JPWO2009028644A1 - 偏性嫌気性細菌の検出用プローブおよびプライマー - Google Patents
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Abstract
本発明は、偏性嫌気性細菌を、正確、迅速、かつ簡便に識別できるプローブおよびプライマーの提供をその目的とする。本発明によれば、配列番号1〜5、7〜11、13〜16、18〜22、および24〜27の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその相同ポリヌクレオチドからなる群から選択されるプライマーを含んでなる、偏性嫌気性細菌の検出に用いられるLAMP法プライマーセットが提供される。
Description
発明の分野
本発明は、偏性嫌気性細菌の検出用プローブおよびプライマーに関し、詳細には、偏性嫌気性細菌の検出用のLAMP法プライマーセットおよびPCR法プライマーセットに関する。
本発明は、偏性嫌気性細菌の検出用プローブおよびプライマーに関し、詳細には、偏性嫌気性細菌の検出用のLAMP法プライマーセットおよびPCR法プライマーセットに関する。
背景技術
ビール業界においては、微生物によるビールの汚染は深刻な問題をもたらす。製品となったビール中で増殖する菌種としてはラクトバチラス属(Lactobacillus)、ペディオコッカス属(Pediococcus)の乳酸菌の報告例が多いが、1970年代以降から、グラム陰性の偏性嫌気性細菌が混濁したビールから分離されている。ペクチネイタス属細菌(Pectinatus)は、ビール混濁能を持つ胞子非形成の偏性嫌気性グラム陰性桿菌であり、ペクチネイタス・セレビシフィラス(Pectinatus cerevisiiphilus)、ペクチネイタス・フリシンゲンシス(Pectinatus frisingensis)、ペクチネイタス・ハイカラエ(Pectinatus haikarae)という菌種が提唱されている(Lee, S. Y. et al. 1978 International Journal of Systematic Bacteriology 28, 582-594、Haikara, A. et al. 1981 Applied and Environmental Microbiology 41, 511-517、Schleifer , K. H. et al. 1990 International Journal of Systematic Bacteriology 40, 19-27、Juvonen, R and Shihko, M. L. 2006 Int J Syst Evol Microbiol. 56(Pt 4), 695-702)。グラム陰性球菌の偏性嫌気性ビール混濁菌としては、メガスフェラ・セレビシェ(Megasphaera cerevisiae)が分離されている(Weiss, N. et al. 1979 Brauwissenschaft 32, 189-194)。ザイモフィラス・パウシボランス(Zymophilus paucivorans)は、胞子非形成の偏性嫌気性グラム陰性桿菌であり、遺伝学的背景がペクチネイタス属と近く、ビール製造に用いられる添加酵母から分離されている(Schleifer , K. H. et al. 1990 International Journal of Systematic Bacteriology 40, 19-27)。これらの細菌がビール中で増殖すると、混濁を起こすのみならず硫化水素や脂肪酸などの不快な香気成分を生産し、ビールの品質を著しく低下させる(Haikara, A. 1985 Monatsschr. fuer Brauwissenschaft 38, 239-243)。また、ペクチネイタス・セレビシフィラスとペクチネイタス・フリシンゲンシスは、ワイン中で増殖できることが報告されている(Gonzalez, J. M. et al. 2004 Antonie van Leeuwenhoek 86, 241-248)。従って、これらの細菌を検出し、同定する技術は酒類製造における品質管理に非常に重要である。
ビール業界においては、微生物によるビールの汚染は深刻な問題をもたらす。製品となったビール中で増殖する菌種としてはラクトバチラス属(Lactobacillus)、ペディオコッカス属(Pediococcus)の乳酸菌の報告例が多いが、1970年代以降から、グラム陰性の偏性嫌気性細菌が混濁したビールから分離されている。ペクチネイタス属細菌(Pectinatus)は、ビール混濁能を持つ胞子非形成の偏性嫌気性グラム陰性桿菌であり、ペクチネイタス・セレビシフィラス(Pectinatus cerevisiiphilus)、ペクチネイタス・フリシンゲンシス(Pectinatus frisingensis)、ペクチネイタス・ハイカラエ(Pectinatus haikarae)という菌種が提唱されている(Lee, S. Y. et al. 1978 International Journal of Systematic Bacteriology 28, 582-594、Haikara, A. et al. 1981 Applied and Environmental Microbiology 41, 511-517、Schleifer , K. H. et al. 1990 International Journal of Systematic Bacteriology 40, 19-27、Juvonen, R and Shihko, M. L. 2006 Int J Syst Evol Microbiol. 56(Pt 4), 695-702)。グラム陰性球菌の偏性嫌気性ビール混濁菌としては、メガスフェラ・セレビシェ(Megasphaera cerevisiae)が分離されている(Weiss, N. et al. 1979 Brauwissenschaft 32, 189-194)。ザイモフィラス・パウシボランス(Zymophilus paucivorans)は、胞子非形成の偏性嫌気性グラム陰性桿菌であり、遺伝学的背景がペクチネイタス属と近く、ビール製造に用いられる添加酵母から分離されている(Schleifer , K. H. et al. 1990 International Journal of Systematic Bacteriology 40, 19-27)。これらの細菌がビール中で増殖すると、混濁を起こすのみならず硫化水素や脂肪酸などの不快な香気成分を生産し、ビールの品質を著しく低下させる(Haikara, A. 1985 Monatsschr. fuer Brauwissenschaft 38, 239-243)。また、ペクチネイタス・セレビシフィラスとペクチネイタス・フリシンゲンシスは、ワイン中で増殖できることが報告されている(Gonzalez, J. M. et al. 2004 Antonie van Leeuwenhoek 86, 241-248)。従って、これらの細菌を検出し、同定する技術は酒類製造における品質管理に非常に重要である。
これまでに、ペクチネイタス・セレビシフィラスとペクチネイタス・フリシンゲンシスについてリボタイピングでハイブリダイズするDNA断片を比較してこれらの細菌の存在を同定する技術(特開平10−243799号公報)が報告されている。また、メガスフェラ・セレビシェの16S rRNA遺伝子配列を用いた検出用プライマー(特開平10−323190号公報)、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス種DSM20764株の16S rRNA遺伝子の塩基配列を用いた検出用プライマー(特開2004−121259号公報)、ザイモフィラス・パウシボランスの16S rRNA遺伝子と23S rRNA遺伝子の間のスペーサー領域の塩基配列を用いた検出用プライマー(特開2000−106881号公報)、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラスのそれぞれに優先的にハイブリダイズするプローブ、及びペクチネイタス属、メガスフェラ属、ザイモフィラス属、セレノモナス属菌に優先的にハイブリダイズするプローブ(特開2001−145492号公報)、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラスの16S rRNA遺伝子と23S rRNA遺伝子の間のスペーサー領域の塩基配列を用いた検出用プライマー(特開2001−218598号公報)、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス・フリシンゲンシスの23S rRNA遺伝子の塩基配列を用いた検出用プローブ(特開2002−17356号公報)、メガスフェラ・セレビシェの16S rRNA遺伝子の塩基配列を用いた検出用プローブ(特開2002−34571号公報)、メガスフェラ・セレビシェの23S rRNA遺伝子の塩基配列を明らかにし、その塩基配列を用いた検出用プローブ(特開2002−125677号公報)、ザイモフィラス属菌の16S rRNA遺伝子の塩基配列を用いた検出用プローブ(特開2003−61674号公報)が報告されている。さらに、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス種DSM20764株、メガスフェラ・セレビシェ、ザイモフィラス・パウシボランスの23S rRNA遺伝子及び5S rRNA遺伝子のスペーサー領域の塩基配列から開発されたPCR−ELISA用のプローブ(特表2003−510091号公報)、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラスの16S rRNA遺伝子配列を使ったネスティッドPCR法用のプライマー(特開2005−6556号公報)が報告されている。
しかし、PCRやFISHは高度な温度制御や蛍光観察が必要なため、高価な機器を必要とする。またPCRは反応後に電気泳動、染色、写真撮影等が必要であり、遺伝子増幅工程後の結果判定までに時間がかかる。このために、日々の微生物検査業務の中で行うことには問題があった。
一方、ペクチネイタス属菌の16S rRNA遺伝子を増幅するLAMPプライマーが開発されているが(WO2005/093059号公報)、ペクチネイタス属の中の菌種を見分けることが出来ず、検出精度の点で更に改善の余地を残すものであった。
また、メガスフェラ・セレビシェとザイモフィラス・パウシボランスを特異的に検出するLAMPプライマーは、まだ報告されていない。
本発明者は、偏性嫌気性細菌であるペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス種DSM20764株、メガスフェラ・セレビシェ、およびザイモフィラス・パウシボランスのDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の部分的な塩基配列を明らかにし、これらの配列情報に基づいて各菌種において特異的な塩基配列を見出した。本発明者はまた、これらの特異的な塩基配列に基づいてペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス種DSM20764株、メガスフェラ・セレビシェ、ザイモフィラス・パウシボランスをそれぞれ正確に検出できるプライマーセットを開発することに成功した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
以下、ペクチネイタス・フリシンゲンシスのDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の塩基配列に関連する発明を第一の態様とし、ペクチネイタス・セレビシフィラスのDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の塩基配列に関連する発明を第二の態様とし、ペクチネイタス種DSM20764株のDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の塩基配列に関連する発明を第三の態様とし、メガスフェラ・セレビシェのDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の塩基配列に関連する発明を第四の態様とし、ザイモフィラス・パウシボランスのDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の塩基配列に関連する発明を第五の態様とする。
第一の態様
本発明者は、ペクチネイタス・フリシンゲンシスDSM6306株のDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の部分的な塩基配列(配列番号6)を明らかにし、このうち配列番号6の114〜174番目の塩基配列がペクチネイタス・フリシンゲンシスにより特異的であることを見いだした。本発明者は、また、この特異的な配列に基づいて設計したペクチネイタス・フリシンゲンシス検出用LAMP法プライマーセットによってペクチネイタス・フリシンゲンシスを正確に検出できることを見いだした。ここで明らかにされたペクチネイタス・フリシンゲンシスのDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の部分的な塩基配列は、これまでに公のデータベースにおいて開示されていない新規な配列である。
本発明者は、ペクチネイタス・フリシンゲンシスDSM6306株のDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の部分的な塩基配列(配列番号6)を明らかにし、このうち配列番号6の114〜174番目の塩基配列がペクチネイタス・フリシンゲンシスにより特異的であることを見いだした。本発明者は、また、この特異的な配列に基づいて設計したペクチネイタス・フリシンゲンシス検出用LAMP法プライマーセットによってペクチネイタス・フリシンゲンシスを正確に検出できることを見いだした。ここで明らかにされたペクチネイタス・フリシンゲンシスのDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の部分的な塩基配列は、これまでに公のデータベースにおいて開示されていない新規な配列である。
本発明の第一の態様によれば、配列番号6の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドからなる、ペクチネイタス・フリシンゲンシスの検出用プローブまたはプライマー(以下、「第一の態様によるプローブまたはプライマー」ということがある)が提供される。
本発明の第一の態様によれば、好ましくは、配列番号6の塩基配列のうち、より識別性の高い部分にハイブリダイズするプローブまたはプライマーが提供される。具体的には、配列番号6の114〜174番目の塩基配列(特に、配列番号6の114〜140番目および156〜174番目の塩基配列)を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドからなるペクチネイタス・フリシンゲンシスの検出用プローブまたはプライマーが提供される。
本発明の第一の態様によれば、二種以上の第一の態様によるプライマーからなる、ペクチネイタス・フリシンゲンシス検出用LAMP法プライマーセット(以下、「第一の態様によるLAMP法プライマーセット」ということがある)が提供され、より具体的には、FIP、F3、BIP、およびB3、並びに場合によってはLFおよび/またはLBを含んでなるペクチネイタス・フリシンゲンシス検出用LAMP法プライマーセットであって、FIP、F3、BIP、B3、LF、およびLBが、それぞれ、本発明の第一の態様によるプライマーからなる、ペクチネイタス・フリシンゲンシス検出用LAMP法プライマーセットが提供される。
本発明の第一の態様によれば、好ましくは、FIP、F3、BIP、およびB3、並びに場合によってはLFおよび/またはLBを含んでなり、
FIPが、配列番号6の114〜140番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなり、
BIPが、配列番号6の156〜174番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなる、
第一の態様によるLAMP法プライマーセットが提供される。
FIPが、配列番号6の114〜140番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなり、
BIPが、配列番号6の156〜174番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなる、
第一の態様によるLAMP法プライマーセットが提供される。
本発明の第一の態様によれば、より好ましくは、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、第一の態様によるLAMP法プライマーセットが提供される:
配列番号1の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(FIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号2の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(F3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号3の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(BIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;および
配列番号4の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(B3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド。
配列番号1の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(FIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号2の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(F3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号3の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(BIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;および
配列番号4の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(B3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド。
本発明の第一の態様によれば、本発明の第一の態様による二種以上のプライマーからなる、ペクチネイタス・フリシンゲンシス検出用PCR法プライマーセット(以下、「第一の態様によるPCR法プライマーセット」ということがある)が提供される。
本発明の第一の態様によれば、好ましくは、少なくとも1種のプライマーが、配列番号6の114〜174番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも15塩基のポリヌクレオチドからなる、第一の態様によるPCR法プライマーセットが提供される。
本発明の第一の態様によれば、本発明の第一の態様によるペクチネイタス・フリシンゲンシス検出用プローブが提供される。このプローブは、好ましくは、配列番号6の114〜174番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも15塩基のポリヌクレオチドからなることができる。
本発明の第一の態様によれば、本発明の第一の態様によるプローブまたはプライマー、本発明の第一の態様によるLAMP法プライマーセット、または本発明の第一の態様によるPCR法プライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ペクチネイタス・フリシンゲンシスの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
第二の態様
本発明者は、ペクチネイタス・セレビシフィラスDSM20467株のDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の部分的な塩基配列(配列番号12)を明らかにし、このうち配列番号12の183〜258番目の塩基配列がペクチネイタス・セレビシフィラスにより特異的であることを見いだした。本発明者は、また、この特異的な配列に基づいて設計したペクチネイタス・セレビシフィラス検出用LAMP法プライマーセットによってペクチネイタス・セレビシフィラスを正確に検出できることを見いだした。ここで明らかにされたペクチネイタス・セレビシフィラスのDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の部分的な塩基配列は、これまでに公のデータベースにおいて開示されていない新規な配列である。
本発明者は、ペクチネイタス・セレビシフィラスDSM20467株のDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の部分的な塩基配列(配列番号12)を明らかにし、このうち配列番号12の183〜258番目の塩基配列がペクチネイタス・セレビシフィラスにより特異的であることを見いだした。本発明者は、また、この特異的な配列に基づいて設計したペクチネイタス・セレビシフィラス検出用LAMP法プライマーセットによってペクチネイタス・セレビシフィラスを正確に検出できることを見いだした。ここで明らかにされたペクチネイタス・セレビシフィラスのDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の部分的な塩基配列は、これまでに公のデータベースにおいて開示されていない新規な配列である。
本発明の第二の態様によれば、配列番号12の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドからなる、ペクチネイタス・セレビシフィラスの検出用プローブまたはプライマー(以下、「第二の態様によるプローブまたはプライマー」ということがある)が提供される。
本発明の第二の態様によれば、好ましくは、配列番号12の塩基配列のうち、より識別性の高い部分にハイブリダイズするプローブまたはプライマーが提供される。具体的には、配列番号12の183〜258番目の塩基配列(特に、配列番号12の183〜207番目および244〜258番目の塩基配列)を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドからなるペクチネイタス・セレビシフィラスの検出用プローブまたはプライマーが提供される。
本発明の第二の態様によれば、二種以上の第二の態様によるプライマーからなる、ペクチネイタス・セレビシフィラス検出用LAMP法プライマーセット(以下、「第二の態様によるLAMP法プライマーセット」ということがある)が提供され、より具体的には、FIP、F3、BIP、およびB3、並びに場合によってはLFおよび/またはLBを含んでなるペクチネイタス・セレビシフィラス検出用LAMP法プライマーセットであって、FIP、F3、BIP、B3、LF、およびLBが、それぞれ、本発明の第二の態様によるプライマーからなる、ペクチネイタス・セレビシフィラス検出用LAMP法プライマーセットが提供される。
本発明の第二の態様によれば、好ましくは、FIP、F3、BIP、およびB3、並びに場合によってはLFおよび/またはLBを含んでなり、
FIPが、配列番号12の183〜207番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなり、
BIPが、配列番号12の244〜258番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなる、
第二の態様によるLAMP法プライマーセットが提供される。
FIPが、配列番号12の183〜207番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなり、
BIPが、配列番号12の244〜258番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなる、
第二の態様によるLAMP法プライマーセットが提供される。
本発明の第二の態様によれば、より好ましくは、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、第二の態様によるLAMP法プライマーセットが提供される:
配列番号7の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(FIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号8の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(F3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号9の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(BIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;および
配列番号10の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(B3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド。
配列番号7の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(FIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号8の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(F3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号9の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(BIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;および
配列番号10の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(B3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド。
本発明の第二の態様によれば、本発明の第二の態様による二種以上のプライマーからなる、ペクチネイタス・セレビシフィラス検出用PCR法プライマーセット(以下、「第二の態様によるPCR法プライマーセット」ということがある)が提供される。
本発明の第二の態様によれば、好ましくは、少なくとも1種のプライマーが、配列番号12の183〜258番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも15塩基のポリヌクレオチドからなる、第二の態様によるPCR法プライマーセットが提供される。
本発明の第二の態様によれば、本発明の第二の態様によるペクチネイタス・セレビシフィラス検出用プローブが提供される。このプローブは、好ましくは、配列番号12の183〜258番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも15塩基のポリヌクレオチドからなることができる。
本発明の第二の態様によれば、本発明の第二の態様によるプローブまたはプライマー、本発明の第二の態様によるLAMP法プライマーセット、または本発明の第二の態様によるPCR法プライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ペクチネイタス・セレビシフィラスの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
第三の態様
本発明者は、ペクチネイタス種DSM20764株のDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の部分的な塩基配列(配列番号17)を明らかにし、このうち配列番号17の174〜219番目の塩基配列がペクチネイタス種DSM20764株により特異的であることを見いだした。本発明者は、また、この特異的な配列に基づいて設計したペクチネイタス種DSM20764株検出用LAMP法プライマーセットによってペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種であるペクチネイタス・ハイカラエを正確に検出できることを見いだした。ここで明らかにされたペクチネイタス種DSM20764株のDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の部分的な塩基配列は、これまでに公のデータベースにおいて開示されていない新規な配列である。
本発明者は、ペクチネイタス種DSM20764株のDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の部分的な塩基配列(配列番号17)を明らかにし、このうち配列番号17の174〜219番目の塩基配列がペクチネイタス種DSM20764株により特異的であることを見いだした。本発明者は、また、この特異的な配列に基づいて設計したペクチネイタス種DSM20764株検出用LAMP法プライマーセットによってペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種であるペクチネイタス・ハイカラエを正確に検出できることを見いだした。ここで明らかにされたペクチネイタス種DSM20764株のDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の部分的な塩基配列は、これまでに公のデータベースにおいて開示されていない新規な配列である。
本発明の第三の態様によれば、配列番号17の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドからなる、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種の検出用プローブまたはプライマー(以下、「第三の態様によるプローブまたはプライマー」ということがある)が提供される。
本発明の第三の態様によれば、好ましくは、配列番号17の塩基配列のうち、より識別性の高い部分にハイブリダイズするプローブまたはプライマーが提供される。具体的には、配列番号17の174〜219番目の塩基配列(特に、配列番号17の174〜193番目および195〜219番目の塩基配列)を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドからなるペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種の検出用プローブまたはプライマーが提供される。
本発明の第三の態様によれば、二種以上の第三の態様によるプライマーからなる、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種検出用LAMP法プライマーセット(以下、「第三の態様によるLAMP法プライマーセット」ということがある)が提供され、より具体的には、FIP、F3、BIP、およびB3、並びに場合によってはLFおよび/またはLBを含んでなるペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種検出用LAMP法プライマーセットであって、FIP、F3、BIP、B3、LF、およびLBが、それぞれ、本発明の第三の態様によるプライマーからなる、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種検出用LAMP法プライマーセットが提供される。
本発明の第三の態様によれば、好ましくは、FIP、F3、BIP、およびB3、並びに場合によってはLFおよび/またはLBを含んでなり、
FIPが、配列番号17の174〜193番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなり、
BIPが、配列番号17の195〜219番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなる、
第三の態様によるLAMP法プライマーセットが提供される。
FIPが、配列番号17の174〜193番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなり、
BIPが、配列番号17の195〜219番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなる、
第三の態様によるLAMP法プライマーセットが提供される。
本発明の第三の態様によれば、より好ましくは、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、第三の態様によるLAMP法プライマーセットが提供される:
配列番号13の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(FIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号14の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(F3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号15の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(BIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;および
配列番号16の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(B3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド。
配列番号13の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(FIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号14の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(F3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号15の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(BIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;および
配列番号16の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(B3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド。
本発明の第三の態様によれば、本発明の第三の態様による二種以上のプライマーからなる、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種検出用PCR法プライマーセット(以下、「第三の態様によるPCR法プライマーセット」ということがある)が提供される。
本発明の第三の態様によれば、好ましくは、少なくとも1種のプライマーが、配列番号17の174〜219番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも15塩基のポリヌクレオチドからなる、第三の態様によるPCR法プライマーセットが提供される。
本発明の第三の態様によれば、本発明の第三の態様によるペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種検出用プローブが提供される。このプローブは、好ましくは、配列番号17の174〜219番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも15塩基のポリヌクレオチドからなることができる。
本発明の第三の態様によれば、本発明の第三の態様によるプローブまたはプライマー、本発明の第三の態様によるLAMP法プライマーセット、または本発明の第三の態様によるPCR法プライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種の検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
第四の態様
本発明者は、メガスフェラ・セレビシェDSM20462株のDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の部分的な塩基配列(配列番号23)を明らかにし、このうち配列番号23の297〜345番目の塩基配列がメガスフェラ・セレビシェにより特異的であることを見いだした。本発明者は、また、この特異的な配列に基づいて設計したメガスフェラ・セレビシェ検出用LAMP法プライマーセットによってメガスフェラ・セレビシェを正確に検出できることを見いだした。ここで明らかにされたメガスフェラ・セレビシェのDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の部分的な塩基配列は、これまでに公のデータベースにおいて開示されていない新規な配列である。
本発明者は、メガスフェラ・セレビシェDSM20462株のDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の部分的な塩基配列(配列番号23)を明らかにし、このうち配列番号23の297〜345番目の塩基配列がメガスフェラ・セレビシェにより特異的であることを見いだした。本発明者は、また、この特異的な配列に基づいて設計したメガスフェラ・セレビシェ検出用LAMP法プライマーセットによってメガスフェラ・セレビシェを正確に検出できることを見いだした。ここで明らかにされたメガスフェラ・セレビシェのDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の部分的な塩基配列は、これまでに公のデータベースにおいて開示されていない新規な配列である。
本発明の第四の態様によれば、配列番号23の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドからなる、メガスフェラ・セレビシェの検出用プローブまたはプライマー(以下、「第四の態様によるプローブまたはプライマー」ということがある)が提供される。
本発明の第四の態様によれば、好ましくは、配列番号23の塩基配列のうち、より識別性の高い部分にハイブリダイズするプローブまたはプライマーが提供される。具体的には、配列番号23の297〜345番目の塩基配列(特に、配列番号23の297〜322番目および330〜345番目の塩基配列)を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドからなるメガスフェラ・セレビシェの検出用プローブまたはプライマーが提供される。
本発明の第四の態様によれば、二種以上の第四の態様によるプライマーからなる、メガスフェラ・セレビシェ検出用LAMP法プライマーセット(以下、「第四の態様によるLAMP法プライマーセット」ということがある)が提供され、より具体的には、FIP、F3、BIP、およびB3、並びに場合によってはLFおよび/またはLBを含んでなるメガスフェラ・セレビシェの検出用LAMP法プライマーセットであって、FIP、F3、BIP、B3、LF、およびLBが、それぞれ、本発明の第四の態様によるプライマーからなる、メガスフェラ・セレビシェ検出用LAMP法プライマーセットが提供される。
本発明の第四の態様によれば、好ましくは、FIP、F3、BIP、およびB3、並びに場合によってはLFおよび/またはLBを含んでなり、
FIPが、配列番号23の297〜322番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなり、
BIPが、配列番号23の330〜345番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなる、
第四の態様によるLAMP法プライマーセットが提供される。
FIPが、配列番号23の297〜322番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなり、
BIPが、配列番号23の330〜345番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなる、
第四の態様によるLAMP法プライマーセットが提供される。
本発明の第四の態様によれば、より好ましくは、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、第四の態様によるLAMP法プライマーセットが提供される:
配列番号18の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(FIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号19の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(F3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号20の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(BIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;および
配列番号21の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(B3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド。
配列番号18の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(FIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号19の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(F3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号20の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(BIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;および
配列番号21の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(B3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド。
本発明の第四の態様によれば、本発明の第四の態様による二種以上のプライマーからなる、メガスフェラ・セレビシェ検出用PCR法プライマーセット(以下、「第四の態様によるPCR法プライマーセット」ということがある)が提供される。
本発明の第四の態様によれば、好ましくは、少なくとも1種のプライマーが、配列番号23の297〜345番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも15塩基のポリヌクレオチドからなる、第四の態様によるPCR法プライマーセットが提供される。
本発明の第四の態様によれば、本発明の第四の態様によるメガスフェラ・セレビシェ検出用プローブが提供される。このプローブは、好ましくは、配列番号23の297〜345番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも15塩基のポリヌクレオチドからなることができる。
本発明の第四の態様によれば、本発明の第四の態様によるプローブまたはプライマー、本発明の第四の態様によるLAMP法プライマーセット、または本発明の第四の態様によるPCR法プライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、メガスフェラ・セレビシェの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
第五の態様
本発明者は、ザイモフィラス・パウシボランスDSM20756株のDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の部分的な塩基配列(配列番号28)を明らかにし、このうち配列番号28の123〜165番目の塩基配列がザイモフィラス・パウシボランスにより特異的であることを見いだした。本発明者は、また、この特異的な配列に基づいて設計したザイモフィラス・パウシボランス検出用LAMP法プライマーセットによってザイモフィラス・パウシボランスを正確に検出できることを見いだした。ここで明らかにされたザイモフィラス・パウシボランスのDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の部分的な塩基配列は、これまでに公のデータベースにおいて開示されていない新規な配列である。
本発明者は、ザイモフィラス・パウシボランスDSM20756株のDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の部分的な塩基配列(配列番号28)を明らかにし、このうち配列番号28の123〜165番目の塩基配列がザイモフィラス・パウシボランスにより特異的であることを見いだした。本発明者は、また、この特異的な配列に基づいて設計したザイモフィラス・パウシボランス検出用LAMP法プライマーセットによってザイモフィラス・パウシボランスを正確に検出できることを見いだした。ここで明らかにされたザイモフィラス・パウシボランスのDNAジャイレースサブユニットB遺伝子の部分的な塩基配列は、これまでに公のデータベースにおいて開示されていない新規な配列である。
本発明の第五の態様によれば、配列番号28の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドからなる、ザイモフィラス・パウシボランスの検出用プローブまたはプライマー(以下、「第五の態様によるプローブまたはプライマー」ということがある)が提供される。
本発明の第五の態様によれば、配列番号28の塩基配列のうち、より識別性の高い部分にハイブリダイズするプローブまたはプライマーが提供される。具体的には、具体的には、配列番号28の123〜165番目の塩基配列(特に、配列番号28の123〜144番目および148〜165番目の塩基配列)を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドからなるザイモフィラス・パウシボランスの検出用プローブまたはプライマーが提供される。
本発明の第五の態様によれば、二種以上の第五の態様によるプライマーからなる、ザイモフィラス・パウシボランス検出用LAMP法プライマーセット(以下、「第五の態様によるLAMP法プライマーセット」ということがある)が提供され、より具体的には、FIP、F3、BIP、およびB3、並びに場合によってはLFおよび/またはLBを含んでなるザイモフィラス・パウシボランス検出用LAMP法プライマーセットであって、FIP、F3、BIP、B3、LF、およびLBが、それぞれ、本発明の第五の態様によるプライマーからなる、ザイモフィラス・パウシボランス検出用LAMP法プライマーセットが提供される。
本発明の第五の態様によれば、好ましくは、FIP、F3、BIP、およびB3、並びに場合によってはLFおよび/またはLBを含んでなり、
FIPが、配列番号28の123〜144番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなり、
BIPが、配列番号28の148〜165番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなる、
第五の態様によるLAMP法プライマーセットが提供される。
FIPが、配列番号28の123〜144番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなり、
BIPが、配列番号28の148〜165番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなる、
第五の態様によるLAMP法プライマーセットが提供される。
本発明の第五の態様によれば、より好ましくは、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、LAMP法プライマーセットが提供される:
配列番号24の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(FIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号25の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(F3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号26の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(BIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;および
配列番号27の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(B3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド。
配列番号24の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(FIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号25の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(F3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号26の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(BIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;および
配列番号27の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(B3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド。
本発明の第五の態様によれば、本発明の第五の態様による二種以上のプライマーからなる、ザイモフィラス・パウシボランス検出用PCR法プライマーセット(以下、「第五の態様によるPCR法プライマーセット」ということがある)が提供される。
本発明の第五の態様によれば、好ましくは、少なくとも1種のプライマーが、配列番号28の123〜165番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも15塩基のポリヌクレオチドからなる、第五の態様によるPCR法プライマーセットが提供される。
本発明の第五の態様によれば、本発明の第五の態様によるザイモフィラス・パウシボランス検出用プローブが提供される。このプローブは、好ましくは、配列番号28の123〜165番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも15塩基のポリヌクレオチドからなることができる。
本発明の第五の態様によれば、本発明の第五の態様によるプローブまたはプライマー、本発明の第五の態様によるLAMP法プライマーセット、または本発明の第五の態様によるPCR法プライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ザイモフィラス・パウシボランスの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットによれば、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種、メガスフェラ・セレビシェ、ザイモフィラス・パウシボランスを正確に検出することができる。特に、本発明によるLAMP法プライマーセットは、LAMP法による核酸増幅反応に使用することができ、増幅産物の有無により対象菌種を検出することができる。従って、本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセット(特に、LAMP法プライマーセット)によれば、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種、メガスフェラ・セレビシェ、ザイモフィラス・パウシボランスを、正確、迅速、かつ簡便に識別することができる。
ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種、メガスフェラ・セレビシェ、ザイモフィラス・パウシボランスは、ビール、発泡酒、およびワインなどの各種飲料を混濁させる原因菌であり、これらの菌の存在・不存在は各種飲料の品質管理の指標となりうる。従って、本発明によるプライマーセットは、各種飲料(特に、ビール、発泡酒、およびワイン)の品質管理や環境試料の検査に有用である。
特に、第三の態様によるプローブおよびプライマー並びにプライマーセットは、ペクチネイタス種DSM20764株のみならず、その近縁種(ペクチネイタス・ハイカラエ)をも検出することができる。従って、第三の態様による発明は、各種飲料において混濁を生じさせる可能性がある偏性嫌気性細菌を漏れなく検出できる点でも有利である。
定義
本発明において「近縁種」とは、ある菌種の16S rRNA遺伝子または約1500ヌクレオチドの領域を少なくとも含む16S rRNA遺伝子の一部と、少なくとも98%以上、好ましくは99%以上の同一性を示す16S rRNA遺伝子またはその一部を有する菌種を意味する。遺伝子の塩基配列の同一性は、BLASTなどの周知の相同性検索ソフトウェアを用いて、デフォルト(初期設定)のパラメーターを設定して算出することができる。
本発明において「近縁種」とは、ある菌種の16S rRNA遺伝子または約1500ヌクレオチドの領域を少なくとも含む16S rRNA遺伝子の一部と、少なくとも98%以上、好ましくは99%以上の同一性を示す16S rRNA遺伝子またはその一部を有する菌種を意味する。遺伝子の塩基配列の同一性は、BLASTなどの周知の相同性検索ソフトウェアを用いて、デフォルト(初期設定)のパラメーターを設定して算出することができる。
ペクチネイタス種DSM20764株の近縁種としては、ペクチネイタス・ハイカラエ(例えば、Pectinatus haikarae DSM 16980株)が挙げられる。ペクチネイタス種DSM20764株の16S rRNA遺伝子の塩基配列(特開2004−121259号公報)をペクチネイタス・ハイカラエの16S rRNA遺伝子の塩基配列(DQ223731)とBLASTにより比較したところ、約1500bpの範囲で99%以上の同一性を示しており、少なくともペクチネイタス種DSM20764株の近縁種であることを確認している。
プライマー、プローブ、およびプライマーセット
本発明によるプライマーセットは、FIP、F3、BIP、およびB3の4種類のプライマーからなり、これらのプライマーは標的ヌクレオチド配列の6つの領域に対応している。具体的には、標的塩基配列について、3’末端側から5’末端側に向かって順番にF3c、F2c、F1c、B1、B2、B3という領域をそれぞれ規定し、この6領域に対し、4種類のプライマー、すなわちFIP、F3、BIPおよびB3を作製する。ここで、F3c、F2c、F1cの各領域に相補的な領域はそれぞれF3、F2、F1であり、またB1、B2、B3の各領域に相補的な領域はそれぞれB1c、B2c、B3cである。
本発明によるプライマーセットは、FIP、F3、BIP、およびB3の4種類のプライマーからなり、これらのプライマーは標的ヌクレオチド配列の6つの領域に対応している。具体的には、標的塩基配列について、3’末端側から5’末端側に向かって順番にF3c、F2c、F1c、B1、B2、B3という領域をそれぞれ規定し、この6領域に対し、4種類のプライマー、すなわちFIP、F3、BIPおよびB3を作製する。ここで、F3c、F2c、F1cの各領域に相補的な領域はそれぞれF3、F2、F1であり、またB1、B2、B3の各領域に相補的な領域はそれぞれB1c、B2c、B3cである。
FIPは、標的配列のF2c領域と相補的なF2領域を3’末端側にもち、5’末端側に標的遺伝子のF1c領域と同じ配列を持つように作製されたプライマーである。必要ならば、FIPプライマーのF1cとF2の間に制限酵素部位を導入することもできる。
F3は、標的遺伝子のF3c領域と相補的なF3領域をもつように作製されたプライマーである。
BIPは、標的配列のB2c領域と相補的なB2領域を3’末端側にもち、5’末端側に標的遺伝子のB1c領域と同じ配列を持つように作製されたプライマーである。必要ならば、BIPプライマーのB1cとB2の間に制限酵素部位を導入することもできる。
B3は、標的遺伝子のB3c領域と相補的なB3領域をもつように作製されたプライマーである。
LAMP法プライマーの作製に当たっては、FIPおよびBIPを構成するF1c(F1)領域およびB1(B1c)領域は、識別性のより高い部分配列を含むように設計することが好ましい。特に、F1およびB1の3’末端領域は、識別性が特に高い配列に対応するように設計することが好ましい。F3およびB3は、FIPおよびBIPを構成する領域の周辺領域から設計できることは当業者に自明である。
FIPおよびBIPプライマーに制限酵素部位が含まれる場合、LAMP法による核酸増幅反応後に増幅産物を制限酵素で処理することによって、電気泳動後に1つのバンドとして観察することができる。この場合、もし標的配列に制限酵素部位があれば、プライマーに人為的に制限酵素部位を導入しなくてもよい。
本発明によるLAMP法プライマーセットの実施に当たっては、核酸の増幅反応を加速するためにループプライマー(LFプライマーまたはLBプライマー)を1種類あるいは2種類追加してもよい。ループプライマーは、F1領域とF2領域の間の領域、あるいはB1領域とB2領域の間の領域にアニールするように設計できる。このようにして設計したループプライマーをLAMP法反応系に追加して使用すると、これらのプライマーが核酸増幅工程で利用されていないループ部分に結合することにより、全てのループ部分を起点として核酸反応が進み、核酸増幅反応が加速される(例えば、特開2002−345499号公報参照)。
具体的には、本発明による第一の態様のプライマーセットは、配列番号5の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(LF)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
本発明による第二の態様のプライマーセットは、配列番号11の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(LB)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
本発明による第四の態様のプライマーセットは、配列番号22の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(LF)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
本発明では、配列番号1〜5、7〜11、13〜16、18〜22、および24〜27の塩基配列で表されるポリヌクレオチドのみならず、配列番号1〜5、7〜11、13〜16、18〜22、および24〜27の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド(以下、「相同ポリヌクレオチド」と言うことがある)も、プライマーやプローブとして用いることができる。なお、これらのポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドもプライマーやプローブとして用いることができることはいうまでもない。
本発明では、配列番号6、12、17、23、および28の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基(好ましくは、少なくとも15塩基、より好ましくは少なくとも18塩基、特に好ましくは少なくとも20塩基)のポリヌクレオチド、並びに配列番号6、12、17、23、および28の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基(好ましくは、少なくとも15塩基、より好ましくは少なくとも18塩基、特に好ましくは少なくとも20塩基)のポリヌクレオチドを、プライマーやプローブとして用いることができる。
本明細書において「ハイブリダイズする」とは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドには、実質的にはハイブリダイズしないことを意味する。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施することができる。ここで「ストリンジェントな条件」は、プライマー配列とその相補鎖との二重鎖のTm(℃)および必要な塩濃度などに依存して決定でき、プライマーとなる配列を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である(例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等参照)。ストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーションに通常用いられる適切な緩衝液中で、ヌクレオチド配列によって決定されるTmよりわずかに低い温度(例えば、Tmよりも0〜約5℃低い温度)においてハイブリダイゼーション反応を実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件としてはまた、ハイブリダイゼーション反応後の洗浄を高濃度低塩濃度溶液で実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件の例としては、6×SSC/0.05%ピロリン酸ナトリウム溶液中で、37℃(約14塩基のオリゴヌクレオチドについて)、48℃(約17塩基のオリゴヌクレオチドについて)、55℃(約20塩基のオリゴヌクレオチドについて)、60℃(約23塩基のオリゴヌクレオチドについて)の洗浄条件が挙げられる。
相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、少なくとも10塩基である。
LAMP法プライマーでは、FIPおよびBIPの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも30塩基、より好ましくは、少なくとも38塩基、特に好ましくは、少なくとも43塩基とすることができ、また、好ましくは、最大で60塩基、より好ましくは、最大で57塩基とすることができる。FIPおよびBIPの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、例えば、30〜60塩基、38〜57塩基、または43〜57塩基とすることができる。
LAMP法プライマーでは、FIPおよびBIPの相同ポリヌクレオチドは、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも30個、好ましくは少なくとも38個、より好ましくは少なくとも43個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドであることができる。
LAMP法プライマーでは、F3、B3、LF、およびLBの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも15塩基、より好ましくは、少なくとも19塩基とすることができ、また、好ましくは、最大で30塩基、好ましくは、最大で25塩基、より好ましくは、最大で24塩基とすることができる。F3、B3、LF、およびLBの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、例えば、15〜30塩基、19〜30塩基、または19〜24塩基とすることができる。
LAMP法プライマーでは、F3、B3、LF、およびLBの相同ポリヌクレオチドは、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも10個、好ましくは少なくとも15個、より好ましくは少なくとも18個、特に好ましくは少なくとも20個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドであることができる。
配列番号1〜5、7〜11、13〜16、18〜22、および24〜27の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドの例を示すと以下の通りである。
・配列番号1の塩基配列で表されるFIPの相同ポリヌクレオチド:配列番号1の連続する少なくとも38個(38〜46個)、より好ましくは、少なくとも43個(43〜46個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基、より好ましくは最大で50塩基とすることができる)。
・配列番号2の塩基配列で表されるF3の相同ポリヌクレオチド:配列番号2の連続する少なくとも15個(15〜20個)、より好ましくは、少なくとも19個(19〜20個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基とすることができる)。
・配列番号3の塩基配列で表されるBIPの相同ポリヌクレオチド:配列番号3の連続する少なくとも38個(38〜45個)、より好ましくは、少なくとも43個(43〜45個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基、より好ましくは最大で50塩基とすることができる)。
・配列番号4の塩基配列で表されるB3の相同ポリヌクレオチド:配列番号4の連続する少なくとも15個(15〜20個)、より好ましくは、少なくとも19個(19〜20個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基とすることができる)。
・配列番号5の塩基配列で表されるLFの相同ポリヌクレオチド:配列番号5の連続する少なくとも15個(15〜19個)、より好ましくは、少なくとも17個(17〜19個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基とすることができる)。
・配列番号7の塩基配列で表されるFIPの相同ポリヌクレオチド:配列番号7の連続する少なくとも38個(38〜43個)、より好ましくは、少なくとも40個(40〜43個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基、より好ましくは最大で50塩基とすることができる)。
・配列番号8の塩基配列で表されるF3の相同ポリヌクレオチド:配列番号8の連続する少なくとも15個(15〜22個)、より好ましくは、少なくとも19個(19〜22個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基とすることができる)。
・配列番号9の塩基配列で表されるBIPの相同ポリヌクレオチド:配列番号9の連続する少なくとも38個(38〜43個)、より好ましくは、少なくとも40個(40〜43個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基、より好ましくは最大で50塩基とすることができる)。
・配列番号10の塩基配列で表されるB3の相同ポリヌクレオチド:配列番号10の連続する少なくとも19個(19〜23個)、より好ましくは、少なくとも21個(21〜23個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基とすることができる)。
・配列番号11の塩基配列で表されるLBの相同ポリヌクレオチド:配列番号11の連続する少なくとも19個(19〜27個)、より好ましくは、少なくとも23個(23〜27個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基とすることができる)。
・配列番号13の塩基配列で表されるFIPの相同ポリヌクレオチド:配列番号13の連続する少なくとも38個(38〜43個)、より好ましくは、少なくとも40個(40〜43個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基、より好ましくは最大で50塩基とすることができる)。
・配列番号14の塩基配列で表されるF3の相同ポリヌクレオチド:配列番号14の連続する少なくとも15個(15〜22個)、より好ましくは、少なくとも19個(19〜22個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基とすることができる)。
・配列番号15の塩基配列で表されるBIPの相同ポリヌクレオチド:配列番号15の連続する少なくとも43個(43〜49個)、より好ましくは、少なくとも45個(45〜49個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基、より好ましくは最大で53塩基とすることができる)。
・配列番号16の塩基配列で表されるB3の相同ポリヌクレオチド:配列番号16の連続する少なくとも15個(15〜19個)、より好ましくは、少なくとも17個(17〜19個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基とすることができる)。
・配列番号18の塩基配列で表されるFIPの相同ポリヌクレオチド:配列番号18の連続する少なくとも43個(43〜50個)、より好ましくは、少なくとも48個(48〜50個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基、より好ましくは最大で53塩基とすることができる)。
・配列番号19の塩基配列で表されるF3の相同ポリヌクレオチド:配列番号19の連続する少なくとも19個(19〜24個)、より好ましくは、少なくとも21個(21〜24個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基とすることができる)。
・配列番号20の塩基配列で表されるBIPの相同ポリヌクレオチド:配列番号20の連続する少なくとも43個(43〜48個)、より好ましくは、少なくとも45個(45〜48個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基、より好ましくは最大で53塩基とすることができる)。
・配列番号21の塩基配列で表されるB3の相同ポリヌクレオチド:配列番号21の連続する少なくとも15個(15〜22個)、より好ましくは、少なくとも19個(19〜22個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基とすることができる)。
・配列番号22の塩基配列で表されるLBの相同ポリヌクレオチド:配列番号22の連続する少なくとも19個(19〜25個)、より好ましくは、少なくとも21個(21〜25個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基とすることができる)。
・配列番号24の塩基配列で表されるFIPの相同ポリヌクレオチド:配列番号24の連続する少なくとも43個(43〜48個)、より好ましくは、少なくとも45個(45〜48個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基、より好ましくは最大で53塩基とすることができる)。
・配列番号25の塩基配列で表されるF3の相同ポリヌクレオチド:配列番号25の連続する少なくとも19個(19〜23個)、より好ましくは、少なくとも21個(21〜23個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基とすることができる)。
・配列番号26の塩基配列で表されるBIPの相同ポリヌクレオチド:配列番号26の連続する少なくとも43個(43〜49個)、より好ましくは、少なくとも45個(45〜49個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基、より好ましくは最大で53塩基とすることができる)。
・配列番号27の塩基配列で表されるB3の相同ポリヌクレオチド:配列番号27の連続する少なくとも15個(15〜21個)、より好ましくは、少なくとも19個(19〜21個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基とすることができる)。
本発明では、また、配列番号6、12、17、23および28の塩基配列並びにそれらの相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドを、LAMP法プライマー、PCR法プライマー、およびプローブとして使用できる。
配列番号6、12、17、23および28の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをLAMP法のFIPおよびBIPとして用いる場合には、そのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも30塩基、より好ましくは、少なくとも38塩基、特に好ましくは、少なくとも43塩基とすることができ、また、好ましくは、最大で60塩基、より好ましくは、最大で57塩基とすることができる。そのヌクレオチド長は、例えば、30〜60塩基、38〜57塩基、または43〜57塩基とすることができる。
配列番号6、12、17、23および28の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをLAMP法のF3、B3、LF、およびLBプライマーとして用いる場合には、そのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも15塩基、より好ましくは、少なくとも19塩基とすることができ、また、好ましくは、最大で30塩基、好ましくは、最大で25塩基、より好ましくは、最大で24塩基とすることができる。そのヌクレオチド長は、例えば、15〜30塩基、19〜30塩基、または19〜24塩基とすることができる。
配列番号6、12、17、23および28の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをPCR法プライマーとして用いる場合には、そのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも15塩基、より好ましくは、少なくとも18塩基、特に好ましくは、少なくとも20塩基とすることができ、また、好ましくは、最大で30塩基、より好ましくは最大で25塩基、特に好ましくは最大で24塩基とすることができる。そのヌクレオチド長は、例えば、15〜30塩基、18〜24塩基、18〜30塩基、20〜25塩基、または20〜30塩基とすることができる。
配列番号6、12、17、23および28の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合には、そのヌクレオチド長は、少なくとも12塩基、好ましくは、少なくとも15塩基、より好ましくは、少なくとも18塩基、特に好ましくは、少なくとも20塩基とすることができ、また、好ましくは、最大で30塩基、より好ましくは最大で25塩基、特に好ましくは最大で24塩基とすることができる。そのヌクレオチド長は、例えば、12〜30塩基、15〜30塩基、18〜24塩基、18〜30塩基、20〜25塩基、または20〜30塩基とすることができる。
本発明の第一の態様では、配列番号6の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド、および配列番号6の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号6の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも10個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド、および配列番号6の塩基配列の連続する少なくとも10個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドとすることができる。
本発明の第一の態様においては、配列番号6の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ペクチネイタス・フリシンゲンシスを検出するためのLAMP法プライマーセットを選択することができる。LAMP法は周知であり、当業者であればLAMP法プライマーを適宜設計することができる。具体的には、LAMP法の実施に必要な4種類のプライマー、すなわち、FIP、F3、BIP、およびB3を、前述のように設計し、必要に応じてループプライマー、すなわち、LFおよびLBを使用することもできる。LAMP法においては、好ましくは、LAMP法の実施に必要な4種のプライマーのうち、少なくともFIPおよびBIPのいずれかまたは両方の一部または全部を、配列番号6の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号6の114〜174番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。この場合、LAMP法の実施に必要な他のプライマーは、配列番号6の塩基配列またはその相補配列に対合するように選択しても、配列番号6の塩基配列およびその相補配列以外の配列(配列番号6の配列の外側の領域)に対合するように選択してもよい。
配列番号6の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをLAMP法のFIPおよびBIPとして用いる場合には、配列番号6の塩基配列(好ましくは、114〜174番目の塩基配列)またはその相補配列の連続する少なくとも30個(例えば、30〜60個)、好ましくは、少なくとも38個(例えば、38〜57個)、より好ましくは、少なくとも43個(例えば、43〜57塩基)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
配列番号6の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをLAMP法のFIPとして用いる場合には、好ましくは、配列番号6の114〜140番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列の連続する少なくとも30個(例えば、30〜60個)、好ましくは、少なくとも38個(例えば、38〜57個)、より好ましくは、少なくとも43個(例えば、43〜57塩基)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
配列番号6の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをLAMP法のBIPとして用いる場合には、好ましくは、配列番号6の156〜174番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列の連続する少なくとも30個(例えば、30〜60個)、好ましくは、少なくとも38個(例えば、38〜57個)、より好ましくは、少なくとも43個(例えば、43〜57塩基)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
配列番号6の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをLAMP法のF3、B3、LB、およびLFとして用いる場合には、配列番号6の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも15個(例えば、15〜30個)、好ましくは、少なくとも19個(例えば、19〜24個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
本発明の第一の態様においては、また、配列番号6の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ペクチネイタス・フリシンゲンシスを検出するためのPCR法プライマーペアを選択することができる。具体的には、PCR法においては、二つのプライマーの一方が配列番号6の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号6の塩基配列の相補配列に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、PCR法においては、二つのプライマーの一方が配列番号6の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号6の塩基配列の相補配列以外の配列(配列番号6の配列の外側の領域)に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択してもよい。PCR法においては、好ましくは、二つのプライマーの一方あるいは両方を、配列番号6の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号6の114〜174番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。
配列番号6の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをPCR法プライマーとして用いる場合には、配列番号6の塩基配列(好ましくは、114〜174番目の塩基配列)またはその相補配列の連続する少なくとも15個(例えば、15〜30個)、より好ましくは、少なくとも18個(例えば、18〜24個および18〜30個)、特に好ましくは、少なくとも20個(例えば、20〜25個および20〜30個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基、より好ましくは最大で24塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
本発明の第一の態様においては、また、配列番号6の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ペクチネイタス・フリシンゲンシスを検出するためのプローブを選択することができる。
配列番号6の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合には、配列番号6の塩基配列(好ましくは、114〜174番目の塩基配列)またはその相補配列の連続する少なくとも12個(例えば、12〜30個)、好ましくは、少なくとも15個(例えば、15〜30個)、より好ましくは、少なくとも18個(例えば、18〜24個および18〜30個)、特に好ましくは、少なくとも20個(例えば、20〜25個および20〜30個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基、より好ましくは最大で24塩基とすることができる)をプローブとして使用できる。
本発明の第二の態様では、配列番号12の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド、および配列番号12の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号12の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも10個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド、および配列番号12の塩基配列の連続する少なくとも10個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドとすることができる。
本発明の第二の態様においては、配列番号12の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ペクチネイタス・セレビシフィラスを検出するためのLAMP法プライマーセットを選択することができる。LAMP法は周知であり、当業者であればLAMP法プライマーを適宜設計することができる。具体的には、LAMP法の実施に必要な4種類のプライマー、すなわち、FIP、F3、BIP、およびB3を、前述のように設計し、必要に応じてループプライマー、すなわち、LFおよびLBを使用することもできる。LAMP法においては、好ましくは、LAMP法の実施に必要な4種のプライマーのうち、少なくともFIPおよびBIPのいずれかまたは両方の一部または全部を、配列番号12の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号12の183〜258番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。この場合、LAMP法の実施に必要な他のプライマーは、配列番号12の塩基配列またはその相補配列に対合するように選択しても、配列番号12の塩基配列およびその相補配列以外の配列(配列番号12の配列の外側の領域)に対合するように選択してもよい。
配列番号12の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをLAMP法のFIPおよびBIPとして用いる場合には、配列番号12の塩基配列(好ましくは、183〜258番目の塩基配列)またはその相補配列の連続する少なくとも30個(例えば、30〜60個)、好ましくは、少なくとも38個(例えば、38〜57個)、より好ましくは、少なくとも43個(例えば、43〜57塩基)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
配列番号12の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをLAMP法のFIPとして用いる場合には、好ましくは、配列番号12の183〜207番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列の連続する少なくとも30個(例えば、30〜60個)、好ましくは、少なくとも38個(例えば、38〜57個)、より好ましくは、少なくとも43個(例えば、43〜57塩基)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
配列番号12の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをLAMP法のBIPとして用いる場合には、好ましくは、配列番号12の244〜258番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列の連続する少なくとも30個(例えば、30〜60個)、好ましくは、少なくとも38個(例えば、38〜57個)、より好ましくは、少なくとも43個(例えば、43〜57塩基)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
配列番号12の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをLAMP法のF3、B3、LB、およびLFとして用いる場合には、配列番号12の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも15個(例えば、15〜30個)、好ましくは、少なくとも19個(例えば、19〜24個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
本発明の第二の態様においては、また、配列番号12の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ペクチネイタス・セレビシフィラスを検出するためのPCR法プライマーペアを選択することができる。具体的には、PCR法においては、二つのプライマーの一方が配列番号12の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号12の塩基配列の相補配列に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、PCR法においては、二つのプライマーの一方が配列番号12の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号12の塩基配列の相補配列以外の配列(配列番号12の配列の外側の領域)に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択してもよい。PCR法においては、好ましくは、二つのプライマーの一方あるいは両方を、配列番号12の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号12の183〜258番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。
配列番号12の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをPCR法プライマーとして用いる場合には、配列番号12の塩基配列(好ましくは、183〜258番目の塩基配列)またはその相補配列の連続する少なくとも15個(例えば、15〜30個)、より好ましくは、少なくとも18個(例えば、18〜24個および18〜30個)、特に好ましくは、少なくとも20個(例えば、20〜25個および20〜30個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基、より好ましくは最大で24塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
本発明の第二の態様においては、また、配列番号12の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ペクチネイタス・セレビシフィラスを検出するためのプローブを選択することができる。
配列番号12の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合には、配列番号12の塩基配列(好ましくは、183〜258番目の塩基配列)またはその相補配列の連続する少なくとも12個(例えば、12〜30個)、好ましくは、少なくとも15個(例えば、15〜30個)、より好ましくは、少なくとも18個(例えば、18〜24個および18〜30個)、特に好ましくは、少なくとも20個(例えば、20〜25個および20〜30個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基、より好ましくは最大で24塩基とすることができる)をプローブとして使用できる。
本発明の第三の態様では、配列番号17の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド、および配列番号17の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号17の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも10個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド、および配列番号17の塩基配列の連続する少なくとも10個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドとすることができる。
本発明の第三の態様においては、配列番号17の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種を検出するためのLAMP法プライマーセットを選択することができる。LAMP法は周知であり、当業者であればLAMP法プライマーを適宜設計することができる。具体的には、LAMP法の実施に必要な4種類のプライマー、すなわち、FIP、F3、BIP、およびB3を、前述のように設計し、必要に応じてループプライマー、すなわち、LFおよびLBを使用することもできる。LAMP法においては、好ましくは、LAMP法の実施に必要な4種のプライマーのうち、少なくともFIPおよびBIPのいずれかまたは両方の一部または全部を、配列番号17の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号17の174〜219番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。この場合、LAMP法の実施に必要な他のプライマーは、配列番号17の塩基配列またはその相補配列に対合するように選択しても、配列番号17の塩基配列およびその相補配列以外の配列(配列番号17の配列の外側の領域)に対合するように選択してもよい。
配列番号17の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをLAMP法のFIPおよびBIPとして用いる場合には、配列番号17の塩基配列(好ましくは、174〜219番目の塩基配列)またはその相補配列の連続する少なくとも30個(例えば、30〜60個)、好ましくは、少なくとも38個(例えば、38〜57個)、より好ましくは、少なくとも43個(例えば、43〜57塩基)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
配列番号17の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをLAMP法のFIPとして用いる場合には、好ましくは、配列番号17の174〜193番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列の連続する少なくとも30個(例えば、30〜60個)、好ましくは、少なくとも38個(例えば、38〜57個)、より好ましくは、少なくとも43個(例えば、43〜57塩基)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
配列番号17の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをLAMP法のBIPとして用いる場合には、好ましくは、配列番号17の195〜219番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列の連続する少なくとも30個(例えば、30〜60個)、好ましくは、少なくとも38個(例えば、38〜57個)、より好ましくは、少なくとも43個(例えば、43〜57塩基)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
配列番号17の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをLAMP法のF3、B3、LB、およびLFとして用いる場合には、配列番号17の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも15個(例えば、15〜30個)、好ましくは、少なくとも19個(例えば、19〜24個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
本発明の第三の態様においては、また、配列番号17の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種を検出するためのPCR法プライマーペアを選択することができる。具体的には、PCR法においては、二つのプライマーの一方が配列番号17の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号17の塩基配列の相補配列に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、PCR法においては、二つのプライマーの一方が配列番号17の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号17の塩基配列の相補配列以外の配列(配列番号17の配列の外側の領域)に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択してもよい。PCR法においては、好ましくは、二つのプライマーの一方あるいは両方を、配列番号17の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号17の174〜219番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。
配列番号17の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをPCR法プライマーとして用いる場合には、配列番号17の塩基配列(好ましくは、174〜219番目の塩基配列)またはその相補配列の連続する少なくとも15個(例えば、15〜30個)、より好ましくは、少なくとも18個(例えば、18〜24個および18〜30個)、特に好ましくは、少なくとも20個(例えば、20〜25個および20〜30個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基、より好ましくは最大で24塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
本発明の第三の態様においては、また、配列番号17の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種を検出するためのプローブを選択することができる。
配列番号17の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合には、配列番号17の塩基配列(好ましくは、174〜219番目の塩基配列)またはその相補配列の連続する少なくとも12個(例えば、12〜30個)、好ましくは、少なくとも15個(例えば、15〜30個)、より好ましくは、少なくとも18個(例えば、18〜24個および18〜30個)、特に好ましくは、少なくとも20個(例えば、20〜25個および20〜30個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基、より好ましくは最大で24塩基とすることができる)をプローブとして使用できる。
本発明の第四の態様では、配列番号23の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド、および配列番号23の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号23の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも10個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド、および配列番号23の塩基配列の連続する少なくとも10個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドとすることができる。
本発明の第四の態様においては、配列番号23の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、メガスフェラ・セレビシェを検出するためのLAMP法プライマーセットを選択することができる。LAMP法は周知であり、当業者であればLAMP法プライマーを適宜設計することができる。具体的には、LAMP法の実施に必要な4種類のプライマー、すなわち、FIP、F3、BIP、およびB3を、前述のように設計し、必要に応じてループプライマー、すなわち、LFおよびLBを使用することもできる。LAMP法においては、好ましくは、LAMP法の実施に必要な4種のプライマーのうち、少なくともFIPおよびBIPのいずれかまたは両方の一部または全部を、配列番号23の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号23の297〜345番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。この場合、LAMP法の実施に必要な他のプライマーは、配列番号23の塩基配列またはその相補配列に対合するように選択しても、配列番号23の塩基配列およびその相補配列以外の配列(配列番号23の配列の外側の領域)に対合するように選択してもよい。
配列番号23の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをLAMP法プライマー(FIPおよびBIP)として用いる場合には、配列番号23の塩基配列(好ましくは、297〜345番目の塩基配列)またはその相補配列の連続する少なくとも30個(例えば、30〜60個)、好ましくは、少なくとも38個(例えば、38〜57個)、より好ましくは、少なくとも43個(例えば、43〜57塩基)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
配列番号23の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをLAMP法のFIPとして用いる場合には、好ましくは、配列番号23の297〜322番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列の連続する少なくとも30個(例えば、30〜60個)、好ましくは、少なくとも38個(例えば、38〜57個)、より好ましくは、少なくとも43個(例えば、43〜57塩基)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
配列番号23の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをLAMP法のBIPとして用いる場合には、好ましくは、配列番号23の330〜345番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列の連続する少なくとも30個(例えば、30〜60個)、好ましくは、少なくとも38個(例えば、38〜57個)、より好ましくは、少なくとも43個(例えば、43〜57塩基)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
配列番号23の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをLAMP法のF3、B3、LB、およびLFとして用いる場合には、配列番号23の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも15個(例えば、15〜30個)、好ましくは、少なくとも19個(例えば、19〜24個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
本発明の第四の態様においては、また、配列番号23の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、メガスフェラ・セレビシェを検出するためのPCR法プライマーペアを選択することができる。具体的には、PCR法においては、二つのプライマーの一方が配列番号23の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号23の塩基配列の相補配列に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、PCR法においては、二つのプライマーの一方が配列番号23の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号23の塩基配列の相補配列以外の配列(配列番号23の配列の外側の領域)に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択してもよい。PCR法においては、好ましくは、二つのプライマーの一方あるいは両方を、配列番号23の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号23の297〜345番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。
配列番号23の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをPCR法プライマーとして用いる場合には、配列番号23の塩基配列(好ましくは、297〜345番目の塩基配列)またはその相補配列の連続する少なくとも15個(例えば、15〜30個)、より好ましくは、少なくとも18個(例えば、18〜24個および18〜30個)、特に好ましくは、少なくとも20個(例えば、20〜25個および20〜30個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基、より好ましくは最大で24塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
本発明の第四の態様においては、また、配列番号23の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、メガスフェラ・セレビシェを検出するためのプローブを選択することができる。
配列番号23の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合には、配列番号23の塩基配列(好ましくは、297〜345番目の塩基配列)またはその相補配列の連続する少なくとも12個(例えば、12〜30個)、好ましくは、少なくとも15個(例えば、15〜30個)、より好ましくは、少なくとも18個(例えば、18〜24個および18〜30個)、特に好ましくは、少なくとも20個(例えば、20〜25個および20〜30個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基、より好ましくは最大で24塩基とすることができる)をプローブとして使用できる。
本発明の第五の態様では、配列番号28の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド、および配列番号28の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号28の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも10個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド、および配列番号28の塩基配列の連続する少なくとも10個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドとすることができる。
本発明の第五の態様においては、配列番号28の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ザイモフィラス・パウシボランスを検出するためのLAMP法プライマーセットを選択することができる。LAMP法は周知であり、当業者であればLAMP法プライマーを適宜設計することができる。具体的には、LAMP法の実施に必要な4種類のプライマー、すなわち、FIP、F3、BIP、およびB3を、前述のように設計し、必要に応じてループプライマー、すなわち、LFおよびLBを使用することもできる。LAMP法においては、好ましくは、LAMP法の実施に必要な4種のプライマーのうち、少なくともFIPおよびBIPのいずれかまたは両方の一部または全部を、配列番号28の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号28の123〜165番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。この場合、LAMP法の実施に必要な他のプライマーは、配列番号28の塩基配列またはその相補配列に対合するように選択しても、配列番号28の塩基配列およびその相補配列以外の配列(配列番号28の配列の外側の領域)に対合するように選択してもよい。
配列番号28の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをLAMP法のFIPおよびBIPとして用いる場合には、配列番号28の塩基配列(好ましくは、123〜165番目の塩基配列)またはその相補配列の連続する少なくとも30個(例えば、30〜60個)、好ましくは、少なくとも38個(例えば、38〜57個)、より好ましくは、少なくとも43個(例えば、43〜57塩基)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
配列番号28の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをLAMP法のFIPとして用いる場合には、好ましくは、配列番号28の123〜144番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列の連続する少なくとも30個(例えば、30〜60個)、好ましくは、少なくとも38個(例えば、38〜57個)、より好ましくは、少なくとも43個(例えば、43〜57塩基)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
配列番号28の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをLAMP法のBIPとして用いる場合には、好ましくは、配列番号28の148〜165番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列の連続する少なくとも30個(例えば、30〜60個)、好ましくは、少なくとも38個(例えば、38〜57個)、より好ましくは、少なくとも43個(例えば、43〜57塩基)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で60塩基、好ましくは最大で57塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
配列番号28の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをLAMP法のF3、B3、LB、およびLFとして用いる場合には、配列番号28の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも15個(例えば、15〜30個)、好ましくは、少なくとも19個(例えば、19〜24個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
本発明の第五の態様においては、また、配列番号28の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ザイモフィラス・パウシボランスを検出するためのPCR法プライマーペアを選択することができる。具体的には、PCR法においては、二つのプライマーの一方が配列番号28の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号28の塩基配列の相補配列に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、PCR法においては、二つのプライマーの一方が配列番号28の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号28の塩基配列の相補配列以外の配列(配列番号28の配列の外側の領域)に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択してもよい。PCR法においては、好ましくは、二つのプライマーの一方あるいは両方を、配列番号28の塩基配列のうちより識別性の高い部分、すなわち、配列番号28の123〜165番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列、に対合するように選択してもよい。
配列番号28の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをPCR法プライマーとして用いる場合には、配列番号28の塩基配列(好ましくは、123〜165番目の塩基配列)またはその相補配列の連続する少なくとも15個(例えば、15〜30個)、より好ましくは、少なくとも18個(例えば、18〜24個および18〜30個)、特に好ましくは、少なくとも20個(例えば、20〜25個および20〜30個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基、より好ましくは最大で24塩基とすることができる)をプライマーとして使用できる。
本発明の第五の態様においては、また、配列番号28の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、ザイモフィラス・パウシボランスを検出するためのプローブを選択することができる。
配列番号28の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをプローブとして用いる場合には、配列番号28の塩基配列(好ましくは、123〜165番目の塩基配列)またはその相補配列の連続する少なくとも12個(例えば、12〜30個)、好ましくは、少なくとも15個(例えば、15〜30個)、より好ましくは、少なくとも18個(例えば、18〜24個および18〜30個)、特に好ましくは、少なくとも20個(例えば、20〜25個および20〜30個)のヌクレオチド(1または数個の変異が導入されていてもよい)を含んでなるポリヌクレオチド(ヌクレオチド長は最大で30塩基、好ましくは最大で25塩基、より好ましくは最大で24塩基とすることができる)をプローブとして使用できる。
相同ポリヌクレオチドおよび配列番号6、12、17、23および28の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドは、また、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%の同一性を有するポリヌクレオチドであることができる。同一性の数値は、当業界において周知のアルゴリズムに従って算出することができ、例えば、BLAST(http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html)を使用して同一性の数値を算出することができる。
相同ポリヌクレオチドおよび配列番号6、12、17、23および28の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドは、更に、それぞれ、対応する塩基配列に1または数個の変異が導入された改変塩基配列からなり、かつ対応する塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであることができる。
ここで「変異」は、同一または異なっていてもよく、置換、欠失、挿入、および付加から選択でき、好ましくは、ある1個の塩基を他の1個の塩基に置換する「一塩基置換」、ある1個の塩基を欠失させる「一塩基欠失」、ある1個の塩基を挿入する「一塩基挿入」、およびある1個の塩基を付加する「一塩基付加」から選択できる。また、変異の個数は、1〜6個、1、2、3、または4個、1または2個、あるいは1個とすることができる。
本発明において「ポリヌクレオチド」とはDNA、RNA、およびPNA(peptide nucleic acid)を含む意味で用いられる。
本発明によるプライマーおよびプライマーセット等を構成するポリヌクレオチドは、例えばホスファイト・トリエステル法(Hunkapiller, M. et al., Nature, 310,105, 1984)等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製してもよいし、検出対象の菌株の全DNAを取得し、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に基づいて目的のヌクレオチド配列を含むDNA断片をPCR法等で適宜取得してもよい。
本発明によるLAMP法プライマーセットまたはPCR法プライマーセットは、それぞれ単独で使用しても、適宜組み合わせて使用してもよい。本発明によるプライマーセットを組み合わせて実施することにより、偏性嫌気性細菌を正確に区別して検出することが可能となる。
本発明によるプライマーセットは、単独で、あるいは組み合わせて、キットの形態で提供することができる。従って、本発明によれば、第一の態様のLAMP法プライマーセット;第二の態様のLAMP法プライマーセット;第三の態様のLAMP法プライマーセット;第四の態様のLAMP法プライマーセット;第五の態様のLAMP法プライマーセット;およびこれらの一部または全部の組み合わせからなる群から選択されるプライマーセット含んでなる、偏性嫌気性細菌の検出キットが提供される。本発明によれば、また、第一の態様のPCR法プライマーセット;第二の態様のPCR法プライマーセット;第三の態様のPCR法プライマーセット;第四の態様のPCR法プライマーセット;第五の態様のPCR法プライマーセット;およびこれらの一部または全部の組み合わせからなる群から選択されるプライマーセット含んでなる、偏性嫌気性細菌の検出キットが提供される。
LAMP法プライマーセットを含む本発明によるキットは、LAMP法による核酸増幅反応の実施に必要な試薬(例えば、Bst DNAポリメラーゼ、反応用試薬混合液)や器具(例えば、反応用チューブ)を含んでいてもよい。
PCR法プライマーセットを含む本発明によるキットは、PCR法による核酸増幅反応の実施に必要な試薬(例えば、DNAポリメラーゼ、精製水)や器具(例えば、反応用チューブ)を含んでいてもよい。
本発明によるプライマーセットを用いて核酸増幅反応を実施すると、各種飲料(例えば、酒類)の品質低下の原因となる偏性嫌気性細菌を正確に識別することができる。従って、本発明によるプライマーセットおよびキットは、各種飲料(例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒、およびワイン)の品質管理や、環境試料(例えば、原料用水)の検査に用いることができる。
ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種、メガスフェラ・セレビシェ、ザイモフィラス・パウシボランスは、ビール、発泡酒、およびワインの製造工程あるいは最終製品の品質に影響する能力を持つ細菌種である。従って、第一の態様のLAMP法プライマーセット;第二の態様のLAMP法プライマーセット;第三の態様のLAMP法プライマーセット;第四の態様のLAMP法プライマーセット;第五の態様のLAMP法プライマーセット;並びにこれらの一部または全部の組み合わせは、好ましくは、ビール、発泡酒、およびワインの品質管理に用いることができる。
検出方法および判定方法
本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットは、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種、メガスフェラ・セレビシェ、およびザイモフィラス・パウシボランスのような偏性嫌気性細菌の検出に用いることができる。すなわち、本発明によれば、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、上記偏性嫌気性細菌の検出方法が提供される。より具体的には、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料中との標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程を含む、上記偏性嫌気性細菌の検出方法が提供される。
本発明によるプライマーおよびプローブ並びにプライマーセットは、ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種、メガスフェラ・セレビシェ、およびザイモフィラス・パウシボランスのような偏性嫌気性細菌の検出に用いることができる。すなわち、本発明によれば、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、上記偏性嫌気性細菌の検出方法が提供される。より具体的には、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料中との標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程を含む、上記偏性嫌気性細菌の検出方法が提供される。
ペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種、メガスフェラ・セレビシェ、およびザイモフィラス・パウシボランスのような偏性嫌気性細菌は各種飲料(例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒、およびワイン)を混濁させる原因菌である。従って、本発明によるプローブおよびプライマー並びにプライマーセットは、上記偏性嫌気性細菌の検出のみならず、各種飲料(例えば、酒類、特に、ビール、発泡酒、およびワイン)の混濁可能性の判定に用いることができる。すなわち、本発明によるプローブおよびプライマー並びにプライマーセットにより検出対象菌種が検出された場合には、混濁菌が試料中に存在していると、あるいは試料が混濁する見込みがあると判定することができる。
従って、本発明によれば、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。より具体的には、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料とを接触させ、本発明によるプローブもしくはプライマーまたはプライマーセットと試料中との標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出する工程を含む、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
ここで、ハイブリダイゼーションの検出方法は周知であり、その検出のための装置、器具は市販のものを用いることができる。ハイブリダイゼーションの検出は、例えば、LAMP法やPCR法など周知の核酸増幅法を使用して増幅産物の有無等を検出することにより、あるいはサザンブロット法など周知の核酸検出法を使用してハイブリダイゼーション複合体の有無等を検出することにより、実施することができる。
本発明による検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対してLAMP法による核酸増幅反応を実施した後、核酸増幅産物の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。
すなわち、本発明の第一の態様によれば、
(a)本発明の第一の態様によるLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(b)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がペクチネイタス・フリシンゲンシスの存在を示す、ペクチネイタス・フリシンゲンシスの検出方法が提供される。
(a)本発明の第一の態様によるLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(b)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がペクチネイタス・フリシンゲンシスの存在を示す、ペクチネイタス・フリシンゲンシスの検出方法が提供される。
本発明の第一の態様によれば、また、
(a)本発明の第一の態様によるLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(b)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
(a)本発明の第一の態様によるLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(b)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
本発明の第二の態様によれば、
(c)本発明の第二の態様によるLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(d)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がペクチネイタス・セレビシフィラスの存在を示す、ペクチネイタス・セレビシフィラスの検出方法が提供される。
(c)本発明の第二の態様によるLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(d)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がペクチネイタス・セレビシフィラスの存在を示す、ペクチネイタス・セレビシフィラスの検出方法が提供される。
本発明の第二の態様によれば、また、
(c)本発明の第二の態様によるLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(d)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
(c)本発明の第二の態様によるLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(d)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
本発明の第三の態様によれば、
(e)本発明の第三の態様によるLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(f)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種の存在を示す、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種の検出方法が提供される。
(e)本発明の第三の態様によるLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(f)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種の存在を示す、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種の検出方法が提供される。
本発明の第三の態様によれば、また、
(e)本発明の第三の態様によるLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(f)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
(e)本発明の第三の態様によるLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(f)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
本発明の第四の態様によれば、
(g)本発明の第四の態様によるLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(h)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がメガスフェラ・セレビシェの存在を示す、メガスフェラ・セレビシェの検出方法が提供される。
(g)本発明の第四の態様によるLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(h)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がメガスフェラ・セレビシェの存在を示す、メガスフェラ・セレビシェの検出方法が提供される。
本発明の第四の態様によれば、また、
(g)本発明の第四の態様によるLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(h)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
(g)本発明の第四の態様によるLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(h)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
本発明の第五の態様によれば、
(i)本発明の第五の態様によるLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(j)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がザイモフィラス・パウシボランスの存在を示す、ザイモフィラス・パウシボランスの検出方法が提供される。
(i)本発明の第五の態様によるLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(j)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がザイモフィラス・パウシボランスの存在を示す、ザイモフィラス・パウシボランスの検出方法が提供される。
本発明の第五の態様によれば、また、
(i)本発明の第五の態様によるLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(j)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
(i)本発明の第五の態様によるLAMP法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてLAMP法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(j)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
LAMP法による核酸増幅工程に供される試料は、試料中の菌体を培養してから核酸を抽出しても、培養せずに核酸を抽出してもよい。菌体の培養や核酸の抽出など核酸試料の調製については後述する。
LAMP法による核酸増幅工程では、試料中の核酸に対して増幅反応が実施される。LAMP法による核酸増幅反応については後述する。
試料中に検出対象菌種が存在する場合には、標的とする特定の領域が増幅され、増幅産物が生成する。増幅産物が生成した場合には、核酸増幅反応が実施された試料溶液が白濁することから、試料溶液の濁度を測定することにより増幅産物の有無を決定することができる。LAMP法における濁度の測定は周知であり、市販のエンドポイント濁度測定装置(例えば、テラメックス社製LA−100)やリアルタイム濁度測定装置(例えば、テラメックス社製LA−200)を用いて濁度の測定をすることができる。
本発明による検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対してPCR法による核酸増幅反応を実施した後、核酸増幅産物の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。
すなわち、本発明の第一の態様によれば、
(a’)本発明の第一の態様によるPCR法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてPCR法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(b’)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がペクチネイタス・フリシンゲンシスの存在を示す、ペクチネイタス・フリシンゲンシスの検出方法が提供される。
(a’)本発明の第一の態様によるPCR法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてPCR法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(b’)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がペクチネイタス・フリシンゲンシスの存在を示す、ペクチネイタス・フリシンゲンシスの検出方法が提供される。
本発明の第一の態様によれば、また、
(a’)本発明の第一の態様によるPCR法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてPCR法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(b’)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
(a’)本発明の第一の態様によるPCR法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてPCR法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(b’)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
本発明の第二の態様によれば、
(c’)本発明の第二の態様によるPCR法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてPCR法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(d’)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がペクチネイタス・セレビシフィラスの存在を示す、ペクチネイタス・セレビシフィラスの検出方法が提供される。
(c’)本発明の第二の態様によるPCR法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてPCR法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(d’)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がペクチネイタス・セレビシフィラスの存在を示す、ペクチネイタス・セレビシフィラスの検出方法が提供される。
本発明の第二の態様によれば、また、
(c’)本発明の第二の態様によるPCR法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてPCR法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(d’)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
(c’)本発明の第二の態様によるPCR法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてPCR法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(d’)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
本発明の第三の態様によれば、
(e’)本発明の第三の態様によるPCR法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてPCR法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(f’)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種の存在を示す、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種の検出方法が提供される。
(e’)本発明の第三の態様によるPCR法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてPCR法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(f’)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種の存在を示す、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種の検出方法が提供される。
本発明の第三の態様によれば、また、
(e’)本発明の第三の態様によるPCR法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてPCR法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(f’)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
(e’)本発明の第三の態様によるPCR法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてPCR法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(f’)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
本発明の第四の態様によれば、
(g’)本発明の第四の態様によるPCR法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてPCR法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(h’)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がメガスフェラ・セレビシェの存在を示す、メガスフェラ・セレビシェの検出方法が提供される。
(g’)本発明の第四の態様によるPCR法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてPCR法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(h’)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がメガスフェラ・セレビシェの存在を示す、メガスフェラ・セレビシェの検出方法が提供される。
本発明の第四の態様によれば、また、
(g’)本発明の第四の態様によるPCR法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてPCR法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(h’)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
(g’)本発明の第四の態様によるPCR法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてPCR法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(h’)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
本発明の第五の態様によれば、
(i’)本発明の第五の態様によるPCR法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてPCR法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(j’)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がザイモフィラス・パウシボランスの存在を示す、ザイモフィラス・パウシボランスの検出方法が提供される。
(i’)本発明の第五の態様によるPCR法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてPCR法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(j’)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がザイモフィラス・パウシボランスの存在を示す、ザイモフィラス・パウシボランスの検出方法が提供される。
本発明の第五の態様によれば、また、
(i’)本発明の第五の態様によるPCR法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてPCR法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(j’)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
(i’)本発明の第五の態様によるPCR法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてPCR法により核酸増幅反応を実施する工程;および
(j’)増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
PCR法による核酸増幅工程に供される試料は、試料中の菌体を培養してから核酸を抽出しても、培養せずに核酸を抽出してもよい。菌体の培養や核酸の抽出など核酸試料の調製については後述する。
PCR法による核酸増幅工程では、試料中の核酸に対して増幅反応が実施される。PCR法による核酸増幅反応は周知であり、当業者であればPCR法およびその改変方法の実施条件等を適宜設定し、PCR法を実施することができる。
本発明による検出方法のうちプローブによる検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対する本発明によるプローブのハイブリダイゼーションを実施した後、核酸複合体の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。
すなわち、本発明の第一の態様によれば、
(a”)本発明の第一の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程;および
(b”)ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がペクチネイタス・フリシンゲンシスの存在を示す、ペクチネイタス・フリシンゲンシスの検出方法が提供される。
(a”)本発明の第一の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程;および
(b”)ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がペクチネイタス・フリシンゲンシスの存在を示す、ペクチネイタス・フリシンゲンシスの検出方法が提供される。
本発明の第一の態様によれば、また、
(a”)本発明の第一の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程;および
(b”)ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
(a”)本発明の第一の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程;および
(b”)ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
本発明の第二の態様によれば、
(c”)本発明の第二の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程;および
(d”)ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がペクチネイタス・セレビシフィラスの存在を示す、ペクチネイタス・セレビシフィラスの検出方法が提供される。
(c”)本発明の第二の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程;および
(d”)ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がペクチネイタス・セレビシフィラスの存在を示す、ペクチネイタス・セレビシフィラスの検出方法が提供される。
本発明の第二の態様によれば、また、
(c”)本発明の第二の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程;および
(d”)ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
(c”)本発明の第二の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程;および
(d”)ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
本発明の第三の態様によれば、
(e”)本発明の第三の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程;および
(f”)ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種の存在を示す、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種の検出方法が提供される。
(e”)本発明の第三の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程;および
(f”)ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種の存在を示す、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種の検出方法が提供される。
本発明の第三の態様によれば、また、
(e”)本発明の第三の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程;および
(f”)ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
(e”)本発明の第三の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程;および
(f”)ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
本発明の第四の態様によれば、
(g”)本発明の第四の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程;および
(h”)ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がメガスフェラ・セレビシェの存在を示す、メガスフェラ・セレビシェの検出方法が提供される。
(g”)本発明の第四の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程;および
(h”)ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がメガスフェラ・セレビシェの存在を示す、メガスフェラ・セレビシェの検出方法が提供される。
本発明の第四の態様によれば、また、
(g”)本発明の第四の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程;および
(h”)ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
(g”)本発明の第四の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程;および
(h”)ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
本発明の第五の態様によれば、
(i”)本発明の第五の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程;および
(j”)ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がザイモフィラス・パウシボランスの存在を示す、ザイモフィラス・パウシボランスの検出方法が提供される。
(i”)本発明の第五の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程;および
(j”)ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がザイモフィラス・パウシボランスの存在を示す、ザイモフィラス・パウシボランスの検出方法が提供される。
本発明の第五の態様によれば、また、
(i”)本発明の第五の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程;および
(j”)ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
(i”)本発明の第五の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程;および
(j”)ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成が混濁可能性を示す、飲料の混濁可能性の判定方法が提供される。
プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射性元素(例えば、32Pおよび14C)、蛍光化合物(例えば、FITC)、酵素反応に関与する分子(例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ)が挙げられる。
ハイブリダイゼーション複合体の検出は、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の周知の方法を用いて実施できる。ハイブリダイゼーション複合体の検出に先立って、未結合プローブやハイブリダイズしないその他の成分を除去してもよい。
LAMP法による核酸増幅反応
本発明によるLAMP法プライマーセットは、LAMP法による核酸増幅反応のプライマーとして用いることができる。本発明によるプライマーセットはまた、LAMP法のみならず、LAMP法を改良した核酸増幅反応のプライマーとしても用いることができる。
本発明によるLAMP法プライマーセットは、LAMP法による核酸増幅反応のプライマーとして用いることができる。本発明によるプライマーセットはまた、LAMP法のみならず、LAMP法を改良した核酸増幅反応のプライマーとしても用いることができる。
LAMP法の原理およびそれを利用した核酸増幅方法は周知であり、LAMP法による核酸増幅反応の実施に当たっては、例えば、WO00/28082号公報やNotomi T. et al., Nucleic Acids Research, 28(12),e63(2000)の開示を参照することができる。
LAMP法による核酸増幅反応は、市販のLAMP法遺伝子増幅試薬キットに従って実施することができるが、例えば、サンプルのDNA、プライマー溶液、および市販のLAMP法遺伝子増幅試薬キット(例えば、栄研化学社製Loopamp DNA増幅キット)で提供される試薬を、キットに添付されている説明書に従って混合して一定温度(60〜65℃)に保ち、一定時間(標準で1時間)反応させることにより実施できる。
LAMP法による核酸増幅反応は、以下のような工程を経て実施することができる。
(i)鎖置換型DNAポリメラーゼの働きにより、FIPのF2領域の3’末端を起点として鋳型DNAと相補的なDNA鎖が合成される。
(ii)FIPの外側に、F3プライマーがアニールし、その3’末端を起点として鎖置換型DNAポリメラーゼの働きによって、先に合成されているFIPからのDNA鎖を剥がしながらDNA合成が伸長する。
(iii)F3プライマーから合成されたDNA鎖と鋳型DNAが二本鎖となる。
(iv)FIPから先に合成されたDNA鎖は、F3プライマーからのDNA鎖によって剥がされて一本鎖DNAとなるが、このDNA鎖は、5’末端側に相補的な領域F1c、F1をもち、自己アニールを起こし、ループを形成する。
(v)上記(iv)の過程でループを形成したDNA鎖に対し、BIPがアニールし、このBIPの3’末端を起点として相補的なDNAが合成される。この過程でループが剥がされて伸びる。さらに、BIPの外側にB3プライマーがアニールし、その3’末端を起点として鎖置換型DNAポリメラーゼの働きによって、先に合成されたBIPからのDNA鎖を剥がしながらDNA合成が伸長する。
(vi)上記(v)の過程で二本鎖DNAが形成される。
(vii)上記(v)の過程で剥がされたBIPから合成されたDNA鎖は両端に相補的な配列を持つため、自己アニールし、ループを形成してダンベル様の構造となる。
(viii)上記ダンベル構造のDNA鎖を起点として、FIP次いでBIPのアニ−リングを介して所望DNAの増幅サイクルが行われる。
(i)鎖置換型DNAポリメラーゼの働きにより、FIPのF2領域の3’末端を起点として鋳型DNAと相補的なDNA鎖が合成される。
(ii)FIPの外側に、F3プライマーがアニールし、その3’末端を起点として鎖置換型DNAポリメラーゼの働きによって、先に合成されているFIPからのDNA鎖を剥がしながらDNA合成が伸長する。
(iii)F3プライマーから合成されたDNA鎖と鋳型DNAが二本鎖となる。
(iv)FIPから先に合成されたDNA鎖は、F3プライマーからのDNA鎖によって剥がされて一本鎖DNAとなるが、このDNA鎖は、5’末端側に相補的な領域F1c、F1をもち、自己アニールを起こし、ループを形成する。
(v)上記(iv)の過程でループを形成したDNA鎖に対し、BIPがアニールし、このBIPの3’末端を起点として相補的なDNAが合成される。この過程でループが剥がされて伸びる。さらに、BIPの外側にB3プライマーがアニールし、その3’末端を起点として鎖置換型DNAポリメラーゼの働きによって、先に合成されたBIPからのDNA鎖を剥がしながらDNA合成が伸長する。
(vi)上記(v)の過程で二本鎖DNAが形成される。
(vii)上記(v)の過程で剥がされたBIPから合成されたDNA鎖は両端に相補的な配列を持つため、自己アニールし、ループを形成してダンベル様の構造となる。
(viii)上記ダンベル構造のDNA鎖を起点として、FIP次いでBIPのアニ−リングを介して所望DNAの増幅サイクルが行われる。
LAMP法による核酸増幅反応は、上記の工程を適宜改変して実施できることは当業者に自明であろう。本発明によるプライマーセットはそのような改変された方法にも用いることができる。
本発明によるLAMP法プライマーセットは、約60〜約65℃(例えば65℃)においてアニーリングと同時にDNA鎖の合成も起こす。アニ−リング反応およびDNA鎖合成により約1時間反応を行うことにより109〜1010倍に核酸を増幅させることができる。
本発明によるLAMP法プライマーセットをLAMP法による核酸増幅反応の条件の下で試料核酸と反応させると、検出対象の菌株のターゲット領域が増幅される。このような増幅反応が起こると、副産物として形成されるピロリン酸マグネシウムの影響で反応液が白濁するため、この濁度に基づき増幅の有無が目視により判定できる。増幅の有無は、濁度測定装置を用いて濁度を光学的に測定してもよく、また、アガロースゲル電気泳動法などを利用してDNA断片の有無を確認し検出してもよい。
核酸増幅が観察されるならば、標的塩基配列が存在することを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陽性(+)を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的塩基配列が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陰性(−)を表す。
PCR法による核酸増幅反応
本発明によるPCR法プライマーセットは、PCR法、RT−PCR法、リアルタイムPCR法、in situ PCR等の核酸増幅法を利用して、偏性嫌気性細菌の識別に用いることができる。
本発明によるPCR法プライマーセットは、PCR法、RT−PCR法、リアルタイムPCR法、in situ PCR等の核酸増幅法を利用して、偏性嫌気性細菌の識別に用いることができる。
核酸増幅物が観察されるならば、標的塩基配列が存在することを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陽性(+)を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的塩基配列が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陰性(−)を表す。
PCR法では、アガロースゲル電気泳動など周知の方法に従って核酸増幅物を検出することができる。また、リアルタイムPCR法では、インターカレーターや蛍光標識プローブを使用し、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計とが一体化された装置において、核酸増幅物を経時的に検出することができる。
検出対象試料とその調製
本発明によるプライマーセットおよびキットの検出の対象となる試料としては、ビール、発泡酒、ワインなどの酒類;ラムネ、炭酸水などの清涼飲料;原料用に採取された水等の環境試料;酒類や清涼飲料等の製造工程から採取された半製品などが挙げられる。
本発明によるプライマーセットおよびキットの検出の対象となる試料としては、ビール、発泡酒、ワインなどの酒類;ラムネ、炭酸水などの清涼飲料;原料用に採取された水等の環境試料;酒類や清涼飲料等の製造工程から採取された半製品などが挙げられる。
これらをLAMP法の試料として用いる場合には、試料中に存在する菌の濃縮、分離、および培養、菌体からの核酸分離、核酸の濃縮などの操作を前処理として実施してもよい。試料中に存在する菌の濃縮や分離の方法としては、ろ過、遠心分離などが挙げられ、適宜選択できる。また試料から濃縮、分離した菌を、さらに培養して菌数を増やしてもよい。培養には、対象とする細菌株の増殖に適切な寒天固体培地や液体培地を用いることができ、また対象とする細菌株を選択するためにシクロヘキシミドなどの薬剤を添加してもよい。飲料試料や環境試料などに存在する菌体、あるいは培養した菌体から核酸を遊離させるためには、例えば、市販のキットを使用する方法や、アルカリ溶液などによって菌体を処理し、100℃での加熱により菌体から核酸を遊離させる方法を選択することができる。また、核酸を更に精製する必要があれば、フェノール/クロロホルム処理、エタノール沈殿や遠心等により核酸の精製を行い、最終的にTE緩衝液などに再溶解させ鋳型DNAとして試験に供してもよい(European Brewery Convention:ANALYTICA - MICROBIOLOGICA - EBC, 2nd ed. 2005 Fachverlag Hans Carl, Nuernberg、Rolfsら:PCR - Clinical diagnostics and research, Springer-Verlag, Berlin, 1992、大嶋泰治ら:蛋白 核酸 酵素, vol. 35, 2523-2541, 1990)。
本発明によるプライマーセットおよびキットを用いた偏性嫌気性細菌の検出は、例えば、以下のように実施することができる。
まず、試料中に存在すると考えられる偏性嫌気性細菌を適切な培地で増菌培養する。次いで、寒天培地上に形成されたコロニーからDNAを分離し、このDNAに対して本発明によるプライマーセットを用いたLAMP法を実施し、偏性嫌気性細菌の特定遺伝子領域を増幅する。遺伝子増幅産物の存在は検出対象菌種の存在を示す。また、検出対象菌種の存在は、混濁菌が試料中に存在していること、あるいは試料が混濁する見込みを示す。
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例:偏性嫌気性細菌の検出
(a)ゲノムDNA抽出法
寒天平板培地上で培養した菌体をかき取り、滅菌蒸留水に懸濁した。この懸濁液を遠心分離(15000rpm、5分間)し、上澄みを捨てた。沈殿した菌体に再度滅菌蒸留水を添加、懸濁し、遠心分離した。上澄みを捨て、得られた菌体にPrepMan Ultra(アプライドバイオシステムズ社製)の溶液100μlを添加し、95℃、10分間加熱した。その後、15000rpm、1分間遠心分離し、上澄みをゲノムDNA溶液として使用した。あるいは洗浄した菌体に0.1N NaOH溶液を100μl添加し、95℃、10分間加熱した。その後、1M Tris緩衝液(pH7.0)を用いて中和し、上澄みをゲノムDNA溶液として使用した。
(a)ゲノムDNA抽出法
寒天平板培地上で培養した菌体をかき取り、滅菌蒸留水に懸濁した。この懸濁液を遠心分離(15000rpm、5分間)し、上澄みを捨てた。沈殿した菌体に再度滅菌蒸留水を添加、懸濁し、遠心分離した。上澄みを捨て、得られた菌体にPrepMan Ultra(アプライドバイオシステムズ社製)の溶液100μlを添加し、95℃、10分間加熱した。その後、15000rpm、1分間遠心分離し、上澄みをゲノムDNA溶液として使用した。あるいは洗浄した菌体に0.1N NaOH溶液を100μl添加し、95℃、10分間加熱した。その後、1M Tris緩衝液(pH7.0)を用いて中和し、上澄みをゲノムDNA溶液として使用した。
(b)LAMP用プライマー
以下の偏性嫌気性細菌各菌種用プライマーを、富士通システムソリューションズ社のeGenome Order(http://genome.e-mp.jp/index.html)、あるいはそれと同等の方法で化学合成し、TE緩衝液(pH8.0)で100μMの濃度になるように溶解した。これらの溶液を、FIP、BIPプライマー:16μM、F3、B3プライマー:2μM、LF、LBプライマー:8μMとなるように混合し、希釈した。
以下の偏性嫌気性細菌各菌種用プライマーを、富士通システムソリューションズ社のeGenome Order(http://genome.e-mp.jp/index.html)、あるいはそれと同等の方法で化学合成し、TE緩衝液(pH8.0)で100μMの濃度になるように溶解した。これらの溶液を、FIP、BIPプライマー:16μM、F3、B3プライマー:2μM、LF、LBプライマー:8μMとなるように混合し、希釈した。
[ペクチネイタス・フリシンゲンシス検出用プライマーセット(PFG4LF1)]
FIP GTCTTGGTGA TGCCATATTC AAAAGTGTCA GCCAAGCGAT GAAAGT (配列番号1)
F3 GGTGTGTCCG TAGTCAATGC (配列番号2)
BIP TAGGCACTAC CGACAGTACC GCGTAATCGT AGGTTGTTTC AGTGA (配列番号3)
B3 AAAATGCCAA TTCACGCAGG (配列番号4)
LF TCCGCCGCGT TTAACTTGA (配列番号5)
[ペクチネイタス・セレビシフィラス検出用プライマーセット(PCG1LB1)]
FIP AGTGTCATCC GGTTTAAAAT GCACACGTTG CACGAAATCG GCA (配列番号7)
F3 GCCTATGGAG TAACAAAGGA AC (配列番号8)
BIP CGGCAGCGTT TACGTGAATT GTCTTCACGT TCATCAATCA AGG (配列番号9)
B3 CCCCTTCGTC ATAAAACACT TCT (配列番号10)
LB GCATTTTTAA ATTGCGGTAT TCATATC (配列番号11)
[ペクチネイタス種DSM20764株検出用プライマーセット(PSG1)]
FIP GGAAGCGGAC TGTGGTTCCA GATCCTTCGC TTATGGAATG ACT (配列番号13)
F3 GTGGCGGAAA AATATACGGT AT (配列番号14)
BIP ACCGGATGAC ACTATTTTTA CGGAAACCCG CAATTTAGAA AAGCCAATT (配列番号15)
B3 TCGCGTTCAT CTGTGAGTG (配列番号16)
[メガスフェラ・セレビシェ検出用プライマーセット(MCG1LF1)]
FIP GTGCACGTTT ATCATTCAAG GTAATATGAA TGATACGCTG AAAACACGCC (配列番号18)
F3 GCAGATGAAG ATATTTTCCC TGAT (配列番号19)
BIP AAGTGAAGTA TACTGTTATG AAGGAGGGAC CGTCGTATTG ATTGCCTG (配列番号20)
B3 CATCGTTTTT TTTGCCTTCC AA (配列番号21)
LF CCCTTATTTA AAAAAGCCAA CTCAC (配列番号22)
[ザイモフィラス・パウシボランス検出用プライマーセット(ZPG1)]
FIP AGGCACTTAC TGTATACCCC TTGTGAAGTT GAAGTAAAAA GAGATGGA (配列番号24)
F3 AATCTCTGTT GTAAATGCAC TGA (配列番号25)
BIP TGAAAGTTGT TGGTGATACG GATGAAACAA CCTCATCAAA AATCTCAGC (配列番号26)
B3 CCAATTCTCG CAAACGATGT T (配列番号27)
(c)LAMP増幅反応溶液調製
LAMP法のための遺伝子増幅試薬キットとして、栄研化学社製Loopamp DNA増幅キットを使用した。反応用チューブに、ゲノムDNA溶液:2.5μl、プライマー溶液:2.5μl、2倍濃度反応用緩衝液:12.5μl、Bst DNAポリメラーゼ:1μl、滅菌水:6.5μlを添加し、全量25μlの反応液を調製した。
FIP GTCTTGGTGA TGCCATATTC AAAAGTGTCA GCCAAGCGAT GAAAGT (配列番号1)
F3 GGTGTGTCCG TAGTCAATGC (配列番号2)
BIP TAGGCACTAC CGACAGTACC GCGTAATCGT AGGTTGTTTC AGTGA (配列番号3)
B3 AAAATGCCAA TTCACGCAGG (配列番号4)
LF TCCGCCGCGT TTAACTTGA (配列番号5)
[ペクチネイタス・セレビシフィラス検出用プライマーセット(PCG1LB1)]
FIP AGTGTCATCC GGTTTAAAAT GCACACGTTG CACGAAATCG GCA (配列番号7)
F3 GCCTATGGAG TAACAAAGGA AC (配列番号8)
BIP CGGCAGCGTT TACGTGAATT GTCTTCACGT TCATCAATCA AGG (配列番号9)
B3 CCCCTTCGTC ATAAAACACT TCT (配列番号10)
LB GCATTTTTAA ATTGCGGTAT TCATATC (配列番号11)
[ペクチネイタス種DSM20764株検出用プライマーセット(PSG1)]
FIP GGAAGCGGAC TGTGGTTCCA GATCCTTCGC TTATGGAATG ACT (配列番号13)
F3 GTGGCGGAAA AATATACGGT AT (配列番号14)
BIP ACCGGATGAC ACTATTTTTA CGGAAACCCG CAATTTAGAA AAGCCAATT (配列番号15)
B3 TCGCGTTCAT CTGTGAGTG (配列番号16)
[メガスフェラ・セレビシェ検出用プライマーセット(MCG1LF1)]
FIP GTGCACGTTT ATCATTCAAG GTAATATGAA TGATACGCTG AAAACACGCC (配列番号18)
F3 GCAGATGAAG ATATTTTCCC TGAT (配列番号19)
BIP AAGTGAAGTA TACTGTTATG AAGGAGGGAC CGTCGTATTG ATTGCCTG (配列番号20)
B3 CATCGTTTTT TTTGCCTTCC AA (配列番号21)
LF CCCTTATTTA AAAAAGCCAA CTCAC (配列番号22)
[ザイモフィラス・パウシボランス検出用プライマーセット(ZPG1)]
FIP AGGCACTTAC TGTATACCCC TTGTGAAGTT GAAGTAAAAA GAGATGGA (配列番号24)
F3 AATCTCTGTT GTAAATGCAC TGA (配列番号25)
BIP TGAAAGTTGT TGGTGATACG GATGAAACAA CCTCATCAAA AATCTCAGC (配列番号26)
B3 CCAATTCTCG CAAACGATGT T (配列番号27)
(c)LAMP増幅反応溶液調製
LAMP法のための遺伝子増幅試薬キットとして、栄研化学社製Loopamp DNA増幅キットを使用した。反応用チューブに、ゲノムDNA溶液:2.5μl、プライマー溶液:2.5μl、2倍濃度反応用緩衝液:12.5μl、Bst DNAポリメラーゼ:1μl、滅菌水:6.5μlを添加し、全量25μlの反応液を調製した。
(d)LAMP反応
LAMP反応には、テラメックス社製リアルタイム濁度計LA−200、あるいは栄研化学社製LA−320Cを使用した。反応チューブをセットし、65℃一定(ボンネットは75℃)で反応させ、その間の濁度変化を6秒毎に計測した。濁度が上昇するものを陽性、濁度の上昇が認められないものを陰性とした。
LAMP反応には、テラメックス社製リアルタイム濁度計LA−200、あるいは栄研化学社製LA−320Cを使用した。反応チューブをセットし、65℃一定(ボンネットは75℃)で反応させ、その間の濁度変化を6秒毎に計測した。濁度が上昇するものを陽性、濁度の上昇が認められないものを陰性とした。
(e)各菌種用プライマーの特異性評価
各種偏性嫌気性細菌用プライマーとして開発したLAMPプライマーセット、PFG4LF1、PCG1LB1、PSG1、MCG1LF1、およびZPG1について、各種偏性嫌気性菌標準株を用いてLAMP法で特異性を評価した。その結果、各LAMPプライマーセットは、対象とした菌種の菌株と反応させた場合にDNA増幅に伴う濁度上昇が観察された(表1)。各LAMPプライマーセットは各菌種の標準株のDNAジャイレースサブユニットB遺伝子配列に基づいて設計されたものであるが、同じ菌種に属するそれ以外の菌株を用いた場合もDNA増幅に伴う濁度上昇が観察された(表1)。
各種偏性嫌気性細菌用プライマーとして開発したLAMPプライマーセット、PFG4LF1、PCG1LB1、PSG1、MCG1LF1、およびZPG1について、各種偏性嫌気性菌標準株を用いてLAMP法で特異性を評価した。その結果、各LAMPプライマーセットは、対象とした菌種の菌株と反応させた場合にDNA増幅に伴う濁度上昇が観察された(表1)。各LAMPプライマーセットは各菌種の標準株のDNAジャイレースサブユニットB遺伝子配列に基づいて設計されたものであるが、同じ菌種に属するそれ以外の菌株を用いた場合もDNA増幅に伴う濁度上昇が観察された(表1)。
また、PSG1プライマーはペクチネイタス種DSM20764株用に作成したプライマーであるが、ペクチネイタス・ハイカラエ(Pectinatus haikarae)DSM16980についても同程度の反応時間で増幅が起こった(表1)。ペクチネイタス種DSM20764株の16S rRNA遺伝子の塩基配列(特開2004−121259号公報)をペクチネイタス・ハイカラエの16S rRNA遺伝子の塩基配列(DQ223731)とBLASTにより比較したところ、約1500bpの範囲で99%以上の相同性があり、両者は分類学的に非常に近縁であることが推定された。このように、PSG1プライマーはペクチネイタス種DSM20764株の近縁種も検出できることが示された。
PSG1、ZPG1プライマーは増幅までに50〜60分と他のプライマーに比べて若干長い時間が必要であったが、対象とする菌株に対する特異性は十分なものであった。
さらに、各種乳酸菌標準株、工場分離乳酸菌株を用いて各プライマーセットの特異性を評価した。その結果、各LAMPプライマーセットが検出対象としている菌種以外の菌株ではDNA増幅に伴う濁度上昇は観察されなかった(表2および表3)。これにより、各LAMPプライマーセットは特異性が高いことが確認された。
以上により、偏性嫌気性細菌であるペクチネイタス・フリシンゲンシス、ペクチネイタス・セレビシフィラス、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種、メガスフェラ・セレビシェ、ザイモフィラス・パウシボランスに対して作成した本発明によるプライマーセットは、検査対象とする偏性嫌気性細菌を菌種レベルで正確に検出できることが示された。本発明によるプライマーを用いれば、遺伝子増幅の有無を確認するだけで、これら菌種を同定・検出することができる。
Claims (44)
- 配列番号6の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドからなる、ペクチネイタス・フリシンゲンシス(Pectinatus frisingensis)検出用プローブまたはプライマー。
- 請求項1に記載の二種以上のプライマーからなる、ペクチネイタス・フリシンゲンシス検出用LAMP法プライマーセット。
- FIP、F3、BIP、およびB3、並びに場合によってはLFおよび/またはLBを含んでなり、
FIPが、配列番号6の114〜140番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなり、
BIPが、配列番号6の156〜174番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなる、
請求項2に記載のLAMP法プライマーセット。 - 下記ポリヌクレオチドを含んでなる、請求項2または3に記載のLAMP法プライマーセット:
配列番号1の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(FIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号2の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(F3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号3の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(BIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;および
配列番号4の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(B3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド。 - 配列番号5の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(LF)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドを更に含んでなる、請求項4に記載のLAMP法プライマーセット。
- 請求項1に記載の二種以上のプライマーからなる、ペクチネイタス・フリシンゲンシス検出用PCR法プライマーセット。
- 少なくとも1種のプライマーが、配列番号6の114〜174番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも15塩基のポリヌクレオチドからなる、請求項6に記載のPCR法プライマーセット。
- 配列番号12の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドからなる、ペクチネイタス・セレビシフィラス(Pectinatus cerevisiiphilus)検出用プローブまたはプライマー。
- 請求項8に記載の二種以上のプライマーからなる、ペクチネイタス・セレビシフィラス検出用LAMP法プライマーセット。
- FIP、F3、BIP、およびB3、並びに場合によってはLFおよび/またはLBを含んでなり、
FIPが、配列番号12の183〜207番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなり、
BIPが、配列番号12の244〜258番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなる、
請求項9に記載のLAMP法プライマーセット。 - 下記ポリヌクレオチドを含んでなる、請求項9または10に記載のLAMP法プライマーセット:
配列番号7の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(FIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号8の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(F3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号9の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(BIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;および
配列番号10の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(B3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド。 - 配列番号11の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(LB)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドを更に含んでなる、請求項11に記載のLAMP法プライマーセット。
- 請求項8に記載の二種以上のプライマーからなる、ペクチネイタス・セレビシフィラス検出用PCR法プライマーセット。
- 少なくとも1種のプライマーが、配列番号12の183〜258番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも15塩基のポリヌクレオチドからなる、請求項13に記載のPCR法プライマーセット。
- 配列番号17の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドからなる、ペクチネイタス種DSM20764株(Pectinatus sp. DSM20764)およびその近縁種検出用プローブまたはプライマー。
- 請求項15に記載の二種以上のプライマーからなる、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種検出用LAMP法プライマーセット。
- FIP、F3、BIP、およびB3、並びに場合によってはLFおよび/またはLBを含んでなり、
FIPが、配列番号17の174〜193番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなり、
BIPが、配列番号17の195〜219番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなる、
請求項16に記載のLAMP法プライマーセット。 - 下記ポリヌクレオチドを含んでなる、請求項16または17に記載のLAMP法プライマーセット:
配列番号13の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(FIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号14の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(F3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号15の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(BIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;および
配列番号16の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(B3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド。 - 請求項15に記載の二種以上のプライマーからなる、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種検出用PCR法プライマーセット。
- 少なくとも1種のプライマーが、配列番号17の174〜219番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも15塩基のポリヌクレオチドからなる、請求項19に記載のPCR法プライマーセット。
- 配列番号23の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドからなる、メガスフェラ・セレビシェ(Megasphaera cerevisiae)検出用プローブまたはプライマー。
- 請求項21に記載の二種以上のプライマーからなる、メガスフェラ・セレビシェ検出用LAMP法プライマーセット。
- FIP、F3、BIP、およびB3、並びに場合によってはLFおよび/またはLBを含んでなり、
FIPが、配列番号23の297〜322番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなり、
BIPが、配列番号23の330〜345番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなる、
請求項22に記載のLAMP法プライマーセット。 - 下記ポリヌクレオチドを含んでなる、請求項22または23に記載のLAMP法プライマーセット:
配列番号18の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(FIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号19の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(F3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号20の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(BIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;および
配列番号21の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(B3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド。 - 配列番号22の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(LF)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドを更に含んでなる、請求項24に記載のプライマーセット。
- 請求項21に記載の二種以上のプライマーからなる、メガスフェラ・セレビシェ検出用PCR法プライマーセット。
- 少なくとも1種のプライマーが、配列番号23の297〜345番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも15塩基のポリヌクレオチドからなる、請求項26に記載のPCR法プライマーセット。
- 配列番号28の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドからなる、ザイモフィラス・パウシボランス(Zymophilus paucivorans)検出用プローブまたはプライマー。
- 請求項28に記載の二種以上のプライマーからなる、ザイモフィラス・パウシボランス検出用LAMP法プライマーセット。
- FIP、F3、BIP、およびB3、並びに場合によってはLFおよび/またはLBを含んでなり、
FIPが、配列番号28の123〜144番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなり、
BIPが、配列番号28の148〜165番目の塩基配列を少なくとも有する部分配列またはその部分配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも38塩基のポリヌクレオチドからなる、
請求項29に記載のLAMP法プライマーセット。 - 下記ポリヌクレオチドを含んでなる、請求項29または30に記載のLAMP法プライマーセット:
配列番号24の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(FIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号25の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(F3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;
配列番号26の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(BIP)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド;および
配列番号27の塩基配列で表されるポリヌクレオチド(B3)またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド。 - 請求項28に記載の二種以上のプライマーからなる、ザイモフィラス・パウシボランス検出用PCR法プライマーセット。
- 少なくとも1種のプライマーが、配列番号28の123〜165番目の塩基配列またはその相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも15塩基のポリヌクレオチドからなる、請求項32に記載のPCR法プライマーセット。
- 配列番号6、12、17、23、または28の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド、および配列番号6、12、17、23、または28の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号6、12、17、23、または28の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも10個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド、および配列番号6、12、17、23、または28の塩基配列の連続する少なくとも10個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、請求項1、8、15、21、または28に記載のプローブまたはプライマー。
- 配列番号6、12、17、23、または28の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド、および配列番号6、12、17、23、または28の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号6、12、17、23、または28の塩基配列の相補配列と少なくとも90%の同一性を有するポリヌクレオチド、および配列番号6、12、17、23、または28の塩基配列と少なくとも90%の同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項1、8、15、21、または28に記載のプローブまたはプライマー。
- 配列番号6、12、17、23、または28の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチド、および配列番号6、12、17、23、または28の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号6、12、17、23、または28の塩基配列の相補配列において1または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ配列番号6、12、17、23、または28の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、および配列番号6、12、17、23、または28の塩基配列において1または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ配列番号6、12、17、23、または28の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項1、8、15、21、または28に記載のプローブまたはプライマー。
- 配列番号1〜5、7〜11、13〜16、18〜22、または24〜27の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも10個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、請求項4、5、11、12、18、24、25、および31のいずれか一項に記載のプライマーセット。
- 配列番号1〜5、7〜11、13〜16、18〜22、または24〜27の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも90%の同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項4、5、11、12、18、24、25、および31のいずれか一項に記載のプライマーセット。
- 配列番号1〜5、7〜11、13〜16、18〜22、または24〜27の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも10塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列において、1または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ対応する塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項4、5、11、12、18、24、25、および31のいずれか一項に記載のプライマーセット。
- 請求項1に記載のプローブまたはプライマー、請求項2〜5のいずれか一項に記載のLAMP法プライマーセット、または請求項6または7に記載のPCR法プライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ペクチネイタス・フリシンゲンシスの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法。
- 請求項8に記載のプローブまたはプライマー、請求項9〜12のいずれか一項に記載のLAMP法プライマーセット、または請求項13または14に記載のPCR法プライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ペクチネイタス・セレビシフィラスの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法。
- 請求項15に記載のプローブまたはプライマー、請求項16〜18のいずれか一項に記載のLAMP法プライマーセット、または請求項19または20に記載のPCR法プライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ペクチネイタス種DSM20764株およびその近縁種の検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法。
- 請求項21に記載のプローブまたはプライマー、請求項22〜25のいずれか一項に記載のLAMP法プライマーセット、または請求項26または27に記載のPCR法プライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、メガスフェラ・セレビシェの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法。
- 請求項28に記載のプローブまたはプライマー、請求項29〜31のいずれか一項に記載のLAMP法プライマーセット、または請求項32または33に記載のPCR法プライマーセットを用いて試料中の標的核酸を検出する工程を含んでなる、ザイモフィラス・パウシボランスの検出方法および飲料の混濁可能性の判定方法。
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