラス・パウジボラン
ス（Zymophilus pausivorans）の16S rDNAの配列を公知
の実験プロトコールにより決定し、 ザイモフィラス属
菌の進化的近縁細菌であるPectinatus frisingensis、P
ectinatus cerevisiiphilus、Megasphaera cerevisia
e、Selenomonas属菌 、ビール有害菌として知られるLac
tobacillus属菌、またはE.coliを含む他の細菌16S rDNA
の配列と比較した。この結果を基に、ザイモフィラス属
菌に対して特異的なプローブを配列番号１〜８のごとく
設計した。
造途中の半製品または、ビール醸造場や下水などの環境
下から採取された試料中の細菌の特異的検出のための核
酸ハイブリダイゼーションアッセイ開発の基礎を提供す
る。本発明のプローブはまた、ビール混濁有害菌の存在
を確認するための基礎を提供する。本発明のプローブの
開発に際して最初にとられたステップは特異的核酸プロ
ーブに対して、標的とするビール有害菌の16S rRNA内の
特有な領域を同定することであった。これは、16S rRNA
内のどの標的領域が、ビール混濁の原因となるペクチネ
イタス（Pectinatus）属菌とメガスフェラ（Megasphaer
a）属菌等のビール混濁原因菌に対してザイモフィラス
属菌に特異的であるかを見いだすことであった。そこ
で、これらの実現のためザイモフィラス・パウジボラン
ス（Zymophilus pausivorans）の16S rDNAの配列を公知
の実験プロトコールにより決定し、 ザイモフィラス属
菌の進化的近縁細菌であるPectinatus frisingensis、P
ectinatus cerevisiiphilus、Megasphaera cerevisia
e、Selenomonas属菌 、ビール有害菌として知られるLac
tobacillus属菌、またはE.coliを含む他の細菌16S rDNA
の配列と比較した。この結果を基に、ザイモフィラス属
菌に対して特異的なプローブを配列番号１〜８のごとく
設計した。
【００１３】本発明のプローブは蛍光インサイツハイブ
リッド形成法（fluorescence in situ hybridization
（以下FISHと略す））に用いることができる。ビール及
びビール製造途中の半製品または、ビール醸造場や下水
などの環境下から採取された試料を、遠心分離またはビ
ール有害細菌を捕捉可能なメンブランフィルター処理
し、試料中に存在するかもしれない標的ビール混濁有害
菌と検出プローブとを適切なハイブリダイゼーション条
件下で接触させる。検出プローブは標的細菌内の細胞質
内に侵入し、そこに存在する16S rRNA内の標的部位に適
切なハイブリダイゼーション条件下でアクセスし、ハイ
ブリダイズする。この際に、検出プローブを、放射性同
位元素、蛍光物質、化学発光物質等のトレーサー標識を
することで特異的なハイブリダイゼーションの現象を適
当な手法によってモニタリングすることができる。たと
えば、検出プローブが放射性同位元素で標識されている
場合にはオートラジオグラフィー等の方法によってアッ
セイを実施し、蛍光物質で標識されている場合には蛍光
顕微鏡等でアッセイを実施し、化学発光物質で標識され
ている場合には感光フィルムを用いた解析やCCDカメラ
を用いたデジタル解析を実施し、標的生物の存在の有無
を判定することができる。上記で定義したオリゴヌクレ
オチドはまた、公知の方法で耐熱性ポリメラーゼの存在
下、ザイモフィラス属菌の16S rDNAもしくは16S rRNAを
増幅合成するための特異的プライマーとして使用するこ
とができる（ＰＣＲ，ＲＴ−ＰＣＲなど）。使用するプ
ライマーの組み合わせと適切な反応プログラムの設定に
より、目的とする核酸が増幅されるかどうかの結果から
標的細菌の存在の有無もまた判定可能である。
リッド形成法（fluorescence in situ hybridization
（以下FISHと略す））に用いることができる。ビール及
びビール製造途中の半製品または、ビール醸造場や下水
などの環境下から採取された試料を、遠心分離またはビ
ール有害細菌を捕捉可能なメンブランフィルター処理
し、試料中に存在するかもしれない標的ビール混濁有害
菌と検出プローブとを適切なハイブリダイゼーション条
件下で接触させる。検出プローブは標的細菌内の細胞質
内に侵入し、そこに存在する16S rRNA内の標的部位に適
切なハイブリダイゼーション条件下でアクセスし、ハイ
ブリダイズする。この際に、検出プローブを、放射性同
位元素、蛍光物質、化学発光物質等のトレーサー標識を
することで特異的なハイブリダイゼーションの現象を適
当な手法によってモニタリングすることができる。たと
えば、検出プローブが放射性同位元素で標識されている
場合にはオートラジオグラフィー等の方法によってアッ
セイを実施し、蛍光物質で標識されている場合には蛍光
顕微鏡等でアッセイを実施し、化学発光物質で標識され
ている場合には感光フィルムを用いた解析やCCDカメラ
を用いたデジタル解析を実施し、標的生物の存在の有無
を判定することができる。上記で定義したオリゴヌクレ
オチドはまた、公知の方法で耐熱性ポリメラーゼの存在
下、ザイモフィラス属菌の16S rDNAもしくは16S rRNAを
増幅合成するための特異的プライマーとして使用するこ
とができる（ＰＣＲ，ＲＴ−ＰＣＲなど）。使用するプ
ライマーの組み合わせと適切な反応プログラムの設定に
より、目的とする核酸が増幅されるかどうかの結果から
標的細菌の存在の有無もまた判定可能である。
【００１４】
【実施例】本発明を下記実施例により説明するが、本発
明はこれらに限定されるものではない。
明はこれらに限定されるものではない。
【００１５】実施例１ FISH法によるビール有害細菌の
検出・同定 ビール及びビール製造途中の半製品または、ビール醸造
場や下水などの環境下から採取された試料からの細菌の
捕集は以下の２つの手法を用いて行った。 （１）遠心分離法による捕集 供試サンプル50mlを遠心チューブに入れ、遠心分離（1
0,000Xg、10分間、４℃）を行い、上清液を捨て細菌ペ
レットを回収後、さらに30mlのPBS溶液で同条件で遠心
分離し洗浄を行った。洗浄後、細菌ペレットを１ｍlの
固定液（４％ w/vのパラホルムアルデヒドを含むPBS）
に再けん濁し、４℃で５時間固定した。細菌を固定後、
さらに遠心分離により細菌細胞を２回洗浄処理後、適当
量の50％のエタノールを含むPBSに再けん濁し、FISHに
供する細菌液を得た。これらの細菌液をゼラチンでコー
ティングしたスライドガラス上に一滴のせ風乾後、70%
エタノール液、続いて99%エタノール液中にそれぞれ２
分間静置し、脱水処理を行い、FISHに供する試験標本と
した。FISHに用いるプローブは、5’端をFITC標識した
蛍光プローブを使用した。FISHは、50 pmolの蛍光プロ
ーブを含むハイブリダイゼーション液（0.9M NaCl, 0.0
5% SDS, 20mM Tris, 5mM EDTA, 10%ホルムアミド, pH
7.6）20μlを上述した試験標本に接触させ、高湿度を保
ったチャンバー内で４０℃、２時間行った。洗浄は、以
下の通り行った。42℃の上述したハイブリダイゼーショ
ン液中に20分間、試験標本を静置後、常温の滅菌蒸留水
ですすぎ、余分な蛍光プローブを除去した。このハイブ
リダイゼーションと洗浄を終えた試験標本を風乾後、10
μg/mlのDAPIを含む褪色防止剤（SlowFade（登録商
標）；Molecular Probe社）を用いて、全細胞を染色
し、蛍光顕微鏡で観察した。
検出・同定 ビール及びビール製造途中の半製品または、ビール醸造
場や下水などの環境下から採取された試料からの細菌の
捕集は以下の２つの手法を用いて行った。 （１）遠心分離法による捕集 供試サンプル50mlを遠心チューブに入れ、遠心分離（1
0,000Xg、10分間、４℃）を行い、上清液を捨て細菌ペ
レットを回収後、さらに30mlのPBS溶液で同条件で遠心
分離し洗浄を行った。洗浄後、細菌ペレットを１ｍlの
固定液（４％ w/vのパラホルムアルデヒドを含むPBS）
に再けん濁し、４℃で５時間固定した。細菌を固定後、
さらに遠心分離により細菌細胞を２回洗浄処理後、適当
量の50％のエタノールを含むPBSに再けん濁し、FISHに
供する細菌液を得た。これらの細菌液をゼラチンでコー
ティングしたスライドガラス上に一滴のせ風乾後、70%
エタノール液、続いて99%エタノール液中にそれぞれ２
分間静置し、脱水処理を行い、FISHに供する試験標本と
した。FISHに用いるプローブは、5’端をFITC標識した
蛍光プローブを使用した。FISHは、50 pmolの蛍光プロ
ーブを含むハイブリダイゼーション液（0.9M NaCl, 0.0
5% SDS, 20mM Tris, 5mM EDTA, 10%ホルムアミド, pH
7.6）20μlを上述した試験標本に接触させ、高湿度を保
ったチャンバー内で４０℃、２時間行った。洗浄は、以
下の通り行った。42℃の上述したハイブリダイゼーショ
ン液中に20分間、試験標本を静置後、常温の滅菌蒸留水
ですすぎ、余分な蛍光プローブを除去した。このハイブ
リダイゼーションと洗浄を終えた試験標本を風乾後、10
μg/mlのDAPIを含む褪色防止剤（SlowFade（登録商
標）；Molecular Probe社）を用いて、全細胞を染色
し、蛍光顕微鏡で観察した。
【００１６】（２）メンブランフィルターによる捕集
供試サンプル150mlをポリカーボネート製のメンブラン
フィルター（直径47mm、孔径0.4μｍ）で吸引濾過した
後、50mlのPBSで２回洗浄した。続いて10 mlのハイブリ
ダイゼーションバッファー（0.9M NaCl, 0.05% SDS, 20
mM Tris, 5mM EDTA, 10%ホルムアミド, pH 7.6）で洗浄
し、FISHに供試した。 FISHは、50 pmolの蛍光プローブ
を含むハイブリダイゼーション液（0.9M NaCl, 0.05% S
DS, 20mMTris, 5mM EDTA, 10%ホルムアミド, pH 7.6）2
00μlをプラスチックシャーレに滴下し、この上に菌体
の捕捉されている面が上になるようにフィルターを接触
させ、高湿度を保ったチャンバー内で40℃、２時間行っ
た。洗浄は、以下の通り行った。ハイブリダイゼーショ
ンの終わったフィルターを吸引濾過装置にセットし、42
℃のハイブリダイゼーションバッファー100ml、続いて
常温のフィルター濾過した滅菌水50mlを用いて吸引洗浄
した。ハイブリダイゼーションと洗浄を終えたメンブラ
ンフィルターを無菌的に風乾後、無蛍光スライドグラス
上に細菌捕捉面を上にしてのせ、さらにこの面に直接10
μg/mlのDAPIを含む褪色防止剤（SlowFade（登録商
標）；Molecular Probe社）をのせ、全細胞を染色し、
カバーグラスでフィルターを覆い蛍光顕微鏡で観察し
た。観察画像を図１に示す。
フィルター（直径47mm、孔径0.4μｍ）で吸引濾過した
後、50mlのPBSで２回洗浄した。続いて10 mlのハイブリ
ダイゼーションバッファー（0.9M NaCl, 0.05% SDS, 20
mM Tris, 5mM EDTA, 10%ホルムアミド, pH 7.6）で洗浄
し、FISHに供試した。 FISHは、50 pmolの蛍光プローブ
を含むハイブリダイゼーション液（0.9M NaCl, 0.05% S
DS, 20mMTris, 5mM EDTA, 10%ホルムアミド, pH 7.6）2
00μlをプラスチックシャーレに滴下し、この上に菌体
の捕捉されている面が上になるようにフィルターを接触
させ、高湿度を保ったチャンバー内で40℃、２時間行っ
た。洗浄は、以下の通り行った。ハイブリダイゼーショ
ンの終わったフィルターを吸引濾過装置にセットし、42
℃のハイブリダイゼーションバッファー100ml、続いて
常温のフィルター濾過した滅菌水50mlを用いて吸引洗浄
した。ハイブリダイゼーションと洗浄を終えたメンブラ
ンフィルターを無菌的に風乾後、無蛍光スライドグラス
上に細菌捕捉面を上にしてのせ、さらにこの面に直接10
μg/mlのDAPIを含む褪色防止剤（SlowFade（登録商
標）；Molecular Probe社）をのせ、全細胞を染色し、
カバーグラスでフィルターを覆い蛍光顕微鏡で観察し
た。観察画像を図１に示す。
【００１７】FITC標識した特異的プローブを用いてFISH
解析を行い、蛍光顕微鏡下で観察するとターゲットとな
る菌全体が蛍光を発しているのが見える。たとえば、FI
TC標識した配列番号１の相補鎖プローブを用いてインサ
イツハイブリダイゼーションを行うと、図に示すように
ザイモフィラス属菌は蛍光標識されて検出されるが、大
腸菌等は検出されない。上述した２つの手法は完全に一
致し、その結果は表１の通りであった。表中、○は反応
性あり、×は反応性なしを示す。
解析を行い、蛍光顕微鏡下で観察するとターゲットとな
る菌全体が蛍光を発しているのが見える。たとえば、FI
TC標識した配列番号１の相補鎖プローブを用いてインサ
イツハイブリダイゼーションを行うと、図に示すように
ザイモフィラス属菌は蛍光標識されて検出されるが、大
腸菌等は検出されない。上述した２つの手法は完全に一
致し、その結果は表１の通りであった。表中、○は反応
性あり、×は反応性なしを示す。
【００１８】
【表１】
【００１９】また、複数のプローブを同時に用いる手法
もある。例えば、プローブ１とプローブ２を同時にFISH
解析に供試すると、プローブ１とプローブ２はそれぞれ
16SrRNA内の標的領域が異なるため、加算的にシグナル
の増強ができた。このように、本発明によって得たプロ
ーブを検出したい標的目標に応じて、組み合わせて用い
ることは有用であった。
もある。例えば、プローブ１とプローブ２を同時にFISH
解析に供試すると、プローブ１とプローブ２はそれぞれ
16SrRNA内の標的領域が異なるため、加算的にシグナル
の増強ができた。このように、本発明によって得たプロ
ーブを検出したい標的目標に応じて、組み合わせて用い
ることは有用であった。
【００２０】実施例２ FISH法によるザイモフィラス属
菌の定量 試料中のザイモフィラス属菌の定量は下記の通り行っ
た。実施例１のごとく試料中の細菌を捕集する直前に、
バクトメーターを用いて直接計数管理した大腸菌を試料
中に添加し、FISH解析結果を分析することにより得た。
例えば、ザイモフィラス パウシボランス（Zymophilus
paucivorans）に汚染されたビールに対し、直接計数
法によって管理した大腸菌（Ｃ個）を混入させ、ザイモ
フィラス パウシボランスの16S rRNAに特異的な配列番
号１に示す蛍光標識プローブを用いて実施例１のごとく
FISH解析を行った。得られる蛍光画像から、図２のごと
くDAPIに染まった菌数（Ａ）とFITC標識された菌数
（Ｂ）を決定し、ビール中に存在したザイモフィラス
パウシボランスの数を推定できる。
菌の定量 試料中のザイモフィラス属菌の定量は下記の通り行っ
た。実施例１のごとく試料中の細菌を捕集する直前に、
バクトメーターを用いて直接計数管理した大腸菌を試料
中に添加し、FISH解析結果を分析することにより得た。
例えば、ザイモフィラス パウシボランス（Zymophilus
paucivorans）に汚染されたビールに対し、直接計数
法によって管理した大腸菌（Ｃ個）を混入させ、ザイモ
フィラス パウシボランスの16S rRNAに特異的な配列番
号１に示す蛍光標識プローブを用いて実施例１のごとく
FISH解析を行った。得られる蛍光画像から、図２のごと
くDAPIに染まった菌数（Ａ）とFITC標識された菌数
（Ｂ）を決定し、ビール中に存在したザイモフィラス
パウシボランスの数を推定できる。
【００２１】蛍光顕微鏡観察により、蛍光を発しない細
胞（大腸菌）と発する細胞（ザイモフィラス菌）の比率
からザイモフィラス パウシボランスを定量できる。例
えば、ザイモフィラス パウシボランス単独に汚染され
た試料に107個の大腸菌を添加して回収した検体に対
し、蛍光標識した配列番号１の相補鎖プローブを用いて
FISH解析を行った場合、蛍光標識されない大腸菌1000個
に対し、蛍光標識された細胞（ザイモフィラス パウシ
ボランス）が10個認められると、ザイモフィラス パウ
シボランスはもとの試料中に105個存在したことにな
る。すなわち、試験に供したビール中に存在したザイモ
フィラス パウシボランス数（Ｎ）は以下の関係式で表
すことができる。
胞（大腸菌）と発する細胞（ザイモフィラス菌）の比率
からザイモフィラス パウシボランスを定量できる。例
えば、ザイモフィラス パウシボランス単独に汚染され
た試料に107個の大腸菌を添加して回収した検体に対
し、蛍光標識した配列番号１の相補鎖プローブを用いて
FISH解析を行った場合、蛍光標識されない大腸菌1000個
に対し、蛍光標識された細胞（ザイモフィラス パウシ
ボランス）が10個認められると、ザイモフィラス パウ
シボランスはもとの試料中に105個存在したことにな
る。すなわち、試験に供したビール中に存在したザイモ
フィラス パウシボランス数（Ｎ）は以下の関係式で表
すことができる。
【００２２】Ｎ＝Ｂ×Ｃ／Ａ−Ｂ
また、ザイモフィラス属菌の他、複数の種の細菌によっ
て汚染された試料については、上述した大腸菌の代わり
に試料中に存在しない細菌をカウンター株として用いる
ことによって、特定のザイモフィラス属菌の試料中の菌
数を推定できる。使用しようとするカウンター株が試料
中に存在するか否かは、ＰＣＲ法による判定から容易に
知ることができた。例えば、 ザイモフィラス パウシボ
ランスとそれ以外の複数種の微生物に汚染されている
が、ペクチネイタス セレビシエ（Pectinatus cerevis
iae）に汚染されていないビール中のザイモフィラス パ
ウシボランス数を知りたい場合を例をとり、以下に説明
する。 ザイモフィラス パウシボランスを含む複数種の
微生物汚染ビールに対し、直接計数法によって管理した
ペクチネイタス セレビシエ（Ｃ個）を混入させ、ザイ
モフィラス パウシボランスの16S rRNAに特異的な配列
番号１に示す蛍光標識プローブとペクチネイタス セレ
ビシエの16S rRNAに特異的なローダミンで標識したプロ
ーブの共存下に、実施例１のごとくFISH解析を行った。
得られた蛍光画像からローダミン標識された菌数（Ａ）
とFITC標識された菌数（Ｂ）を決定し、汚染ビール中に
存在したザイモフィラス パウシボランスの数の推定が
可能であった。すなわち、試験に供したビール中に存在
したザイモフィラス パウシボランス数（Ｎ）は以下の
関係式で表すことができる。
て汚染された試料については、上述した大腸菌の代わり
に試料中に存在しない細菌をカウンター株として用いる
ことによって、特定のザイモフィラス属菌の試料中の菌
数を推定できる。使用しようとするカウンター株が試料
中に存在するか否かは、ＰＣＲ法による判定から容易に
知ることができた。例えば、 ザイモフィラス パウシボ
ランスとそれ以外の複数種の微生物に汚染されている
が、ペクチネイタス セレビシエ（Pectinatus cerevis
iae）に汚染されていないビール中のザイモフィラス パ
ウシボランス数を知りたい場合を例をとり、以下に説明
する。 ザイモフィラス パウシボランスを含む複数種の
微生物汚染ビールに対し、直接計数法によって管理した
ペクチネイタス セレビシエ（Ｃ個）を混入させ、ザイ
モフィラス パウシボランスの16S rRNAに特異的な配列
番号１に示す蛍光標識プローブとペクチネイタス セレ
ビシエの16S rRNAに特異的なローダミンで標識したプロ
ーブの共存下に、実施例１のごとくFISH解析を行った。
得られた蛍光画像からローダミン標識された菌数（Ａ）
とFITC標識された菌数（Ｂ）を決定し、汚染ビール中に
存在したザイモフィラス パウシボランスの数の推定が
可能であった。すなわち、試験に供したビール中に存在
したザイモフィラス パウシボランス数（Ｎ）は以下の
関係式で表すことができる。
【００２３】Ｎ＝Ｂ×Ｃ／Ａ
ここで、カウンター株の16S rRNAと特異的にハイブリダ
イズするプローブの標識物質は標的細菌特異的なプロー
ブの標的物質と識別できるものであれば良い。
イズするプローブの標識物質は標的細菌特異的なプロー
ブの標的物質と識別できるものであれば良い。
【００２４】実施例３ ドットブロットによるザイモフ
ィラス属菌の同定 市販品として入手可能なニトロセルロース、ナイロン、
PVDF等のフィルター上に細菌試料から公知の手法により
抽出した核酸を固定化した。目的に応じて、プローブは
ベーリンガー・マンハイム社のDIGオリゴヌクレオチド
デイリングキットを用いて標識し、ハイブリダイゼーシ
ョンに供した。検出は、ベーリンガー・マンハイム社の
DIG発光検出キットを用い、その手順書に従って行い、
最終的にフィルターを適当な時間X線フィルムに露光
し、ハイブリダイゼーションシグナルの有無から、 ザ
イモフィラス属菌の同定を行った。ドットブロットの結
果を表２に示す。表中、●は反応性あり、点線の○は反
応性なしを示す。
ィラス属菌の同定 市販品として入手可能なニトロセルロース、ナイロン、
PVDF等のフィルター上に細菌試料から公知の手法により
抽出した核酸を固定化した。目的に応じて、プローブは
ベーリンガー・マンハイム社のDIGオリゴヌクレオチド
デイリングキットを用いて標識し、ハイブリダイゼーシ
ョンに供した。検出は、ベーリンガー・マンハイム社の
DIG発光検出キットを用い、その手順書に従って行い、
最終的にフィルターを適当な時間X線フィルムに露光
し、ハイブリダイゼーションシグナルの有無から、 ザ
イモフィラス属菌の同定を行った。ドットブロットの結
果を表２に示す。表中、●は反応性あり、点線の○は反
応性なしを示す。
【００２５】
【表２】
【００２６】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Asahi Brewries Ltd.
<120> A Nucleic acid probe for detecting the genus Zymophilus and a meth
od for detecting beer turbiding bacteria
<130> 2000-06P
<160> 8
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Zymophilus paucivorans
<400> 1
agtagctttc ccatgtggga aagaca 26
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Zymophilus paucivorans
<400> 2
ttttagtgac agcttataaa tag 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Zymophilus paucivorans
<400> 3
atactgcacg ttcgtctcaa ac 22
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Zymophilus paucivorans
<400> 4
ttacagcaca ttattcgt 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Zymophilus paucivorans
<400> 5
ggattcgaac tggtcatctt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Zymophilus paucivorans
<400> 6
aagactgact tacattccca 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Zymophilus paucivorans
<400> 7
aagaaatgta gtttctgtcc 20
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Zymophilus paucivorans
<400> 8
gaagagggac taatctctta gcctt 25
【図１】FISH法によるザイモフィラス属菌の検出結果の
蛍光顕微鏡観察画像。
蛍光顕微鏡観察画像。
【図２】ザイモフィラス属菌の定量方法を示す図。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｒ 1:01
33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
//(Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３０１Ａ
Ｃ１２Ｒ 1:01）
(Ｃ１２Ｑ 1/68
Ｃ１２Ｒ 1:01）
Ｆターム(参考） 2G045 AA28 BA13 BA14 BB04 BB24
CB21 DA12 DA13 DA14 FA16
FB02 FB05 FB07 FB09 FB13
GC15
4B024 AA11 CA02 CA09 CA11 HA12
4B063 QA18 QQ15 QQ43 QQ54 QR08
QR42 QR56 QS13 QS16 QS25
QS34 QX02
Claims (14)
- 【請求項１】ザイモフィラス（Zymophilus）属菌を選択
的に検出するため、ザイモフィラス属菌の16S rDNAなら
びに16S rRNAを標的とする配列であって、該オリゴヌク
レオチドが配列番号１〜８の少なくとも１つを有する
か、または対応する相補鎖を有することを特徴とする一
本鎖オリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】請求項１に記載されたオリゴヌクレオチド
の配列群より選択される配列中のいずれか１０個の連続
したヌクレオチド単位を有するオリゴヌクレオチドを含
むかまたは少なくとも90%相同であることを特徴とする
一本鎖オリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】トレーサーで標識されていることを特徴と
する請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４】固体支持体上に固定化されていることを特
徴とする請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項５】試料から細菌を捕集する工程と、該細菌を
請求項１または２に記載のものから選択されるオリゴヌ
クレオチドである１つまたは複数の核酸プローブと、ハ
イブリダイゼーション下に接触させる工程と、該プロー
ブと該細菌の核酸との間のハイブリダイゼーション複合
体の形成の有無を測定する工程からなること特徴とする
ザイモフィラス属菌の検出方法。 - 【請求項６】試料から細菌を捕集する工程と、該細菌を
請求項１または２に記載のものから選択されるオリゴヌ
クレオチドである１つまたは複数の核酸プローブと、ハ
イブリダイゼーション下に接触させる工程と、該プロー
ブと該細菌の核酸との間のハイブリダイゼーション複合
体の形成の有無を測定する工程からなること特徴とする
ザイモフィラス属菌の同定方法。 - 【請求項７】細菌を捕集する方法が、遠心分離法または
メンブランフィルター捕集法のいずれかである、請求項
５記載のメガスフェラ・セレビシエの検出方法。 - 【請求項８】細菌を捕集する方法が、遠心分離法または
メンブランフィルター捕集法のいずれかである、請求項
６記載のメガスフェラ・セレビシエの同定方法。 - 【請求項９】ハイブリダイゼーション複合体の形成の有
無を測定する方法が、ＦＩＳＨ法（fluorescence in si
tu hybridization）、ドット−ブロット法、サザンブロ
ット法、ノーザンブロット法のいずれかである請求項５
記載のメガスフェラ・セレビシエの検出方法。 - 【請求項１０】ハイブリダイゼーション複合体の形成の
有無を測定する方法が、ＦＩＳＨ法、ドット−ブロット
法、サザンブロット法、ノーザンブロット法のいずれか
である請求項６記載のメガスフェラ・セレビシエの同定
方法。 - 【請求項１１】数的に管理した対照細菌を試料中に意図
的に混入させる工程と、該試料を請求項１または２に記
載のものから選択されるオリゴヌクレオチドである１つ
または複数の核酸プローブと、ハイブリダイゼーション
下に接触させる工程と、該プローブと該試料の細菌の核
酸との間のハイブリダイゼーション複合体の形成の有無
を測定する工程と、複合体形成のあった細菌と対照細菌
の数から細菌の数を推定することを特徴とするメガスフ
ェラ・セレビシエの定量方法。 - 【請求項１２】ハイブリダイゼーション複合体の形成の
有無を測定する方法がＦＩＳＨ法である請求項１１記載
のメガスフェラ・セレビシエの定量方法。 - 【請求項１３】請求項１または２に記載のオリゴヌクレ
オチドをポリメラーゼ存在下での核酸増幅のためのヌク
レオチドプライマーとして使用する方法。 - 【請求項１４】請求項１３に記載の方法で増幅させた核
酸を、電気泳動法および核酸染色法により検出する方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001255769A JP2003061674A (ja) | 2001-08-27 | 2001-08-27 | ザイモフィラス属菌検出のための核酸プローブ、およびビール混濁細菌の検出方法 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001255769A JP2003061674A (ja) | 2001-08-27 | 2001-08-27 | ザイモフィラス属菌検出のための核酸プローブ、およびビール混濁細菌の検出方法 |
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|---|---|
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|---|---|
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005078092A1 (ja) * | 2004-02-17 | 2005-08-25 | Sapporo Breweries Limited | 偏性嫌気性グラム陰性菌の検出・識別方法 |
| KR100770281B1 (ko) * | 2007-07-06 | 2007-10-25 | 이창근 | 자연녹화가 가능한 경계석 |
| JP2009055788A (ja) * | 2007-08-29 | 2009-03-19 | Ihi Corp | 汚染源の特定方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO1997020071A1 (fr) * | 1995-11-28 | 1997-06-05 | Asahi Breweries, Ltd. | Procede de detection d'une bacterie appartenant au genre pectinatus |
| JP2001145492A (ja) * | 1999-11-19 | 2001-05-29 | Asahi Breweries Ltd | ペクチネータス属の細菌検出用核酸プローブおよびビール混濁原因菌の検出方法 |
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2001
- 2001-08-27 JP JP2001255769A patent/JP2003061674A/ja active Pending
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