JP2008263971A - ラクトバチラス属乳酸菌の検出用プライマーおよびプローブ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその相同ポリヌクレオチドからなる群から選択されるプライマーを含んでなる、ラクトバチラス属乳酸菌の検出に用いられるLAMP法プライマーセットおよびPCR法プライマーセット。プライマーセットを用いてLAMP法により核酸増幅反応を実施する。
【選択図】なし
Description
本発明者は、ラクトバチラス・コリノイデスに近縁であるラクトバチラス・パラコリノイデス(Lactobacillus paracollinoides)JCM11969株の23S rRNA遺伝子と5S rRNA遺伝子間のスペーサー領域の塩基配列(配列番号6)を明らかにし、この配列がラクトバチラス・コリノイデスとその近縁種に特異的な塩基配列であることを見いだした。本発明者は、このスペーサー領域の塩基配列に基づいて、ラクトバチラス・コリノイデスとその近縁種検出用LAMP法プライマーセットを設計し、そのプライマーセットによってラクトバチラス・コリノイデスとその近縁種を正確に検出できることを見いだした。ラクトバチラス・コリノイデス近縁株の23S rRNA遺伝子と5S rRNA遺伝子間のスペーサー領域の塩基配列は、これまでに公のデータベースにおいて開示されていない新規な配列である。
配列番号1の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(FIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号2の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(F3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号3の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(BIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;および
配列番号4の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(B3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド。
本発明者は、ラクトバチラス・バッキ近縁株の16S rRNA遺伝子と23S rRNA遺伝子間のスペーサー領域、23S rRNA遺伝子全体、23S rRNA遺伝子と5S rRNA遺伝子間のスペーサー領域の塩基配列を明らかにし、これらの配列がラクトバチラス・バッキとその近縁種に特異的な塩基配列であることを見いだした。本発明者は、ラクトバチラス・バッキ近縁株であるビール工場分離株BK2株の16S rRNA遺伝子と23S rRNA遺伝子間のスペーサー領域、23S rRNA遺伝子全体、23S rRNA遺伝子と5S rRNA遺伝子間のスペーサー領域の塩基配列(配列番号13)に基づいて、ラクトバチラス・バッキとその近縁種検出用LAMP法プライマーセットを設計し、そのプライマーセットによってラクトバチラス・バッキとその近縁種を正確に検出できることを見いだした。ラクトバチラス・バッキ近縁株の16S rRNA遺伝子と23S rRNA遺伝子間のスペーサー領域、23S rRNA遺伝子全体、23S rRNA遺伝子と5S rRNA遺伝子間のスペーサー領域の塩基配列は、これまでに公のデータベースにおいて開示されていない新規な配列である。
配列番号7の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(FIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号8の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(F3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号9の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(BIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;および
配列番号10の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(B3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド。
配列番号28の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;および
配列番号24、25、26、または27の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド。
本発明者は、特許第3677056号公報により明らかにされたラクトバチラス・リンドネリの16S rRNA遺伝子の塩基配列に基づいて、ラクトバチラス・リンドネリ検出用LAMP法プライマーセットを設計し、そのプライマーセットによってラクトバチラス・リンドネリを正確に検出できることを見いだした。
配列番号14の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(FIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号15の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(F3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号16の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(BIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;および
配列番号17の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(B3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド。
本発明において「近縁種」とは、ある菌種の16S rRNA遺伝子または約1500ヌクレオチドの領域を少なくとも含む16S rRNA遺伝子の一部と、少なくとも98%以上、好ましくは99%以上の同一性を示す16S rRNA遺伝子またはその一部を有する菌種を意味する。遺伝子の塩基配列の同一性は、BLASTなどの周知の相同性検索ソフトウェアを用いて、デフォルト(初期設定)のパラメーターを設定して算出することができる。
ラクトバチラス・バッキ近縁株BK2株(Lactobacillus sp. BK2)は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(郵便番号305−8566 日本国茨城県つくば市東1−1−1 つくばセンター 中央第6)に平成19年3月2日に寄託されており、受託番号はFERM BP−10794である。
本発明によるLAMP法プライマーセットは、FIP、F3、BIP、およびB3の4種類のプライマーからなり、これらのプライマーは標的ヌクレオチド配列の6つの領域に対応している。具体的には、標的塩基配列について、3’末端側から5’末端側に向かって順番にF3c、F2c、F1c、B1、B2、B3という領域をそれぞれ規定し、この6領域に対し、4種類のプライマー、すなわちFIP、F3、BIPおよびB3を作製する。ここで、F3c、F2c、F1cの各領域に相補的な領域はそれぞれF3、F2、F1であり、またB1、B2、B3の各領域に相補的な領域はそれぞれB1c、B2c、B3cである。
・配列番号1の塩基配列で表されるFIPの相同ポリヌクレオチド:配列番号1の連続する少なくとも41個(41〜47個)、より好ましくは、少なくとも43個(43〜47個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号2の塩基配列で表されるF3の相同ポリヌクレオチド:配列番号2の連続する少なくとも17個(17〜24個)、より好ましくは、少なくとも21個(21〜24個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号3の塩基配列で表されるBIPの相同ポリヌクレオチド:配列番号3の連続する少なくとも41個(41〜51個)、より好ましくは、少なくとも47個(47〜51個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号4の塩基配列で表されるB3の相同ポリヌクレオチド:配列番号4の連続する少なくとも15個(15〜18個)、より好ましくは、少なくとも17個(17〜18個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号5の塩基配列で表されるLFの相同ポリヌクレオチド:配列番号5の連続する少なくとも17個(17〜21個)、より好ましくは、少なくとも18個(18〜21個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号7の塩基配列で表されるFIPの相同ポリヌクレオチド:配列番号7の連続する少なくとも38個(38〜44個)、より好ましくは、少なくとも41個(41〜44個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号8の塩基配列で表されるF3の相同ポリヌクレオチド:配列番号8の連続する少なくとも17個(17〜21個)、より好ましくは、少なくとも18個(18〜21個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号9の塩基配列で表されるBIPの相同ポリヌクレオチド:配列番号9の連続する少なくとも36個(36〜44個)、より好ましくは、少なくとも41個(41〜44個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号10の塩基配列で表されるB3の相同ポリヌクレオチド:配列番号10の連続する少なくとも17個(17〜22個)、より好ましくは、少なくとも21個(21〜22個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号11の塩基配列で表されるLFの相同ポリヌクレオチド:配列番号11の連続する少なくとも17個(17〜21個)、より好ましくは、少なくとも18個(18〜21個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号12の塩基配列で表されるLBの相同ポリヌクレオチド:配列番号12の連続する少なくとも18個(18〜22個)、より好ましくは、少なくとも20個(20〜22個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号14の塩基配列で表されるFIPの相同ポリヌクレオチド:配列番号14の連続する少なくとも41個(41〜47個)、より好ましくは、少なくとも43個(43〜47個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号15の塩基配列で表されるF3の相同ポリヌクレオチド:配列番号15の連続する少なくとも15個(15〜17個)、より好ましくは、少なくとも16個(16〜17個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号16の塩基配列で表されるBIPの相同ポリヌクレオチド:配列番号16の連続する少なくとも33個(33〜41個)、より好ましくは、少なくとも38個(38〜41個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号17の塩基配列で表されるB3の相同ポリヌクレオチド:配列番号17の連続する少なくとも17個(17〜21個)、より好ましくは、少なくとも18個(18〜21個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド。
・配列番号24の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド:配列番号24の連続する少なくとも18個(18〜24個)、より好ましくは、少なくとも20個(20〜24個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基とすることができる)。
・配列番号25の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド:配列番号25の連続する少なくとも15個(15〜18個)、より好ましくは、少なくとも17個(17〜18個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基、より好ましくは最大で23塩基とすることができる)。
・配列番号26の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド:配列番号26の連続する少なくとも18個(18〜23個)、より好ましくは、少なくとも20個(20〜23個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基とすることができる)。
・配列番号27の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド:配列番号27の連続する少なくとも18個(18〜24個)、より好ましくは、少なくとも20個(20〜24個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基とすることができる)。
・配列番号28の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド:配列番号28の連続する少なくとも15個(15〜18個)、より好ましくは、少なくとも17個(17〜18個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基、より好ましくは最大で23塩基とすることができる)。
(a)本発明による第一の態様のLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(b)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種の存在を示す、ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種の検出方法が提供される。
(c)本発明による第二の態様のLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(d)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がラクトバチラス・バッキおよびその近縁種の存在を示す、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種の検出方法が提供される。
(e)本発明による第三の態様のLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(f)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がラクトバチラス・リンドネリの存在を示す、ラクトバチラス・リンドネリの検出方法が提供される。
(a)本発明による第一の態様のLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;
(b’)核酸増幅反応の開始から一定の濁度に達するまでの時間を測定する工程;および
(b”)測定した時間から検体中の菌体数を求める工程
を含んでなる、ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種の定量方法が提供される。
(c)本発明による第二の態様のLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;
(d’)核酸増幅反応の開始から一定の濁度に達するまでの時間を測定する工程;および
(d”)測定した時間から検体中の菌体数を求める工程
を含んでなる、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種の定量方法が提供される。
(e)本発明による第三の態様のLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;
(f’)核酸増幅反応の開始から一定の濁度に達するまでの時間を測定する工程;および
(f”)測定した時間から検体中の菌体数を求める工程
を含んでなる、ラクトバチラス・リンドネリの定量方法が提供される。
(g)本発明による第一の態様のPCR法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてPCR法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(h)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種の存在を示す、ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種の検出方法が提供される。
(i)本発明による第二の態様のPCR法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてPCR法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(j)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がラクトバチラス・バッキおよびその近縁種の存在を示す、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種の検出方法が提供される。
(k)本発明による第一の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程;および
(l)ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種の存在を示す、ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種の検出方法が提供される。
(m)本発明による第二の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程;および
(n)ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がラクトバチラス・バッキおよびその近縁種の存在を示す、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種の検出方法が提供される。
本発明によるLAMP法プライマーセットは、LAMP法による核酸増幅反応のプライマーとして用いることができる。本発明によるプライマーセットはまた、LAMP法のみならず、LAMP法を改良した核酸増幅反応のプライマーとしても用いることができる。
(i)鎖置換型DNAポリメラーゼの働きにより、FIPのF2領域の3’末端を起点として鋳型DNAと相補的なDNA鎖が合成される。
(ii)FIPの外側に、F3プライマーがアニールし、その3’末端を起点として鎖置換型DNAポリメラーゼの働きによって、先に合成されているFIPからのDNA鎖を剥がしながらDNA合成が伸長する。
(iii)F3プライマーから合成されたDNA鎖と鋳型DNAが二本鎖となる。
(iv)FIPから先に合成されたDNA鎖は、F3プライマーからのDNA鎖によって剥がされて一本鎖DNAとなるが、このDNA鎖は、5’末端側に相補的な領域F1c、F1をもち、自己アニールを起こし、ループを形成する。
(v)上記(iv)の過程でループを形成したDNA鎖に対し、BIPがアニールし、このBIPの3’末端を起点として相補的なDNAが合成される。この過程でループが剥がされて伸びる。さらに、BIPの外側にB3プライマーがアニールし、その3’末端を起点として鎖置換型DNAポリメラーゼの働きによって、先に合成されたBIPからのDNA鎖を剥がしながらDNA合成が伸長する。
(vi)上記(v)の過程で二本鎖DNAが形成される。
(vii)上記(v)の過程で剥がされたBIPから合成されたDNA鎖は両端に相補的な配列を持つため、自己アニールし、ループを形成してダンベル様の構造となる。
(viii)上記ダンベル構造のDNA鎖を起点として、FIP次いでBIPのアニ−リングを介して所望DNAの増幅サイクルが行われる。
本発明によるPCR法プライマーセットは、PCR法、RT−PCR法、リアルタイムPCR法、in situ PCR等の核酸増幅法を利用して、ラクトバチラス属乳酸菌の識別に用いることができる。
本発明によるプライマーセットおよびキットの検出の対象となる試料としては、ビール、発泡酒、ワインなどの酒類;ラムネ、炭酸水などの清涼飲料;原料用に採取された水等の環境試料;酒類や清涼飲料等の製造工程から採取された半製品などが挙げられる。
(a)ゲノムDNA抽出法
寒天平板培地上で培養した菌体をかき取り、滅菌蒸留水に懸濁した。この懸濁液を遠心分離(15000rpm、5分間)し、上澄みを捨てた。沈殿した菌体に再度滅菌蒸留水を添加、懸濁し、遠心分離した。上澄みを捨て、得られた菌体にPrepMan Ultra(アプライドバイオシステムズ社製)の溶液100μlを添加し、95℃、10分間加熱した。その後、15000rpm、1分間遠心分離し、上澄みをゲノムDNA溶液として使用した。あるいは洗浄した菌体に0.1N NaOH溶液を100μl添加し、95℃、10分間加熱した。その後、1M Tris緩衝液(pH7.0)を用いて中和し、上澄みをゲノムDNA溶液として使用した。
以下のラクトバチラス属乳酸菌検出用プライマーを、富士通システムソリューションズ社のeGenome Order(http://genome.e-mp.jp/index.html)、あるいはそれと同等の方法で化学合成し、TE緩衝液(pH8.0)で100μMの濃度になるように溶解した。これらの溶液を、FIP、BIPプライマー:16μM、F3、B3プライマー:2μM、LF、LBプライマー:8μMとなるように混合し、希釈した。
FIP CCGTTTTCTTACTTGGTTAAGTCCTCGGGAAGTCCAGTGATGGATGG(配列番号1)
F3 TGATCAGGTAGATAGGCTAGAAGT(配列番号2)
BIP GGTAGGAAAACGATATTATCTAGTTTTGAGAGATCCTTCAGGCTATCGCCA(配列番号3)
B3 TTCGGCATGGGAACAGGT(配列番号4)
LF ACCGATTAGTACTAGTCCGCT(配列番号5)
FIP ACGGCACTTCCACTTCCAACTTCCTTTATGGAAGTAAGACCCCT(配列番号7)
F3 CCCGCAAGATTAGATTTCCCA(配列番号8)
BIP GTCGGAAACAATGTTTCCGCGTAGCTCTCAAAACTGGACCTTCT(配列番号9)
B3 CCACACCACTATCTGAGAACTT(配列番号10)
LF CTATCTACCTGATCATCTCTC(配列番号11)
LB GTGTTCAAAGGTCAAAGAAAAT(配列番号12)
FIP GGTCAGATCTATCGTCAAGCTGATGGCCTAAATAACATGCAAGTCGA(配列番号14)
F3 TCAGGACGAACGTTGGC(配列番号15)
BIP AACCTGCCCAGAAGAAGGGGTGGTTCTCGTTGTTATACGGT(配列番号16)
B3 GAAGCGATAGCATAAAAGCCA(配列番号17)
LAMP法のための遺伝子増幅試薬キットとして、栄研化学社製Loopamp DNA増幅キットを使用した。反応用チューブに、ゲノムDNA溶液:2.5μl、プライマー溶液:2.5μl、2倍濃度反応用緩衝液:12.5μl、Bst DNAポリメラーゼ:1μl、滅菌水:6.5μlを添加し、全量25μlの反応液を調製した。
LAMP反応には、テラメックス社製リアルタイム濁度計LA−200、あるいは栄研化学社製LA−320Cを使用した。反応チューブをセットし、65℃一定(ボンネットは75℃)で反応させ、その間の濁度変化を6秒毎に計測した。濁度が上昇するものを陽性、濁度の上昇が認められないものを陰性とした。
ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種、並びにラクトバチラス・リンドネリに対して作成したそれぞれの菌種特異的なプライマーについて乳酸菌の各種標準株を使ってLAMP法で特異性を評価した。結果は表1〜3に示される通りであった。
(a)特許文献のプライマー
土屋らの特許文献(WO2005/093059号公報)に記載されていた以下のラクトバチラス・ヘキソーサス検出用プライマーセット(SLH1)について、実施例1(b)と同様にLAMP法用プライマー溶液を調製した。ラクトバチラス・ヘキソーサス検出用プライマーセット(SLH1)は16S rRNA遺伝子を標的としており、ラクトバチラス・バッキの16S rRNA遺伝子配列と相同性が高いことから、ラクトバチラス・バッキ近縁種が検出されると考えられる。
FIP TGACCATGTGGTCACTTAAATTACACGTGGGTAACCTACCCAA(配列番号18)
F3 TGGAGAGTTTGATCCTGGCTC(配列番号19)
BIP CACTTAATGAAAGATGYTTCGGCCGTTATCCCACCAACTAGC(配列番号20)
B3 GCTGCTGGCACGTAGTTAGCC(配列番号21)
LF CTGTTTCCTTTTGTTATCCCCCA(配列番号22)
LB CTATCACTTTTGGATGGACCC(配列番号23)
その結果、SLH1は試験した乳酸菌株のいくつかの菌種と反応し、特異性が低いと考えられた。16S rRNA遺伝子中の設計に使用された配列の菌種特異性が低く、交差反応したと考えられた。
LAMP法の増幅効率を検討するために、m−NBB液体培地で培養したラクトバチラス・リンドネリDSM20692、ラクトバチラス・パラコリノイデスJCM11969、ラクトバチラス・バッキ近縁種BK2株の菌体を遠心分離して集菌し、その菌体を滅菌水に懸濁し、段階的に希釈して上記した方法でDNA抽出し、これをLAMP法に供した。その結果、LAMP法では102cfuレベルの少ない菌体量からも増幅が観察された。
検出限界 検量線近似式 検量線相関係数(R2)
LCN3LF1 3.4x102 cfu y = 19792x-2.3525 0.956
LL12 3.3x102 cfu y = 97125x-2.4127 0.996
HM6LB1LF1 1.2x102 cfu y = 1026.2x-1.5426 0.990
ビール製造工程中では、多くの場合、麦汁に下面発酵酵母を多量に添加して発酵させるが、外部から汚染する乳酸菌の菌数は製造用酵母に比べると非常に少ない。ビールに下面発酵酵母を懸濁させた液からの乳酸菌の検出限界について検討した。m−NBB固体培地で培養したラクトバチラス・バッキ近縁株BK2株の菌体を白金耳でかき取り、滅菌水に懸濁後、段階的に希釈して遠心分離し、その菌体にビールに多量の下面発酵酵母を懸濁させた液を添加して懸濁させた。その後、1回集菌洗浄し、実施例1(a)に記載した方法でまとめてDNA抽出し、HM6LB1LF1を使ったLAMP法でラクトバチラス・バッキ近縁株BK2株が検出可能かどうか検討した。その結果、ビールによる反応阻害および下面発酵酵母の存在に関係なく、滅菌水に懸濁した場合とほとんど同じ検出限界(102cfuレベル)でラクトバチラス・バッキ近縁株BK2株が検出できることがわかった。なお、同様の実験で下面発酵酵母を懸濁していないビールからの検出も検討し、同じ検出限界で検出できることを確認した。
ビール+下面発酵酵母(1 x 107 cells) 2.1x 102 cfu
ラクトバチラス・バッキ近縁株であるビール工場分離株BK2株の16S rRNA遺伝子と23S rRNA遺伝子間のスペーサー領域、23S rRNA遺伝子全体、23S rRNA遺伝子と5S rRNA遺伝子間のスペーサー領域の塩基配列(配列番号13)からPCR法用のプライマーセットを設計し、各種乳酸菌で評価した。
HMLS#1:CTAAGTTGTGAATACATAGCAGCT(配列番号24)
HMLS#2:GCAGTTGGAACGCTGCGT(配列番号25)
HMLS#3:CTGTGGATGATCACGTTAGTGAT(配列番号26)
HMLS#4:TCTTAGTTTGAGTTAAAGGCTTGA(配列番号27)
HMLSR#1:TCATTTCTGGGCTTCGCG(配列番号28)
セット2:HMLS#2およびHMLSR#1(約1570bp)
セット3:HMLS#3およびHMLSR#1(約710bp)
セット4:HMLS#4およびHMLSR#1(約390bp)
(括弧内は予想されるバンドの分子量である。)
Claims (18)
- 配列番号6の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドからなる、ラクトバチラス・コリノイデス(Lactobacillus collinoides)およびその近縁種検出用プローブまたはプライマー。
- 請求項1に記載の二種以上のプライマーからなる、ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種検出用LAMP法プライマーセット。
- 下記ポリヌクレオチドを含んでなる、請求項2に記載のLAMP法プライマーセット:
配列番号1の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(FIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号2の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(F3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号3の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(BIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;および
配列番号4の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(B3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド。 - 配列番号5の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(LF)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドを更に含んでなる、請求項3に記載のLAMP法プライマーセット。
- 配列番号13の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドからなる、ラクトバチラス・バッキ(Lactobacillus backi)およびその近縁種検出用プローブまたはプライマー。
- 請求項5に記載の二種以上のプライマーからなる、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種検出用LAMP法プライマーセット。
- 下記ポリヌクレオチドを含んでなる、請求項6に記載のLAMP法プライマーセット:
配列番号7の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(FIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号8の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(F3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号9の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(BIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;および
配列番号10の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(B3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド。 - 下記ポリヌクレオチドのいずれか一方あるいは両方を更に含んでなる、請求項7に記載のLAMP法プライマーセット:
配列番号11の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(LF)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;および
配列番号12の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(LB)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド。 - 請求項5に記載の二種以上のプライマーからなる、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種検出用PCR法プライマーセット。
- 下記ポリヌクレオチドを含んでなる、請求項9に記載のPCR法プライマーセット:
配列番号28の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;および
配列番号24、25、26、または27の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド。 - 下記ポリヌクレオチドを含んでなる、ラクトバチラス・リンドネリ(Lactobacillus lindneri)の検出に用いられるLAMP法プライマーセット:
配列番号14の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(FIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号15の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(F3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号16の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(BIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;および
配列番号17の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(B3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド。 - 配列番号1〜17および24〜28の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも10個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、請求項3、4、7、8、10、および11のいずれか一項に記載のプライマーセットまたは請求項1および5に記載のプローブまたはプライマー。
- 配列番号1〜17および24〜28の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも90%の同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項3、4、7、8、10、および11のいずれか一項に記載のプライマーセットまたは請求項1および5に記載のプローブまたはプライマー。
- 配列番号1〜17および24〜28の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列において、1または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ対応する塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項3、4、7、8、10、および11のいずれか一項に記載のプライマーセットまたは請求項1および5に記載のプローブまたはプライマー。
- 請求項2〜4のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、ラクトバチラス・コリノイデスおよびその近縁種の検出方法。
- 請求項6〜8のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種の検出方法。
- 請求項9または10に記載のPCR法プライマーセットを用いてPCR法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、ラクトバチラス・バッキおよびその近縁種の検出方法。
- 請求項11に記載のプライマーセットを用いてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、ラクトバチラス・リンドネリの検出方法。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014027933A (ja) * | 2012-07-23 | 2014-02-13 | Pall Corp | 食品変敗微生物を検出するための組成物 |
WO2022115318A1 (en) * | 2020-11-24 | 2022-06-02 | Day Zero Diagnostics, Inc. | Universal primers for rapid bacterial genome detection |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002345499A (ja) * | 2001-05-29 | 2002-12-03 | Eiken Chem Co Ltd | 核酸配列を検出する方法及びその方法に使用するキット |
JP2005006557A (ja) * | 2003-06-19 | 2005-01-13 | Asahi Breweries Ltd | Pcrによるビール有害乳酸菌の同定法 |
JP2005229839A (ja) * | 2004-02-17 | 2005-09-02 | Sapporo Breweries Ltd | 乳酸菌の検出・識別方法 |
WO2005093059A1 (ja) * | 2004-03-25 | 2005-10-06 | Sapporo Breweries Limited | 酵母、乳酸菌及び偏性嫌気性菌検出・識別のためのプライマー及びプライマーセット並びにそれらを用いた検出・識別方法 |
-
2008
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002345499A (ja) * | 2001-05-29 | 2002-12-03 | Eiken Chem Co Ltd | 核酸配列を検出する方法及びその方法に使用するキット |
JP2005006557A (ja) * | 2003-06-19 | 2005-01-13 | Asahi Breweries Ltd | Pcrによるビール有害乳酸菌の同定法 |
JP2005229839A (ja) * | 2004-02-17 | 2005-09-02 | Sapporo Breweries Ltd | 乳酸菌の検出・識別方法 |
WO2005093059A1 (ja) * | 2004-03-25 | 2005-10-06 | Sapporo Breweries Limited | 酵母、乳酸菌及び偏性嫌気性菌検出・識別のためのプライマー及びプライマーセット並びにそれらを用いた検出・識別方法 |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014027933A (ja) * | 2012-07-23 | 2014-02-13 | Pall Corp | 食品変敗微生物を検出するための組成物 |
US9303281B2 (en) | 2012-07-23 | 2016-04-05 | Pall Corporation | Compositions for detecting foodstuff spoilage microorganisms |
JP2016116507A (ja) * | 2012-07-23 | 2016-06-30 | ポール・コーポレーションPall Corporation | 食品変敗微生物を検出するための組成物 |
WO2022115318A1 (en) * | 2020-11-24 | 2022-06-02 | Day Zero Diagnostics, Inc. | Universal primers for rapid bacterial genome detection |
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