WO2005093059A1

WO2005093059A1 - 酵母、乳酸菌及び偏性嫌気性菌検出・識別のためのプライマー及びプライマーセット並びにそれらを用いた検出・識別方法

Info

Publication number: WO2005093059A1
Application number: PCT/JP2005/005404
Authority: WO
Inventors: Youichi Tsuchiya; Masahiro Ogawa; Yasukazu Nakakita
Original assignee: Sapporo Breweries Limited; Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2004-03-25
Filing date: 2005-03-24
Publication date: 2005-10-06
Also published as: JPWO2005093059A1

Abstract

　サッカロミセス（Saccharomyces）属酵母のｒＲＮＡ遺伝子内Ｄ２領域の一部又はその相補鎖から選択される標的領域の塩基配列を増幅し、（ａ）第１のセグメントとして、サッカロミセス属酵母のｒＲＮＡ遺伝子にアニールしてプライマーとして機能する塩基配列と、（ｂ）第２のセグメントとして、第１のセグメントの３’側の塩基配列に相補的であり、第１のセグメントの５’側に位置する塩基配列と、を含むことを特徴とするプライマー。

Description

母、乳酸菌及，，

び・別のためのプライプライセ、

びにそれらを用た検出・法

術分野

０００1 、ビを混濁さる酵母、乳酸菌及び気性菌の別法に関する。、ビを混濁さる酵母、乳酸菌及び気性菌のソム (「 ) 伝子、ジャイスサット伝子ビア伝子に特異なプライに関する。さらに詳しは、、ビを混濁さる酵母、乳酸菌及び気性菌のソム伝子、ジャイスサット伝子ビア伝子の域を増幅能なビを混濁さる微生物出用プライ又はプライセットびにビ

。プライ又はプライセットに関する。、また、前記プライ又はライセットを P法に使用する、ビを混濁さる微生物の・法にも関する。、さらに、法に使用する薬の法、 P法に使用するキット、 P法により酸を増幅さる方法にも関する。

０００2 年のビのビのれは、ビたな価値観をもたらした。した背景ら、ビ製造会社にとては、ビの製造ら出荷までの間を的に短縮するために、ビ又は発泡を混濁さる微生物 ( 下、ビ

。 )の染を確に判定する必要が高まて。

０００3 故を未然に防ぐために、 P C ( P o m e a s e C h a n R e a c o n )や S ( n o e s c e n c e n S h b d z a o n )を用各種出法が既に報告されて (

5など )。しし、れの合も高価な機器を必要とし、また雑な作を伴ため、の生物査に使用するには問題がある。

０００4 1 5 54

2 6 4 899

3 7 289295 4 2 98

5 4 34578 報

発明の

明が解決しよとする課題

０００5 記の題点に、従来術の法とは別の観点ら、簡便速なビの出法及び別法の発が望まれてる。したがて、明の、前記の題を解決し、製品ビ、製品として出来上がる前の醸中の ( 下、製品。 )、又は醸境におけるビの無にて、簡便速な検出・別法を提供することにある。

ビ、程で取り除れるものであるが、もし、れなどが生じ、製品ビに混入した場合には、増殖に引き起こす可能性がある。したがて、降の査で下ビ母が検出された場合、下ビ母もビとして取り扱われる。そこで、明の、ビ母の便速な検出・別法を提供することにある。

さらに、上記法に関連して、明の、 P法を実施するにあたり、要とされる作を簡便施する方法を提供することにある。

題を解決するための

０００6 らは、る課題を解決する検討を重ね、温の伝子応である o o p m e d a e d s o h e m a a m p nn C a o n ( P ) ( W 28 82 ン )を利用することに、ビの・別を簡便速に行得ることを見出した。

０００7 すなわち、ビ伝子、イスサット伝子ビア伝子に特異なプライ又はプライセットを提供する。、また、ビの・法を提供する。

０００8 えば、ビサッカセス ( a c c h o c e s ) 母の合、本

下記 ( ) ( 4 )を提供する。

( )サッカセス母の伝子内 2 域のはその鎖ら選択される標的域の基配列を増幅し、 ( a ) のセグメントとして、サッカセス母の伝子にアプライとして機能する基配列、 ( b ) 2 のセグメントとして、のセグメントの 3側の塩基配列に相補であり、のセグメントの 5側に位置する基配列、を含むことを特徴とするプライ。

( 2 ) 5で表される基配列を含むオクオセットらなり、サッカセス母の伝子の域を増幅能なサッカセス

出用プライセット。

( 3 ) に存在するサッカセス母の出方法であて、サッカセス母の伝子の域を標的とし、 ( 2 )に記載のプライセットで伝子の域を選択的に、 P法により増幅さ、物の無を確認することを特徴とする、サッカセス母の出方法。

( 4 ) を増養し、出現菌ら料を分離し、料に対して、 ( 2 ) に記載のプライセットを用て、 P法により増幅応を行、サッカセス母のソム伝子の域を増幅さ、この物の無を確認することを特徴とする、サッカセス母の。

０００9 、また、ビ伝子イスサット伝子に特異なプライ又はプライセット、ポメラゼ、 d P s、反応を少なとも含むことを特徴とする、ビ中で増殖得る微生物・キットを提供する。

００1０明の定のプライセットを P法に使用すると、対応するビ

伝子、イスサット伝子の域にアする。これを P法で定める増幅件の下で増幅すると、特定の伝子域が増幅される。このよ増幅物の無を、電気簡易出法によて確認する。このよにして、ビを検出することができる。

００11 また、明の出方法を特定の ( えば、ビ酒など )に適用するとき、体ら採取した菌を培養して料を分離し、この料に本明の定のプライセットを作用さ、増幅された物の無を確認する。このよにして、ビを検出することができる。

００12 、また、ビ母のビア伝子に特異なプライ又はプライセット、ポメラゼ、 d P s、反応を少なとも含むことを特徴とするビ母の・法を提供する。

００13 明のビ母に特異なプライセットを P法に使用すると、ビ母のビア伝子の域にアする。これを P法で定める増幅件の下で増幅すると、特定の伝子域が増幅される。このよ増幅物の無を、電気簡易出法によて確認する。このよにして、ビ母を検出することができる。

００14 また、明のビ母の出方法を特定の ( えば、ビ

酒など )に適用するとき、体ら採取した菌を培養して料を分離し、この料に本明の定のプライセットを作用さ、増幅された物の無を確認する。このよにして、ビ母を検出することができる。

００15 降の査におて、明のサッカセス出用プライセ、を用た検査の果が陽性となた場合、検出された母が下ビ母なの生酵母のサッカなの別がな。明のビ

出用プライセットは、ビ母のビア伝子を特異に増幅することが可能であて、野性母のサッカのビア伝子を増幅することはできな。したがて、明のビ出用プライを用ることにより、検出母が下ビ母なの生酵母なの別をすることが可能である。

００16 、さらに、 ( ) P法に使用する薬の法であて、第一の器に P用プライ P用を収容して存し、第二の器にポメラゼネラオイを収容して存することを特徴とする保存法、 ( 2 ) P法に使用するキットであて、 P用プライ P 用を収容する第一の器と、ポメラゼネラオイを収容する第二の器と、を少なとも備えるキット、 ( 3 ) P法により酸を増幅さる方法であて、 P用プライ P用を収容する第一の器に料を添加して混合を調製し、調製した、ポメラゼネラオイを収容した第二の器に添加し、 P法によりを増幅さる方法、 ( 4 ) P法により酸を増幅さる方法であて、 P用プライ P用を収容した第一の器に料を添加して混合を調製し、調製した 95 Cに加熱し、の度を 6 Cまで下げ、ポメラゼネラオイを収容した第二の器に添加し、 P法により酸を増幅さる方法を提供する。００17 P法に使用される酵素 ( ポメラゼ ) のサンプあたり・ 5 極少量であり、操作性が悪題点がある。しし、明の P法に使用する薬の法、 P法に使用するキット P法により酸を増幅する方法によれば、比較的容量の P用プライ

P用、極少量の液及びネラオイが分注されて器に添加することが可能であり、操作性を改善することが可能である。

００18 また、 P 応を開始する前に、料を P用プライ P 用混ぜた 95 Cに加熱し、混合の度を 6 Cまで下げることにより、の性及びプライとのアングを生じさることが可能である。これにより P法による核酸の率を上げることが可能である。

明の

００19 、配列 8 2 54で表される核酸列を含むオクオを組み合わたプライセットを P法に使用して、ビの・別を可能にする。

００2０また、明によるビの出方法は、配列 8 2 54で表される核酸列を含むオクオを組み合わたプライセットを用て、体らられた料に P法を施し、増幅物の無を確認することらなるので、ビの・別を簡易、実に行わしめる。

００21 は、増幅間と濁の係を表わす図である。 ( a ) P e d o c o c c s d a m n o s s 。

B C 8０22 来のゲノムに 95 C 理をしたサンプ ( b ) M a e p h s C e e v s a e B C 8０34 来の。

ゲノムに 95 C 理をしたサンプ ( c ) P e d o c o c c s d a m n o s s B C 8０22 来のゲノムに。

95 C 理をしなたサンプ ( ) 。 M a e p h s C e e v s a e B C 8０34 来のゲノムに C 理をしなたサンフ。

明を実施するための良の

００22 下、本明の適な実施態にて詳細に説明する。

００23 、製品ビ、それらの製品、あるは境に、ビ

が存在する否を判定するために、ビに特異なオクオドプライを用た P法による等温伝子幅により、ビ

伝子、イスサット伝子ビア伝子の域の幅を、増幅物の無を確認することを基礎としてる。００24 なお、本明細書で使用するビとは、ビ又は発泡で増殖能であり、ビ又は発泡に混濁を生じさる微生物のことを。

。とは、ビを含む可能性があり、明の・別法の象となるサンフであるが、特に限定はな。えば、製品ビ、それらの製品あるは境ら直接あるは適当な増養を施したもの等を挙げることができる。また、本明細書で使用するとは、複数ののなで検出象であるビを識別することを指す。また、本明細書で使用するとは、検出した菌がビ否を判定することを指し、検出と同義に使用されることもある。００25 明で使用される A P法は、 P C と異なり、増幅程での度調節 (サイク

)を不要とし、一種類の素を用て、一定温度 ( )で増幅する遺伝子である ( O 28 82 ン、前掲 )。

００26 明のビソム伝子、イスサット伝子もしはビア伝子に特異なプライは、その域を標的として、プを形成する 2 類のプライ ( P P )と 2 類のプライ ( 3 3 )の 4 類のセットとして、設計する。幅する遺伝子の、 5 b 度である。

００27 ここで、内部プライは、標的域の基配列を増幅し、 ( a ) のセグメントとして、標的遺伝子にアプライとして機能する基配列、 ( b ) 2のセグメントとして、のセグメントの 3側の塩基配列に相補であり、のセグメントの 5 側に位置する基配列、を含むことを特徴とする。

００28 また、増幅応の点となるダベ造の 5 プの分に相補な配列を持ププライ ( o o o o )を用ることにより、成の点を増やすことが可能となる。このため、ププライを利用すると、増幅率が上がり、増幅に要する時間を 3 2に短縮することが可能である。そして、外部プライは、標的 3 にある基配列を認識し、点を与える基配列を有する。

００29 プライのオクオの列が決定されると、オクオ身の、の段、例えば、キン製の置を用て実施できる。

００3０明におて、ビの種であるサッカセス母を検出・別するためのプライセッとして、例えば、配列で表されるオリクオ ( プライ )と、配列 2で表されるオクオ ( プライ )と、配列 3で表されるオクオ ( プライ )と、配列 4で表されるオ。クオ ( ププライ )と、配列 5で表されるオクオ ( ライ )と、を含むプライセットを挙げることができる。ここで、サッカセスプライとは、母の伝子内の 2 域を特異に増幅能なプライである。

００31 明におて、ビの種である、ケラ母を検出・別するためのプライセットとして、例えば、配列で表されるオクオ ( プライ )と、配列 6で表されるオクオ ( ププライ )と、配列

表されるオリクオ ( プライと、配列 8で表されるオリクオ ( プライ )と、配列 5で表されるオクオ ( プライと、を含むプライセットを挙げることができる。ここで、、ケラプライとは、母の伝子内の 2 域を特異に増幅能なプライである。

００32 明におて、ビの種であるタノセス母を検出・別するためのプライセットとして、例えば、配列で表されるオクオ部プライ ) 、配列 9で表されるオクオ ( ププライ )と、配列で表されるオリクオ ( プライ )と、配列

で表されるオクオ ( プライ )と、配列 2で表されるオクオ ( ププライ )と、配列 5で表されるオクオ ( プライ )と、を含むプライセットを挙げることができる。ここで、タノセスプライとは、その母の伝子内の 2 域を特異に増幅能なプライである。

００33 明におて、ビの種であるラクス・ビスを検出・別するためのプライセットとして、例えば、配列 3で表されるオクオ ( プライ )と、配列 4で表れるオクオ ( ププライ )と、配列 5で表されるオクオ ( プライ )と、配列 6で表されるオリクオ ( プライ )と、配列 7で表されるオリクオ ( ププライ )と、配列 8で表されるオクオ ( プライ )と、を含むプライセットを挙げることができる。ここで、ラクス・ビスプライとは、その菌のイスサット伝子を特異に増幅能なプライである。

００34 明におて、ビの種であるラクス・ンドネを検出・別するためのプライセットとして、例えば、配列 2 で表されるオクオ ( プライ )と、配列 2 で表れるオクオ ( ププライ )と、配列 22で表されるオクオ ( プライ )と、配列 23で表されるオクオ ( プライ )と、配列 24で表されるオクオ ( ププライと、配列 25で表されるオリクオ ( プライ )と、を含むプライセットを挙げることができる。ここで、ラクス・ンドネプライとは、その菌のイスサット伝子を特異に増幅能なプライである。なお、ラクス・ンドネのイスサット伝子の部の基配列を配列の 9に示す。００35 明におて、ビの種であるラクス・ドノイを検出・別するためのプライセットとして、例えば、配列 26で表されオクオ ( プライ )と、配列 27で表されるオクオ ( ププライ )と、配列 28で表されるオクオ ( プライ )と、配列 29で表されるオクオ ( プライ )と、配列 3 で表されるオクオ ( ププライ )と、配列 3 で表されるオクオ ( プライ )と、を含むプライセットを挙げることができる。ここで、ラクス・ドノイデスプライとは、その菌のイスサッ伝子を特異に増幅能なプライである。

００36 明におて、ビの種であるラクス・サスを検出・別するためのプライセットとして、例えば、配列 32で表されるオクオ ( プライ )と、配列 33で表されるオクオ ( ププライ )と、配列 34で表されるオクオ ( プライ )と、配列 35で表されるオクオ ( プライ )と、配列 36で表されるオクオ ( ププライ )と、配列 37で表されるオクオ ( プライ )と、を含むプライセットを挙げることができる。ここで、ラクス・サスプライとは、その菌の 6 S 伝子を特異に増幅能なプライである。

００37 明におて、ビの種であるディオカス・ダムを検出・別するためのプライセットとして、例えば、配列 32で表されるオ。クオ ( プライ )と、配列 38で表されるオクオ ( ライ )と、配列 39で表されるオクオ ( プライ )と、配列 4 で表されるオクオ ( ププライ )と、配列 37で表されるオクオ ( プライ )と、を含むプライセットを挙げることができる。さらに、別のプライセッのとして、上記プライセットの、配列 38で表されるオクオ ( プライ )のわりに、配列 53で表されるオクオ ( ププライ ) 54で表されるオクオ ( プライ )を含むプライセットを挙げることができる。ここで、ディオカス・ダムサスプライとは、その菌の 6 S 伝子を特異に増幅能なプライである。００38 明におて、ビの種である気性菌イタスを検出・別するためのプライセッとして、例えば、配列 32で表されるオリクオ ( プライ )と、配列 4 で表されるオクオ ( ププライ )と、配列 42で表されるオクオ ( プライ )と、配列 43で表されるオクオ ( プライ )と、配列 37で表されるオクオ ( プライ )と、を含むプライセットを挙げることができる。ここで、イタスプライとは、その菌の 6 S 伝子を特異に増幅能なプライである。

００39 明におて、ビの種である気性菌ィラス・

を検出・別するためのプライセットとして、例えば、配列 32で表されるオクオ ( プライ )と、配列 44で表されるオクオ ( ププライ )と、配列 45で表されるオリクオ ( プライ )と、配列 46で表されるオクオ ( プライ )と、配列 37で表されるオクオ ( プライ )と、を含むプライセットを挙げることができる。ここで、ィラス・プライとは、その菌の 6 S 伝子を特異に増幅能なプライである。

００4０明におて、ビ母を検出・別するためのプライセットとして、例えば、配列 47で表されるオクオ ( プライ )と、配列 48 で表されるオクオ ( プライ )と、配列 49で表されるオクオ ( プライ )と、配列 5 で表されるオクオ ( プライ )と、配列 5 で表されるオクオ ( ププライ )と、配列 52で表されるオリクオ ( ププライと、を含むプライセ、を挙げることができる。ここで、ビプライとは、その母のビア伝子を特異に増幅能なプライである。また、サッカセス母として検出された母が、野生酵母なのビ母なのを識別することが可能なプライである。

００41 に存在するビの、検出しよとするビに応じて上記したプライセットを用て、 P法に従、伝子 ( 常、 6 Cで 5 )を〒。プライセットを個別に、複数のプライセットを組み合わて、又はプライセットてを、の応系に添加し、 P 応を行ことが可能である。体ら採取したそのものを、適当な地中で養し、遠心で集した後、公の法によて株のを分離して、このに対して、前記プライセットを用て、増幅応を行。幅した

物の、 P法での出、又は通常のによて検出できる。者の出には、 ) のによる ( W 838 7 ン )および 2 ) インタカタの認がある。ずれも、により増幅 ( 的遺伝子の )の無を確認することができる。００42 ビ製程の、前の工程における半製品には、ビ

母が含まれてる。したがて、前の工程におては、ビ

プライセットは、サッカセス出用プライを含まなことが好まし００43 降の程における半製品製品には、ビ母が含まれててはならな。したがて、降の程におては、ビ

プライセットは、サッカセス出用プライセットを含んでてよ。そして、ビ出用プライセットを組み合わてることにより、検出された母が、ビ母なの、野生酵母のサッカなのを判定することが可能である。

００44 出された母が下ビ母であれば、程に不具合があることが推定でき、検出された母が野生酵母であれば、充填でのび込みであることが推定できる。このよにして、トラの (ビの所等 )を予測することが可能となる。

００45 P法に使用する薬の、 P用プライ P用を第一の器に収容して存し、ポメラゼネラオイを第二の器に収容して存することで、 P法の操作性を改善することが可能である。また、 P用プライ P用を収容する第一の器と、

ポメラゼネラオイを収容する第二の器と、を少なとも備えるキットを用ることで、 P法の操作を改善することが可能である。

このよ保存法やキットにより、比較的容量の P用プライ

P用、極少量の ( ポメラゼ ) 液及びネラオイが分注されてる器に添加することが可能であり、操作性を改善でき、 P 法を簡便よ施することが可能でなる。

００46 また、 P 応を開始する前に、料を P用プライ P 用混ぜた 95 Cに加熱し、混合の度を 6 Cまで下げることにより、の性及びプライとのアングを生じさることが可能である。これにより P法による核酸の率を上げることができ、 P法を簡便よ施することが可能である。

００47 ここで、 P用プライとは、 P 応に用られるプライを指す。

P用とは、 P 応を〒ためのを指し、その成は特に限定されなが、例えば、 P 応で通常用られてる反応 ( s C ( P 8・ 8 ) 4 C 2 S O 6 ( ) S O 2 e e 2

4 4 2 4

2 e a e 6 d P s 6 2 8 )などである。

００48 下、実施を挙げて明にて更に詳し説明するが、はこれらのに限定されるものではな。

００49 ( ) ビの・

(ゲノムの )

ビを全ビ ( P 4・ 5、苦味 3 、ア 5 )に、母を P ( キス、ペプトン 2 、グス 2 、寒天 2 )に、乳酸 S (ベクトン・ディッキンソン )、気性菌を G (

)にそれぞれ、 3 Cに、 7 4 間、好気嫌気 (タイスペック置、 C 9 5 5 )を行た。養した体ら

2 2 2

出液 P e p M a n ( ) U a (アプライイオステム )を用てゲノムの出を行た。

００5０ ( 生物の ) 法により調製したゲノムにて、 M c o e q ( ) s e m (アプライド・イオステム )を用て微生物のを行た。

００51 ( P法による遺伝子 )

P法による遺伝子 o o p a p キット ( 学社製 )、例えば、 P 応で通常用られてる反応 ( s C ( P 8 8 ) 4 、 C 2 S O 6 ( ) S O 2 e e 2 2 e a e

4 4 2 4

・ 6 d P 2・ 8 )を用て行た。、

8 2 46のオクオを加え、遺伝子の応を行た。 Cで、 9 た。

００52 ( 物の )

応が進むにれ、離してるン酸が、反応中に存在するグネウムイオンングネウムを形成する。幅が起こてる場合のみ白濁する。この観察することで、増幅物の無を判断した。

００53 果をまとめたものが 2である。

００54

ビール L

S a c c a c e s ール

S a c c o c e S s P ビール

c e v s a e 6

e a e e s s ０

x s s 3

・ o a a ０

o a a 2

o c e s c s e s s 9

B・ c s e s 363 8

4a c o ac / s e v s ００

e v s 8 ０3

/ n e 8 2

L e n 6

・ o c o e s 2

4a c o a c s ex o s s 8００

L h e x o s u s 8051

P e c o c c u s a o s s 8０2

o s u s ０2

P e c a u s s e s s 0 9

s s 9 ００

/ e u s c e e v s a e 8０

ビール p 4 5、苦味０、アルコール中で増殖があるものをとした。」法で目により濁が観察されたものを ) とした。

J J a p a n o e c o n f r o o r g a s a a J a p a n

n e k n n e n u s k e s u s 「 n a n

F : n s u e o r F e r e n a n s a a J a p n

サッポロビル

０8 3０

2 ０8 2

3 ０8 28 ００55 2 L h a w a / a

P c e s ００ 8

a a a e 4 9

a s o s s 4 5

P o 3 2

L c o o e s J 1 1 23

L c o o m s J 4

a c s e 96

P e o c o c c s o a s 3 4

P a o a o c I 1 2 3

c e J 1 1 5

e e a s 4 3 b

e 2

e e 3

a a 58

c c c s c s 6 9

P e v o e a v e o a s J 6290

C o s u 5０

Z o s o s ０ 1 3 56

a o c occ u s a e 249

E e o b a c e a e o e e s J 1 35 f

K ebs e a o h o ca

「 n o c a 4００ 2

ヒール p 4 5、苦味 3０、ルコール 5 増殖かなものをとした。」法で目が観察されなかったものをとした。

J J a p a n e n r r g a a a J a p a n

a n e k n n e n k e k F n a n d

F n e r 「 e r e n a n a k a J a p a n

サッポロビール００56 2に示したよに全てのビにおて増幅物が確認され、ビの菌におては増幅確認されなた。

００57 ( 2 ) 面ビ母の

( P法による遺伝子 )

P法による遺伝子 o o p a m p キット ( 社製 )、例えば、 P 応で通常用られてる反応 ( s C ( P 8 8 ) 4 、 C 2 S O 6 ( ) S O 2 e e 2 2 e a e

4 4 2 4

・ 6 d P s 2・ 8 )を用てた。上記、よび 47 52のオクオを加え、遺伝子の応を行た。

Cで、 9 た。

００58 果をまとめたものが 3である。

００59

。 L

a C 「 O C e S S P A

ル C e S S P B

S p C

S c e e v s a e I 0 a

S c e e v s a e I 39 2

生酵母

S c e e v s a e I 1 f

c e e s a e 3 ０

ビール母と野生酵母の u o y a ノル s e ０

a o a l n s a b y n e c r o p h o r G a r y o y p e f r e n g e a s s m o c e h e m 2 4 94 に記載のつた。

0060 3に示したよに、全てのビ母におて増幅物が確認され、野生酵母におて増幅確認されなた。

００61 ( 3 ) P法の改

8 2 46のオクオ P用とをあらじめ入れた容器 ( a )と、ネラオイを添加した容器 ( b )とを用意した。

で調製したゲノムを ( a )の器に添加し、 Cで 3 理したのちの度を Cまで下げ ( 下、この理を C 。 )、液を ( b )の器に添加し、 Cで 2 理して P法による増幅応を行た。率の、 o o a アタイム測定装置 2 (テラメックス式会社製 ) を用て行た。

0062 は、増幅間と濁の係を表わす図である。 ( a )は P e d o c o c c s

d a n o s s B C 8０22 来のゲノムに C 理をしたサンプを ( b )は M a e p h s C e e v s a e B C 8０34 来のゲノムに C 理をしたサンプ ( c ) P e d o c o c c s d a m n o s s B C 8０22 来のゲノムに C 理をしなたサンプを ( d )は M a e p h s C e e v s a e B C 8０34 来のゲノムに C 理をしなたサンプを表わす。００63 に示したよに、 Cで 3 理した後に Cまで温度を下げる理をした場合、この理を行わなた場合と比較して、増幅率が上がることが確認できた。００64 また、このキットした方法を用て、実施 2で使用した全ての株にて、 3で得られた結果と同様の果が得られることを確認した。

００65 M a e p h s C e e v s a e B C 8０34 、。。 b a C s h e x o s s B C 8０5０株及び

a c o b a c s p s e d o c o n o d e s B C 8０57株は、独立政法人業技術合研究所物寄センタ ( 本国城県ば市東 6 ( 便番号 3 5 8566 ) )に 2 3 2 日に寄されており、受託、それぞれ P 8 P 8529 P である。

上の利用，００66 ビ・で増殖、混濁を生じる全ての生物を便に検出・別することが可能となた。サッカセス母として検出された母が、野生酵母なのビ母なのを便に別することが可能となた。したがて、明のプライプライセットびにそれらを用るビ

の出方法は、ビ・の場で品の質管理に役に立。００67 また、ビのは、ワイン日本酒などにおても増殖、品質をさることが知られてる。したがて、明のプライセットおよびそれを用る酵母、乳酸菌及び気性菌の出方法は、ワイン日本酒などのアの場で品の質管理にも役に立。

Claims

求の

サッカセス ( a c c h o c e s ) 母の伝子内 2 域のはその鎖ら選択される標的域の基配列を増幅し、

( a ) のセグメントとして、サッカセス母の伝子にアプライとして機能する基配列、

( b ) 2のセグメントとして、のセグメントの 3側の塩基配列に相補であり、のセグメントの 5側に位置する基配列、

を含むことを特徴とするプライ。

2 5で表される基配列を含むオクオセットらなり、サッカセス母の伝子の域を増幅能なサッカセス出用プライセット。

3 に存在するサッカセス母の出方法であて、サッカセス

母の伝子の域を標的とし、請求 2に記載のプライセットで伝子の域を選択的に、 P法により増幅さ、物の無を確認することを特徴とする、サッカセス母の出方法。

4 を増養し、出現菌ら料を分離し、料に対して、請求

2に記載のプライセットを用て、 P法により増幅応を、サッカセス母のソム伝子の域を増幅さ、この物の無を確認することを特徴とする、サッカセス母の。

5 、 ( D e k k e a ) 母のソム伝子内 2 域のはその鎖ら選択される標的域の基配列を増幅し、

( a ) のセグメントとして、、ケラ母のソム伝子にア

プライとして機能する基配列、

( b ) 2のセグメントとして、のセグメントの 3側の核列に相補であり、のセグメントの 5側に位置する基配列、

を含むことを特徴とするプライ。

6 5 8で表される核酸列を含むオクオセットらなり、、ケラ母の伝子の域を増幅能な、ケラ出用プライセット。

7 に存在する、ケラ母の出方法であて、、ケラ母の

伝子の域を標的とし、請求 6に記載のプライセットでソム伝子の域を選択的に、 P法により増幅さ、物の無を確認することを特徴とする、、ケラ母の出方法。

8 を増養し、出現菌ら料を分離し、料に対して、請求

6に記載のプライセットを用て、 P法により増幅応を行、、ケラ母のソム伝子の域を増幅さ、この物の無を確認、することを特徴とする、、ケラ母の。

9 タノセス ( B e a n o c e s ) 母の伝子内 2 域のはその鎖ら選択される標的域の基配列を増幅し、

( a ) のセグメントとして、タノセス母の伝子にアプライとして機能する基配列、

を含むことを特徴とするプライ。

０、 5 9 2で表される核酸列を含むオクオセットらなり、タノセス母の伝子の域を増幅能なタノセス出用プライセット。

に存在するタノセス母の出方法であて、タノセス母の伝子の域を標的とし、請求に記載のプライセットで

伝子の域を選択的に、 P法により増幅さ、物の無を確認することを特徴とする、タノセス母の出方法。

2 を増養し、出現菌ら料を分離し、料に対して、請求に記載のプライセットを用て、 P法により増幅応を行、タノセス母のソム伝子の域を増幅さ、この物の無を確認することを特徴とする、タノセス母の。

3 ス・ビス ( a c o b a c s b e v s )のイスサット子のはその鎖ら選択される標的域の基配列を増幅し、 ( a ) のセグメントとして、ラクス・ビスのイスサット伝子にアプライとして機能する基配列、

を含むことを特徴とするプライ。

4 3 8で表される核酸列を含むオクオセットらなり、ラクス・ビスのイスサット伝子の域を増幅能なス・ビス出用プライセット。

5 に存在するス・ビスの出方法であて、ラクス・ビスのイスサット伝子の域を標的とし、請求 4に記載のプライセットでイスサット伝子の域を選択的に、 P法により増幅さ、物の無を確認することを特徴とする、ラクス・ビスの出方法。

6 を増養し、出現菌ら料を分離し、料に対して、請求

4に記載のプライセットを用て、 P法により増幅応を行、ラクス・ビスのイスサット伝子の域を増幅さ、この物の無を確認することを特徴とする、ラクス・ビスの

。

7 9で表される基配列を含むス・ンドネ ( a c o b a c s n d n e )のイスサット伝子の。

8 9で表される基配列を含むス・ンドネのイスサット伝子のはその鎖ら選択される標的域の基配列を増幅し、

( a ) のセグメントとして、ラクス・ンドネのイスサット伝子にアプライとして機能する基配列、

( b 2のセグメントとして、のセグメントの 3側の核列に相補であり、のセグメントの 5側に位置する基配列、を含むことを特徴とするプライ。

9 2 25で表される核酸列を含むオクオセットらなり、ラクス・ンドネのイスサット伝子の域を増幅能なス・ンドネ出用プライセット。

2０に存在するス・ンドネの出方法であて、ラクスンドネのイスサット伝子の域を標的とし、請求 9 に記載のプライセットでイスサット伝子の域を選択的に、 P法により増幅さ、物の無を確認することを特徴とする、ラクス・ンドネの出方法。

2 を増養し、出現菌ら料を分離し、料に対して、請求

9に記載のプライセットを用て、 P法により増幅応を行、ラクス・ンドネのイスサット伝子の域を増幅さ、この物の無を確認することを特徴とする、ラクス・ンドネの。

22 ス・ドノイデス ( a c o b a c s p s e d o c o n o d e s )のイスサット伝子のはその鎖ら選択される標的域の基配列を増幅し、

( a ) のセグメントとして、ラクス・ビスのイスサット伝子にアプライとして機能する基配列、

を含むことを特徴とするプライ。

23 26 3 で表される核酸列を含むオクオセットらなり、ラクス・ドノイのイスサット伝子の域を増幅能なス・ドノイデス出用プライセット。

24 に存在するス・ドノイの出方法であて、ラクス・ドノイのイスサ、伝子の域を標的とし、請求 23に記載のプライセットでイスサット伝子の域を選択的に、 P法により増幅さ、物の無を確認することを特徴とする、ラクス・ドノイの出方法。

25 を増養し、出現菌ら料を分離し、料に対して、請求

23に記載のプライセットを用て、 P法により増幅応を行、ラクス・ドノイのイスサット伝子の域を増幅さ、この物の無を確認することを特徴とする、ラクス・ドノイの。

26 ス・サス ( a c o b a c s h e x o s s )の 6 S 伝子の

はその鎖ら選択される標的域の基配列を増幅し、

( a ) のセグメントとして、ラクス・サスの 6 S 伝子にアプライとして機能する基配列、

を含むことを特徴とするプライ。

27 32 37で表される核酸列を含むオクオセットらなり、ラクス・サスの 6 S 伝子の域を増幅能な

ス・サス出用プライセット。

28 に存在するス・サスの出方法であて、ラク

ス・サスの 6 S 伝子の域を標的とし、請求 27に記載のプライセットで 6 S 伝子の域を選択的に、 P法により増幅さ、物の無を確認することを特徴とする、ラクス・サスの出方法。

29 を増養し、出現菌ら料を分離し、料に対して、請求

27に記載のプライセットを用て、 P法により増幅応を行、ラクス・サスの 6 S 伝子の域を増幅さ、この物の無を確認することを特徴とする、ラクス・サスの。 3０ディオ、カス・ダムサス ( P e d o c o c c s d a m n o s s )の 6 S 伝子のはその鎖ら選択される標的域の基配列を増幅し、 ( a ) のセグメントとして、ディオカス・ダムの 6 S 伝子にアプライとして機能する基配列、

を含むことを特徴とするプライ。

3 32 37 4 、又は配列 32 37 39 4 53 54で表される核酸列を含むオクオセットらなり、ディオカス・ダムの 6 S 伝子の域を増幅能なディオカス・ダムサス出用プライセット。

32 に存在するディオカス・ダムの出方法であて、ディオカス・ダムの 6 S R 伝子の域を標的とし、請求 3 に記載のプライセットで 6 S 伝子の域を選択的に、 P法により増幅さ、物の無を確認することを特徴とする、ディオカス・ダムの出方法。

33 を増養し、出現菌ら料を分離し、料に対して、請求

3 に記載のプライセットを用て、 P法により増幅応を、ディオカス・ダムの 6 S 伝子の域を増幅さ、この物の無を確認することを特徴とする、ディオ、カス・ダムの。 34 イタス ( P e c n a s ) 6 S 伝子のはその鎖ら選択される標的域の基配列を増幅し、

( a ) のセグメントとして、イタス 6 S 伝子にア

プライとして機能する基配列、

を含むことを特徴とするプライ。

35 32 37 4 43で表される核酸列を含むオクオセットらなり、イタス 6 S 伝子の域を増幅能なイタス出用プライセット。 36 に存在するイタスの出方法であて、イタス 6 S 伝子の域を標的とし、請求 35に記載のプライセットで 6 S 伝子の域を選択的に、 P法により増幅さ、物の無を確認することを特徴とする、イタスの出方法。

37 を増養し、出現菌ら料を分離し、料に対して、請求

35に記載のプライセットを用て、 P法により増幅応を、イタス 6 S 伝子の域を増幅さ、この物の無を確認することを特徴とする、イタスの。

38 ィラス・ ( M a e p h s C e e v s a e )の 6 S 伝子の

はその鎖ら選択される標的域の基配列を増幅し、

( a ) のセグメントとして、ィラス・の 6 S 伝子にアプライとして機能する基配列、

を含むことを特徴とするプライ。

39 32 37 44 46で表される核酸列を含むオクオセットらなり、ィラス・の 6 S 伝子の域を増幅能なィラス・出用プライセット。

4０に存在するフィラス・の出方法であて、ィラス・の 6 S 伝子の域を標的とし、請求 39に記載のプライセットで 6 S 伝子の域を選択的に、 P法により増幅さ、物の無を確認することを特徴とする、ィラス・の出方法。

4 を増養し、出現菌ら料を分離し、料に対して、請求

39に記載のプライセットを用て、 P法により増幅応を、ィラス・の 6 S 伝子の域を増幅さ、この物の無を確認することを特徴する、ィラス・の。

42 ビ母のビア伝子のはその鎖ら選択される標的域の基配列を増幅し、

( a ) のセグメントとして、ビ母のビア伝子にアプライとして機能する基配列、

を含むことを特徴とするプライ。

43 47 52で表される核酸列を含むオクオセットらなり、ビ母のビア伝子の域を増幅能なビ出用プライセット。

44 に存在するビ母の出方法であて、ビ母のビア伝子の域を標的とし、請求 43に記載のプライセットでメビア伝子の域を選択的に、 P法により増幅さ、物の無を確認することを特徴とする、ビ母の出方法。

45 を増養し、出現菌ら料を分離し、料に対して、請求

43に記載のプライセットを用て、 P法により増幅応を行、ビ母のビア伝子の域を増幅さ、この物の無を確認、することを特徴とする、ビ母の。

46 3 4 8 9 22 23 26 27 3 3 34 35 38 39 42又は 43に記載のプライ又はプライセット、ポメラゼ、 d P s を少なとも含むことを特徴とする、ビ中で増殖得る微生物・キット。

47 P法に使用する薬の法であて、

第一の器に P用プライ P用を収容して存し、第二の器にポメラゼネラオイを収容して存することを特徴とする保存。

48 P法に使用するキットであて、

P用プライ P用を収容する第一の器と、

ポメラゼネラオイを収容する第二の器と、を少なとも備えるキット。

49 P法により酸を増幅さる方法であて、

P用プライ P用を収容する第一の器に料を添加して混合を調製し、

調製した、ポメラゼネラオイを収容した第二の器に添加し、

P法により酸を増幅さる方法。

5０ P法により酸を増幅さる方法であて、

調製した 95 Cに加熱し、の度を 6 Cまで下げ、ポメラゼネラオイを収容した第二の器に添加し、

P法により酸を増幅さる方法。