JP2002233382A - ビール酵母の識別方法 - Google Patents
ビール酵母の識別方法Info
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 醸造用下面ビール酵母と野生酵母を高精度に
識別する方法を提供すること。 【解決手段】 ビール酵母の識別方法であって、酵母Ｌ
ｇ−ＦＬＯ１遺伝子のＮ末端側の一部からなる塩基配列
（Ａ）の下流に酵母第ＩＸ染色体の一部からなる塩基配
列（Ｂ）が連結し、且つ、配列表の配列番号１〜６に記
載の塩基配列を含む新規遺伝子（Ｃ）において、前記塩
基配列（Ａ）と前記塩基配列（Ｂ）との連結部分を増幅
可能なプライマーを合成する第１の工程と、前記第１の
工程で合成したプライマー及び被検体となる酵母から分
離したＤＮＡを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を行う第２の工程
と、前記第２の工程で得られたＰＣＲ増幅産物から該酵
母が醸造用下面ビール酵母か野生酵母かを識別する第３
の工程と、を含むことを特徴とするビール酵母の識別方
法。
識別する方法を提供すること。 【解決手段】 ビール酵母の識別方法であって、酵母Ｌ
ｇ−ＦＬＯ１遺伝子のＮ末端側の一部からなる塩基配列
（Ａ）の下流に酵母第ＩＸ染色体の一部からなる塩基配
列（Ｂ）が連結し、且つ、配列表の配列番号１〜６に記
載の塩基配列を含む新規遺伝子（Ｃ）において、前記塩
基配列（Ａ）と前記塩基配列（Ｂ）との連結部分を増幅
可能なプライマーを合成する第１の工程と、前記第１の
工程で合成したプライマー及び被検体となる酵母から分
離したＤＮＡを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を行う第２の工程
と、前記第２の工程で得られたＰＣＲ増幅産物から該酵
母が醸造用下面ビール酵母か野生酵母かを識別する第３
の工程と、を含むことを特徴とするビール酵母の識別方
法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、醸造用下面ビール
酵母と野生酵母の識別方法に関する。
酵母と野生酵母の識別方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】麦芽アルコール飲料（ビール、発泡酒
等）の醸造工程において、醸造に用いられる以外の野生
酵母、例えば、ハンセヌラ属(Hansenula) 、ブレタノマ
イセス属(Brettanomyces)、カンジタ属(Candida)、醸造
用酵母以外のサッカロミセス属（Saccharomyces）等が
混入することにより、麦芽アルコール飲料の香味特性が
劣化し、場合によっては混濁やオフフレーバーを引き起
こす原因となる。
等）の醸造工程において、醸造に用いられる以外の野生
酵母、例えば、ハンセヌラ属(Hansenula) 、ブレタノマ
イセス属(Brettanomyces)、カンジタ属(Candida)、醸造
用酵母以外のサッカロミセス属（Saccharomyces）等が
混入することにより、麦芽アルコール飲料の香味特性が
劣化し、場合によっては混濁やオフフレーバーを引き起
こす原因となる。
【０００３】従って、麦芽アルコール飲料の醸造工程に
おいて検出された酵母が醸造用下面ビール酵母であるか
否かを迅速に識別することは、酵母の発酵特性や麦芽ア
ルコール飲料の香味特性を維持、管理するために重要で
ある。
おいて検出された酵母が醸造用下面ビール酵母であるか
否かを迅速に識別することは、酵母の発酵特性や麦芽ア
ルコール飲料の香味特性を維持、管理するために重要で
ある。
【０００４】一方、酵母の同定は、これまで伝統的な生
理学的、生化学的、形態学的な手法によって行われてき
たが、迅速性、正確さに欠ける場合が多かった。また、
醸造用下面ビール酵母は、サッカロミセス属(Saccharom
yces)に分類されていたこともあり（現在では、サッカ
ロミセス・パストリアヌスと分類される）、醸造用下面
ビール酵母以外のサッカロミセス属酵母、例えば、サッ
カロミセス・セレビシエ(S. cerevisiae)、サッカロミ
セス・バヤナス(S. bayanus)、サッカロミセス・ジアス
タティカス(S.diastaticus)などを、これまでの伝統的
な手法で醸造用下面ビール酵母から識別することは困難
であった。
理学的、生化学的、形態学的な手法によって行われてき
たが、迅速性、正確さに欠ける場合が多かった。また、
醸造用下面ビール酵母は、サッカロミセス属(Saccharom
yces)に分類されていたこともあり（現在では、サッカ
ロミセス・パストリアヌスと分類される）、醸造用下面
ビール酵母以外のサッカロミセス属酵母、例えば、サッ
カロミセス・セレビシエ(S. cerevisiae)、サッカロミ
セス・バヤナス(S. bayanus)、サッカロミセス・ジアス
タティカス(S.diastaticus)などを、これまでの伝統的
な手法で醸造用下面ビール酵母から識別することは困難
であった。
【０００５】前記の問題点を解決すべく、特開平１１−
５６３６６号公報には、サッカロミセス属のＦＬＯ１遺
伝子の繰り返し配列部分をＰＣＲ法によって検出するこ
とで醸造用酵母と非醸造用酵母を識別する方法が記載さ
れている。しかしながら、ＦＬＯ１遺伝子及びＬｇ−Ｆ
ＬＯ１遺伝子の繰り返し配列は非常に不安定であるとの
報告があり（Yeast, 10: 211-225, 1994.、J. Bacterio
l. 180(24): 6503-6510, 1998.）、場合によっては、繰
り返し配列部分が完全に脱落してしまうことがあった。
従って、特開平１１−５６３６６号公報に記載の方法で
は、醸造用下面ビール酵母でも野生酵母と誤って判定さ
れる場合があるという問題があった。
５６３６６号公報には、サッカロミセス属のＦＬＯ１遺
伝子の繰り返し配列部分をＰＣＲ法によって検出するこ
とで醸造用酵母と非醸造用酵母を識別する方法が記載さ
れている。しかしながら、ＦＬＯ１遺伝子及びＬｇ−Ｆ
ＬＯ１遺伝子の繰り返し配列は非常に不安定であるとの
報告があり（Yeast, 10: 211-225, 1994.、J. Bacterio
l. 180(24): 6503-6510, 1998.）、場合によっては、繰
り返し配列部分が完全に脱落してしまうことがあった。
従って、特開平１１−５６３６６号公報に記載の方法で
は、醸造用下面ビール酵母でも野生酵母と誤って判定さ
れる場合があるという問題があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来技
術の有する課題に鑑みてなされたものであり、醸造用下
面ビール酵母と野生酵母を高精度に識別する方法を提供
することを目的とする。
術の有する課題に鑑みてなされたものであり、醸造用下
面ビール酵母と野生酵母を高精度に識別する方法を提供
することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、Ｌｇ−ＦＬＯ１遺
伝子のＮ末端側の一部からなる塩基配列（Ａ）及び酵母
ＹＩＬ１６９ｃ遺伝子からなる塩基配列（Ｂ）を含む酵
母の新規遺伝子（Ｃ）において、塩基配列（Ａ）と塩基
配列（Ｂ）の結合部分を増幅可能なプライマーセットを
用いることにより、醸造用下面ビール酵母と野生酵母を
高精度に識別可能であることを見出し、本発明を完成す
るに至った。
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、Ｌｇ−ＦＬＯ１遺
伝子のＮ末端側の一部からなる塩基配列（Ａ）及び酵母
ＹＩＬ１６９ｃ遺伝子からなる塩基配列（Ｂ）を含む酵
母の新規遺伝子（Ｃ）において、塩基配列（Ａ）と塩基
配列（Ｂ）の結合部分を増幅可能なプライマーセットを
用いることにより、醸造用下面ビール酵母と野生酵母を
高精度に識別可能であることを見出し、本発明を完成す
るに至った。
【０００８】すなわち、本発明のビール酵母の識別方法
は、ビール酵母の識別方法であって、酵母Ｌｇ−ＦＬＯ
１遺伝子のＮ末端側の一部からなる塩基配列（Ａ）の下
流に酵母第ＩＸ染色体の一部からなる塩基配列（Ｂ）が
連結し、且つ、配列表の配列番号１〜６に記載の塩基配
列を含む新規遺伝子（Ｃ）において、前記塩基配列
（Ａ）と前記塩基配列（Ｂ）との連結部分を増幅可能な
プライマーを合成する第１の工程と、前記第１の工程で
合成したプライマー及び被検体となる酵母から分離した
ＤＮＡを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａ
ｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を行う第２の工程と、前記
第２の工程で得られたＰＣＲ増幅産物から前記酵母が醸
造用下面ビール酵母か野生酵母かを識別する第３の工程
と、を含むことを特徴とするビール酵母の識別方法であ
る。
は、ビール酵母の識別方法であって、酵母Ｌｇ−ＦＬＯ
１遺伝子のＮ末端側の一部からなる塩基配列（Ａ）の下
流に酵母第ＩＸ染色体の一部からなる塩基配列（Ｂ）が
連結し、且つ、配列表の配列番号１〜６に記載の塩基配
列を含む新規遺伝子（Ｃ）において、前記塩基配列
（Ａ）と前記塩基配列（Ｂ）との連結部分を増幅可能な
プライマーを合成する第１の工程と、前記第１の工程で
合成したプライマー及び被検体となる酵母から分離した
ＤＮＡを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａ
ｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を行う第２の工程と、前記
第２の工程で得られたＰＣＲ増幅産物から前記酵母が醸
造用下面ビール酵母か野生酵母かを識別する第３の工程
と、を含むことを特徴とするビール酵母の識別方法であ
る。
【０００９】ここで、前記プライマーとして、配列表の
配列番号７及び８の塩基配列をそれぞれ含む１組のプラ
イマーを用いることが好ましい。
配列番号７及び８の塩基配列をそれぞれ含む１組のプラ
イマーを用いることが好ましい。
【００１０】また、このようなプライマーの塩基配列に
おいて、１若しくは複数の塩基が置換、欠失又は挿入さ
れた塩基配列を有し、且つ、ＰＣＲ用のプライマーとし
ての機能を有するプライマーであることが好ましい。
おいて、１若しくは複数の塩基が置換、欠失又は挿入さ
れた塩基配列を有し、且つ、ＰＣＲ用のプライマーとし
ての機能を有するプライマーであることが好ましい。
【００１１】さらに、本発明のビール酵母の識別方法
は、酵母Ｌｇ−ＦＬＯ１遺伝子のＮ末端側の一部からな
る塩基配列（Ａ）の下流に酵母第ＩＸ染色体の一部から
なる塩基配列（Ｂ）が連結し、且つ、配列表の配列番号
１〜６に記載の塩基配列を含む新規遺伝子（Ｃ）におい
て、前記塩基配列（Ａ）の一部を増幅可能なプライマー
を合成する第１の工程と、前記第１の工程で合成したプ
ライマー及び被検体となる酵母から分離したＤＮＡを用
いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎｒｅａ
ｃｔｉｏｎ）法を行う第２の工程と、前記第２の工程で
得られたＰＣＲ増幅産物から該酵母が醸造用下面ビール
酵母か野生酵母かを識別する第３の工程と、を含むこと
を特徴とするビール酵母の識別方法である。
は、酵母Ｌｇ−ＦＬＯ１遺伝子のＮ末端側の一部からな
る塩基配列（Ａ）の下流に酵母第ＩＸ染色体の一部から
なる塩基配列（Ｂ）が連結し、且つ、配列表の配列番号
１〜６に記載の塩基配列を含む新規遺伝子（Ｃ）におい
て、前記塩基配列（Ａ）の一部を増幅可能なプライマー
を合成する第１の工程と、前記第１の工程で合成したプ
ライマー及び被検体となる酵母から分離したＤＮＡを用
いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎｒｅａ
ｃｔｉｏｎ）法を行う第２の工程と、前記第２の工程で
得られたＰＣＲ増幅産物から該酵母が醸造用下面ビール
酵母か野生酵母かを識別する第３の工程と、を含むこと
を特徴とするビール酵母の識別方法である。
【００１２】ここで、前記プライマーが、配列表の配列
番号９及び１０の塩基配列をそれぞれ含む１組のプライ
マーを用いることが好ましい。
番号９及び１０の塩基配列をそれぞれ含む１組のプライ
マーを用いることが好ましい。
【００１３】また、前記プライマーの塩基配列におい
て、１若しくは複数の塩基が置換、欠失又は挿入された
塩基配列を有し、且つ、ＰＣＲ用のプライマーとしての
機能を有するプライマーであることが好ましい。
て、１若しくは複数の塩基が置換、欠失又は挿入された
塩基配列を有し、且つ、ＰＣＲ用のプライマーとしての
機能を有するプライマーであることが好ましい。
【００１４】
【発明の実施の形態】以下、本発明の好適な実施形態に
ついて詳細に説明する。
ついて詳細に説明する。
【００１５】先ず、本発明の第１の実施形態について説
明する。
明する。
【００１６】本発明の第１の実施形態にかかるビール酵
母の識別方法は、酵母Ｌｇ−ＦＬＯ１遺伝子のＮ末端側
の一部からなる塩基配列（Ａ）の下流に酵母第ＩＸ染色
体の一部からなる塩基配列（Ｂ）が連結し、且つ、配列
表の配列番号１〜６に記載の塩基配列を含む新規遺伝子
（Ｃ）において、該塩基配列（Ａ）と該塩基配列（Ｂ）
との連結部分を増幅可能なプライマーを合成する第１の
工程と、前記第１の工程で合成したプライマー及び被検
体となる酵母から分離したＤＮＡを用いてＰＣＲ（Ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法
を行う第２の工程と、前記第２の工程で得られたＰＣＲ
増幅産物から該酵母が醸造用下面ビール酵母か野生酵母
かを識別する第３の工程と、を含むことを特徴とするビ
ール酵母の識別方法である。
母の識別方法は、酵母Ｌｇ−ＦＬＯ１遺伝子のＮ末端側
の一部からなる塩基配列（Ａ）の下流に酵母第ＩＸ染色
体の一部からなる塩基配列（Ｂ）が連結し、且つ、配列
表の配列番号１〜６に記載の塩基配列を含む新規遺伝子
（Ｃ）において、該塩基配列（Ａ）と該塩基配列（Ｂ）
との連結部分を増幅可能なプライマーを合成する第１の
工程と、前記第１の工程で合成したプライマー及び被検
体となる酵母から分離したＤＮＡを用いてＰＣＲ（Ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法
を行う第２の工程と、前記第２の工程で得られたＰＣＲ
増幅産物から該酵母が醸造用下面ビール酵母か野生酵母
かを識別する第３の工程と、を含むことを特徴とするビ
ール酵母の識別方法である。
【００１７】先ず、本発明の第１の実施形態にかかる第
１の工程について説明する。
１の工程について説明する。
【００１８】本発明にかかる第１の工程は、酵母Ｌｇ−
ＦＬＯ１遺伝子のＮ末端側の一部からなる塩基配列
（Ａ）の下流に酵母第ＩＸ染色体の一部からなる塩基配
列（Ｂ）が連結し、且つ、配列表の配列番号１〜６に記
載の塩基配列を含む新規遺伝子（Ｃ）において、該塩基
配列（Ａ）と該塩基配列（Ｂ）との結合部分を増幅可能
なプライマーセットを合成する工程である。
ＦＬＯ１遺伝子のＮ末端側の一部からなる塩基配列
（Ａ）の下流に酵母第ＩＸ染色体の一部からなる塩基配
列（Ｂ）が連結し、且つ、配列表の配列番号１〜６に記
載の塩基配列を含む新規遺伝子（Ｃ）において、該塩基
配列（Ａ）と該塩基配列（Ｂ）との結合部分を増幅可能
なプライマーセットを合成する工程である。
【００１９】本発明にかかる塩基配列（Ａ）は、酵母Ｌ
ｇ−ＦＬＯ１遺伝子のＮ末端側の一部からなるものであ
る。ここで、酵母Ｌｇ−ＦＬＯ１遺伝子は、酵母に凝集
性を付与する機能を有するＬｇ−ＦＬＯ１タンパク質を
コードする遺伝子であることが報告されている（特開平
８−２６６２８７号公報）。
ｇ−ＦＬＯ１遺伝子のＮ末端側の一部からなるものであ
る。ここで、酵母Ｌｇ−ＦＬＯ１遺伝子は、酵母に凝集
性を付与する機能を有するＬｇ−ＦＬＯ１タンパク質を
コードする遺伝子であることが報告されている（特開平
８−２６６２８７号公報）。
【００２０】また、Ｌｇ−ＦＬＯ１遺伝子のＮ末端部分
は、マルトース、グルコース等の糖によって酵母の凝集
性が阻害される性質に関与する領域であることが報告さ
れている（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０（２４）：
６５０３−６５１０，１９９８）。
は、マルトース、グルコース等の糖によって酵母の凝集
性が阻害される性質に関与する領域であることが報告さ
れている（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０（２４）：
６５０３−６５１０，１９９８）。
【００２１】なお、凝集性とは、発酵過程において分散
していた酵母が集合して細胞表面で付着・結合して塊
（フロック）を形成する性質をいう。醸造用下面ビール
酵母では、発酵液中で細胞が凝集して沈降し液中から速
やかに分離しやすい特性を持った株と、凝集しにくく比
較的長い期間分散・浮遊する特性を持った株とがあり、
前者を「凝集性酵母」、後者を「非凝集性酵母」とい
う。
していた酵母が集合して細胞表面で付着・結合して塊
（フロック）を形成する性質をいう。醸造用下面ビール
酵母では、発酵液中で細胞が凝集して沈降し液中から速
やかに分離しやすい特性を持った株と、凝集しにくく比
較的長い期間分散・浮遊する特性を持った株とがあり、
前者を「凝集性酵母」、後者を「非凝集性酵母」とい
う。
【００２２】次に、本発明にかかる塩基配列（Ｂ）につ
いて説明する。
いて説明する。
【００２３】本発明にかかる塩基配列（Ｂ）は、酵母第
ＩＸ染色体の一部からなる塩基配列であり、その中には
酵母ＹＩＬ１６９ｃ遺伝子の塩基配列が含まれる。酵母
ＹＩＬ１６９ｃ遺伝子は、ｇｌｕｃａｎ １，４−ａｌ
ｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ遺伝子と塩基配列の相
同性が高いが、詳細な機能は未だ不明である。
ＩＸ染色体の一部からなる塩基配列であり、その中には
酵母ＹＩＬ１６９ｃ遺伝子の塩基配列が含まれる。酵母
ＹＩＬ１６９ｃ遺伝子は、ｇｌｕｃａｎ １，４−ａｌ
ｐｈａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ遺伝子と塩基配列の相
同性が高いが、詳細な機能は未だ不明である。
【００２４】本発明にかかる新規遺伝子は、前記塩基配
列（Ａ）及び（Ｂ）を含み、且つ、配列表の配列番号１
〜６に記載の塩基配列を含む。配列表の配列番号１〜６
に記載の塩基配列は、サッカロミセス・セレビシエの第
ＩＸ染色体の左テロメア側からそれぞれ、２１３４０〜
２１８１８ｂｐ（配列番号１）、２１７４３〜２２１９
０ｂｐ(配列番号２)、２２３５３〜２２８６５ｂｐ（配
列番号３）、２２９２６〜２３３９８ｂｐ（配列番号
４）、２３９４４〜２４２１９ｂｐ（配列番号５）、２
４４０８〜２４９９７ｂｐ（配列番号６）に該当する。
なお、前記の各配列をデータベース上のサッカロミセス
・セレビシエ（S. cerevisiae）の第ＩＸ染色体の塩基
配列と比較した場合に、これらの塩基配列間には１〜１
０数塩基の相違が見られるが、この相違は酵母株間の遺
伝子多型によるものか、又は、塩基配列を決定する際の
エラーと考えられ、実質的には同一の遺伝子である。従
って、本発明にかかる新規遺伝子（Ｃ）は、配列表の配
列番号１〜６に記載の塩基配列そのものを含むもののみ
ならず、実質的に同一の遺伝子と見なすことができる範
囲で配列表の塩基配列１〜６の塩基配列と異なっている
塩基配列を有するものであってもよい。具体的には、前
記塩基配列１〜６に含まれる塩基配列において、各塩基
配列中１〜２０塩基が異なっていても、実質的には塩基
配列１〜６を含む遺伝子と同一であるものと見なすこと
ができる。
列（Ａ）及び（Ｂ）を含み、且つ、配列表の配列番号１
〜６に記載の塩基配列を含む。配列表の配列番号１〜６
に記載の塩基配列は、サッカロミセス・セレビシエの第
ＩＸ染色体の左テロメア側からそれぞれ、２１３４０〜
２１８１８ｂｐ（配列番号１）、２１７４３〜２２１９
０ｂｐ(配列番号２)、２２３５３〜２２８６５ｂｐ（配
列番号３）、２２９２６〜２３３９８ｂｐ（配列番号
４）、２３９４４〜２４２１９ｂｐ（配列番号５）、２
４４０８〜２４９９７ｂｐ（配列番号６）に該当する。
なお、前記の各配列をデータベース上のサッカロミセス
・セレビシエ（S. cerevisiae）の第ＩＸ染色体の塩基
配列と比較した場合に、これらの塩基配列間には１〜１
０数塩基の相違が見られるが、この相違は酵母株間の遺
伝子多型によるものか、又は、塩基配列を決定する際の
エラーと考えられ、実質的には同一の遺伝子である。従
って、本発明にかかる新規遺伝子（Ｃ）は、配列表の配
列番号１〜６に記載の塩基配列そのものを含むもののみ
ならず、実質的に同一の遺伝子と見なすことができる範
囲で配列表の塩基配列１〜６の塩基配列と異なっている
塩基配列を有するものであってもよい。具体的には、前
記塩基配列１〜６に含まれる塩基配列において、各塩基
配列中１〜２０塩基が異なっていても、実質的には塩基
配列１〜６を含む遺伝子と同一であるものと見なすこと
ができる。
【００２５】従って、本発明にかかる新規遺伝子は、図
５に示すように全長９．４ｋｂｐで、Ｌｇ−ＦＬＯ１遺
伝子の一部からなる塩基配列（Ａ）の下流にサッカロミ
セス・セレビシエの第ＩＸ染色体の一部からなる塩基配
列が連結した構造を有する遺伝子である。本発明にかか
る醸造用下面ビール酵母においては、この菌種が樹立さ
れる際にゲノムＤＮＡの組換えが起こり、その結果Ｌｇ
−ＦＬＯ１遺伝子の一部と第ＩＸ染色体の一部が結合
し、新規遺伝子（Ｃ）のような塩基配列を有する遺伝子
が生じるに至ったものと本発明者らは考えている。
５に示すように全長９．４ｋｂｐで、Ｌｇ−ＦＬＯ１遺
伝子の一部からなる塩基配列（Ａ）の下流にサッカロミ
セス・セレビシエの第ＩＸ染色体の一部からなる塩基配
列が連結した構造を有する遺伝子である。本発明にかか
る醸造用下面ビール酵母においては、この菌種が樹立さ
れる際にゲノムＤＮＡの組換えが起こり、その結果Ｌｇ
−ＦＬＯ１遺伝子の一部と第ＩＸ染色体の一部が結合
し、新規遺伝子（Ｃ）のような塩基配列を有する遺伝子
が生じるに至ったものと本発明者らは考えている。
【００２６】また、前記新規遺伝子における「該塩基配
列（Ａ）と該塩基配列（Ｂ）との連結部分」とは、前述
したように、前記新規遺伝子はＬｇ−ＦＬＯ１遺伝子の
一部からなる塩基配列（Ａ）の下流にサッカロミセス・
セレビシエの第ＩＸ染色体の一部からなる塩基配列
（Ｂ）が連結した構造を有することから、その結果生じ
た前記塩基配列（Ａ）と前記塩基配列（Ｂ）の連結部分
を指すものである。しかしながら、本発明にかかる新規
遺伝子はその塩基配列の全てが明らかになってはいない
ことから、結合部位の塩基配列は不明である。
列（Ａ）と該塩基配列（Ｂ）との連結部分」とは、前述
したように、前記新規遺伝子はＬｇ−ＦＬＯ１遺伝子の
一部からなる塩基配列（Ａ）の下流にサッカロミセス・
セレビシエの第ＩＸ染色体の一部からなる塩基配列
（Ｂ）が連結した構造を有することから、その結果生じ
た前記塩基配列（Ａ）と前記塩基配列（Ｂ）の連結部分
を指すものである。しかしながら、本発明にかかる新規
遺伝子はその塩基配列の全てが明らかになってはいない
ことから、結合部位の塩基配列は不明である。
【００２７】本発明にかかるプライマーセットは、この
ような結合部位をＰＣＲ法によって増幅可能な位置に設
定されている。すなわち、プライマーセット中の一方の
プライマーは前記新規遺伝子（Ｃ）を構成する塩基配列
（Ａ）上にセンス方向に設定されており、他方のプライ
マーは前記新規遺伝子を構成する塩基配列（Ｂ）上にア
ンチセンス方向に設定されている。
ような結合部位をＰＣＲ法によって増幅可能な位置に設
定されている。すなわち、プライマーセット中の一方の
プライマーは前記新規遺伝子（Ｃ）を構成する塩基配列
（Ａ）上にセンス方向に設定されており、他方のプライ
マーは前記新規遺伝子を構成する塩基配列（Ｂ）上にア
ンチセンス方向に設定されている。
【００２８】このようなプライマーとしては、その塩基
数は特に制限されないが、１０〜５０ｂｐであることが
好ましく、１５〜３０ｂｐであることがより好ましい。
また、その配列としては特に制限はないが、Ｌｇ−ＦＬ
Ｏ１遺伝子上のセンス方向のプライマーが5'-GGAATACTG
CCTCTTGGAGT-3'（配列番号７）であり、第ＩＸ染色体上
のアンチセンス方向のプライマーが5'-GGATTCTTCAGCGTT
GAAGT-3'（配列番号８）であることが好ましい。
数は特に制限されないが、１０〜５０ｂｐであることが
好ましく、１５〜３０ｂｐであることがより好ましい。
また、その配列としては特に制限はないが、Ｌｇ−ＦＬ
Ｏ１遺伝子上のセンス方向のプライマーが5'-GGAATACTG
CCTCTTGGAGT-3'（配列番号７）であり、第ＩＸ染色体上
のアンチセンス方向のプライマーが5'-GGATTCTTCAGCGTT
GAAGT-3'（配列番号８）であることが好ましい。
【００２９】また、本発明にかかるプライマーセット
は、配列番号７及び８のプライマーの塩基配列を含む塩
基配列を有するプライマーからなるプライマーセットで
あることが好ましい。具体的には、例えば、前記プライ
マーには、増幅産物をクローニングする場合を考慮して
制限酵素認識配列が付与されていてもよい。
は、配列番号７及び８のプライマーの塩基配列を含む塩
基配列を有するプライマーからなるプライマーセットで
あることが好ましい。具体的には、例えば、前記プライ
マーには、増幅産物をクローニングする場合を考慮して
制限酵素認識配列が付与されていてもよい。
【００３０】さらに、前記プライマーがＰＣＲ用のプラ
イマーとしての機能を有する限りは、１又は２以上の置
換、欠失又は挿入があるプライマーからなるプライマー
セットであってもよい。ここで、「ＰＣＲ用のプライマ
ーとして機能する」とは、前記新規遺伝子（Ｃ）を鋳型
としてＰＣＲを行った際にプライマーとして機能するこ
とが可能であることを示す。すなわち、通常のＰＣＲ法
の条件下で前記プライマーが前記新規遺伝子にアニーリ
ング可能である限りはその塩基配列としては特に制限は
ない。
イマーとしての機能を有する限りは、１又は２以上の置
換、欠失又は挿入があるプライマーからなるプライマー
セットであってもよい。ここで、「ＰＣＲ用のプライマ
ーとして機能する」とは、前記新規遺伝子（Ｃ）を鋳型
としてＰＣＲを行った際にプライマーとして機能するこ
とが可能であることを示す。すなわち、通常のＰＣＲ法
の条件下で前記プライマーが前記新規遺伝子にアニーリ
ング可能である限りはその塩基配列としては特に制限は
ない。
【００３１】本発明にかかる第１の工程では、前述のよ
うなプライマーをＤＮＡ合成機等で合成すればよい。
うなプライマーをＤＮＡ合成機等で合成すればよい。
【００３２】次に、本発明の第１の実施形態にかかる第
２の工程について説明する。
２の工程について説明する。
【００３３】本発明にかかる第２の工程は、前記第１の
工程で合成したプライマーセット及び被検体となる酵母
から分離したＤＮＡを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を行う工程であ
る。
工程で合成したプライマーセット及び被検体となる酵母
から分離したＤＮＡを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａ
ｓｅｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を行う工程であ
る。
【００３４】被検体となる酵母からＤＮＡを抽出する方
法としては特に制限はなく、公知の方法を用いて抽出を
行えばよい。具体的には、例えば、培養した酵母を遠心
分離により集菌し、Ｈｏｌｍらの方法（Ｇｅｎｅ，４
２：１６９−１７３，１９８６）に従って酵母からＤＮ
Ａを抽出することができる。
法としては特に制限はなく、公知の方法を用いて抽出を
行えばよい。具体的には、例えば、培養した酵母を遠心
分離により集菌し、Ｈｏｌｍらの方法（Ｇｅｎｅ，４
２：１６９−１７３，１９８６）に従って酵母からＤＮ
Ａを抽出することができる。
【００３５】本発明にかかる第２の工程では、抽出した
ＤＮＡを鋳型とし、第１の工程で合成したプライマーを
用いてＰＣＲ法を行う。前記ＰＣＲ法は公知の方法を用
いて行えばよいが、例えば、FEMS Microbiol. Lett., V
ol.108, p259-264 (1993)に記載の方法を用いることが
できる。また、ＰＣＲ法の条件は、用いるプライマーの
Ｔｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）に応
じて適宜設定すればよいが、例えば、変性温度が９０〜
９８℃、アニーリング温度が４０〜７５℃、伸長温度が
６５〜７５℃、サイクル数は１０回以上であることが好
ましい。また、前記変性温度に維持する時間は１０秒〜
２分、アニーリング温度に維持する時間は２０秒〜２
分、伸長温度に維持する時間は１分〜２０分であること
が好ましい。
ＤＮＡを鋳型とし、第１の工程で合成したプライマーを
用いてＰＣＲ法を行う。前記ＰＣＲ法は公知の方法を用
いて行えばよいが、例えば、FEMS Microbiol. Lett., V
ol.108, p259-264 (1993)に記載の方法を用いることが
できる。また、ＰＣＲ法の条件は、用いるプライマーの
Ｔｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）に応
じて適宜設定すればよいが、例えば、変性温度が９０〜
９８℃、アニーリング温度が４０〜７５℃、伸長温度が
６５〜７５℃、サイクル数は１０回以上であることが好
ましい。また、前記変性温度に維持する時間は１０秒〜
２分、アニーリング温度に維持する時間は２０秒〜２
分、伸長温度に維持する時間は１分〜２０分であること
が好ましい。
【００３６】次に、本発明の第１の実施形態にかかる第
３の工程について説明する。
３の工程について説明する。
【００３７】本発明にかかる第３の工程は、前記第２の
工程で得られたＰＣＲ増幅産物から前記酵母が醸造用下
面ビール酵母か野生酵母かを識別する工程である。
工程で得られたＰＣＲ増幅産物から前記酵母が醸造用下
面ビール酵母か野生酵母かを識別する工程である。
【００３８】第２の工程で得られたＰＣＲ産物から前記
酵母が醸造用下面ビール酵母から野生酵母かを識別する
方法としては特に制限はないが、例えば、ＰＣＲ増幅産
物の一部をアガロースゲル電気泳動に供し、検出される
増幅断片の有無によって醸造用下面ビール酵母か否かを
判定することができる。具体的には、例えば、前記の配
列番号７及び８の核酸配列を有するプライマーセットを
用いてＰＣＲ法を行った場合には、被検体となった酵母
が醸造用下面ビール酵母である場合には増幅されたバン
ドが検出されるが、酵母が野生酵母である場合にはバン
ドは検出されない。
酵母が醸造用下面ビール酵母から野生酵母かを識別する
方法としては特に制限はないが、例えば、ＰＣＲ増幅産
物の一部をアガロースゲル電気泳動に供し、検出される
増幅断片の有無によって醸造用下面ビール酵母か否かを
判定することができる。具体的には、例えば、前記の配
列番号７及び８の核酸配列を有するプライマーセットを
用いてＰＣＲ法を行った場合には、被検体となった酵母
が醸造用下面ビール酵母である場合には増幅されたバン
ドが検出されるが、酵母が野生酵母である場合にはバン
ドは検出されない。
【００３９】このように、本発明の第１の実施形態にか
かる方法によれば、醸造用下面ビール酵母の株の相違、
又は、醸造用下面ビール酵母の凝集性の強弱にかかわら
ず下面ビール酵母を検出することが可能となる。
かる方法によれば、醸造用下面ビール酵母の株の相違、
又は、醸造用下面ビール酵母の凝集性の強弱にかかわら
ず下面ビール酵母を検出することが可能となる。
【００４０】次に、本発明にかかる第２の実施形態につ
いて説明する。
いて説明する。
【００４１】本発明の第２の実施形態にかかるビール酵
母の識別方法は、酵母Ｌｇ−ＦＬＯ１遺伝子のＮ末端側
の一部からなる塩基配列（Ａ）の下流に酵母第ＩＸ染色
体の一部からなる塩基配列（Ｂ）が連結し、且つ、配列
表の配列番号１〜６に記載の塩基配列を含む新規遺伝子
（Ｃ）において、該塩基配列（Ａ）の一部を増幅可能な
プライマーを合成する第１の工程と、前記第１の工程で
合成したプライマー及び被検体となる酵母から分離した
ＤＮＡを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉ
ｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を行う第２の工程と、前記第
２の工程で得られたＰＣＲ増幅産物から該酵母が醸造用
下面ビール酵母か野生酵母かを識別する第３の工程と、
を含むことを特徴とするビール酵母の識別方法である。
母の識別方法は、酵母Ｌｇ−ＦＬＯ１遺伝子のＮ末端側
の一部からなる塩基配列（Ａ）の下流に酵母第ＩＸ染色
体の一部からなる塩基配列（Ｂ）が連結し、且つ、配列
表の配列番号１〜６に記載の塩基配列を含む新規遺伝子
（Ｃ）において、該塩基配列（Ａ）の一部を増幅可能な
プライマーを合成する第１の工程と、前記第１の工程で
合成したプライマー及び被検体となる酵母から分離した
ＤＮＡを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉ
ｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を行う第２の工程と、前記第
２の工程で得られたＰＣＲ増幅産物から該酵母が醸造用
下面ビール酵母か野生酵母かを識別する第３の工程と、
を含むことを特徴とするビール酵母の識別方法である。
【００４２】先ず、本発明の第２の実施形態にかかる第
１の工程について説明する。
１の工程について説明する。
【００４３】前記第１の工程は、酵母Ｌｇ−ＦＬＯ１遺
伝子のＮ末端側の一部からなる塩基配列（Ａ）の下流に
酵母第ＩＸ染色体の一部からなる塩基配列（Ｂ）が連結
し、且つ、配列表の配列番号１〜６に記載の塩基配列を
含む新規遺伝子（Ｃ）において、該塩基配列（Ａ）の一
部を増幅可能なプライマーセットを合成する工程であ
る。
伝子のＮ末端側の一部からなる塩基配列（Ａ）の下流に
酵母第ＩＸ染色体の一部からなる塩基配列（Ｂ）が連結
し、且つ、配列表の配列番号１〜６に記載の塩基配列を
含む新規遺伝子（Ｃ）において、該塩基配列（Ａ）の一
部を増幅可能なプライマーセットを合成する工程であ
る。
【００４４】前記新規遺伝子（Ｃ）は、前述した本発明
に第１の実施形態にかかる新規遺伝子（Ｃ）と同一の遺
伝子である。
に第１の実施形態にかかる新規遺伝子（Ｃ）と同一の遺
伝子である。
【００４５】本工程においては、前記新規遺伝子におい
て、塩基配列（Ａ）の一部を増幅可能なプライマーセッ
トを合成する。ここで、「前記塩基配列（Ａ）の一部」
とは、その塩基数については特に制限ないが、５０〜２
００００ｂｐであることが好ましく、１００〜１０００
０ｂｐであることがより好ましい。
て、塩基配列（Ａ）の一部を増幅可能なプライマーセッ
トを合成する。ここで、「前記塩基配列（Ａ）の一部」
とは、その塩基数については特に制限ないが、５０〜２
００００ｂｐであることが好ましく、１００〜１０００
０ｂｐであることがより好ましい。
【００４６】また、このようなプライマーとしては、そ
の塩基数は特に制限されないが、１０〜５０ｂｐである
ことが好ましく、１５〜３０ｂｐであることがより好ま
しい。また、その配列としては特に制限はないが、セン
ス方向のプライマーが5'-AACGTAGCATCAGGAAGTACACAAGCA
TGC-3'（配列番号９）であり、アンチセンス方向のプラ
イマーが5'-GATCGGGTAATAGTAACCGGCGTACATGTA-3'（配列
番号１０）であることが好ましい。
の塩基数は特に制限されないが、１０〜５０ｂｐである
ことが好ましく、１５〜３０ｂｐであることがより好ま
しい。また、その配列としては特に制限はないが、セン
ス方向のプライマーが5'-AACGTAGCATCAGGAAGTACACAAGCA
TGC-3'（配列番号９）であり、アンチセンス方向のプラ
イマーが5'-GATCGGGTAATAGTAACCGGCGTACATGTA-3'（配列
番号１０）であることが好ましい。
【００４７】また、本発明にかかるプライマーセット
は、配列番号９及び１０のプライマーの塩基配列を含む
塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
であることが好ましい。具体的には、例えば、前記プラ
イマーには、増幅産物をクローニングする場合を考慮し
て制限酵素認識配列が付与されていてもよい。
は、配列番号９及び１０のプライマーの塩基配列を含む
塩基配列を有するプライマーからなるプライマーセット
であることが好ましい。具体的には、例えば、前記プラ
イマーには、増幅産物をクローニングする場合を考慮し
て制限酵素認識配列が付与されていてもよい。
【００４８】さらに、前記プライマーがＰＣＲ用のプラ
イマーとしての機能を有する限りは、１又は２以上の置
換、欠失又は挿入があるプライマーからなるプライマー
セットであってもよい。ここで、「ＰＣＲ用のプライマ
ーとして機能する」とは、前記新規遺伝子（Ｃ）を鋳型
としてＰＣＲを行った際にプライマーとして機能するこ
とが可能であることを示す。すなわち、通常のＰＣＲ法
の条件下で前記プライマーが前記新規遺伝子にアニーリ
ング可能である限りはその塩基配列としては特に制限は
ない。
イマーとしての機能を有する限りは、１又は２以上の置
換、欠失又は挿入があるプライマーからなるプライマー
セットであってもよい。ここで、「ＰＣＲ用のプライマ
ーとして機能する」とは、前記新規遺伝子（Ｃ）を鋳型
としてＰＣＲを行った際にプライマーとして機能するこ
とが可能であることを示す。すなわち、通常のＰＣＲ法
の条件下で前記プライマーが前記新規遺伝子にアニーリ
ング可能である限りはその塩基配列としては特に制限は
ない。
【００４９】本発明にかかる第１の工程では、前述のよ
うなプライマーをＤＮＡ合成機等で合成すればよい。
うなプライマーをＤＮＡ合成機等で合成すればよい。
【００５０】本発明の第２の実施形態にかかる第２の工
程は、前記第１の工程で合成したプライマー及び被検体
となる酵母から分離したＤＮＡを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を
行う工程である。
程は、前記第１の工程で合成したプライマー及び被検体
となる酵母から分離したＤＮＡを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を
行う工程である。
【００５１】被検体となる酵母からＤＮＡを抽出する方
法としては特に制限はなく、公知の方法を用いて抽出を
行えばよい。具体的には、例えば、培養した酵母を遠心
分離により集菌し、Ｈｏｌｍらの方法（Ｇｅｎｅ，４
２：１６９−１７３，１９８６）に従って酵母からＤＮ
Ａを抽出することができる。
法としては特に制限はなく、公知の方法を用いて抽出を
行えばよい。具体的には、例えば、培養した酵母を遠心
分離により集菌し、Ｈｏｌｍらの方法（Ｇｅｎｅ，４
２：１６９−１７３，１９８６）に従って酵母からＤＮ
Ａを抽出することができる。
【００５２】本発明にかかる第２の工程では、抽出した
ＤＮＡを鋳型とし、第１の工程で合成したプライマーを
用いてＰＣＲ法を行う。前記ＰＣＲ法は公知の方法を用
いて行えばよいが、例えば、FEMS Microbiol. Lett., V
ol.108, p259-264 (1993)に記載の方法を用いることが
できる。また、ＰＣＲ法の条件としては、用いるプライ
マーのＴｍに応じて適宜設定すればよいが、例えば、変
性温度が９０〜９８℃、アニーリング温度が４０〜７５
℃、伸長温度が６５〜７５℃、サイクル数は１０回以
上、であることが好ましい。また、前記変性温度に維持
する時間は１０秒〜２分、アニーリング温度に維持する
時間は２０秒〜２分、伸長温度に維持する時間は１分〜
２０分であることが好ましい。
ＤＮＡを鋳型とし、第１の工程で合成したプライマーを
用いてＰＣＲ法を行う。前記ＰＣＲ法は公知の方法を用
いて行えばよいが、例えば、FEMS Microbiol. Lett., V
ol.108, p259-264 (1993)に記載の方法を用いることが
できる。また、ＰＣＲ法の条件としては、用いるプライ
マーのＴｍに応じて適宜設定すればよいが、例えば、変
性温度が９０〜９８℃、アニーリング温度が４０〜７５
℃、伸長温度が６５〜７５℃、サイクル数は１０回以
上、であることが好ましい。また、前記変性温度に維持
する時間は１０秒〜２分、アニーリング温度に維持する
時間は２０秒〜２分、伸長温度に維持する時間は１分〜
２０分であることが好ましい。
【００５３】次に、本発明の第２の実施形態にかかる第
３の工程について説明する。
３の工程について説明する。
【００５４】本発明にかかる第３の工程は、前記第２の
工程で得られたＰＣＲ増幅産物から前記酵母が醸造用下
面ビール酵母か野生酵母かを識別する工程である。
工程で得られたＰＣＲ増幅産物から前記酵母が醸造用下
面ビール酵母か野生酵母かを識別する工程である。
【００５５】第２の工程で得られたＰＣＲ産物から前記
酵母が醸造用下面ビール酵母から野生酵母かを識別する
方法としては特に制限はないが、例えば、ＰＣＲ増幅産
物の一部をアガロースゲル電気泳動に供し、検出される
増幅断片の有無によって醸造用下面ビール酵母か否かを
判定することができる。具体的には、例えば、前記の配
列番号９及び１０の核酸配列を有するプライマーセット
を用いてＰＣＲ法を行った場合には、被検体となった酵
母が醸造用下面ビール酵母である場合には増幅されたバ
ンドが検出されるが、酵母が野生酵母である場合にはバ
ンドは検出されない。
酵母が醸造用下面ビール酵母から野生酵母かを識別する
方法としては特に制限はないが、例えば、ＰＣＲ増幅産
物の一部をアガロースゲル電気泳動に供し、検出される
増幅断片の有無によって醸造用下面ビール酵母か否かを
判定することができる。具体的には、例えば、前記の配
列番号９及び１０の核酸配列を有するプライマーセット
を用いてＰＣＲ法を行った場合には、被検体となった酵
母が醸造用下面ビール酵母である場合には増幅されたバ
ンドが検出されるが、酵母が野生酵母である場合にはバ
ンドは検出されない。
【００５６】このように、本発明の第２の実施形態にか
かる方法によれば、醸造用下面ビール酵母の株の相違、
又は、醸造用下面ビール酵母の凝集性の強弱にかかわら
ず下面ビール酵母を検出することが可能となる。
かる方法によれば、醸造用下面ビール酵母の株の相違、
又は、醸造用下面ビール酵母の凝集性の強弱にかかわら
ず下面ビール酵母を検出することが可能となる。
【００５７】
【実施例】以下、実施例及び比較例に基づいて本発明を
より具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定
されるものではない。
より具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定
されるものではない。
【００５８】比較例１ （Ｌｇ−ＦＬＯ１遺伝子による醸造用下面ビール酵母の
識別）醸造用下面ビール酵母と野生酵母を識別するため
以下の実験を行った。全ＤＮＡの抽出は、それぞれ１０
ｍｌのＹＥＰＤ培地（１％酵母エキス、２％バクトペプ
トン、2％グルコース）を用いて、２０℃で、醸造用下
面ビール酵母 10株と野生酵母６株を定常期まで培養し
た後、遠心分離により集菌し、Ｈｏｌｍらの方法（Ｇｅ
ｎｅ、４２：１６９−１７３，１９８６）によって実施
した。
識別）醸造用下面ビール酵母と野生酵母を識別するため
以下の実験を行った。全ＤＮＡの抽出は、それぞれ１０
ｍｌのＹＥＰＤ培地（１％酵母エキス、２％バクトペプ
トン、2％グルコース）を用いて、２０℃で、醸造用下
面ビール酵母 10株と野生酵母６株を定常期まで培養し
た後、遠心分離により集菌し、Ｈｏｌｍらの方法（Ｇｅ
ｎｅ、４２：１６９−１７３，１９８６）によって実施
した。
【００５９】ＰＣＲ法は以下のようにして行った。すな
わち、小林ら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０（２
４）６５０３−６５１０，１９９８）が報告したＬｇ−
ＦＬＯ１遺伝子の塩基配列を基に5'-GGAATACTGCCTCTTGG
AGT-3'（配列番号１１）と5'-TTACCATACGATTGCCAGCA-3'
（配列番号１２）の２種のプライマーを合成した。これ
らのプライマーセットを用い、表１に示した酵母の全Ｄ
ＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。なお、表１中の番号
１〜１６は図１中のレーン番号に該当する。
わち、小林ら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０（２
４）６５０３−６５１０，１９９８）が報告したＬｇ−
ＦＬＯ１遺伝子の塩基配列を基に5'-GGAATACTGCCTCTTGG
AGT-3'（配列番号１１）と5'-TTACCATACGATTGCCAGCA-3'
（配列番号１２）の２種のプライマーを合成した。これ
らのプライマーセットを用い、表１に示した酵母の全Ｄ
ＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。なお、表１中の番号
１〜１６は図１中のレーン番号に該当する。
【００６０】
【表１】
【００６１】ＰＣＲの条件は、９４℃ １分間の後、９
８℃ ２０秒間、６８℃ ３分間 を３０サイクル繰り返
した。なお、ＰＣＲ反応系に加える鋳型ＤＮＡの量は、
試験の再現性を考慮し、全て０．５〜１μｇとした。次
に、この反応生成物の一部を１％アガロース中で電気泳
動し、増幅の有無、又はバンドサイズによって、醸造用
下面ビール酵母か否かを判定した。
８℃ ２０秒間、６８℃ ３分間 を３０サイクル繰り返
した。なお、ＰＣＲ反応系に加える鋳型ＤＮＡの量は、
試験の再現性を考慮し、全て０．５〜１μｇとした。次
に、この反応生成物の一部を１％アガロース中で電気泳
動し、増幅の有無、又はバンドサイズによって、醸造用
下面ビール酵母か否かを判定した。
【００６２】なお、各下面ビール酵母の凝集性の強さ
は、以下の方法で評価した。発酵終了後に遠心分離して
集菌した酵母０．６ｇを２０ｍｌの水道水に懸濁した。
酵母懸濁液９ｍｌに対して１ｍｌの１５００ｐｐｍのカ
ルシウムイオンを含む０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．
５）を加えて、手で上下に振り、凝集の程度を目視で３
段階に判定した。すなわち、Ｆ０：非凝集性、Ｆ１：弱
い凝集性、Ｆ２：並の凝集性、Ｆ３：強い凝集性とし
た。
は、以下の方法で評価した。発酵終了後に遠心分離して
集菌した酵母０．６ｇを２０ｍｌの水道水に懸濁した。
酵母懸濁液９ｍｌに対して１ｍｌの１５００ｐｐｍのカ
ルシウムイオンを含む０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．
５）を加えて、手で上下に振り、凝集の程度を目視で３
段階に判定した。すなわち、Ｆ０：非凝集性、Ｆ１：弱
い凝集性、Ｆ２：並の凝集性、Ｆ３：強い凝集性とし
た。
【００６３】図１に示したように、この方法では、一部
の下面ビール酵母、つまり凝集性が弱化又は消失した株
（Ｆ１又はＦ０）を検出することができず、これらの株
が下面ビール酵母であることを識別することはできなか
った。
の下面ビール酵母、つまり凝集性が弱化又は消失した株
（Ｆ１又はＦ０）を検出することができず、これらの株
が下面ビール酵母であることを識別することはできなか
った。
【００６４】実施例１ （Ｌｇ−ＦＬＯ１遺伝子のＮ末端側の一部を含む新規融
合遺伝子の取得及び塩基配列の部分決定）醸造用下面ビ
ール酵母の凝集性株及び非凝集性株にかかる凝集性遺伝
子のノーザン解析及びサザン解析を実施した。全ＲＮＡ
の抽出及び電気泳動は、凝集性及び非凝集性の下面ビー
ル酵母を比較例１と同様に培養後、Ｓｃｈｍｉｔｔら
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１
８（１０）：３０９１，１９９０）の方法に従って実施
した。電気泳動後のゲル中のＲＮＡは、Ｈｙｂｏｎｄ−
Ｎ＋（アマシャムファルマシアバイオテク社製） を用
いて、添付のプロトコールに従いブロッティングした。
合遺伝子の取得及び塩基配列の部分決定）醸造用下面ビ
ール酵母の凝集性株及び非凝集性株にかかる凝集性遺伝
子のノーザン解析及びサザン解析を実施した。全ＲＮＡ
の抽出及び電気泳動は、凝集性及び非凝集性の下面ビー
ル酵母を比較例１と同様に培養後、Ｓｃｈｍｉｔｔら
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１
８（１０）：３０９１，１９９０）の方法に従って実施
した。電気泳動後のゲル中のＲＮＡは、Ｈｙｂｏｎｄ−
Ｎ＋（アマシャムファルマシアバイオテク社製） を用
いて、添付のプロトコールに従いブロッティングした。
【００６５】また、サザン解析では、比較例１と同様に
抽出した全ＤＮＡを制限酵母ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社
製）で消化後、１％アガロースゲルで電気泳動し、Ｈｙ
ｂｏｎｄ−Ｎ＋（アマシャムファルマシアバイオテク社
製）にブロッティングした。ＲＮＡ又はＤＮＡの検出
は、ＤＩＧシステム（ロッシュ社製）を用いて行った。
抽出した全ＤＮＡを制限酵母ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社
製）で消化後、１％アガロースゲルで電気泳動し、Ｈｙ
ｂｏｎｄ−Ｎ＋（アマシャムファルマシアバイオテク社
製）にブロッティングした。ＲＮＡ又はＤＮＡの検出
は、ＤＩＧシステム（ロッシュ社製）を用いて行った。
【００６６】また、プローブとして用いたＬｇ−ＦＬＯ
１とＦＬＯ１の部分的ＤＮＡ断片は、以下のように調製
した。すなわち、小林ら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１
８０（２４）：６５０３−６５１０，１９９８）の報告
したＬｇ−ＦＬＯ１のＮ末端部分の塩基配列を基に、5'
-AACGTAGCATCAGGAAGTACACAAGCATGC-3'（配列番号９）と
5'-GATCGGGTAATAGTAACCGGCGTACATGTA-3'（配列番号１
０） の２種のプライマーを合成した。これらのプライ
マーを用いて、凝集性の下面ビール酵母の全ＤＮＡを鋳
型としてＰＣＲを行った。一方、渡ら（Ｙｅａｓｔ、１
０：２１１−２２５，１９９４）が報告したＦＬＯ１の
Ｃ末端部分の塩基配列を基に、5'-TTCCAACCAGTAGTTCCAC
C-3'（配列番号１３）と5'-GGTCGCGGAAGCCGTCTGTG-3'
（配列番号１４）の2種のプライマーを合成した。これ
らのプライマーを用いて同様にＰＣＲを行った。なお、
ＰＣＲの条件は比較例1と同様である。
１とＦＬＯ１の部分的ＤＮＡ断片は、以下のように調製
した。すなわち、小林ら（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１
８０（２４）：６５０３−６５１０，１９９８）の報告
したＬｇ−ＦＬＯ１のＮ末端部分の塩基配列を基に、5'
-AACGTAGCATCAGGAAGTACACAAGCATGC-3'（配列番号９）と
5'-GATCGGGTAATAGTAACCGGCGTACATGTA-3'（配列番号１
０） の２種のプライマーを合成した。これらのプライ
マーを用いて、凝集性の下面ビール酵母の全ＤＮＡを鋳
型としてＰＣＲを行った。一方、渡ら（Ｙｅａｓｔ、１
０：２１１−２２５，１９９４）が報告したＦＬＯ１の
Ｃ末端部分の塩基配列を基に、5'-TTCCAACCAGTAGTTCCAC
C-3'（配列番号１３）と5'-GGTCGCGGAAGCCGTCTGTG-3'
（配列番号１４）の2種のプライマーを合成した。これ
らのプライマーを用いて同様にＰＣＲを行った。なお、
ＰＣＲの条件は比較例1と同様である。
【００６７】得られたＤＮＡ断片をＤＩＧシステム（ロ
ッシュ社製）のプロトコールに従って標識後、ノーザン
解析及びサザン解析を行った。
ッシュ社製）のプロトコールに従って標識後、ノーザン
解析及びサザン解析を行った。
【００６８】ノーザン解析の結果、 図２に示したよう
に、Ｌｇ−ＦＬＯ１のＮ末端部分をプローブとした場合
に、凝集性株と非凝集性株において、Ｌｇ−ＦＬＯ１遺
伝子よりも若干低分子側にもシグナルが検出された。本
遺伝子をＬｇ−ＦＬＯ１類似遺伝子とした。一方、ＦＬ
Ｏ１のC末端部分をプローブとした場合には、Ｌｇ−Ｆ
ＬＯ１遺伝子のみが検出された。また、サザン解析の結
果、図３に示したように、凝集性株と非凝集性株におい
て、Ｌｇ−ＦＬＯ１のＮ末端をプローブとして用いた場
合、Ｌｇ−ＦＬＯ１を含む断片よりもやや高分子側にも
シグナルが検出された。このシグナルは、ＦＬＯ１のＣ
末端部分をプローブとしたサザン解析では、検出されな
かったことより、類似遺伝子を含む断片であることが推
察された。
に、Ｌｇ−ＦＬＯ１のＮ末端部分をプローブとした場合
に、凝集性株と非凝集性株において、Ｌｇ−ＦＬＯ１遺
伝子よりも若干低分子側にもシグナルが検出された。本
遺伝子をＬｇ−ＦＬＯ１類似遺伝子とした。一方、ＦＬ
Ｏ１のC末端部分をプローブとした場合には、Ｌｇ−Ｆ
ＬＯ１遺伝子のみが検出された。また、サザン解析の結
果、図３に示したように、凝集性株と非凝集性株におい
て、Ｌｇ−ＦＬＯ１のＮ末端をプローブとして用いた場
合、Ｌｇ−ＦＬＯ１を含む断片よりもやや高分子側にも
シグナルが検出された。このシグナルは、ＦＬＯ１のＣ
末端部分をプローブとしたサザン解析では、検出されな
かったことより、類似遺伝子を含む断片であることが推
察された。
【００６９】ここまでの結果から、本類似遺伝子のＯＲ
Ｆ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）は、分子
量では、Ｌｇ−ＦＬＯ１よりも若干小さく、またＬｇ−
ＦＬＯ１のＮ末端と共通の配列を有するが、Ｃ末部分
は、Ｌｇ−ＦＬＯ１と異なることが推察された。また、
ここではデータは示さないが、Ｎ末端部分の上流に存在
するプロモーター領域よりもさらに上流においても類似
遺伝子は、Ｌｇ−ＦＬＯ１と共通の部位があることがサ
ザン解析によって確認された。
Ｆ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）は、分子
量では、Ｌｇ−ＦＬＯ１よりも若干小さく、またＬｇ−
ＦＬＯ１のＮ末端と共通の配列を有するが、Ｃ末部分
は、Ｌｇ−ＦＬＯ１と異なることが推察された。また、
ここではデータは示さないが、Ｎ末端部分の上流に存在
するプロモーター領域よりもさらに上流においても類似
遺伝子は、Ｌｇ−ＦＬＯ１と共通の部位があることがサ
ザン解析によって確認された。
【００７０】そこで、Ｌｇ−ＦＬＯ１のプロモーター領
域よりさらに上流の配列をプライマーとしたｉｎｖｅｒ
ｓｅ−ＰＣＲを行うことによって類似遺伝子の全長を取
得した。ｉｎｖｅｒｓｅ−ＰＣＲの概要を図４に示す。
域よりさらに上流の配列をプライマーとしたｉｎｖｅｒ
ｓｅ−ＰＣＲを行うことによって類似遺伝子の全長を取
得した。ｉｎｖｅｒｓｅ−ＰＣＲの概要を図４に示す。
【００７１】小林ら（特開平９−２２４６７６号公報）
の報告したＬｇ−ＦＬＯ１のプロモーター領域の塩基配
列より、5'-ACTAGAATTTAGGCACTTTCAACCCAGCCC-3'（配列
番号１５）と5'-GCTGCAACCGGAAGTTATTCCTTCTCCACT-3'
（配列番号１６）の２種のプライマーを合成した。表２
に示した非凝集性下面ビール酵母の全ＤＮＡ２０μｇを
３００ユニットのＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）で消化
し、エタノール沈殿によって回収後、３０μＬのＴＥ緩
衝液に溶解し、３０μＬのスケールでＤＮＡライゲーシ
ョンキット（宝酒造社製）を用いてＤＮＡ断片の自己閉
環化を行った。なお、表２中の番号１〜１６は図８中の
レーン番号に該当する。
の報告したＬｇ−ＦＬＯ１のプロモーター領域の塩基配
列より、5'-ACTAGAATTTAGGCACTTTCAACCCAGCCC-3'（配列
番号１５）と5'-GCTGCAACCGGAAGTTATTCCTTCTCCACT-3'
（配列番号１６）の２種のプライマーを合成した。表２
に示した非凝集性下面ビール酵母の全ＤＮＡ２０μｇを
３００ユニットのＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）で消化
し、エタノール沈殿によって回収後、３０μＬのＴＥ緩
衝液に溶解し、３０μＬのスケールでＤＮＡライゲーシ
ョンキット（宝酒造社製）を用いてＤＮＡ断片の自己閉
環化を行った。なお、表２中の番号１〜１６は図８中の
レーン番号に該当する。
【００７２】
【表２】
【００７３】その結果、図４に示したようなＨｉｎｄＩ
ＩＩで消化された部位が連結した環状分子が形成される
ことが期待される。この反応生成物をエタノール沈殿で
回収し、その１０μg相当を鋳型として、上記のプライ
マーで、ＬＡ−ＰＣＲキット（宝酒造社製）を用いて、
ｉｎｖｅｒｓｅ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９
４℃ １分間の後、９８℃ ２０秒間、６８℃ １０分間
を３０サイクル繰り返した。得られたＰＣＲ産物を１％
アガロースゲルを用いて電気泳動した結果、図５に示し
たような約９．４ｋｂの増幅断片が観察された。なお、
凝集性株からのＬｇ−ＦＬＯ１遺伝子を含むＨｉｎｄＩ
ＩＩ切断断片のＰＣＲ法は、小林ら（特開平８−２６６
２８７号公報）の方法を用いて行った。
ＩＩで消化された部位が連結した環状分子が形成される
ことが期待される。この反応生成物をエタノール沈殿で
回収し、その１０μg相当を鋳型として、上記のプライ
マーで、ＬＡ−ＰＣＲキット（宝酒造社製）を用いて、
ｉｎｖｅｒｓｅ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９
４℃ １分間の後、９８℃ ２０秒間、６８℃ １０分間
を３０サイクル繰り返した。得られたＰＣＲ産物を１％
アガロースゲルを用いて電気泳動した結果、図５に示し
たような約９．４ｋｂの増幅断片が観察された。なお、
凝集性株からのＬｇ−ＦＬＯ１遺伝子を含むＨｉｎｄＩ
ＩＩ切断断片のＰＣＲ法は、小林ら（特開平８−２６６
２８７号公報）の方法を用いて行った。
【００７４】次に、増幅された約９．４ｋｂの断片の制
限酵素地図を作成した。作成した制限酵素地図を図６に
示す。ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断される２．９ｋ
ｂ及び０．６ｋｂの断片をＰｅｒｆｅｃｔｌｙ Ｂｌｕ
ｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ社
製）を用いてクローン化し、塩基配列の決定に用いた。
また、キロシークエンス用ディレーションキット（宝酒
造社製）を用い、添付プロトコールに従って、ディレー
ションミュータントを作製した。塩基配列の決定は、ｄ
Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌ
ｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔ
ｉｏｎキット（アプライドバイオシステムズ社製）を用
い、ＤＮＡシーケンサ（アプライドバイオシステムズ社
製）によって行った。全部で６個所の部分的な塩基配列
の決定を行ったところ、全ての配列が、サッカロミセス
・セレビシエ（S. cerevisiae）の第ＩＸ染色体の左テ
ロメア側から２１３４０ｂｐより下流の配列の配列、す
なわち２１３４０〜２１８１８ｂｐ（配列番号１）、２
１７４３〜２２１９０ｂｐ（配列番号２）、２２３５３
〜２２８６５ｂｐ（配列番号３）、２２９２６〜２３３
９８ｂｐ（配列番号４）、２３９４４〜２４２１９ｂｐ
（配列番号５）、２４４０８〜２４９９７ｂｐ（配列番
号６）と大部分で一致した。なお、前記の各配列をデー
タベース上のサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevis
iae）の第ＩＸ染色体の塩基配列と比較した場合に、こ
れらの塩基配列間には１〜１０数塩基の相違が見られる
が、この相違は酵母株間の遺伝子多型によるものか、塩
基配列を決定する際のエラーと考えられ、実質的には同
一の遺伝子である。
限酵素地図を作成した。作成した制限酵素地図を図６に
示す。ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断される２．９ｋ
ｂ及び０．６ｋｂの断片をＰｅｒｆｅｃｔｌｙ Ｂｌｕ
ｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ社
製）を用いてクローン化し、塩基配列の決定に用いた。
また、キロシークエンス用ディレーションキット（宝酒
造社製）を用い、添付プロトコールに従って、ディレー
ションミュータントを作製した。塩基配列の決定は、ｄ
Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌ
ｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔ
ｉｏｎキット（アプライドバイオシステムズ社製）を用
い、ＤＮＡシーケンサ（アプライドバイオシステムズ社
製）によって行った。全部で６個所の部分的な塩基配列
の決定を行ったところ、全ての配列が、サッカロミセス
・セレビシエ（S. cerevisiae）の第ＩＸ染色体の左テ
ロメア側から２１３４０ｂｐより下流の配列の配列、す
なわち２１３４０〜２１８１８ｂｐ（配列番号１）、２
１７４３〜２２１９０ｂｐ（配列番号２）、２２３５３
〜２２８６５ｂｐ（配列番号３）、２２９２６〜２３３
９８ｂｐ（配列番号４）、２３９４４〜２４２１９ｂｐ
（配列番号５）、２４４０８〜２４９９７ｂｐ（配列番
号６）と大部分で一致した。なお、前記の各配列をデー
タベース上のサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevis
iae）の第ＩＸ染色体の塩基配列と比較した場合に、こ
れらの塩基配列間には１〜１０数塩基の相違が見られる
が、この相違は酵母株間の遺伝子多型によるものか、塩
基配列を決定する際のエラーと考えられ、実質的には同
一の遺伝子である。
【００７５】この結果よりＬｇ−ＦＬＯ１類似遺伝子
は、Ｌｇ−ＦＬＯ１遺伝子とサッカロミセス・セレビシ
エの第ＩＸ染色体の一部との融合遺伝子であることが判
明した。また、第ＩＸ染色体の該当部分には、ＹＩＬ１
６９ｃと称される遺伝子（ｇｌｕｃａｎ １，４−α−
ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅに類似の遺伝子、機能不明）が
存在しており、類似遺伝子のＣ末端側には、図 ７で示
したようにＹＩＬ１６９ｃ遺伝子の大部分が含まれるこ
とが推察された。
は、Ｌｇ−ＦＬＯ１遺伝子とサッカロミセス・セレビシ
エの第ＩＸ染色体の一部との融合遺伝子であることが判
明した。また、第ＩＸ染色体の該当部分には、ＹＩＬ１
６９ｃと称される遺伝子（ｇｌｕｃａｎ １，４−α−
ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅに類似の遺伝子、機能不明）が
存在しており、類似遺伝子のＣ末端側には、図 ７で示
したようにＹＩＬ１６９ｃ遺伝子の大部分が含まれるこ
とが推察された。
【００７６】実施例２ （Ｌｇ−ＦＬＯ１類似遺伝子を利用した醸造用下面ビー
ル酵母の識別）実施例１で得られたＬｇ−ＦＬＯ１類似
遺伝子の一部をＰＣＲ法によって増幅させることによっ
て醸造用下面ビール酵母と野生酵母の識別を行った。Ｐ
ＣＲ法に用いたプライマーとしては、Ｌｇ−ＦＬＯ１遺
伝子のＮ末端部分と類似遺伝子に含まれるＹＩＬ１６９
ｃ遺伝子の一部の配列を利用した。すなわち、5'-GGAAT
ACTGCCTCTTGGAGT-3'（配列番号７）と5'-GGATTCTTCAGCG
TTGAAGT-3'（配列番号８）の2種のプライマーを合成し
た。これらのプライマーを用い、比較例１と同様に酵母
の全ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。図８に示した
ように、この方法では、凝集性を失った下面ビール酵母
でも野生酵母と識別することが可能であった。
ル酵母の識別）実施例１で得られたＬｇ−ＦＬＯ１類似
遺伝子の一部をＰＣＲ法によって増幅させることによっ
て醸造用下面ビール酵母と野生酵母の識別を行った。Ｐ
ＣＲ法に用いたプライマーとしては、Ｌｇ−ＦＬＯ１遺
伝子のＮ末端部分と類似遺伝子に含まれるＹＩＬ１６９
ｃ遺伝子の一部の配列を利用した。すなわち、5'-GGAAT
ACTGCCTCTTGGAGT-3'（配列番号７）と5'-GGATTCTTCAGCG
TTGAAGT-3'（配列番号８）の2種のプライマーを合成し
た。これらのプライマーを用い、比較例１と同様に酵母
の全ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。図８に示した
ように、この方法では、凝集性を失った下面ビール酵母
でも野生酵母と識別することが可能であった。
【００７７】実施例３ Ｌｇ−ＦＬＯ１と前記類似遺伝子の共通部分の塩基配列
を用いて、醸造用下面ビール酵母の野生酵母との識別を
行った。識別の対象となる酵母を表３に示す。なお、表
３中の番号１〜１６は図９中のレーン番号に該当する。
を用いて、醸造用下面ビール酵母の野生酵母との識別を
行った。識別の対象となる酵母を表３に示す。なお、表
３中の番号１〜１６は図９中のレーン番号に該当する。
【００７８】
【表３】
【００７９】ＰＣＲ法に用いたプライマーとして、5'-A
ACGTAGCATCAGGAAGTACACAAGCATGC-3'（配列番号９）と5'
-GATCGGGTAATAGTAACCGGCGTACATGTA-3'（配列番号１０）
を合成した。これらのプライマーセットを用い、比較例
１と同様に酵母の全ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行っ
た。図９に示したように、この場合も凝集性の強弱にか
かわらず、全ての下面ビール酵母の野生酵母との識別が
可能であった。
ACGTAGCATCAGGAAGTACACAAGCATGC-3'（配列番号９）と5'
-GATCGGGTAATAGTAACCGGCGTACATGTA-3'（配列番号１０）
を合成した。これらのプライマーセットを用い、比較例
１と同様に酵母の全ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行っ
た。図９に示したように、この場合も凝集性の強弱にか
かわらず、全ての下面ビール酵母の野生酵母との識別が
可能であった。
【００８０】
【発明の効果】以上説明したように、本発明の醸造用下
面ビール酵母と野生酵母の識別方法によれば、醸造用下
面ビール酵母と野生酵母を高精度に識別する方法を提供
することが可能となる。
面ビール酵母と野生酵母の識別方法によれば、醸造用下
面ビール酵母と野生酵母を高精度に識別する方法を提供
することが可能となる。
【００８１】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> SAPPORO BREWERIES LTD. <120> Method of differentiation for beer yeast <130> 510-1310 <140> <141> <160> 16 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 479 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 agcttcaata aatgcgtgac tggctatagt tgtcggatgg caatccatta ttatgtatac 60 cgtattatta agagtgcaac taggcccgac tataaatcta acactcagat ccttgtactg 120 taatgcatat ttattttttc acaagttgca tgctaataat accatgatat tttttttgaa 180 gccttgaaaa atagttcaag cagctacgat atcatgaatc aatatactca ttgcagccta 240 tgtaatatat ataggttccg tgttaccact cgtttctgat attttcgata tggctacact 300 gggtttttca tgatggaaat gtgatactac cagttccaat atatttatct tccttatcta 360 tatgacacgc tgttatttta gttcaagtca gtgtccaatt gaagtgagtg tcacgtgcac 420 agcgacggta gtcgttggat gtgctaaatg atgttctact gccaatgact gcaaatacg 479 <210> 2 <211> 448 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 gtgagtgtca cgtgcacagc gacggtagtc gttggatgtg ctaaatgatg ttctactgcc 60 aatgactgca aatacgttcg aagagtataa aatcgaagga aacgaattaa gttgccaatc 120 cttactgtaa ctatagcatg ttacatatat gtaccataag tatcacatta aggtttcgcc 180 atagccatgt gcctatatta aatagaaata tcacatggcg atccacggaa tgtttataga 240 ttttcttctt ttgtctatgg cccgggcgag acattaattt atcttgctga aaaattcgaa 300 agttaaaact caattatgcg tgggatttct caattaggtt accagaattt caatctgctg 360 aagaattatg tcttaaaaaa aaaaagtccc gcctcaaaaa agccaaaaag ggtgtgactg 420 tagattgtgg gtaacttgct gtcaaatg 448 <210> 3 <211> 513 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 tgtcggtaag atcttccgta gtggcaggtc aagcagtgag gaagaaagat cggcagtaaa 60 ctgataagag ccaaaccgaa aagtttctta tacgcaaaaa cgctttgaaa attctccaag 120 aatcctattt gaaactctta ttaataaata aagtataaat ataataaagt ttattgtgag 180 acatgtcgcg ataagcaccc cttgtctttc ttggaaggga gaaatttgta atataaagcc 240 aagtgctcag aactcgattt ttttctgacc aaagagcgga agctccacta taaaagttgg 300 gaggtacttt taggttctct taagttcgca tttaattatg gcctgaacga ttttactgtg 360 gacaataagt gaaataagtg tccttaaaat gtgtacgatg tgtacacatc aacctactct 420 ccccttcatt ggcagaagag ggaaccattt catccaaaaa aaataaaaaa ataaaaaaaa 480 tccaaatatt aagctaaaaa aatacttaac tgt 513 <210> 4 <211> 473 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 4 tttaattcct cagttaaaaa aattagttaa agaaagcaag aacgaaaata ccgaccaatg 60 cattcaaagt attggcattc aaacctgcgg caataccctc ggactggaca atgataccag 120 tagaggtctt tattggagct gcagatttgg agtatgtggg aaattgcact agaagccttg 180 gaaatggcag tagtcaatga ggttgcttta gaaccctcag aagtgacagt agtgtatgac 240 tttggagaag cactagttgc gtgacggttg aagtagcttc aggtatttta gaggtgatta 300 tcttgacgtt acaaccattg tcatcaccat tgagtaacca gtggcagtag tgtatgtcct 360 taggggcagc actggtttct gaagtttctg aagtttcttt aggagcttca gaagtgacag 420 tcttggtgct acatccattg tcatcgcact gagtaacagt agcggtggtg tat 473 <210> 5 <211> 276 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 5 aacggtttca gttacaacag caccggttga tgtactaacg tgacatccag tttcatcaca 60 agaagtaata gtggcggtag tggatgagca tggaacggtt gtggtaatgg tatagacgtt 120 accattggag tcagttgtct ctgaacaaga aactacgact gtgcttgtgg catttacata 180 gtctagtgtt gtagtgtaaa cagatgttga accggtaacg gaagcaccaa atgaagtgga 240 agcagttgaa ccggtaacgg aagcaccgaa tgaagt 276 <210> 6 <211> 590 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 6 caatagcaaa agagaattgt ctgttacctt gggttgcagt tagaacaccg gtagtaccgt 60 cataagaaag agcagtgatg tcagcggtaa tggcaatttg gttcttacca gtgtagccaa 120 caacaggaat aggagtggca ttggtttcgg ttgggtcaac agcaaggaca ccttcaccct 180 tgaatacaac agtttggcca gtaaatgtgt cagggtagtg taagtatagg ttaccggaaa 240 tgatgttgac tgtacctttt ccagaaactg gttcgacaat aacataggta cttccattgt 300 ctaggttaat ttcaccgttg tttactgaac cttcagtgtc gtctctacgt tgtagaccgg 360 aaacagaacc accgttgaga atagcgttcg agaaagagaa ggcaccagaa ttggagtatg 420 gagagaaagt gacttcaccc ttcttggact ttgatagact taaggaaatg tcaccactgt 480 tgtcaaaaga acttggagtg aaggagtaga tggatgcaga ggtggcagcg gattcttcag 540 cgttgaagtt accggtcacg tcaaagtttt caccggagat gtcgaattcg 590 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic poly nucleotide <400> 7 ggaatactgc ctcttggagt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic poly nucleotide <400> 8 ggattcttca gcgttgaagt 20 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic poly nucleotide <400> 9 aacgtagcat caggaagtac acaagcatgc 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic poly nucleotide <400> 10 gatcgggtaa tagtaaccgg cgtacatgta 30 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic poly nucleotide <400> 11 ggaatactgc ctcttggagt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic poly nucleotide <400> 12 ttaccatacg attgccagca 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic poly nucleotide <400> 13 ttccaaccag tagttccacc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic poly nucleotide <400> 14 ggtcgcggaa gccgtctgtg 20 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic poly nucleotide <400> 15 actagaattt aggcactttc aacccagccc 30 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic poly nucleotide <400> 16 gctgcaaccg gaagttattc cttctccact 30
【図１】配列番号１０及び１１の塩基配列を有するプラ
イマーを用いて醸造用下面ビール酵母と野生酵母を識別
した場合の電気泳動写真である。
イマーを用いて醸造用下面ビール酵母と野生酵母を識別
した場合の電気泳動写真である。
【図２】Ｌｇ−ＦＬＯ１類似遺伝子のノーザン解析結果
を示すオートラジオグラムである。
を示すオートラジオグラムである。
【図３】Ｌｇ−ＦＬＯ１類似遺伝子のサザン解析結果を
示すオートラジオグラムである。
示すオートラジオグラムである。
【図４】Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲの概要を示す模式図で
ある。
ある。
【図５】Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲによって得られたＬｇ
−ＦＬＯ１類似遺伝子の電気泳動写真である。
−ＦＬＯ１類似遺伝子の電気泳動写真である。
【図６】Ｌｇ−ＦＬＯ１類似遺伝子の制限酵素地図を示
す模式図である。
す模式図である。
【図７】Ｌｇ−ＦＬＯ１類似遺伝子上に存在するＹＩＬ
１６９ｃ遺伝子の位置を示す模式図である。
１６９ｃ遺伝子の位置を示す模式図である。
【図８】配列番号６及び７に記載の塩基配列を有するプ
ライマーを用いて醸造用下面ビール酵母と野生酵母を識
別した場合の電気泳動写真である。
ライマーを用いて醸造用下面ビール酵母と野生酵母を識
別した場合の電気泳動写真である。
【図９】配列番号８及び９に記載の塩基配列を有するプ
ライマーを用いて醸造用下面ビール酵母と野生酵母を識
別した場合の電気泳動写真である。
ライマーを用いて醸造用下面ビール酵母と野生酵母を識
別した場合の電気泳動写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA09 HA11 4B063 QA18 QQ07 QQ15 QQ16 QQ42 QR08 QR42 QR55 QR62 QS03 QS16 QS25 QS34 QX02
Claims (10)
- 【請求項１】 ビール酵母の識別方法であって、 酵母Ｌｇ−ＦＬＯ１遺伝子のＮ末端側の一部からなる塩
基配列（Ａ）の下流に酵母第ＩＸ染色体の一部からなる
塩基配列（Ｂ）が連結し、且つ、配列表の配列番号１〜
６に記載の塩基配列を含む新規遺伝子（Ｃ）において、
該塩基配列（Ａ）と該塩基配列（Ｂ）との連結部分を増
幅可能なプライマーを合成する第１の工程と、 前記第１の工程で合成したプライマー及び被検体となる
酵母から分離したＤＮＡを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を行う第
２の工程と、 前記第２の工程で得られたＰＣＲ増幅産物から該酵母が
醸造用下面ビール酵母か野生酵母かを識別する第３の工
程と、を含むことを特徴とするビール酵母の識別方法。 - 【請求項２】 前記プライマーが、配列表の配列番号７
及び８の塩基配列をそれぞれ含む１組のプライマーであ
ることを特徴とする請求項１に記載のビール酵母の識別
方法。 - 【請求項３】 前記プライマーの塩基配列において、１
若しくは複数の塩基が置換、欠失又は挿入された塩基配
列を有し、且つ、ＰＣＲ用のプライマーとしての機能を
有することを特徴とする請求項２に記載のビール酵母の
識別方法。 - 【請求項４】 ビール酵母の識別方法であって、 酵母Ｌｇ−ＦＬＯ１遺伝子のＮ末端側の一部からなる塩
基配列（Ａ）の下流に酵母第ＩＸ染色体の一部からなる
塩基配列（Ｂ）が連結し、且つ、配列表の配列番号１〜
６に記載の塩基配列を含む新規遺伝子（Ｃ）において、
該塩基配列（Ａ）の一部を増幅可能なプライマーを合成
する第１の工程と、 前記第１の工程で合成したプライマー及び被検体となる
酵母から分離したＤＮＡを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を行う第
２の工程と、 前記第２の工程で得られたＰＣＲ増幅産物から該酵母が
醸造用下面ビール酵母か野生酵母かを識別する第３の工
程と、を含むことを特徴とするビール酵母の識別方法。 - 【請求項５】 前記プライマーが、配列表の配列番号９
及び１０の塩基配列をそれぞれ含む１組のプライマーで
あることを特徴とする請求項４に記載のビール酵母の識
別方法。 - 【請求項６】 前記プライマーの塩基配列において、１
若しくは複数の塩基が置換、欠失又は挿入された塩基配
列を有し、且つ、ＰＣＲ用のプライマーとしての機能を
有することを特徴とする請求項５に記載のビール酵母の
識別方法。 - 【請求項７】 配列表の配列番号７及び８に記載の塩基
配列をそれぞれ含むことを特徴とするプライマーセッ
ト。 - 【請求項８】 前記プライマーセットの塩基配列におい
て、１若しくは複数の塩基が置換、欠失又は挿入された
塩基配列を有し、且つ、プライマーとしての機能を有す
ることを特徴とする請求項７に記載のプライマーセッ
ト。 - 【請求項９】 配列表の配列番号９及び１０に記載の塩
基配列をそれぞれ含むことを特徴とするプライマーセッ
ト。 - 【請求項１０】前記プライマーセットの塩基配列におい
て、１若しくは複数の塩基が置換、欠失又は挿入された
塩基配列を有し、且つ、プライマーとしての機能を有す
ることを特徴とする請求項９に記載のプライマーセッ
ト。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001034113A JP2002233382A (ja) | 2001-02-09 | 2001-02-09 | ビール酵母の識別方法 |
| US10/067,241 US7504239B2 (en) | 2001-02-09 | 2002-02-07 | Method of differentiating beer yeast |
| EP02002058A EP1231283A3 (en) | 2001-02-09 | 2002-02-08 | Method of differentiating beer yeast |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001034113A JP2002233382A (ja) | 2001-02-09 | 2001-02-09 | ビール酵母の識別方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002233382A true JP2002233382A (ja) | 2002-08-20 |
Family
ID=18897771
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001034113A Pending JP2002233382A (ja) | 2001-02-09 | 2001-02-09 | ビール酵母の識別方法 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP1231283A3 (ja) |
| JP (1) | JP2002233382A (ja) |
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| WO2005093059A1 (ja) * | 2004-03-25 | 2005-10-06 | Sapporo Breweries Limited | 酵母、乳酸菌及び偏性嫌気性菌検出・識別のためのプライマー及びプライマーセット並びにそれらを用いた検出・識別方法 |
| DE112007002345T5 (de) | 2006-10-05 | 2010-12-16 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Primersatz zur Verwendung in der Detektion eines Hefepilzes der Gattung Saccharomyces |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP3643404B2 (ja) | 1995-02-01 | 2005-04-27 | 麒麟麦酒株式会社 | 酵母に凝集性を付与する遺伝子及びその遺伝子産物 |
| JPH09224676A (ja) | 1996-02-27 | 1997-09-02 | Kirin Brewery Co Ltd | 新規プロモーター |
| IL156002A0 (en) * | 1997-02-12 | 2003-12-23 | Eugene Y Chan | Methods and products for analyzing polymers |
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-
2001
- 2001-02-09 JP JP2001034113A patent/JP2002233382A/ja active Pending
-
2002
- 2002-02-07 US US10/067,241 patent/US7504239B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-02-08 EP EP02002058A patent/EP1231283A3/en not_active Withdrawn
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| JPWO2005093059A1 (ja) * | 2004-03-25 | 2008-02-14 | サッポロビール株式会社 | 酵母、乳酸菌及び偏性嫌気性菌検出・識別のためのプライマー及びプライマーセット並びにそれらを用いた検出・識別方法 |
| DE112007002345T5 (de) | 2006-10-05 | 2010-12-16 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Primersatz zur Verwendung in der Detektion eines Hefepilzes der Gattung Saccharomyces |
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| US7504239B2 (en) | 2009-03-17 |
| US20030104405A1 (en) | 2003-06-05 |
| EP1231283A2 (en) | 2002-08-14 |
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