WO2005078092A1 - 偏性嫌気性グラム陰性菌の検出・識別方法 - Google Patents

偏性嫌気性グラム陰性菌の検出・識別方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2005078092A1
WO2005078092A1 PCT/JP2005/002335 JP2005002335W WO2005078092A1 WO 2005078092 A1 WO2005078092 A1 WO 2005078092A1 JP 2005002335 W JP2005002335 W JP 2005002335W WO 2005078092 A1 WO2005078092 A1 WO 2005078092A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
beer
nucleic acid
cerevisiae
base sequence
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/002335
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yasukazu Nakakita
Youichi Tsuchiya
Original Assignee
Sapporo Breweries Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sapporo Breweries Limited filed Critical Sapporo Breweries Limited
Priority to US10/589,493 priority Critical patent/US20090142750A1/en
Priority to CA002558662A priority patent/CA2558662A1/en
Priority to EP05719187A priority patent/EP1721975A4/en
Publication of WO2005078092A1 publication Critical patent/WO2005078092A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting and identifying obligate anaerobic gram-negative bacteria.
  • beer producers need to quickly and accurately determine the contamination of beer turbidity (beer turbidity) in order to dramatically reduce the time from beer production to shipping. Is growing.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Publication No. 09-820071
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-145492
  • Non-Patent Document 1 J. Am. Soc. Brew. Chem .: 51 (4), 158-163, 1993
  • an object of the present invention is to provide a method for detecting obligately anaerobic gram-negative bacteria that can make beer turbid, which could not be detected by conventional methods.
  • a further object of the present invention is to provide a method for simultaneously detecting and identifying various beer turbid bacteria including the bacterium. To provide.
  • the present invention provides a polynucleotide consisting of all or a part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the present invention also relates to an oligonucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • a primer set for detecting Malephius cerevisiae comprising an oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in 3, a step of amplifying a nucleic acid fragment using the primer set, and detecting the resulting nucleic acid fragment
  • a method for detecting Malephilus cerevisiae by a gene amplification method comprising the steps of:
  • the present invention provides a beer comprising an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 8, an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 3, and an oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 6.
  • kits for detecting and identifying beer turbid bacteria which comprises the probe set for identification, the primer set and the probe set, and a step of amplifying a nucleic acid fragment using the primer set And fusion of the obtained nucleic acid fragment with the probe set according to claim 4.
  • the present inventors have succeeded in isolating maleophilus' Sherpiche (Mai mark hilus cerevisiae), which is an obligately anaerobic and gram-negative bacterium that can make beer turbid, which cannot be detected by known methods. It was clarified that the nucleotide sequence of the 16S ribosomal RNA gene (16S rRNA gene) of Mai mark hilus cerevisiae SBC8034 strain (unapproved name) was the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. This strain was registered at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary Center, 1-1-1, Tsukuba-Higashi, Ibaraki, Japan 1 Chuo No. 6 (zip code 305-8566) on October 21, 2003. Deposit number is FERM BP-08528.
  • 16S rRNA genes of various beer turbid bacteria can be amplified. Then, a hybrid is formed between the obtained nucleic acid fragment and the probe set for detection and identification of beer turbidity bacteria, and the melting temperature of the hybrid is measured to determine the difference in the type of turbid bacteria from which the nucleic acid fragment is derived. Since the melting temperature varies depending on the melting temperature, it is possible to detect and identify beer turbid bacteria based on the difference in melting temperature.
  • the present invention provides a method for detecting obligately anaerobic gram-negative bacteria that can make beer turbid, and a method for simultaneously detecting and discriminating various beer turbid bacteria including the bacterium, which could not be detected by conventional methods. be able to.
  • FIG. 1 shows melting curves of (a) Megasphaera cerevisiae JCM6129 strain and (b) M. cerevisiae SBC8034 strain at 640 nm.
  • FIG. 2 shows melting curves of (c) P. cerevisiiphilus VTT-E-79105 strain and (d) Pectinatus frisingensis VTT-E_79100 strain at 710 nm.
  • the polynucleotide of the present invention is characterized by comprising all or a part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, but also includes a polynucleotide consisting of all or a part of the complementary sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 represents the base sequence of the 16S rRNA gene of Mai mark hilus cerevisiae, which is an obligate anaerobic Gram-negative bacterium that can make beer turbid.
  • the polynucleotide of the present invention is useful for detecting Malephilus cerevisiae as described below, and can be used as a primer for detecting Malephilus cerevisiae, a nucleic acid fragment amplified by the primer, a probe for detection, and the like.
  • the polynucleotide of the present invention can be chemically modified with a fluorescent substance or the like. It may be decorated.
  • the polynucleotide of the present invention is used as a primer for detection or a probe for detection of Mai hilus cerevisiae, it is preferably an oligonucleotide having a nucleotide length of 15 to 25.
  • primers and if necessary, can also design using primer design support software.
  • polynucleotide and oligonucleotide are used to include DNA, RNA and PNA (peptide nucleic acid).
  • the polynucleotide and the oligonucleotide of the present invention can be synthesized by a known method such as a phosphoramidite method.
  • the primer set for detecting Malephilus cerevisiae of the present invention is characterized by comprising an oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 and an oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3, wherein both oligonucleotides are those of Malephilus cerevisiae.
  • nucleic acids are extracted from a sample (for example, a malt beverage such as beer or low-malt beer).
  • the nucleic acid can be extracted using a method known in the art.
  • DNA can be extracted by a method of performing phenol extraction and ethanol precipitation, a method of using glass beads, and the like.
  • the ability to extract RNA by the AGPC method or the guanidine ultra-centrifugal cesium ultracentrifugation method can be used.
  • the obtained nucleic acid is made into type III, and a nucleic acid fragment is amplified using the primer set.
  • an amplification method an amplification method known in the art can be used.
  • the PCR method or the RT-PCR method is preferable.
  • the extracted DNA is converted to type II, and the DNA fragment between the 16S rRNA gene and the primer set A nucleic acid fragment consisting of the base sequence is amplified.
  • nucleic acid fragment (double-stranded DNA) power is obtained by repeating a cycle consisting of denaturation, annealing, and complementary strand synthesis. It can be easily determined.
  • cDNA is synthesized with reverse transcriptase using extracted RNA as type II, and PCR is performed using the obtained cDNA as type II.
  • the amplified nucleic acid fragment is detected. That is, the amplified nucleic acid fragment
  • Detection can be carried out by methods known in the art, for example, by hybridization using a probe that specifically hybridizes to Mai mark hilus cerevisiae. Further, the nucleic acid fragment can be detected by measuring the melting temperature of the amplified nucleic acid fragment.
  • the melting temperature can be measured by a method known in the art.
  • a nucleic acid staining reagent such as SYBR Green I is added to a solution containing the amplified nucleic acid fragment, and the temperature of the solution is adjusted. It is possible to measure the melting temperature by measuring the fluorescence intensity continuously while increasing the temperature and analyzing the obtained melting temperature curve. Since the nucleic acid staining reagent can be mixed with the reaction solution for amplifying the nucleic acid fragment, the nucleic acid fragment can be detected immediately after the nucleic acid fragment amplification reaction is completed.
  • the step of amplifying a nucleic acid fragment and the step of detecting the obtained nucleic acid fragment can be performed consecutively in one tube or a capillary, so that the melting temperature of the nucleic acid fragment amplified using the nucleic acid staining reagent can be reduced.
  • the method of measuring is particularly preferred.
  • the method also has the advantage of high detection sensitivity.
  • the Mai mark amplified by the primer set for detecting Malephilus cerevisiae of the present invention has a melting temperature of about 88 ° C. of the nucleic acid fragment derived from hilus cerevisiae. By comparing with the melting temperature of the sample, the Mai mark in the sample is obtained. It is possible to determine whether or not hilus cerevisiae is contained, and it is possible to detect Mai mark hilus cerevisiae.
  • the primer set for detecting and identifying beer turbidity bacteria of the present invention contains SEQ ID NOs: 8 and 3, respectively. And 6 comprising an oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in 6.
  • the oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 is a universal primer for the 16S rRNA gene.
  • the probe set for detecting and identifying beer turbidity bacteria of the present invention comprises SEQ ID NOs: 4, 7,
  • This probe set can be used to detect nucleic acid fragments of various beer turbid bacteria, as described below, and can detect and distinguish beer turbid bacteria.
  • the kit for detecting and identifying beer turbidity of the present invention is characterized by comprising the primer set and the probe set.
  • the kit may further include a reaction buffer, a dNTP mixture, an enzyme, and the like, and may further include a DNA extraction reagent and the like.
  • nucleic acids are extracted from a sample (for example, a malt beverage such as beer or low-malt beer).
  • the nucleic acid can be extracted by the same method as described above.
  • nucleic acid is made into type III, and a nucleic acid fragment is amplified using the primer set.
  • Amplification can be performed by the same method as described above, and PCR or RT-PCR is preferred.
  • a hybrid of the obtained nucleic acid fragment and the probe set is formed, and the melting temperature of the hybrid is measured.
  • the outline of the principle of measuring the melting temperature is as follows.
  • the oligonucleotides consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 4 and 7 are labeled at their 5 'ends with fluorescent substances LC Red640 and LCRed705 (hereinafter referred to as "Red 640 probe” and “: Red705 probe", respectively). .).
  • the oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 is labeled at the end with FITC (hereinafter, referred to as “FITC probe”).
  • Each probe is designed so that the 3 'end of the FITC probe and the 5' end of the Red640 and Red705 probes are close to each other and hybridize with the nucleic acid fragment of Beer turbidity bacteria.
  • the FITC probe and the Red640 probe are both hybridized to the nucleic acid fragment and the hybrid is irradiated with light at the excitation wavelength of FITC, FRET (fluorescence resonance energy transfer) occurs and the Red640 ( Or Red 705).
  • the FITC probe and / or Red640 probe melts and peels off from the nucleic acid fragment, and accordingly, FRET does not occur and the fluorescence intensity of Red640 (or Red705) decreases. Decreasing. Then, by measuring the fluorescence intensity at each temperature, taking the temperature on the horizontal axis and the fluorescence intensity (including the rate of change) on the vertical axis, a melting curve can be obtained. By analyzing the melting curve obtained in this way, the melting temperature of the hybrid can be determined.
  • the FITC probe and / or Red640 probe are set so that the degree of mismatch with a nucleic acid fragment varies depending on the type of beer turbid bacteria. Therefore, the melting curve and melting temperature of the hybrid differ depending on the type of beer turbid bacteria, and it is possible to determine the type of beer turbid bacteria based on the difference. Specifically, Malephilus cerevisiae ⁇ 3, / 3 ⁇ 4 65 ° C ⁇ Megasphaera cerevisiae is a stigma 48. C and yarn 56. C, stirrup 63 until Pectinatus frisingensisi. C, Pectinatus cerevisnphilus, has a melting temperature of about 54 ° C. By comparing the melting temperatures of the sample with these melting temperatures, it is possible to detect and identify beer turbid bacteria contained in the sample.
  • the probe set of the present invention can be mixed in a reaction solution for amplifying a nucleic acid fragment, the melting temperature can be measured immediately after the amplification reaction of the nucleic acid fragment is completed. Therefore, the method for detecting and identifying beer turbidity bacteria of the present invention has an advantage that the step of amplifying a nucleic acid fragment and the step of measuring a melting temperature can be performed in a single tube-capillary.
  • the M. cerevisiae SBC8034 strain was grown on a GAM agar medium (Nissui Pharmaceutical) supplemented with 0.2% malic acid. Inoculate one loopful of M. cerevisiae SBC8034 strain into a bottle of whole malt vinole (pH 4.5, bitterness 30, alcohol 5%, volume 350 mL), stopper the beer bottle, and heat to 30 ° C. After culturing for about one month, the beer became cloudy. [0036] Table 1 shows the concentration (ppm) of organic acids in cloudy beer after one month of culture.
  • the cloudy beer inoculated with the M. cerevisiae SBC8034 strain had a malic acid-succinic acid concentration about twice that of normal beer.
  • the M. cerevisiae SBC8034 strain was inoculated on a GAM agar medium supplemented with 0.2% malic acid, and anaerobically cultured at 30 ° C. for 7-14 days.
  • DNA was extracted from the obtained cells of the M. cerevisiae SBC8034 strain using a DNA extract PrepMan Ultra (Applied Biosystems Japan).
  • the 16S rRNA gene of M. cerevisiae SBC8034 was sequenced using the DNA extract prepared by the above method. M. obtained as a result of the sequence
  • SEQ ID NO: 1 shows the 16S rRNA gene sequence of S. cerevisiae SBC8034 strain. This gene distribution, System IJ, was clearly different from the gene sequences of Vectinatas spp. And Megaspela spp., Which are obligate anaerobic Gram-negative bacteria that make beer turbid. Furthermore, a database search of GenBank and the like was performed, but no gene sequence registered or found was found. Therefore, it was revealed that M. cerevisiae is a novel obligate anaerobic Gram-negative bacterium that makes beer turbid.
  • DNA was extracted from various strains that could make beer turbid.
  • the obtained DNA extract was subjected to PCR using the oligonucleotides having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 2 and 3 as primers with the composition of the reaction reagents shown in Table 2.
  • the temperature was continuously raised to 95 ° C, immediately cooled to 65 ° C, maintained at the same temperature for 15 seconds, and then raised to 95 ° C at a rate of 20 ° C / sec. Raised. During this heating, the fluorescence intensity at 530 nm was measured every 0.2 ° C, and the melting temperature was determined by the peak generated by plotting the negative value of the first derivative (1 dF / dT) of the value.
  • Table 3 shows whether a peak at a melting temperature of about 88 ° C appeared for PCR products of various strains. As is evident from Table 3, a peak showing a melting temperature of about 88 ° C was observed only in M. cerevisiae. From these facts, it has been clarified that M. cerevisiae can be specifically detected by using a primer set comprising an oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 3.
  • Test strain (Gram negative bacteria) Test strain (Gram positive bacteria) at 88 ° C Peak at 88 ° C Peak Peak
  • Pectinatus frisingensis ID107-9 one actobsci I I us paracase i ⁇
  • Zymomonas mob i I is subsp.I Lactobac i I I us coryn i form is s mobi I is IF013756 subsp.coryn i form is s JCM1164
  • JCM Japan Collection of Microorganisms, Sa ⁇ tama, Japan
  • Example 4 Detection and identification of obligately anaerobic gram-negative bacteria using real-time PCR DNA extracts of various strains prepared by the same method as in Example 2 were used as primers in SEQ ID NO: 8.
  • An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOS: 3 and 6 (universal primer of the 16S rRNA gene, 5'-TGGGAGAGTTTGATCCTGGCTC-3) and an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOS: 3 and 6 were used as the probe.
  • Oligonucleotide consisting of the sequence (phosphorylated at the 3 'end and labeled at the 5' end with LC Red640), oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 (phosphorylated at the 3 'end and Using an oligonucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 5 (labeled with LC Red 705) and the base sequence of SEQ ID NO: 5 (labeled with FITC at the 3 'end), PCR was carried out in the composition.
  • the temperature was continuously raised to 95 ° C, immediately cooled to 40 ° C, maintained at the same temperature for 15 seconds, and then raised to 95 ° C at a rate of 20 ° C / sec. Raised.
  • the fluorescence intensity at 640 nm and 710 nm was measured every 0.2 ° C, and the melting temperature was determined by the peak generated by plotting the negative value of the primary fraction (1 dF / dT) at that temperature. .
  • Fig. 1 is a melting curve showing the relationship between the rate of change (-dF / dT) and temperature (° C) of Fig. 1.
  • Fig. 1 shows the melting curves of (a) Megasphaera cerevisiae JCM6129 strain and (b) ⁇ ⁇ cerevisiae SBC8034 strain at 640 nm.
  • Figure 2 shows the melting curves of (c) P.
  • the present invention is capable of simultaneously detecting and identifying various beer turbid bacteria, so that the quality of beer can be controlled.
  • C that can be used

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　ビールを混濁させ得る偏性嫌気性グラム陰性菌を検出する方法、当該菌を含めた様々なビール混濁菌を同時に検出・識別する方法を提供する。

Description

明 細 書
偏性嫌気性グラム陰性菌の検出'識別方法
技術分野
[0001] 本発明は、偏性嫌気性グラム陰性菌の検出'識別方法に関する。
背景技術
[0002] 近年のビールの生ビール化への流れは、ビール鮮度という新たな価値観をもたらし た。こうした背景から、ビール製造会社にとっては、ビールの製造から出荷までの時 間を劇的に短縮するために、ビールを混濁させる菌（ビール混濁菌）の汚染を迅速か つ正確に判定する必要が高まっている。
[0003] 偏性嫌気性菌であるべクチネータス属菌（Pectinatus)及びメガスフエラ属菌（
Megasphera)は、製品ビールの嫌気度が高まるにしたがって汚染事故の原因菌とし ての危険度が増すため、これらの菌群を迅速かつ正確に検出することが望まれてい る。これらの菌群の検出方法として、従来より、抗原抗体反応を利用した検出法 (例え ば、非特許文献 1参照）、 PCR法 (ポリメラーゼ連鎖反応法）による検出法 (例えば、 特許文献 1参照）、 FISH法 (蛍光 in situハイブリッド形成法）による検出法 (例えば 、特許文献 2参照）などが知られている。
[0004] 特許文献 1 :特再平 09 - 820071号公報
特許文献 2：特開 2001 - 145492号公報
非特許文献 1 : J. Am. Soc. Brew. Chem. : 51(4)， 158-163, 1993
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] し力、しながら、本発明者らは、ビールを混濁させる新規な偏性嫌気性グラム陰性菌 を発見し、上記従来技術の方法では当該菌を検出できない可能性があることを見出 した。
[0006] したがって、本発明の目的は、従来の方法では検出できなかった、ビールを混濁さ せ得る偏性嫌気性グラム陰性菌を検出する方法を提供することにある。本発明の目 的は、さらに、当該菌を含めた様々なビール混濁菌を同時に検出'識別する方法を 提供することにある。
課題を解決するための手段
[0007] 上記目的を達成するために、本発明は、配列番号 1に示す塩基配列の全部又は一 部からなるポリヌクレオチドを提供する。
[0008] また、本発明は、配列番号 2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号
3に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなる、マレフイラス'シェルピシェ（ Malephilus cerevisiae)検出用プライマーセット、並びに、当該プライマーセットを用い て核酸断片を増幅する工程、及び、得られた核酸断片を検出する工程を含むことを 特徴とする遺伝子増幅法によるマレフィラス'シェルビシェ（Malephilus cerevisiae)の 検出方法を提供する。
[0009] さらに、本発明は、配列番号 8に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番 号 3に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号 6に示す塩基配列からな るオリゴヌクレオチドとからなるビール混濁菌の検出 ·識別用プライマーセット、配列番 号 4に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号 7に示す塩基配列からな るオリゴヌクレオチドと配列番号 5に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからな るビール混濁菌の検出'識別用プローブセット、当該プライマーセット及び当該プロ ーブセットを含むことを特徴とするビール混濁菌の検出 ·識別用キット、並びに、当該 プライマーセットを用いて核酸断片を増幅する工程、及び、得られた核酸断片と請求 項 4記載のプローブセットとのハイブリッドの融解温度を測定する工程を含むことを特 徴とするビール混濁菌の検出'識別方法を提供する。
[0010] 本発明者らは、既知の方法では検出できなレ、ビールを混濁させ得る偏性嫌気性グ ラム陰性菌であるマレフィラス 'シェルピシェ（Mai印 hilus cerevisiae)を分離することに 成功し、 Mai印 hilus cerevisiae SBC8034株（未承認名）の 16S リボソ一マル RNA遺 伝子（16S rRNA遺伝子）の塩基配列が配列番号 1に示す塩基配列であることを明 らかにした。本菌株は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センタ 一 (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305-8566) )に 2 003年 10月 21日に寄託されており、その寄託番号は FERM BP— 08528である。
[0011] Malephilus cerevisiae検出用プライマーセットを用いることにより、 Malephilus cerevisiaeの 16S rRNA遺伝子を特異的に増幅することができるため、 Malephilus cerevisiaeを検出することが可能となる。
[0012] また、ビール混濁菌の検出'識別用プライマーセットを用いることにより、様々なビー ル混濁菌の 16S rRNA遺伝子を増幅することができる。そして、得られた核酸断片 とビール混濁菌の検出'識別用プローブセットとのハイブリッドを形成させ、当該ハイ ブリツドの融解温度を測定することにより、核酸断片の由来している混濁菌の種類の 違いによって融解温度が異なるため、融解温度の違いによりビール混濁菌の検出及 び識別することが可能となる。
発明の効果
[0013] 従来の方法では検出できなかった、ビールを混濁させ得る偏性嫌気性グラム陰性 菌を検出する方法、当該菌を含めた様々なビール混濁菌を同時に検出'識別する方 法を提供することができる。
図面の簡単な説明
[0014] [図 l]640nmにおける（a) Megasphaera cerevisiaeJCM6129株及び（b) M. cerevisiae SBC8034株の融解曲線である。
[図 2]710nmにおける（c) P. cerevisiiphilus VTT-E- 79105株及び（d) Pectinatus frisingensis VTT- E_79100株の融解曲線である。
発明を実施するための最良の形態
[0015] 以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
[0016] くポリヌクレ才チド〉
まず、本発明のポリヌクレオチドについて説明する。本発明のポリヌクレオチドは、 配列番号 1に示す塩基配列の全部又は一部からなることを特徴とするが、配列番号 1 に示す塩基配列の相補配列の全部又は一部からなるポリヌクレオチドをも含む。ここ で、配列番号 1は、ビールを混濁させ得る偏性嫌気性グラム陰性菌である Mai印 hilus cerevisiaeの 16S rRNA遺伝子の塩基配列を表わす。本発明のポリヌクレオチドは、 以下に述べるように、 Malephilus cerevisiaeを検出する上で有用であり、 Malephilus cerevisiae検出用プライマー、プライマーにより増幅された核酸断片、検出用プローブ 等として使用可能である。また、本発明のポリヌクレオチドは蛍光物質等により化学修 飾されていてもよい。
[0017] 本発明のポリヌクレオチドが Mai印 hilus cerevisiae検出用プライマー又は検出用プロ ーブとして使用される場合には、ヌクレオチドの長さが 15— 25であるオリゴヌクレオチ ドであることが望ましい。プライマーの設計は、当業者であれば容易に行うことができ 、必要があれば、プライマー設計支援ソフトウェアを利用して設計することも可能であ る。
[0018] なお、本発明において「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」とは、 DNA、 R NA及び PNA (ペプチド核酸）を含む意味で用いられる。また、本発明のポリヌクレオ チド及びオリゴヌクレオチドは、例えば、ホスホロアミダイト法等の公知の方法により合 成することが可能である。
[0019] < Malephilus cerevisiaeの検出 >
次に、本発明の Mai印 hilus cerevisiae検出用プライマーセット及びそれを用いた Malephilus cerevisiaeの検出方法について説明する。本発明の Malephilus cerevisiae 検出用プライマーセットは、配列番号 2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと 配列番号 3に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとからなることを特徴とし、両ォ リゴヌクレオチドは Malephilus cerevisiaeの 16S rRNA遺伝子に特異的な塩基配列 を有していることから、 Malephilus cerevisiaeの 16S rRNA遺伝子を特異的に増幅 することができるため、 Mai印 hilus cerevisiaeを特異的に検出することが可能である。
[0020] 本発明の検出方法により Mai印 hilus cerevisiaeの検出を行うには、まず、試料（例え ば、ビールや発泡酒などの麦芽飲料)から核酸を抽出する。核酸の抽出は、当技術 分野で公知の方法を使用することによりでき、具体的には例えば、フエノール抽出及 びエタノール沈殿を行う方法、ガラスビーズを用いる方法などにより DNAを抽出する ことができ、 AGPC法やグァニジン ·塩ィ匕セシウム超遠心法などにより RNAを抽出す ること力 Sできる。
[0021] 次に、得られた核酸を铸型とし、前記プライマーセットを用いて核酸断片を増幅する 。増幅方法として、当技術分野で公知の増幅方法を用レ、ることができるが、特に、 PC R法又は RT— PCR法が好ましレ、。 PCR法では、抽出された DNAを铸型として、 DN Aポリメラーゼにより、 16S rRNA遺伝子のうちプライマーセットに挟まれた部分の塩 基配列からなる核酸断片が増幅される。 PCR法では、変性、アニーリング、相補鎖合 成からなるサイクルを繰り返すことにより核酸断片（二本鎖 DNA)力 各工程の温度 や時間、サイクル数等の PCRの最適条件は、当業者であれば用意に決定することが できる。 RT— PCR法では、抽出された RNAを铸型として、逆転写酵素により cDNA を合成し、得られた cDNAを錡型として PCR法を行うものである。
[0022] 次に、増幅された核酸断片を検出する。すなわち、増幅された核酸断片が
Malephilus cerevisiaeに特異的なものか否かを判定する。検出は、当技術分野で公 知の方法により行うことができ、例えば、 Mai印 hilus cerevisiaeに特異的にハイブリダィ ズするプローブを用いたハイブリダィゼーシヨンにより行うことが可能である。また、増 幅された核酸断片の融解温度を測定することにより、核酸断片を検出することも可能 である。
[0023] 融解温度の測定は、当技術分野で公知の方法により行うことができるが、例えば、 増幅された核酸断片を含む溶液に SYBR Green Iなどの核酸染色試薬を添加し、 溶液の温度を上昇させながら蛍光強度を連続的に測定し、得られた融解温度曲線を 分析することにより融解温度を測定することが可能である。核酸染色試薬は核酸断片 を増幅する反応溶液に混ぜておくことができるため、核酸断片の増幅反応が終了後 ただちに核酸断片を検出することができる。したがって、 1つのチューブやキヤビラリ 一内で、核酸断片を増幅する工程と得られた核酸断片を検出する工程とを連続して 行えるため、核酸染色試薬を用いて増幅された核酸断片の融解温度を測定する方 法が特に好ましい。また、本方法は、検出感度が高いという利点もある。
[0024] 本発明の Malephilus cerevisiae検出用プライマーセットにより増幅される Mai印 hilus cerevisiae由来の核酸断片の融解温度は約 88°Cであり、試料の融解温度と比較する ことにより、試料中に Mai印 hilus cerevisiaeが含まれているか否かの判定を行うことが でき、 Mai印 hilus cerevisiaeの検出が可能である。
[0025] くビール混濁菌の検出'識別 >
最後に、本発明のビール混濁菌の検出'識別用プライマーセット、プローブセット及 びキット並びにそれらを用いたビール混濁菌の検出 ·識別方法について説明する。
[0026] 本発明のビール混濁菌の検出 ·識別用プライマーセットは、それぞれ配列番号 8、 3 及び 6に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。配列番 号 8に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、 16S rRNA遺伝子のュニバー サルプライマーである。本発明のプライマーセットを用いることにより、様々なビール 混濁菌の核酸断片を増幅することが可能である。
[0027] 本発明のビール混濁菌の検出 ·識別用プローブセットは、それぞれ配列番号 4、 7、
5に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。本プローブセ ットは、以下に述べるように、様々なビール混濁菌の核酸断片を検出するのに用いる ことができ、ビール混濁菌を検出 ·識別することが可能である。
[0028] 本発明のビール混濁菌の検出.識別用キットは、前記プライマーセットと前記プロ一 ブセットを含むことを特徴とする。本キットは、さらに、反応バッファー、 dNTP混合物、 酵素などを含んでレ、てもよく、 DNA抽出試薬などを含んでレ、てもよレ、。
[0029] 本発明の検出'識別方法によりビール混濁菌を検出'識別するには、まず、試料（ 例えば、ビールや発泡酒などの麦芽飲料)から核酸を抽出する。核酸の抽出は、前 述と同様の方法により行うことができる。
[0030] 次に、得られた核酸を铸型とし、前記プライマーセットを用いて核酸断片を増幅する
。増幅は、前述と同様の方法により行うことができ、 PCR法又は RT— PCR法が好まし レ、。
[0031] 次に、得られた核酸断片と前記プローブセットとのハイブリッドを形成させ、ハイプリ ッドの融解温度を測定する。融解温度の測定原理の概要は次のとおりである。配列 番号 4及び 7に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、それぞれ 5'末端が蛍光 物質である LC Red640及び LC Red705で標識されている（以下、それぞれ「Red 640プローブ」及び「： Red705プローブ」という。）。一方、配列番号 5に示す塩基配列 力 なるオリゴヌクレオチドは、 3，末端が FITCで標識されている（以下、「FITCプロ ーブ」という。）。そして、各プローブは、 FITCプローブの 3'末端と Red640プローブ 及び Red705プローブの 5 '末端とが近接してビール混濁菌の核酸断片とハイブリダ ィズするように設計されている。核酸断片に FITCプローブと Red640プローブ（又は Red705プローブ）とがともにハイブリダィズしている状態で、ハイブリッドに FITCの 励起波長の光を照射すると、 FRET (蛍光共鳴エネルギー移動）が生じ、 Red640 ( 又は Red705)の蛍光波長の光が観察される。この状態から温度を上昇させていくと 、 FITCプローブ及び/又は Red640プローブ（又は Red705プローブ）が融解して 核酸断片から剥がれていき、それに従って FRETが生じなくなり Red640 (又は Red7 05)の蛍光強度が減少していく。そして、各温度における蛍光強度を測定し、横軸に 温度をとり、縦軸に蛍光強度 (変化率も含む）をとれば、融解曲線が得られる。このよ うにして得られた融解曲線を解析することにより、ハイブリッドの融解温度を求めること ができる。
[0032] FITCプローブ及び/又は Red640プローブ（又は Red705プローブ）は、核酸断 片とのミスマッチの程度がビール混濁菌の種類によって差が生じるように設定してあ る。したがって、ビール混濁菌の種類によって、ハイブリッドの示す融解曲線及び融 解温度が異なるため、その違いに基づいてビール混濁菌の種類を判別することが可 肯で¾>0。具体的には、 Malephilus cerevisiae {3,/¾ 65 °C Λ Megasphaera cerevisiaeは 糸勺 48。C及び糸勺 56。C、 Pectinatus frisingensisiまで糸勺 63。C、 Pectinatus cerevisnphilus は約 54°Cの融解温度を示す。試料の融解温度とこれらの融解温度を比較することに より、試料中に含まれているビール混濁菌の検出 ·識別を行うことができる。
[0033] なお、本発明のプローブセットは、核酸断片を増幅する反応溶液に混ぜておくこと ができるため、核酸断片の増幅反応が終了後ただちに融解温度を測定することがで きる。したがって、本発明のビール混濁菌の検出'識別方法は、 1つのチューブゃキ ャピラリー内で核酸断片を増幅する工程と融解温度を測定する工程を連続して行え るという利点がある。
実施例
[0034] 以下、実施例を挙げて本発明について更に詳しく説明するが、本発明はこれらの 実施例に限定されるものではない。
[0035] (実施例 1) M. cerevisiaeの植菌によるビールの混濁
M. cerevisiae SBC8034株を、 0· 2%のリンゴ酸を添加した GAM寒天培地（日水製 薬社）で増殖させた。 M. cerevisiae SBC8034株の 1白金耳量を瓶入りの全麦芽ビー ノレ（pH4. 5、苦味価 30、アルコール 5%、容量 350mL)に植菌し、ビール瓶に打栓 をし、 30°Cにて約 1ヶ月間培養を行ったところ、ビールが混濁した。 [0036] 表 1は培養 1ヶ月後の混濁ビール中の有機酸の濃度 (ppm)を示したものである。
M. cerevisiae SBC8034株を植菌した混濁ビールは、正常ビールに比べ、リンゴ酸ゃ コハク酸の濃度が約 2倍になっていた。
[0037] [表 1]
Figure imgf000009_0001
[0038] (実施例 2) 16S rRNA遺伝子のシークェンス
(ゲノム DNAの調製）
M. cerevisiae SBC8034株を、 0. 2%のリンゴ酸を添加した GAM寒天培地に植菌し 、 30°Cにて、 7— 14日間、嫌気培養を行った。なお、嫌気培養は、タバイエスペック 社製の嫌気培養装置を用い、 N ： H ： CO = 90 : 5 : 5という条件で行った。嫌気培養
2 2 2
した M. cerevisiae SBC8034株の菌体から、 DNA抽出液 PrepMan Ultra (アプライド' バイオシステムズジャパン社）を用いて、 DNAの抽出を行った。
[0039] ( 16S rRNA遺伝子の増幅'解析）
上記方法により調製した DNA抽出液について、 MicroSeq Full Gene 16S rDNAキッ ト（アプライド 'バイオシステムズジャパン社）を用いて、 M. cerevisiae SBC8034株の 16 S rRNA遺伝子のシークェンスを行った。シークェンスの結果得られた M.
cerevisiae SBC8034株の 16S rRNA遺伝子配列を配列番号 1に示す。本遺伝子配 歹 IJは、ビールを混濁させる偏性嫌気性グラム陰性菌であるべクチネータス属菌及びメ ガスフェラ属菌の遺伝子配列とは、明らかに異なっていた。さらに、 GenBank等のデ ータベース検索を行ったが、登録されてレ、る何れの遺伝子配列とも一致しなかった。 従って、 M. cerevisiaeはビールを混濁させる新規な偏性嫌気性グラム陰性菌であるこ とが明らかとなった。
[0040] (実施例 3)リアルタイム PCRを用いた M. cerevisiaeの検出および識別
実施例 2と同様の方法により、ビールを混濁させ得る様々な菌株から DNAを抽出し 、得られた DNA抽出液について、配列番号 2及び 3に示す塩基配列からなるオリゴ ヌクレオチドをプライマーとして用いて、表 2に示した反応試薬の組成で PCRを行つ た。
[表 2]
Figure imgf000010_0001
ロシュ ■ ダイァグノスティ ックス社製
[0042] 反応装置に LightCyclerクイックシステム 330(ロッシュ 'ダイァグノスティックス社製)を 用レ、、 95°Cで 10分間処理した後、 1サイクルを 95°Cで 15秒間、 50°Cで 5秒間、 72 °Cで 20秒間とし、それを 40サイクル繰り返すことにより PCRを行った。
[0043] PCR終了後引き続いて 95°Cまで温度を上昇させた後、直ちに 65°Cまで冷却し、 同温度を 15秒間保持した後、 20°C/秒の割合で 95°Cまで温度を上昇させた。この 加熱の間、 530nmの蛍光強度を 0. 2°C毎に測定し、その値の一次微分の負の値 (一 dF/dT)をプロットして生じるピークにより融解温度を決定した。
[0044] 表 3に様々な菌株の PCR産物に対して融解温度約 88°Cのピークが出現したか否 かを示す。表 3から明らかなように、 M. cerevisiaeのみに約 88°Cの融解温度を示すピ ークが観察された。このこと力ら、配列番号 2及び 3に示す塩基配列からなるオリゴヌ クレオチドからなるプライマーセットを用いることにより、 M. cerevisiaeを特異的に検出 できることが明らかとなった。
[0045] なお、使用した一部の菌株（サッポロビール分離株）については、実施例 2と同様の 方法により、 16S rRNA遺伝子配列からの菌種決定を行った。
[0046] [表 3] 供試菌株 （グラム陰性菌） 88°Cの 供試菌株 （グラム陽性菌） 88°Cの ピーク ピーク
Ma I eph i I us cer ev i s i ae SBC8034 + Lactobaci l lus brevis SBC8003
Ma I eph i I us cer ev i s i ae SBC8065 + Lactobaci l lus brevis I D19 /-1 一
Ma I eph i I us cer ev i s i ae SBC8066 + Lactobaci l lus co 11 i no i des 一
JCM1123
Pect i natus cerev i s i i ph i u I s ― Lactobac i I I us buchner i JCM1115 VTT-E-79105
Pect i natus f r i s i ngens i s 一 Lactobac i 11 us 1 i ndner i 一 VTT-E-79100 VTT-E-82166
Pectinatus frisingensis ID107 - 9 一 し actobsci I I us paracase i ―
ID196-1
Megasphaera cer ev i s i ae JCM6129 一 Lactobac i I I us ma I ef ermentans 一
ID140-3
Prevote I I a corpor is JCM8529 一 Lactobac i I I us p I antarum ―
ID158-1
Zymomonas mob i I is subsp. 一 Lactobac i I I us coryn i form i s 一 mobi I is IF013756 subsp. coryn i form i s JCM1164
Enter obacter aerogenes JC 1235 一 Ped i ococcus damnosus BC8022 一
Klebsiel la aerogenes ATCC15050 一 Lactococcus I act i s I D169-1 -
Rahnel la aquat i I i s ID252-2 一 Staphylococcus warner i I D249 一
Cedecea dav i sae I D313-9 一
JCM： Japan Col lection of Microorganisms, Sa ι tama, Japan
ATCC： Amer ican Type Culture Col lection, USA
VTT： Va 11 i on Tekn i I I i nen Tutk i muskeskus, Finland
SBC, ID: サッポロ ビ一ル分離株
[0047] (実施例 4)リアルタイム PCRを用いた偏性嫌気性グラム陰性菌の検出および識別 実施例 2と同様の方法により調製した様々な菌株の DNA抽出液について、プライ マーとして配列番号 8に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（16S rRNA遺伝 子のユニバーサルプライマー、 5 ' - TGGAGAGTTTGATCCTGGCTC- 3， )並びに配 列番号 3及び 6に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、プローブとして 配列番号 4の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（3'末端をリン酸化し、 5'末端を L C Red640でラベルしてある）、配列番号 7の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（3 '末端をリン酸化し、 5'末端を LC Red705でラベルしてある）及び配列番号 5の塩 基配列からなるオリゴヌクレオチド（3'末端を FITCでラベルしてある）を使用し、表 4 に示した反応試薬の組成で PCRを行った。
[0048] [表 4] 試薬 容量
L i ghtCyc I e r -FastSta r t DNA Maste r Hyb r i d i zat i on 2 . 0 し P r obes *
プライマ一 （ 1 O jw M ) 各 1 . 0 プローブ （ 1 0 M ) 各 0 . 4 jU L
M g C I 2 ( 2 5 m M ) 1 . 6 jU し 滅菌水 1 1 . 7 jU し
D N A抽出液 0 . 5 し
1=1 BT 2 0 . 0 〃 し ロッシュ ■ ダイァグノスティ ックス社製
[0049] 反応装置に、 LightCyclerクイックシステム 330 (ロッシュ 'ダイァグノスティックス社製） を用い、 95°Cで 10分間処理した後、 1サイクルを 95°Cで 15秒間、 50°Cで 5秒間、 7 2°Cで 20秒間とし、それを 40サイクル繰り返すことにより PCRを行った。
[0050] PCR終了後引き続いて 95°Cまで温度を上昇させた後、直ちに 40°Cまで冷却し、 同温度を 15秒間保持した後、 20°C/秒の割合で 95°Cまで温度を上昇させた。この 加熱の間、 640nm及び 710nmの蛍光強度を 0. 2°C毎に測定し、その値の一次微 分の負の値 (一 dF/dT)をプロットして生じるピークにより融解温度を決定した。
[0051] その結果、 M. cerevisiae SBC8034株は 640nmで約 65°C、 Megasphaera cerevisiae
JCM6129株は 640nmで約 48°C及び約 56°C、 Pectinatus frisingensis VT
丁 -79100株は71(¾111で約63。〇、 P. cerevisiiphilus VTT-E-79105株は 710nmで 約 54°Cの融解温度を示すピークが観察された。図 1及び図 2は、蛍光強度の変化率 (-dF/dT)と温度（°C)との関係を表わす融解曲線である。図 1は 640nmにおける（ a) Megasphaera cerevisiae JCM6129株及び（b) Μ· cerevisiae SBC8034株の融解曲 線を、図 2は 710nmにおける（c) P. cerevisiiphilus VTT-E-79105株及び（d) Pectinatus frisingensis VTT-E-79100株の融解曲線を示す。上記の 4つの菌株以外 の菌株は、融解曲線においてピークを示さなかった。なお、本実施例において用い た菌株は表 3に示した菌株と同一である。
[0052] 以上より、上記プライマーおよびプローブを用いることにより、同時に複数の偏性嫌 気性グラム陰性菌の検出'識別をすることが可能であることが確認された。
産業上の利用可能性
[0053] 本発明は、様々なビール混濁菌を同時に検出 '識別できるため、ビールの品質管 理に利用することができる c

Claims

請求の範囲
[1] 配列番号 1に示す塩基配列の全部又は一部からなるポリヌクレオチド。
[2] 配列番号 2に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号 3に示す塩基配 歹 IJからなるオリゴヌクレオチドとからなる、マレフィラス'シェルピシェ（Mai印 hilus cerevisiaej検出用フライマーセット。
[3] 配列番号 8に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号 3に示す塩基配 歹 IJからなるオリゴヌクレオチドと配列番号 6に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド とからなるビール混濁菌の検出'識別用プライマーセット。
[4] 配列番号 4に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号 7に示す塩基配 歹 IJからなるオリゴヌクレオチドと配列番号 5に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチド とからなるビール混濁菌の検出'識別用プローブセット。
[5] 請求項 3記載のプライマーセット及び請求項 4記載のプローブセットを含むことを特 徴とするビール混濁菌の検出 ·識別用キット。
[6] 請求項 2記載のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅する工程、及び、得られ た核酸断片を検出する工程を含むことを特徴とする遺伝子増幅法によるマレフィラス
•シェルピシェ（Mai印 hilus cerevisiae)の検出方法。
[7] 請求項 3記載のプライマーセットを用いて核酸断片を増幅する工程、及び、得られ た核酸断片と請求項 4記載のプローブセットとのハイブリッドの融解温度を測定する 工程を含むことを特徴とするビール混濁菌の検出'識別方法。
PCT/JP2005/002335 2004-02-17 2005-02-16 偏性嫌気性グラム陰性菌の検出・識別方法 WO2005078092A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/589,493 US20090142750A1 (en) 2004-02-17 2005-02-16 Method of detecting and identifying gram-negative obligative anaerobic bacterium
CA002558662A CA2558662A1 (en) 2004-02-17 2005-02-16 Method of detecting and identifying gram-negative obligative anaerobic bacterium
EP05719187A EP1721975A4 (en) 2004-02-17 2005-02-16 METHOD FOR DETECTING AND IDENTIFYING A GRAMNEGATIVE OBLIGATOR ANAEROBIC BACTERIUM

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004040376A JP2005229838A (ja) 2004-02-17 2004-02-17 偏性嫌気性グラム陰性菌の検出・識別方法
JP2004-040376 2004-02-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005078092A1 true WO2005078092A1 (ja) 2005-08-25

Family

ID=34857882

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/002335 WO2005078092A1 (ja) 2004-02-17 2005-02-16 偏性嫌気性グラム陰性菌の検出・識別方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20090142750A1 (ja)
EP (1) EP1721975A4 (ja)
JP (1) JP2005229838A (ja)
CA (1) CA2558662A1 (ja)
WO (1) WO2005078092A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9303281B2 (en) 2012-07-23 2016-04-05 Pall Corporation Compositions for detecting foodstuff spoilage microorganisms

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10210980A (ja) * 1997-01-29 1998-08-11 Asahi Breweries Ltd 乳酸菌検出用オリゴヌクレオチド及び該菌の検出方法
JP2001231564A (ja) * 2000-02-18 2001-08-28 Asahi Breweries Ltd 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法
JP2002125677A (ja) * 2000-10-24 2002-05-08 Asahi Breweries Ltd メガスフェラ・セレビシエ検出のための核酸プローブ、およびビール混濁細菌の検出方法
JP2003061674A (ja) * 2001-08-27 2003-03-04 Asahi Breweries Ltd ザイモフィラス属菌検出のための核酸プローブ、およびビール混濁細菌の検出方法
JP2003061675A (ja) * 2001-08-27 2003-03-04 Asahi Breweries Ltd セレノモナス属菌検出のための核酸プローブ、およびビール混濁細菌の検出方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19732086C2 (de) * 1997-07-25 2002-11-21 Univ Leipzig Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Eubakterien
AUPQ909000A0 (en) * 2000-07-28 2000-08-24 University Of Sydney, The A method of detecting microorganisms
DE10129410A1 (de) * 2001-06-19 2003-01-02 Vermicon Ag Verfahren zum spezifischen Schnellnachweis bierschädlicher Bakterien

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10210980A (ja) * 1997-01-29 1998-08-11 Asahi Breweries Ltd 乳酸菌検出用オリゴヌクレオチド及び該菌の検出方法
JP2001231564A (ja) * 2000-02-18 2001-08-28 Asahi Breweries Ltd 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法
JP2002125677A (ja) * 2000-10-24 2002-05-08 Asahi Breweries Ltd メガスフェラ・セレビシエ検出のための核酸プローブ、およびビール混濁細菌の検出方法
JP2003061674A (ja) * 2001-08-27 2003-03-04 Asahi Breweries Ltd ザイモフィラス属菌検出のための核酸プローブ、およびビール混濁細菌の検出方法
JP2003061675A (ja) * 2001-08-27 2003-03-04 Asahi Breweries Ltd セレノモナス属菌検出のための核酸プローブ、およびビール混濁細菌の検出方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE GENBANK [online] 9 February 2000 (2000-02-09), RAMSAK A. ET AL: "Unraveling genetic diversity of ruminal bacteria belonging to the CFB phylum", XP002988737, Database accession no. (AF218618) *
SCHROETER M. ET AL: "Genotyping of Hepatitis C Virus Types 1, 2, 3, and 4 by a One-Step LightCycler Method Using Three Different Pairs of Hybridization Probes", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, vol. 40, no. 6, 2002, pages 2046 - 2050, XP002988738 *
See also references of EP1721975A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20090142750A1 (en) 2009-06-04
EP1721975A1 (en) 2006-11-15
CA2558662A1 (en) 2005-08-25
JP2005229838A (ja) 2005-09-02
EP1721975A4 (en) 2008-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2005078086A1 (ja) 乳酸菌の検出・識別方法
JPWO2005093059A1 (ja) 酵母、乳酸菌及び偏性嫌気性菌検出・識別のためのプライマー及びプライマーセット並びにそれらを用いた検出・識別方法
RU2404255C2 (ru) Набор праймеров для использования при детекции дрожжей рода dekkera и дрожжей рода brettanomyces
JP5654265B2 (ja) ビソクラミス属に属する菌類の検出方法
JP5048622B2 (ja) 乳酸菌検出用ｐｃｒプライマー
WO2010055868A1 (ja) ゲオスミチア（Ｇｅｏｓｍｉｔｈｉａ）属に属する菌類の検出方法
JP2014003946A (ja) サーモアスカス属真菌の検出方法
WO2005078092A1 (ja) 偏性嫌気性グラム陰性菌の検出・識別方法
JP5605739B2 (ja) 被検試料中のバチルスコアグランスを特異的、短時間、かつ、高感度で検出する方法
Ohshima et al. Detection method of food-borne pathogens in seafood
WO2023214588A1 (ja) 芽胞形成細菌の検出方法
JP2008263971A (ja) ラクトバチラス属乳酸菌の検出用プライマーおよびプローブ
JP5697881B2 (ja) パエシロマイセスサトゥラタス及びパエシロマイセスディバリカタスの検出方法
KR102655121B1 (ko) 락토바실러스 사케이 k040706 균주 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도
WO2016129249A1 (ja) 乳酸菌の検出方法、乳酸菌検出キット、及び乳酸菌検出器具
JP5873356B2 (ja) モニリエラ属真菌の検出方法
JP4037926B2 (ja) Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓの検出に用いるプライマー
Juvonen et al. PCR detection of Gram-negative brewery contaminants-present state
JPH07289295A (ja) 乳酸菌の検出または同定方法
TWI464177B (zh) 用於檢測德克酵母菌菌株的核酸分子、檢驗套組、生物晶片以及方法
JP2010081935A (ja) ペディオコッカス・ダムノサスの検出用プライマーおよびプローブ
JPWO2008044358A1 (ja) サッカロミセス属酵母の検出用プライマーセット
JPH10323190A (ja) 微生物検出用オリゴヌクレオチド及び微生物検出方法
CASTELLUCCI RESOLUTION OIV-OENO 409-2012
JP2008161187A (ja) サッカロミセス属酵母の検出用プライマーセットおよびその組合せ

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2558662

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005719187

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005719187

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10589493

Country of ref document: US