CN1965089A - 用于基于pcr的克隆系研究的核酸扩增引物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于PCR的克隆系研究，所述研究可用于早期诊断淋巴组织增生性疾病等。提供了一组核酸扩增引物，包括正向引物或其变体，以及反向引物或其变体，所述引物能够扩增选自下组的重排：VH－JH IGH重排，DH－JH IGH重排，Vκ－Jκ IGK重排，Vκ/内含子－Kde IGK重排，Vλ－Jλ IGL重排，Vβ－Jβ TCRB重排，Dβ－Jβ TCRB重排，Vγ－Jγ TCRG重排，Vδ－Jδ TCRD重排，Dδ－Dδ TCRD重排，Dδ－Jδ TCRD重排，Vδ－Dδ TCRD重排，或所述引物可扩增选自t(11；14)(BCL1－IGH)或t(14；18)(BCL2－IGH)的转位。所述引物可用于基于PCR的克隆系研究中以早期诊断淋巴组织增生性疾病及检测微小残留病变(MRD)。还提供了包含本发明的至少一组引物的试剂盒。

Description

用于基于PCR的克隆系研究的核酸扩增引物
本发明涉及用于早期诊断淋巴组织增生性疾病(lymphoproliferativedisorder)的基于PCR的克隆系(PCR-based clonality)研究。在大多数可疑患有淋巴组织增生性疾病的患者中，组织形态学或细胞形态学以及免疫组织学或流式细胞免疫分型(flow cytometric immunophenotyping)可区分恶性与反应性(reactive)淋巴组织增生。然而，在5-10％的病例中，进行诊断较困难。淋巴组织恶性疾病的诊断可由克隆系评估支持，所述评估基于通常所有恶性细胞都具有共同的克隆起源的事实。
大多数淋巴组织恶性疾病属于B-细胞系(90-95％)并且仅有少数属于T-细胞系(5-7％)或NK-细胞系(＜2％)。急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblasticleukemia)(所有)的15-20％的病例是T-细胞来源的，但成熟淋巴系统白血病(mature lymphoid leukemia)和非霍杰金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)(NHL)的组中T-细胞恶性疾病相对较少，但其中具体的亚组诸如皮肤淋巴瘤(cutaneous lymphoma)除外(表1)。因此，大多数淋巴系统恶性疾病(＞98％)含有以相同的(克隆的)方式进行重排的免疫球蛋白(Ig)和/或T-细胞受体(TCR)基因，并且在25-30％的病例中，还发现了明确的(well-defined)染色体异常，所有这些均可作为克隆系的标志物。1，2
Ig和TCR基因的基因座含有许多不同的可变(variable)(V)，多样性(diversity)(D)，和连接(joining)(J)基因片段，其在早期淋巴细胞分化中经历重排过程。3，4V-D-J重排由重组酶复合物介导，其中RAG1和RAG2蛋白通过识别并在重组信号序列(recombination signal sequence)(RSS)切割DNA而起重要作用，所述RSS位于V基因片段下游，D基因片段两侧，以及J基因片段上游(图1)。不适宜的RSS减少或完全阻止重排。
所述重排过程通常从D到J重排开始，然后对于以下基因为V到D-J重排：Ig重链(IGH)，TCRβ(TCRB)，和TCRδ(TCRD)基因(图1)，或对于以下基因为直接V到J重排：Igκ(IGK)，Igλ(IGL)，TCRα(TCRA)和TCRγ(TCRG)基因。发生重排的基因片段之间的序列通常以环状切除产物(circularexcision product)的形式(也称TCR切除环(TREC)或B细胞受体切除环(BREC))(图1)的形式缺失。
淋巴系统早期分化过程中Ig和TCR基因重排通常遵循等级顺序(hierarchical order)。B-细胞分化过程中：IGH基因首先发生重排，然后是IGK，可能导致IGH/κ表达或然后是IGK缺失和IGL重排，可能然后是IGH/λ表达。5这表明实际上所有Igλ+B-细胞具有单等位基因(monoallelic)或双等位基因(biallelic)IGK基因缺失。T-细胞分化过程中：TCRD基因首先发生重排，然后是TCRG，可能导致TCRγδ表达或然后是进一步TCRB重排和TCRD缺失以及随后的TCRA重排，可能然后是TCRαβ表达。淋巴系统恶性疾病中的Ig和TCR基因重排模式通常适合上述等级顺序，但也可见到异常重排模式，具体是在所有中。6
V，D和J基因片段的不同组合代表所谓的组合库(combinatorialrepertoire)(表2)，估计其包含～2×106Ig分子，～3×106TCRαβ分子以及～5×103TCRγδ分子。在V，D和J基因片段的接点，在重排过程中出现缺失和随机插入，导致连接区的高度多样性，其对于Ig和TCR分子的总库有很大贡献，估计为＞1012。5
成熟B-淋巴细胞还在滤泡中心进行抗原识别时通过体细胞高变(somatic hypermutation)来扩大其Ig库，所述体细胞高变过程导致Ig分子的亲和力成熟。体细胞高变过程集中在IGH的V-(D-)J外显子以及Ig轻链基因，并涉及单个核苷酸突变且有时涉及核苷酸插入或缺失。体细胞-突变的(somatic所有y mutated)Ig基因也见于滤泡性或后-滤泡性(post-follicular)来源的的成熟B细胞恶性疾病。7
功能重排的Ig和TCR基因导致Ig、TCRαβ或TCRγδ分子的表面膜表达(surface membrane expression)。根据淋巴细胞或淋巴细胞克隆仅表达一个类型的Ig或TCR分子这一观点，成熟淋巴系统恶性疾病的克隆重排的基因可在蛋白水平检出。长期以来，检测单个Ig轻链表达(IGK或IgS)已经用于区分反应性(多克隆)B-淋巴细胞(正常Igκ/Igλ比：0.7-2.8)与异常(克隆的)B-淋巴细胞(Igκ/Igλ比为＞4.0或＜0.5)。8-10在大多数(＞90％)成熟B淋巴细胞恶性疾病中，单个Ig轻链表达可由恶性疾病的克隆来源支持。
同样，当与适宜的参照值比较时，许多不同抗各种TCR链可变区的抗体允许检测单型(monotypic)Vβ，Vγ和VS区。11-16在利用抗不同Vβ家族(表2)的20-25种抗体解释单型Vβ结果时，应理解临床良性的克隆TCRαβ+T-细胞扩增(通常是CD8+)常规见于老年个体的外周血(PB)。13，17然而这些克隆T-细胞在PB中的扩增的体积相对较小：＜40％的PB T-淋巴细胞，且＜0.5×106/ml PB。13然而，仍不清楚所述临床良性T细胞克隆在淋巴系统的组织中被所发现的程度。
单型Vγ和Vδ区表达的结果应谨慎解释，因为在健康个体中，大部分正常多克隆TCRγδ+T-淋巴细胞被选择用于Vγ9-Jγ1.2和Vδ2-Jδ1。18，19因此，Vy9+/Vδ2+T-淋巴细胞在PB中的高频率应当被认为是正常发现，除非绝对计数为1-2×106/ml PB。应注意大多数TCRγδ+T-细胞恶性疾病表达Vδ1或其它非-Vδ2基因片段以及单个Vγ区(通常不是Vγ9)。15，20
检测Igκ或Igλ限制的表达或单型Vβ、Vγ或Vδ的表达在对患有成熟B细胞或T细胞白血病患者的PB和骨髓(BM)样品进行的流式细胞研究相对容易。然而，这在与正常(反应性)淋巴细胞混合的可疑淋巴组织增生性疾病的组织样品中较难。
与基于抗体的技术不同，分子技术广泛用于检测克隆重排的Ig/TCR基因以及确定的染色体异常。这以前涉及Southern印迹分析，但现在具体使用PCR技术。
尽管由免疫分型，在一部分(5-10％)病例中最终诊断为淋巴系统恶性疾病(lymphoid malignancy)仍有困难。因此，需要其它(分子克隆系)诊断来产生或确认最后诊断，诸如：
-任何可疑B细胞增生，其中形态学和免疫分型不是结论性的；
-所有可疑T细胞增生(注意：T细胞富集的B-NHL(T-cell rich B-NHL))；
-免疫缺陷的患者或接受过移植的患者的淋巴组织增生；
-评价一个患者中的两种淋巴系统恶性疾病之间的克隆相关性或区分恶性疾病的复发和第二种恶性疾病；
-恶性疾病的进一步分类，例如通过Ig/TCR基因重排模式或具体染色体异常；
-较少地(occasionally)：淋巴瘤的分期(staging)。
长期以来，Southern印迹分析是分子克隆系研究的金标准。Southern印迹基于非-种系(″经过重排的″)DNA片段的检测，所述片段是用限制酶消化后获得的。选定的适宜(well-chosen)限制酶(产生2-15kb的片段)以及适宜定位的(well-positioned)DNA探针(具体是下游J片段探针)允许检测基本上所有Ig和TCR基因重排，以及涉及J基因片段的染色体异常。21-28应注意Southern印迹分析的焦点在于Ig/TCR基因片段的重排多样性，由此可利用组合库。
用于克隆系评估的优化Southern印迹结果具体可用IGH，IGK和TCRB基因获得，因为这些基因具有广泛的组合库以及相对简单的基因结构，其可仅用一或两种DNA探针评估。22，24，28IGL和TCRA基因更加复杂并需要多个探针组。25，26，29最后，TCRG和TCRD基因具有限制的组合库，其对于经由Southern印迹分析区分单克隆系(monoclonality)和多克隆系(polyclonality)为次最佳的。20，21
尽管Southern印迹分析的高度可信性，它逐渐被PCR技术取代，这是由于多种内在优势：Southern印迹分析较为耗时，技术要求较高，需要10-20μg高质量DNA，并且具有限制的敏感性5-10％。21
通过PCR技术检测经过重排的Ig/TCR基因和染色体异常需要对于重排后的基因片段的精确了解，以便分别在连接区多样性和断点融合区(breakpoint fusion region)的对应侧(opposite side)设计适宜的引物。
在常规的基于PCR的克隆系研究中，引物之间的距离应小于1kb，优选小于500bp。这对于区分来自单克隆Ig/TCR基因重排的PCR产物与来自多克隆Ig/TCR基因重排的PCR产物尤其重要，所述区分基于连接区的多样性(大小和组成的多样性)。目前为止，主要是IGH和TCRG基因重排用于基于PCR的克隆系研究，这是由于检测VH-JH和Vy-Jy重排所需的有限数量的引物。
PCR技术的主要优势是它们的速度，需要DNA量较少，可能利用低质量DNA，以及相对较好的敏感性1-5％，对于一些类型的重排敏感性甚至＜1％。因此，PCR技术允许利用小的生物活检样品(例如，细针吸出的生物活检样品)，或利用甲醛固定的、石蜡包埋的样品(通常产生较低质量的DNA)。因此，如果需要还可使用存档物质(archival material)。
分子克隆系研究可以包含大量信息，但一些限制和缺陷将阻碍对传统检测方法获得的结果进行解释：
1.有限制的敏感性，与正常多克隆背景相关
检测限为1％-10％(或甚至15％)，依赖于所应用的技术(Southern印迹分析或PCR技术)，并且依赖于正常B和T淋巴细胞的“背景”的相对大小。有限制的敏感性会妨碍具有小于5-10％的克隆淋巴细胞群的小克隆淋巴细胞群的检测。
2.克隆系不等同于恶性疾病
检测到克隆系不总表示存在恶性疾病。一些临床良性增生具有克隆性(clonal)来源，诸如许多为免疫缺陷患者的CD8+(或有时为CD4+)T-淋巴细胞增多(lymphocytosis)，良性单克隆丙种球蛋白症(monoclonal gammopathy)，EBV′淋巴组织增生(通常是寡克隆的)，以及良性皮肤T-细胞增生，诸如淋巴瘤样丘疹病(lymphomatoid papulosis)等。这表示分子克隆系研究的结果应总是在临床，形态学和免疫分型诊断的背景中解释，即在血液学家，细胞形态学家，病理学家以及免疫学家的密切支持下。
3.Ig和TCR基因重排不是系(lineage)的标记
与最初的推定不同，10多年以来明确了Ig和TCR基因重排不必要分别限于B-细胞和T-细胞系。交叉-系(cross-lineage)TCR基因重排在未成熟B-细胞恶性疾病种相对常见，尤其在前体-B-ALL(＞90％的病例)中，30但急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia)(AML)和成熟B-细胞恶性疾病也可含有TCR基因重排。31-33虽然频率较低，交叉-系Ig基因重排也出现于T-细胞恶性疾病和AML，主要涉及Ig重链(IGH)位点。33，34
几乎所有(＞98％)TCRαβ+T-细胞恶性疾病都具有TCRG基因重排(通常为双等位基因)，且许多TCRγδ+T-细胞恶性疾病都具有TCRB基因重排，也提示检测到TCRB或TCRG重排不分别指示αβ或γδT细胞系的T细胞。
除了这些重排，还确定了多种淋巴系统恶性疾病具有异常Ig/TCR基因重排模式。该信息可详细用于前体-B-ALL和T-ALL，但仍不适于大多数其它淋巴系统恶性疾病。6
4.假克隆系(pseudoclonality)和寡克隆系(oligoclonality)
似乎为克隆的或似乎为寡克隆的淋巴细胞群(假克隆系)的检测在Southern印迹分析中较少，除非使用具有限制的组合库的基因，诸如TCRG或TCRD。这可导致弱的重排带，例如分别为来自经抗原选择的TCRγδ+T-淋巴细胞的Vγ9-Jγ1.2或Vδ2-Jδ1重排。然而，这是Southern印迹分析的公知缺陷，并且不产生高密度重排带。
基于PCR的克隆系研究中的假克隆系较难识别。PCR的高敏感性可导致来自所研究的组织样品中有限数目的B-细胞或T-细胞的较少Ig或TCR基因重排的扩增。具体地，具有高肿瘤负荷的小针活检样品中或B-NHL样品中的很少的反应性(多克隆)T-细胞可导致(寡)克隆的PCR产物。通常，这种PCR产物的量有限。这在TCRG基因用作PCR靶时具体可见。二元(duplicate)或三元(triplicate)PCR分析之后混合获得的PCR产物将有助于阐明似乎是克隆的PCR产物是否实际上起源于不同的淋巴细胞。
最后，反应性淋巴结可显示降低的Ig/TCR库多样性，这是由数个经抗原选择的亚克隆(寡克隆系)的优势(predominance)造成的。具体地，具有活跃EBV或CMV感染的患者的淋巴结或血样品可显示限制的TCR库或TCR基因寡克隆系。同样，免疫抑制的临床图像也通常与限制的TCR库相关，例如在接受移植的患者或患有毛细胞白血病(hairy cell leukemia)的患者中。35从移植(transplantation)或血液学缓解(hematologicai remission)回收后，恢复(restoration)多克隆TCR库。36 37
5.假-阳性结果
Southern印迹分析中，假-阳性结果罕见并通常可通过检测消化不完全(underdigestion)或通过排除多态性限制位点来防止。21
如果没有对所得PCR产物进行适当分析以区分单克隆或多克隆PCR产物，假-阳性PCR结果就包括严重的问题。所述区分可通过单链构象多态性(SSCP)分析(single-strand conformation polymorphism(SSCP)ananlysis)，38变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis)(DGGE)，39异源双链分析(heteroduplex analysis)(HD)，40或GeneScanning(GS)实现。42 43这些技术利用连接区多样性来区分具有相同的连接区多样性的单克隆细胞与具有高度多样的连接区的多克隆细胞。
6.假-阴性结果
假-阴性结果在Southern印迹分析很少见，条件是使用适当的J基因片段探针。然而，一些异常重排(通常为非-功能性重排)可被遗漏，诸如V-D重排或J区缺失。Ig和TCR基因的PCR分析可受到假-阴性结果的阻碍，这是由于所用PCR产物与经过重排的基因片段发生不适当的退火。这种不适当的引物退火可由两种不同现象导致。首先，所有不同V，D，和J基因片段的精确检测需要许多不同引物(表1)，这在实践中是不可行的。结果，设计出家族引物(family primer)，其特异性识别大多数或所有具体V，D或J家族的成员。可选，使用共有序列引物，推定其识别所研究基因座的几乎所有V和J基因片段。家族引物以及具体地共有序列引物(consensus primer)对于部分相关基因片段是通常最合适的，但显示与其它基因片段的同源性较低(70-80％)。这可最终导致假-阴性结果，具体是在具有不同基因片段的Ig/TCR基因中。TCRG和TCRD基因中，这个问题很小，这是由于其不同基因片段数目有限。
第二个现象是体细胞高变出现在滤泡性和后滤泡性B-细胞恶性疾病的经过重排的Ig基因中，具体是具有类别转换的(class-switched)IGH基因的B-细胞恶性疾病。
足够的知识和经验可防止前四个缺陷，这是由于它们主要涉及解释问题。后两个缺陷涉及技术问题，其可通过选择适宜的PCR产物分析技术以及设计较好的引物组来解决。
Ig/TCR基因的Southern印迹分析的优化在过去的10年中的结果是选择限制酶(2-15kb的片段，避免多态性限制位点)以及探针(主要是J基因片段下游)的可信组合。尽管Southern印迹分析是绝对“金标准”技术，许多实验室都逐渐用PCR技术取代Southern印迹分析，这是由于PCR较快，需要最少量的中等质量DNA，并总体上具有较好的敏感性。
尽管优势明显，用PCR技术取代Southern印迹分析进行可信的Ig/TCR研究受两个主要的技术问题阻碍：
-不适当的引物退火造成的假阴性结果；
-区分单克隆和多克隆Ig/TCR基因重排的困难。
数个单独诊断实验室试图解决基于PCR的克隆系研究的问题，但目前没有可信的标准化PCR方案。反之使用许多不同引物组，所述引物组的敏感性和适用性(applicability)不同。
本发明提供了核酸扩增引物组和标准化PCR方案，用于检测几乎所有相关Ig和TCR基因座以及两种经常出现的染色体异常。本发明的引物组包含正向和反向引物组，其能够扩增Ig重链基因(IGH)，Igκ链基因(IGI)，Igλ链基因(IGL)，TCRβ基因(TCRB)，TCRγ基因(TCRG)，以及TCRδ基因(TCRD)或染色体转位t(11；14)(BCLI-IGF1)和t(14；18)(BCL2-IGH)。本发明的引物使得完全和不完全重排都可检测，并且可识别来自不同V，(D)，和J家族的基因片段。
可用于本发明区分单克隆与多克隆Ig/TCR基因重排的方法中的两种技术是异源双链分析和GeneScanning。异源双链分析利用双链PCR产物，并利用连接区多样性的长度和组成，而GeneScanning中单链PCR产物在高分辨凝胶或聚合物中仅根据其长度而被分离(图2)。
提供了107种不同的特异性引物用于所有相关Ig/TCR基因座以及t(11；14)(BCL1-IGH)和t(14；18)(BCL2-IGH)，或其变体(见图3-11)。术语“变体(variant)”指这样的引物，其与所示引物的核苷酸序列的大小和/或位置相差1-5个核苷酸，优选1-3个核苷酸，只要所述变体引物的核苷酸序列含有与靶基因座的最多2个错配，最多1个错配，最优选不含错配。此外，变体引物包含(区别)标记的引物，即具有可通过任何手段(包括使用分析装置)来鉴定或与其它标记区分的标记的引物。区别标记的引物的实例是具有荧光标记诸如6-FAM，HEX，TET或NED染料的引物。本发明标记的引物具体优选用于自动高分辨率PCR片段分析(GeneScanning技术)用于检测PCR产物。如下所示，本发明区别标记的引物允许区分长度(大小)大致相同的PCR扩增产物，优选使用多色(multi-color)GeneScanning。当然，变体核酸扩增引物(可为正向或反向(染料标记的)引物)应不能与用于扩增反应的任何其它(变体)正向和/或反向核酸扩增引物形成二聚体。这是由于这可干扰与靶位点退火的引物，并由此干扰目的转位或重排的扩增。
一个实施方案中，本发明提供了利用本发明的至少一组引物的核酸扩增检测法，优选PCR检测法。所述PCR检测法可为单(single)(单元(monoplex))或多元(monoplex)PCR。优选实施方案中，本发明的引物组可用于标准化多元PCR检测法，所述检测法利用例如两或多种正向引物，或3或4种正向引物，或其变体(例如选自“家族引物”的组，例如来自VH家族引物)，以及一或多种共有序列反向引物，或其变体(例如JH共有序列引物)。本发明的家族引物被设计为可识别具体家族的大多数或所有基因片段(见表2)。在具体实施方案中，所有107种引物用于仅18个多元PCR试管：5个用于IGH(3xVH-JH和2xDH-JH)，2个用于IGK，1个用于IGL，3个用于TCRB(2xVβ-Jβ和1xDβ-Jβ)，2个用于TCRG，1个用于TCRD，3个用于BCL2-IGH，1个用于BCL1-IGH(图3-11)。这种检测法允许评估克隆重排和/或染色体异常。此外，其允许检测淋巴组织增生性疾病。在约90个定义为淋巴组织增生的Southern印迹上对引物进行的多元PCR检测显示，在95％以上样品中Southern印迹和PCR结果一致。
另一实施方案中，提供利用本发明的至少一组引物检测重排，优选两或多种重排的方法，所述重排选自：VH-J高重排，DH-JHIGH重排，Vκ-JκIGK重排，Vκ/内含子-KdeIGK重排，Vλ-JλIGL重排，Vβ-JβTCRB重排，Dβ-JβTCRB重排，Vγ-JγTCRG重排，Vδ-JδTCRD重排，Dδ-JδTCRD重排，Dδ-DδTCRD重排，和Vδ-DδTCRD重排。还提供了利用本发明的至少一组引物检测t(11；14)(BCL1-IGH)转位或t(14；18)(BCL2-IGH)转位的方法。此外，提供利用本发明提供的至少两组引物检测上述至少一种重排与至少一种转位的方法。
另一方面，提供了能扩增以下人基因的核酸扩增引物组：人AF4基因(外显子3)，人AF4基因(外显子11)，人PLZF1基因，人RAG1基因和人TBXAS1基因(见图12)。利用这5组引物中的一或多种(包含正向引物(或其变体)和反向引物(或其变体))，在本发明核酸扩增试验中，可能检测一或多种“对照基因(Control Gene)”，所述对照基因选自：人AF4基因(外显子3)，人AF4基因(外显子11)，人PLZF1基因，人RAG1基因和人TBXAS1基因。这种检测方法优选用于评估核酸(DNA)样品的质量(例如完整性和可扩增性)，所述核酸提取或分离自生物样品的核酸，例如提取自石蜡包埋的样品的DNA(见实施例10)。
本发明不同引物组扩增克隆重排和/或染色体异常(转位)的能力已经在不同类型的恶性淋巴瘤中检测过，所述恶性淋巴瘤包括滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma)，弥散大B-细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma)，和多发性骨髓瘤(multiple myeloma)。发现一组引物非常适合用于检测克隆重排和/或染色体转位。利用本发明的多元引物试管的克隆重排检出率空前地高，即至少95％。
平行检测可得的上述石蜡包埋的组织样品显示大致相同结果，如果这些组织的DNA质量足够高，表明可在特异性设计的对照基因PCR中扩增出至少300bp的片段。
在每种类型的淋巴系统恶性疾病的50-100个病例系列中评估本发明开发的多元PCR检测法的可用性。在有困难的情况下根据national pathologypanel review，以及central pathology panel review，所有这些病例都根据WorldHealth Organization(WHO)分类来确定。研究的诊断分类包括恶性疾病诸如滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma)，套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)，边缘带淋巴瘤(marginal zone lymphoma)，弥散大B-细胞淋巴瘤，成血管免疫细胞性(angioimmunoblastic)T-细胞淋巴瘤，外周(peripheral)T-细胞淋巴瘤，和分化不良的大细胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma)，以及反应性损伤(reactive lesion)。结果显示非常高水平的克隆系检测，即使在已知具有体细胞高变(somatic hypermutation)的实体(entity)诸如滤泡性淋巴瘤和弥散大B-细胞淋巴瘤等中也如此。具体地，三个IGHVH-JH试管，以及两个IGHDH-JH试管和两个IGK试管的使用似乎可高效检测克隆Ig基因重排。所述高效通过Ig试管的互补性以及DH-JH和IGK-Kde重排不是(或很少为)体细胞突变(somatically mutated)的这一事实来获得。对于T-细胞恶性疾病，所述互补性也见于TCRB和TCRG引物。
此外，观察到有趣的且不可预测的重排模式，诸如异常交叉-系重排。明显地，在约10％的反应性损伤中检测到克隆重排。这些反应性淋巴组织增生包括EBV-相关的淋巴组织增生和不典型增生例如Castlemanbin病(Castleman′s disease)，以及可疑为B-或T-细胞克隆的疾病。
在具体实施方案中，提供了检测微小残留病变(MRD)的方法。术语微小残留病变(MRD)描述了一种状态，其中在急性白血病(AL)化疗后，形态正常的骨髓仍可保持相应量的残留恶性细胞。检测微小残留病变(MRD)是精确检测治疗过程中的症状缓解诱导的新实用工具，这是由于白血病母细胞的检测限为10-4-10-6。已知基于PCR的MRD分析利用克隆抗原受体重排，其可在所研究患者样品的～90-95％中检测到。然而，扩增多克隆产物通常导致假-阳性PCR扩增子，其不适合MRD分析。本发明提供检测以相同(克隆)方式重排的Ig和TCR基因或检测已定性且频繁的染色体异常，诸如t(11；14)，和t(14；18)。因此利用本发明引物组检测的重排和转位不仅可作为克隆系诊断的标记，也作为检测随诊过程中的MRD的PCR靶。
另一方面，本发明提供包含本发明的至少一组引物的(诊断)试剂盒，其用于检测选自VH-JHIGH重排，DH-JHIGH重排，Vκ-JκIGK重排，Vκ/内含子-KdeIGK重排，Vλ-JλIGL重排，Vβ-JβTCRB重排，Dβ-JβTCRB重排，Vγ-JγTCRG重排，Vδ-JδTCRD重排，Dδ-DδTCRD重排，Dδ-JδTCRD重排或Vδ-DδTCRD重排的至少一种重排和/或选自t(11；14)(BCL-IGH)和t(14；18)(BCL2-IGH)的至少一种转位。本发明的试剂盒高度适合基于PCR的克隆系检测。可选所述试剂盒可包含至少一组引物，其能够扩增人“对照基因”，如上述。在对照试管中包含一个，优选至少两个，更优选至少三个这些对照基因引物组有助于评估待诊断DNA样品例如从石蜡包埋的组织提取的DNA的质量。
另一方面，本发明提供在相同多元PCR试管中快速区分不同类型的Ig/TCR基因重排的方法。GeneScanning允许在单个试管中应用多种不同荧光染料偶联的引物。这种对引物的区别标记可用于额外区分不同类型的Ig或TCR基因重排。
V引物的区别标记通常具有限制的增加值，但区别标记下游引物支持Ig/TCR基因重排类型的快速且容易地鉴定，其用于基于PCR的微小残留病变的检测。44 45标记J引物不认为是提示(informative for)IGH(VH-JH或DH-JH)，IGK(Vκ-Jκ)，或IGL(VX-JB)。为快速鉴定IGK Kde重排，通过区别标记Kde和内含子RSS引物可区分Vκ-Kde和内含子RSS-Kde重排(见图5B)。
可设计提供的信息最丰富的(most informative)多色(multicolor)GeneScanning用于TCR基因重排，促进快速识别不同类型的TCRB，TCRG和TCRD基因重排。例如，在TCRB试管A中区别标记Jβ1和Jβ2引物(见图7B)允许容易地鉴定多克隆和单克隆Vβ-Jβ1与Vβ-Jβ2重排(图13A)。区别标记Jγ1.3/2.3和Jγ1.1/2.1引物(图8B)导致可容易地鉴定不同类型的TCRG基因重排(图13B)。在TCRD试管中区别标记Jδ引物，Dδ2引物，和Dδ3引物(图9B)导致容易鉴定大多数相关TCRD基因重排，诸如Dδ2-Jδ，Vδ-Jδ，Dδ2-Dδ3以及Vδ2-Dδ3重排(图13C)。
这些多色多元PCR试管对于基于PCR的克隆系诊断的日常实践而言容易且方便。
附图说明
图1TCRB基因的顺次重排步骤，转录和翻译的图示。在该实例中，首先Dβ2与Jβ2.3重排，然后是Vβ4与Dβ2-Jβ2.3重排，形成Vβ4-Dβ2-Jβ2.3编码连接(joint)。经过重排的TCRB基因转录成前体mRNA，经剪切成为RNA，并最终翻译成TCRβ蛋白质链。还显示出在该重组过程中形成的两种染色体外TCR切割环(TREC)；它们分别含有D-J信号接点和V-D信号接点。
图2.获自经过重排的Ig和TCR基因的PCR产物的异源双链分析和GeneScanning的图示。A.经过重排的Ig和TCR基因(实施例中的IGH)显示异源连接区的大小和核苷酸组成。V，D和J基因片段的种系核苷酸以大的大写字母给出，并随机插入的核苷酸为小的大写字母。连接区异源性用于异源双链分析(大小和组成)以及GeneScanning(仅大小)以区分来自单克隆淋巴细胞群的产物与来自多克隆淋巴细胞(lymphoid cell)群的产物。B.异源双链分析中，PCR产物经加热变性(5min，94℃)并随后迅速冷却(1小时，4℃)以诱导双链体(同源或异源双链)形成。在由克隆性淋巴细胞组成的细胞样品中，经重排的IGH基因的PCR产物在变性和复性后产生双链体，而在含有多克隆淋巴组织细胞群的样品中，单链PCR片段主要形成异源双链，导致电泳时缓慢迁移的背景成片条带(background smear)。C.在GeneScanning中，使经重排的IGH基因的荧光染料-标记的PCR产物变性然后对产生的单链片段进行高分辨率片段分析。单克隆细胞样品产生相同大小的PCR产物(单峰)，而多克隆样品中形成许多不同IGH PCR产物，其显示特征性Gaussian大小分布。
图3.IGH(VH-JH)重排的PCR分析。A.染色体带14q32.3上的IGH基因复合物的图示(得自ImMuno基因Tics数据库)。46，47仅可重排的非多态性VH基因片段包含在蓝色部分(功能性VH)，或灰色部分(可重排的假基因(pseudogene))中。最近发现的(通常为截短的)VH假基因未显示。B.图示了IGH VH-JH重排以及三组VH引物和一种JH共有序列引物，引物在三个多元试管中混合。VH和JH引物的相对位置由其位于所涉及RSS的上游(-)或下游(+)的最5′核苷酸给出。用作代表性VH家族成员以进行引物设计的VH基因片段显示在括号中。C，D，和E.相同的多克隆和单克隆细胞群的异源双链分析和GeneScanning，显示常见的异源双链成片条带和同源双链带(左图)以及常见的多克隆Gaussian曲线和单克隆峰(右图)。多克隆Gaussian曲线的大致分布在nt中显示。
图4.IGH(DH-JH)重排的PCR分析。A.IGH(DH-JH)重排以及七种DH家族引物和一种JH共有序列引物的图示，所述引物被分入两个试管(IGH试管D和E)。将DH7(7-27)引物与其它6种DH引物分离，因为DH7和JH共有序列引物将产生211nt的种系PCR产物。DH和JH引物的相对位置根据其位于所涉及RSS的上游(-)或下游(+)的最5′核苷酸给出。用作代表性DH家族成员以进行引物设计的DH基因片段显示在括号中。B和C.相同的多克隆和单克隆细胞群的异源双链分析(左图)和GeneScanning(右图)。显示多克隆峰和单克隆峰的大致分布。试管D中可能的背景带/峰用星号表示，并位于DH-JH重排的预期范围以外。试管E的种系DH7-JH带也用星号指示。
图5.IGK基因重排的PCR分析。A.染色体带2p11.2的IGK基因复合物的图示(得自ImMuno基因Tics数据库)。46 47仅可重排的非多态性Vκ基因片段用蓝(功能性Vκ)，或灰(非功能性Vκ)表示。反转的Vκ基因片段簇(cluster)(由字母D编码)位于非-反转的Vκ基因片段上游～800kb。这些上游Vκ基因片段为其相应的非反转对应物的镜像(mirrored image)。B.Vκ-Jκ重排和两种类型的Kde重排(Vκ-Kde和内含子RSS-Kde)的图示。Vκ，Jκ，Kde和内含子RSS(INTR)引物的相对位置根据其位于所涉及RSS的上游(-)或下游(+)的最5′核苷酸给出。用作Vκ1，Vκ2，和Vκ3家族的代表性成员的Vκ基因片段显示在括号中。Vκ4，Vκ5，和Vκ7是单成员的Vκ家族。所述引物分入两个试管：试管A具有Vκ和Jκ引物，试管B具有Vκ，内含子RSS和Kde引物。C和D.相同的多克隆及单克隆细胞群的异源双链分析和GeneScanning，显示常见的异源双链成片条带和同源双链带(左图)以及常见的Gaussian曲线和单克隆峰(右图)。多克隆Gaussian曲线的大致分布在nt中显示。
图6.IGL基因重排的PCR分析。A.染色体带22q11.2上的IGL基因复合物的图示(得自ImMunoGenetics数据库)。46 47仅可重排的非多态性Vλ基因片段包括在蓝色部分(功能性Vλ)或灰色部分(非功能性Vλ)中。B.Vλ-Jλ重排以及两种Vλ家族引物和一种Jλ共有序列引物的图示。仅两种Vλ引物设计用于Vλ1及Vλ2并用于Vλ3，因为这些三个Vλ家族覆盖了大约70％可重排的Vλ基因片段，且因为所有IGL基因重排中大约90％涉及Vλ1，Vλ2或Vλ3基因片段。46尽管7个Jλ基因片段中有5个可重排，仅一个Jλ共有序列引物被设计为用于Jλ1，Jλ2，和Jλ3，因为所有IGL基因重排的98％涉及这三个基因片段之一。49Vλ和Jλ引物的相对位置根据其位于所涉及RSS的上游(-)或下游(+)的最5′核苷酸来表示。C.相同的多克隆和单克隆细胞群的异源双链分析以及GeneScanning，显示常见的异源双链成片条带和同源双链带(左图)以及常见的多克隆Gaussian曲线和单克隆峰(右图)。多克隆Gaussian曲线的大致分布在nt中显示。
图7.TCRB基因重排的PCR分析。A.人TCRB基因座的图示。所述基因片段根据Arden等所述命名。50根据Rowen等51和Lefranc等48，47的命名显示在括号中。该图得自international ImMunoGeneTics数据库。46，47仅可重排的非-多态性Vβ基因片段描绘在蓝色部分(功能性Vβ)，半蓝/半灰部分(可能有功能，但没有发现蛋白质表达)和灰色部分(非-功能性Vβ)中。B.Vβ-Jβ和Dβ-Jβ重排的图示。23种Vβ引物，13种Jβ引物和两种Dβ引物在三个试管中混合：试管A含有23种Vβ引物和9种Jβ引物，试管B含有23种Vβ引物和四种Jβ引物，且试管C含有两种Dβ引物和13种Jβ引物。将23种Vp引物与13种Jp引物进行序列比对以便获得PCR产物的相对大小(见图C和D)。Vβ引物包括大约90％的所有Vβ基因片段。Vβ，Dβ，和Jp引物的相对位置根据其位于所涉及RSS的上游(-)或下游(+)的最5′核苷酸来表示。C，D，和E.相同多克隆和单克隆细胞群的异源双链分析和GeneScanning，显示常见的异源双链成片条带和同源双链带(左图)以及常见的多克隆Gaussian曲线和单克隆峰(右图)。多克隆Gaussian曲线的大致分布在nt中显示。
图8.TCRG基因重排的PCR分析。A.染色体带7p14上的人TCRG基因座的图示。仅可重排的Vγ基因片段在蓝色部分(功能性Vγ)或灰色部分(非功能性Vγ)中显示。对于Jγ基因片段，使用了两种命名法。46，47，52B.TCRGVγ-Jγ重排以及四种Vγ引物和两种Jγ引物的的图示，所述引物被分入两个试管。Vγ和Jγ引物的相对位置根据其位于所涉及RSS的上游(-)或下游(+)的最5′核苷酸来表示。C和D.相同的多克隆和单克隆细胞群的异源双链分析以及GeneScanning，显示常见的异源双链成片条带和同源双链带(左图)以及常见的多克隆Gaussian曲线和单克隆峰(右图)。多克隆Gaussian曲线的大致分布在nt中显示。
图9.TCRD基因重排的PCR分析。A.图示了染色体带14q11.2上的人TCRD基因座。六种“经典的”Vd基因片段用蓝色表示，分散在黑色的Vα基因片段之间。由于Vδ4，Vδ5和Vδ6也被识别为Vα基因片段，它们的Vα基因密码在括号中给出。B.图示Vδ-Jδ，Dδ2-Jδ，Dδ2-Dδ3和Vδ-Dδ3重排，显示6种Vδ，4种Jδ和两种Dδ引物的定位，所有都在单个试管中混合。Vδ，Dδ和Jδ引物的相对位置根据它们位于涉及的RSS上游(-)或下游(+)的最5′核苷酸来表示。C.相同的多克隆和单克隆细胞群的异源双链分析(左图)以及GeneScanning(右图)。多克隆细胞系在异源双链分析中显示模糊的成片条带，并在GeneScanning中显示复杂的广泛峰模式。显示GeneScanning中不同类型的重排的PCR产物的大致位置。
图10.BCL1-IGH重排的检测。A.图示了染色体带11q13上的CCND1基因和BCL1断点区MTC以及染色体带14q32上的JH基因片段。为BCL1-MTC区中进行引物设计，组成人工BCLI-MTC/JH4接头序列(如对JVM2的部分报道53)：Williams54报道的前50个核苷酸连接于MTC-序列的核苷酸1-439(得自NCBI(登录号S7704955))；JVM253的N-区“GCCC”被加入代表JH4-JH6基因组区(登录号J00256)的核苷酸1921-3182后。B.来自不同MCL患者和阳性对照细胞系JVM2的一系列BCLI-IGH PCR产物的琼脂糖凝胶电泳。PCR产物大小不同，表明BCL1-MTC断点位置不同。低密度的较大带代表延伸到下一个下游种系JH基因片段的PCR产物。
图11.BCL2-IGH重排的PCR检测。A.染色体带18q21上的BCL2基因的图示。BCL2断点的主要部分聚集在三个区：MBR，3′MBR，和mcr。因此，设计包含所述三个区中的断点的多元引物：两种MBR引物，四种3′MBR引物，和三种mcr引物。BCL2引物的相对位置根据其位于涉及的BCL2外显子3(NCBI登录号AF325194S1)的3′末端上游(-)或下游(+)的最5′核苷酸来表示，但除外两种BCL2-mcr引物；其位置在AF275873序列的第一个核苷酸下游标出。B，C，和D.来自不同FCL患者和数种阳性对照细胞系(DoHH2，K231，OZ，和SC1)的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳。图B和D含有相同样品并显示阳性中的互补性(complementarity in positivity)，表明试管C(mcr管)具有附加的值。PCR产物大小不同，与BCL2断点的不同位置相关。同一泳道中低密度的较大带代表PCR产物，所述产物延伸到下一下游种系JH基因片段或到下一上游BCL2引物。
图12.用于评估DNA样品的可扩增性和完整性的对照基因PCR。A.图示了五种对照基因外显子和五组引物，其用于获得600bp，400bp，300bp，200bp和100bp的PCR产物。对照基因引物的相对位置根据涉及的对照基因外显子的5’剪切位点下游的最5′核苷酸给出。B.六种DNA样品的对照基因PCR产物，在6％聚丙烯酰胺凝胶中分离。两种对照样品含有高分子量DNA(外侧泳道)，四种DNA样品获自石蜡包埋的组织样品，显示降低的可扩增性(例如GBS-4 50ng相对于GBS-4 500ng)或降低的DNA完整性(PT-4)。
图13.用于支持快速且容易的TCR基因重排鉴定的多色GeneScanning。A.用区别标记的Jβ1引物(TET-标记的；绿)和Jβ2引物(FAM标记的；蓝)进行的TCRB试管A的双色分析。上部的图显示两种多克隆Jβ1和Jβ2重排模式(c.f.图7C)，其中另外两个图显示克隆性Jβ2重排。B.利用区别标记的Jy1.3/2.3引物(FAM-标记的；蓝色)和Jy1.1/2.1(TET-标记；绿色)进行的TCRG试管A的双色分析。上部的图显示多克隆重排模式(c.f.图8C)，而另外两张图分别显示克隆性Jγ1.3/2.3和克隆Jγ1.1/2.1重排。C.用区别标记的Jδ引物(FAM标记；蓝色)，Dδ2引物(HEX-标记；绿色)和Dδ3引物(NED-标记；黑色)进行的TCRD基因重排的三色分析(three-coloranalysis)。在TCRD试管中的复杂重排模式中(图9C)，三色分析允许直接检测Vδ-Jδ重排(蓝峰)，Dδ2-Jδ重排(蓝色和绿色的峰，不完全共迁移(comigrate)是由于两种荧光染色体的迁移速度不同)，Vδ2-Dδ3重排(黑色的峰)，和Dδ2-Dδ3重排(共迁移的绿和黑色峰)。
材料和方法
PCR靶选择：目的在于互补性
决定目标是在每种淋巴系统恶性疾病中提供至少一种PCR-可检测的克隆系靶。在成熟B-细胞恶性疾病中，该目的可能由于Ig基因中的体细胞高变的出现而受到阻碍，具体见于滤泡性和后滤泡性(post-follicular)B-细胞恶性疾病。因此决定包括具有一定程度的互补性的PCR靶。
数种原理用于靶选择：
-IGH基因：不仅完整VH-JH重排还有不完全DH-JH重排都被包含在内作为靶，因为DH-JH重排可能不受体细胞高变影响；
-IGK和IGL基因：Ig轻链基因均可被包含作为PCR靶，由于这可增加发现每种成熟B-细胞恶性疾病中的PCR-可检测型Ig基因重排的几率；
-IGK基因：不仅包括Vκ-Jκ重排还包括κ缺失元件(Kde)的重排，因为它们出现在(几乎)所有IGK+B-细胞恶性疾病和以及三分之一的IGK+B-细胞恶性疾病中的一个或所有两个等位基因中，且因为Kde重排很可能不受体细胞高变影响；
-TCRB基因：完全Vβ-Jβ和不完全Dβ-Jβ重排，因为完全和不完全TRCB基因重排出现在所有成熟TCRαβ+T-细胞恶性疾病以及许多TCRγδ+T-细胞恶性疾病中；
-TCRG基因：该经典的PCR克隆系靶可用于TCRγδ和TCRαβ系的所有T-细胞恶性疾病中。
-TCRD基因：其为未成熟T-细胞恶性疾病以及TCRγδ+T-细胞恶性疾病中可能有用的靶；
-TCRA基因：该基因不作为PCR靶，因为它与～50V和61J基因片段具有高度复合性(complexity)。此外，所有具有TCRA基因重排的T-细胞恶性疾病包含TCRB基因重排并通常也具有TCRG基因重排；
-功能性基因片段：大多数可疑淋巴组织增生涉及成熟淋巴细胞，其因此具有功能性Ig或TCR基因重排。因此PCR引物设计意在包括(几乎)所有功能性Ig/TCR基因片段。
-确定的(well-defined)染色体异常：具有BCL1-IGH的t(11；14)和具有BCL2-IGH的t(14；18)被包含作为另外的靶，因为这两种异常在淋巴瘤中通过PCR检出的频率相对高，即分别见于30％的套细胞淋巴瘤(MCL)和60-70％的滤泡性细胞淋巴瘤(FCL)。
用于多元PCR的引物设计
在经过重排的Ig和TCR基因中精确检测所有V，D和J基因片段需要许多不同引物(表2)。对于一些基因复合物这是可能的(例如TCRG和TCRD)，但对于其它实践中的基因座而言这是不可能的，因为不同基因片段的数目较高。为解决该问题，可设计家族引物，其识别具体家族的大多数或所有基因片段(表2)。可选，可制备共有序列引物，其识别出现在许多或所有涉及的基因片段中的保守序列。
家族引物以及共有序列引物的设计在有限数目的引物和与所有相关基因片段的最大同源性之间平衡。在该研究中，我们的目的在于与所有相关基因片段(尤其是功能性基因片段)的最大同源性以防止次最佳引物退火，其可导致假-阴性结果。此外，我们的目的在于设计具体家族引物，其不与其它家族发生交叉退火。
为限制每个基因座的PCR试管数，PCR引物多元化(多重xing)对于实际原因很重要。因此，研发具体的方案以保证设计用于多元PCR试管的引物的最大可能。为该目的，W.Rychlick博士(Molecular Biology InsIGHts，Cascade，CO，USA)提供了其特殊改进的OLIGO 6.2软件程序，并支持了用于最佳引物设计的方案的开发。
引物设计的常用方案如下：
-选择引物的位置使得PCR产物的大小优选＜300bp(优选100-300bp)，以便能利用石蜡包埋的物质；
-应考虑与接点区的最小距离优选＞10-15bp(为了避免假阴性，这由因种系序列的核苷酸缺失致使引物的3’末端不可能与经重排的靶退火导致)；
-引物优选不太长(例如＜25核苷酸)。
以下参数用于利用OLIGO 6.2程序设计引物：
-搜索引物应当采用中等严谨度；
-引物效率(efficiency)(PE)值应当优选-400(且＞630，如果所述引物也用作其它基因片段的共有序列引物；
-上/上、下/下或上/下引物的最稳定的3′二聚体不应超过～4Kcal(适度搜索策略(moderate search strategy))；最稳定的二聚体总体上较不重要；
-对于多元PCR，考虑以下方案：需在大多数共有序列区(即在共有序列搜索中高PE)中设计共同引物，而单个引物(家族或成员)必须被设计在最小共有序列区中(即该引物对于不应包括在内的基因片段的PE值较低)，以避免与其它基因片段的交叉退火并从而避免形成多重(不需要的)PCR产物。
PCR方案
标准PCR方案基于来自早期欧洲联合研究的现存经验开发。经初始测定和许可后，所述方案被接受并总结于表3。
用于分析获自Ig/TCR基因重排的PCR产物的技术
需分析获自Ig和TCR基因重排的PCR产物以区分具有相同连接区的单克隆淋巴细胞以及具有高度多样的连接区的多克隆淋巴组织细胞。
基于参与的实验室的综合经验，选择两种技术：异源双链(HD)分析和GeneScanning(GS)分析。HD分析利用双链PCR产物并利用连接区的长度和组成；而在GS中，单链PCR产物在高分辨率凝胶或聚合物中仅根据它们的长度分离(图2)。
PCR产物的异源双链分析
用未标记的引物获得的PCR产物在高温变性(～95C、5min)，然后在低温快速随机复性(优选4℃、1小时)。该强迫的(enforced)双链体形成在多克隆淋巴组织增生时产生迁移速度不同的多种不同异源双链，但对于单克隆淋巴组织增生，产生迁移速度同样快速的的同源双链。在6％聚丙烯酰胺凝胶中同源双链的电泳结果是单个预定大小的带，而异源双链形成较高位置的成片条带(图2)。所述异源双链技术迅速，简单并廉价(见表4中的技术细节)并检测限～5％。所述检测限受多克隆淋巴细胞的频率影响，因为许多异源双链的形成也消耗部分单克隆PCR产物。41
PCR产物的的GeneScanning分析
用于GeneScannning分析的引物需要用荧光染料标记以便用自动测序仪(automated sequencing equipement)检测PCR产物(图2)。
荧光染料标记的单链(变性的)PCR产物是在变性的聚丙烯酰胺测序凝胶或毛细管测序聚合物(capillary sequencing polymer)中根据大小分离的，并通过激光进行自动扫描来检测(见表5的技术细节)。这导致多峰型Gausian分布，对于多克隆淋巴组织增生表示许多不同PCR产物，而对于完全单克隆淋巴组织增生则为由一种类型PCR产物组成的单峰。
GeneScanning快速，相对简单，但需要昂贵的仪器。GeneScanning通常比异源双链分析更敏感，且敏感性可达0.5-1.0％克隆淋巴细胞。
对照基因和石蜡包埋的组织
在数个欧洲国家中，新鲜组织物质不易于进行分子诊断诸如基于PCR的克隆系研究。因此本研究的一个目的是开发用于在石蜡包埋的组织中进行基于PCR的克隆系研究的策略。
为控制来自石蜡包埋的物质的DNA的质量和可扩增性，开发了具体的多元对照基因PCR，其产生5片段的梯(ladder)(100bp，200bp，300bp，400bp，和600bp)。将来自上述90个病例中45例的石蜡包埋的组织的用于DNA提取。这些DNA样品与新鲜获得的DNA样品平行检测，利用对照基因多元管(Control Gene multiplex tube)以及Ig/TCR/BCLI1/BCL2多元管用于克隆系诊断(见实施例10)。
实施例
实施例1.完全IGH基因重排：VH-JH
背景
IGH基因的功能性重排，首先是DH与JH重排，然后V与DH-JH重排，然后进行抗体表达(成熟B-细胞的标志)。IGH基因位于染色体14q32.3上大约包含1250个碱基的区域中。鉴定了46-52个功能性VH片段(根据个体单体型)，其根据它们在6或7个VH亚组中的同源性分组。此外，描述了大约30非-功能性VH片段。此外，一致发现了27种DH片段以及6种功能性JH片段(表2和图3A)。56
VH片段包含三个框架(FR)和两个互补性决定区(CDR)(图3B)。FR的特征在于其在各种VH片段中的相似性而CDR即使在相同的VH家族中也相差很大。此外，CDR代表生发中心反应(germinal center reaction)过程中体细胞高变的优选靶序列，所述反应增加了这些区中的变异性。尽管FR通常受到体细胞突变的影响较小，核苷酸取代也可出现在这些区内，尤其是在重(heavy)突变过程下的B细胞中。
高变的V-D-JH区可通过PCR扩增以检测克隆性B-细胞群，所述细胞群指示恶性B细胞疾病的存在。克隆性B-细胞可与多克隆B-细胞(即正常或反应性淋巴系统组织)区别，所述区别基于与大小(大约60bp)的许多不同多克隆PCR产物相比，克隆性PCR产物的大小和组成一致并以Gaussian分布排列。用于检测组织切片和细胞悬液中的克隆性B-细胞群的基于PCR的策略已经在90年代早期建立。然而，最早的PCR方案利用单个VH共有序列引物，其能结合三个框架区之一，主要是FR3。这种共有序列引物不适合以相同的效率扩增所有VH片段，这导致大量克隆重排不可检测出。此外，生发中心反应的过程中的体细胞高变不限于CDR，也出现于FR，从而防止引物退火并导致在存在肿瘤性B细胞群存在的情况下克隆性PCR产物仍缺失。这对于滤泡性淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤以及多发性骨髓瘤尤其正确，所述肿瘤通常含有很高数目的体细胞高变。
为进一步增加IGH PCR的检出率，进行多种尝试以设计家族特异性引物来克服共有序列引物的限制。然而，这些家族特异性引物主要基于以前的共有序列引物的序列。尽管这些PCR策略有助于改善检出率，仍需要其对于体细胞高变较不敏感的引物系统，从而允许扩增(几乎)所有可能的V-D-JH重排.。
引物设计
根据本发明的方案，利用OLIGO-6.2程序设计三组VH引物，所述引物组对应于三个VH框架区(FR1，FR2和FR3)(图3B)。每组引物由6或7个寡核苷酸组成，并且大多数VH片段能够无错配地与其相应VH片段退火(VH1与VH7)，而对于一些少见的VH片段所述退火可具有一或至多两个错配。所述设计使得错配就位于所述引物的5’末端。这些VH引物组与单个JH共有序列引物一起使用，其设计为与6种JH片段的同源最高的3’末端(大约在JHRSS下游35bp)退火。这保证所有JH片段可以相同结合效率检出，并且引物结合经不容易受到重排过程中的大量(extensive)核苷酸缺失的影响。此外，通过OLIGO-6.2程序评估发现，VH引物和JH引物之间没有交叉退火。
也将JH引物设计为用于扩增其它PCR靶，诸如不完全DH-JH重排以及t(11；14)(BCL1-IGH)和t(14；18)(BCL2-IGH)。这允许通过GS分析采用相同的经标记的JH引物来检测不同PCR产物。
初始检测阶段的结果
新设计的VH-JHPCR的初始检测通过在单独的PCR中分开应用每种VH引物以及JH引物实施。为此，使用提取自B-细胞系以及确定的克隆性患者样品的DNA。此外，通过在提取自反应性扁桃体的DNA中进行连续稀释来检测克隆重排的敏感性。克隆性对照样品不可用于每种可能的IGH重排，但所有主要VH片段和数种几乎没有经过重排的VH片段包括在初始检测阶段内。
所有引物对均为高效且敏感的。预期的克隆VH重排是可检测的且敏感性为至少1％(10-2)。在预期大小范围内没有背景且扁桃体DNA的扩增给出预期的Gaussian分布曲线。(图3C，D和E)
根据这些结果，我们通过以下方式开始初始引物检验的下一阶段：将VH引物结合成三个组，每个组特异于三个框架区之一，所述引物组与共同JH引物一起使用(图3B)。结果与用单个引物对所得结果一致，但具有较低的敏感性。此外，除了出现于FR1多元PCR中的340bp PCR产物，没有扩增出大小在预期范围内的非特异性产物。该PCR产物的产生与用于PCR的DNA来源(淋巴系统的和非淋巴系统的)无关，而当没有应用DN模板时没有获得PCR产物。此外，该扩增子仅可在异源双链分析中检测到，而不见于GeneScanning。这表明荧光标记的JH引物与该PCR产物的产生无关。该PCR产物的序列分析公开了通过FR1 VH4引物以及FR1 VH2引物扩增的VH4片段，FR1 VH2引物通过与内含子VH4序列结合而明显地作为下游引物。该问题可通过设计新的FR1 VH2引物解决，所述引物位于前述引物结合位点上游25bp。
一般(general)检测阶段的结果
将认可的IGH PCR用于90个Southern印迹定义的DNA样品，其来自确定的病例。参与一般检测阶段的11个实验室中的6个进行了PCR产物的GS分析且5个实验室进行了HD分析。此外，包括数个多克隆以及单克隆样品(细胞系DNA)作为对照。GS分析显示这些病例中的45例显示优势(dominant)PCR产物，而HD检测显示这些病例中的49例显示优势PCR产物，表示存在单克隆B细胞群。克隆重排可用所有三种FR引物组由45个克隆病例(GS)的33个中检出，并且在余下的12个病例中由一或两个三个FR引物组检出。结论是，大多数阴性结果由引物结合位点中的体细胞高变造成，其阻止引物退火且从而阻止扩增。
VH-JH PCR结果与Southern印迹的结果比较显示了高度一致性。分别有85％(55个中有46个)和76％(55个中有42个)通过Southern印迹分析发现具有经过重排的VH基因的样品显示GS分析和HD分析的优势扩增产物。反之，除了两个样品以外的所有通过Southern印迹显示具有种系VH基因的样品经GS和HD分析而显示多克隆模式。
结论
结论是，用于检测克隆VH-JH重排的三种多元PCR提供了鉴定克隆B-细胞增生的新的且可信的检测法。在三种不同FR中联合利用标准化引物有助于降低假-阴性结果率，所述假阴性结果由涉及的VH基因片段的引物结合位点中的体细胞高变造成。
实施例2.不完全IGH基因重排：DH-JH
背景
完全V-D-J重排在染色体14q32.3上IGH基因座中的形成是连续的两步过程：在早期前体-B细胞中通常首先是DH和JH基因片段之间的初始重排，然后是VH偶联(综述57)。除了许多不同许多不同的VH基因片段和6个功能性JH基因片段(见实施例1)，人IGH基因座还包含27个DH基因片段。58基于序列同源性，27个DH片段可分成7个家族：DH1(以前称作DM)，DH2(DLR)，DH3(DXP)，DH4(DA)，DH5(DK)，DH6(DN)，和DH7(DQ52)；所有家族包含至少四个成员，但第七个由JH区上游的单个DH7-27片段组成(图3A)。58，59
DH和JH片段之间的重组将导致形成不完全DH-JH连接，其可轻易在骨髓来源的CD10+/CD19-前体B-细胞中检出60，61，且从而也见于前体B-细胞急性淋巴母细胞白血病的亚组(20-25％)，其显示未成熟基因型。62测序显示DH2(DH2-2)，DH3(DH3-9)和DH7-27片段在前体B-ALL中占主要部分，分别包含所有鉴定的片段的36％，33％，和19％。62
然而，据报道不完全DH-JH重排也见于成熟B-细胞恶性疾病。61，63此外，即使在IGH-阴性的多发性骨髓瘤(其可被认为是B-系恶性疾病的最成熟类型)中，也观察到DH-JH连接。64这些DH-JH重排来自非编码型第二等位基因，并涉及DH1到DH4家族的片段。64基于对前体-B-ALL以及多发性骨髓瘤中的DH-JH连接的描述，推定不完全DH-JH重排也存在于其它类型的B-细胞白血病和淋巴瘤中。在未成熟T-细胞恶性疾病中，将DH-JH偶联鉴定为交叉系重排；34有趣的是，这些几乎仅出现在更不成熟的非-TCRαβ+T-ALL亚组并且主要涉及更下游的DH6-19和DH7-27片段。后一片段通常(达40％)用于胎B细胞但很少用于成人B细胞。65，66可见人成人前体和成熟B细胞主要利用DH2和DH3家族片段，这可由完全VH-DH-JH重排的序列证实。66
尽管不同类型的成熟B-细胞恶性疾病中的不完全DH-JH偶联的确切频率未知，很明显它们至少低于VH-JH连接的频率。然而，DH-JH重排可仍代表用于基于PCR的克隆系评估的重要互补靶。该推定的DH-JH重排分布(作为PCR靶)基于IGH基因座中的不完全重排不包含体细胞高变的推定，因为从V基因片段中的启动子开始的转录没有出现，而所述转录被认为是体细胞高变出现的必要前提。87，88具体在其中体细胞高变频繁的那些类型的B-系增生中，可能的DH-JH重组产物的PCR分析可因此相关，且有时甚至为检测B-细胞克隆的唯一可能性。
引物设计
基于每个DH家族的高度同源性，设计7种家族-特异性DH引物(图4)以及共有序列JH引物，所述JH引物也用于检测VH-JH重排(见实施例1)和t(11；14)(BCLT-IGH)和t(14；18)(BCL2-IGH)(实施例8和9)。设计引物使得与其它DH家族片段的交叉-退火可最小化或优选缺失，导致不同家族引物相对于RB元件的不同位置(图4)。DH-JH接点的预期PCR产物的大小为110-130bp(对于DH7-JH连接)到395-415bp(对于DH3-JH重排)。注意，由于DH7-27片段的位置接近JH区中的片段，211bp的PCR产物(以及对于与下游JH基因片段退火的引物而言也可为419，1031，1404，1804，和2420bp)将从未-经过重排的等位基因开始扩增并作为种系带的梯在几乎每个样品中检测出。
初始检测阶段的结果
对于单个DH引物的首次检测，使用具有确定的克隆DH-JH重排的高肿瘤负荷前体B-ALL或T-ALL样品。在标准PCR条件下，利用1.5mM MgCl2和AmpliTaq Gold缓冲液，所有7种引物组合可检测克隆DH-JH靶，其产物长度在预期大小范围内。DH引物与来自其它DH家族的、重排过的基因片段的交叉退火仅仅非常弱或根本没有观察到。此外，健康对照中也观察到大小在正确范围内的扁桃体或MNC DNA PCR产物。利用非-模板特异性对照DNA，对于几乎所有引物组都没有观察到引物的非特异性退火；仅在DH2/JH引物组的情况现，在HeLa DNA中观察到(有时微弱)340-350bp产物。进一步测序显示该非特异性产物是由于DH2引物对JH4片段上游的DNA序列假引发(false priming)造成的。然而，由于该非特异性产物大小与任何真正DH-JH PCR产物的大小差异很大，决定不设计新的DH2引物。事实上，非特异性350bp带可用作成功DNA扩增的内部标记，由此反映模板DNA的质量，所述带在提供足够的克隆或多克隆DH-JH模板时(例如在扁桃体DNA或来自具体白血病样品的DNA中)，几乎不能观察到或仅为很微弱的带，但在包含少量具有DH-JH重排的淋巴细胞的样品中尤其强。
利用HD分析发现，将来自克隆参照样品的DNA的逐级稀释入扁桃体DNA通常导致敏感性为5％或更低(DH6-JH重排时为0.5-1％)；GS分析中的敏感性通常1-2个稀释步骤更好(1-2 dilution steps better)，即1％或更低。克隆DH7-JH靶仅可在敏感性为～10％时检测到，其最可能由在包括非-经过重排的种系DH7和JH基因片段的PCR扩增子中的引物消耗造成。
尽管最初的多元策略(如来自OLIGO 6.2-支持的引物设计提示)，是将各种DH引物分入两个试管，决定在检测各种多元方法后将除了DH7引物外的所有引物结合到一个试管中(IGH克隆系检测的试管D)，DH7引物包含在分离的试管中(IGH克隆系检测的试管E)。包括DH7引物的理由是复杂的种系模式，这是由于容易用非-重排的DH7片段扩增等位基因。利用这种两-试管的多元方法(two-tube multiplex approach)，所有克隆参照样品仍可检测。在多元条件下这些各种克隆靶的检测限与单检测(single assay)相比合乎逻辑地为次佳的，所述检测限的范围是～5％(DH3，DH4，和DH6)到～10％(DH2和DH5)。对于可得的DH1克隆参照样品，观察到敏感性～20％；在后一阶段，发现在多元检测法中细胞系KCA的DH1-JH重排在低至敏感性10％时是为可检测的。由于试管E仅含有DH7引物，对于该试管10％敏感性与前所述的相同。用500ng而不是100ng DNA的连续稀释进行相同的多元分析，所得敏感性稍好。在MNC DNA而非扁桃体DNA中利用连续稀释不明显影响DH-JH重组检测法的检测限。
一般检测阶段的结果
在参与引物设计的三个检测法室中进行初始检测后，进一步利用90个Southern印迹-确定的样品评估开发的IGHDH-JH多元PCR检测法。在4个实验室通过HD并在5个实验室通过GS分析平行分析每个样品，在另外两个实验室所有样品均通过所述两种技术分析。对于每个样品每管总共获得6个HD和7个GS分析结果。尽管大多数样品中的结果一致(＞80％的实验室具有相同结果)，9个显示试管D的结果在实验室间不一致。进一步分析显示这些可通过存在具有弱克隆产物的小克隆，或大体积的产物(-390和更大的)得以解释。在一些情况中所述产物非常大，使得仅在测序后才清楚它们涉及真实但延长的DH-JH重排，其可自上游的DH(例如DH6-25-DH1-26-JHNL-12中)或自下游的JH基因片段(例如PT-14中的DH6-25-JH4-JH5)。在其中的克隆产物利用试管E发现的所有三个病例中(NL-17，蕈样肉芽肿(mycosisfungoides)；FR-1，B-CLL；FR-5，FCL)，实验室间的结果完全一致。
当评估HD和GS分析的结果时，这些似乎是可比的，但通常在所得结果相同的实验室中，利用HD分析的实验室的数目高于利用GS分析的实验室的数目(图4B和C)。
直接比较DH-JH多元PCR结果与SB数据实际上不可能，这是因为在(IGHJ6)JH区中用单个探针进行杂交不能区分VH-JH和DH-JH重排。三个样品中，很明显结合的VH-JH和DH-JH检测的克隆产物的检测不符合(fit with)SB分析中IGH基因座的构型。明显地，在前滤泡性(pre-follicular)B-细胞恶性疾病中没有观察到克隆DH-JH PCR产物。反之，11/16 B-CLL样品和12/25(后(post)-)滤泡性B-细胞恶性疾病样品包含克隆重排的DH-JH PCR产物。在18个T-细胞恶性疾病病例的3个中可见克隆性DH-JH重排；这些涉及具有SB-检测到的IGH重排的T-LBL(ES-9)和蕈样肉芽肿(NL-17)病例，和一例不具有SB-检测到的IGH重排的T-NHL/EATL(PT-4)，可能由＜15％的低肿瘤负荷造成。所有15个反应性病例仅显示多克隆性DH-JH PCR产物，这与SB结果相符。在诊断困难的类型D中，三个样品(PT-12，GBS-10，和GBN-8)显示克隆性IGH DH-JH PCR产物，这与三个病例的两个中的SB数据以及IGICPCR数据相符；其它两个样品(PT-6和GBS-9)中(均为富含T-细胞的B-NHL病例)，发现克隆性DH-JH产物以及克隆性IGK和/或IGL产物，但没有来自SB分析的克隆系的证据，其最好可由这些样品中B-细胞克隆较小来解释。
为确定DH-JH PCR分析的其它价值，将所述结果与VH-JH PCR分析的结果进行比较。在5种(NL-4，PT-14，GBN-2，FR-7，NL-12)B-细胞恶性疾病中，发现克隆性DH-JH PCR产物，而仅观察到多克隆VH-JH PCR产物。
结论
结论是，基于最初和一般检测阶段，DH-JH PCR分析显示对克隆系评估有附加价值。尽管HD的分析结果可能稍微更容易解释，没有对HD或GS分析的明显偏向，这是由于它们都适合分析扩增的PCR产物。DH-JH PCR分析的可能困难是预期的PCR产物的大小范围相对较大，这是由于分散的引物位置以及自上游DH或下游JH基因片段的延伸的扩增，表示对于GS分析推荐较长距离(long run)。最后，DH7-27基因片段在IGH基因座中的不寻常位置导致在管E中的种系扩增产物的梯(ladder of germline amplificationproduct)，其中的克隆产物作为小得多的带/峰而容易被识别。
实施例3.IGK基因重排：Vκ-Jκ，Vκ-Kde/内含子RSS-Kde
背景
人IGK轻链基因座(染色体2p11.2上)包含许多不同Vκ基因片段(分成七个Vκ基因家族)以及Cκ区上游的5个Jκ基因片段。最初，Vκ基因片段根据Zachau等所述的命名法来命名。可选的命名法将Vκ基因片段分成7个家族，并用于ImMunoGeneTics数据库种。46。这里，我们根据后一命名法。Vκ1，Vκ2，和Vκ3家是包括功能性和假基因片段的多-成员家族，而另一家族仅含有单个(Vκ4，Vκ5，Vκ7)或一些片段(Vκ6)。70明显地，所有Vκ基因片段分散在两个大的复制性簇(duplicated cluster)中，一个在Jκ片段上游与所述片段紧邻且与该片段方向相同，另一个位于更远端(distal)并为反转方向(inverted orientation)(图5A)。71后者提示所谓的反转重排是形成涉及远端簇的Vκ基因的Vκ-Jκ连接所需的。此外对Vκ和Jκ片段，位于IGK基因座中的其它元件可参与重组。κ缺失型元件(kappa deleting element)(Kde)(Jκ-Cκ区下游大约24kb)，可与Vκ基因片段(Vκ-Kde)重排，但也可与Jκ-CK内含子(内含子RSS-Kde)中分离的RSS重排。24，27两种类型的重排都导致IGK等位基因的功能性失活，所述失活可通过缺失CK外显子(内含子RSS-Kde重排)或整个Jκ-Cκ区(Vκ-Kde重排)。
由于人IGK重组开始于骨髓中的前体B细胞，IGK重排也可在前体B细胞急性白血病(30-45％的等位基因，与年龄有关)中检出。尽管存在Vκ-Jκ连接，这些IGK重排主要涉及包括Kde的重组(25-35％的等位基因)。在儿童期前体B-ALL中，Vκ-Kde重组比内含子-Kde更有优势，而成人ALL所述缺失只涉及Vκ-Kde偶联。24，73，74在慢性B-细胞白血病中，IGK重排甚至更经常，可在所有等位基因的75％(Igκ+病例)或甚至95％(Igλ+病例)中检出。通过定义，功能性Vκ-Jκ重排见于Igκ+B-细胞白血病中的至少一个等位基因；非-编码型第二个等位基因存在于种系构型(germline configuration)中或通过Vκ-Kde(8％的等位基因)或内含子RSS-Kde(8％的等位基因)重组失活。Kde重排在Igλ+B-细胞白血病(～85％的等位基因)中常见，内含子RSS-Kde重组比Vκ-Kde重排稍占优势。这表明几乎所有Igλ+白血病都含有Kde重排，而可能的功能性Vκ-Jκ偶联相对非常少。24，75数个研究表明Vκ基因片段的利用在各种正常和恶性B细胞群中几乎相同并在很大程度上反映了每个家族中可得基因片段的数目。Vκ-Jκ以及Vκ-Kde重排中，来自前四个家族(Vκ1-Vκ4)的Vκ基因片段占优势。Vκ2基因利用在前体B-ALL中高于更成熟的B-细胞淋巴组织增生或正常B细胞中的所述利用。值得注意地，远端的反转的Vκ簇很少用于Vκ-Jκ重排，而Vκ假基因片段从不参与，也不参与到Igλ+病例中。76对于Jκ基因片段利用知之甚少，但少量的数据显示Jκ1，Jκ2和Jκ4最常用的Jκ基因片段。75
Vκ-Jκ重排可以是B-细胞增生的重要互补PCR靶，所述B细胞增生中的体细胞高变可妨碍VH-JH靶的扩增，但涉及Kde的重组很可能更有价值。Jκ-Cκ内含子中的干扰序列的缺失导致去除了IGK增强子，所述增强子被认为对于体细胞高变过程的出现很重要。涉及Kde的重排因此被认为无体细胞高变，并由此应该可相当容易地扩增。
引物设计
利用OLIGO 6.2软件，设计6种家族-特异性Vκ引物，其可识别七个Vκ家族的各种Vκ基因片段；Vκ6家族基因片段被Vκ1家族引物(图5B)覆盖(cover)。对于相对较大的Vκ1，Vκ2和Vκ3家族仅考虑功能性Vκ基因片段，这是由于同源性较低的假基因片段使得最佳引物设计变得非常复杂。设计家族-特异性Vκ引物，所述引物与两种Jκ引物的组(包括前四个Jκ片段的Jκ1-4及包括第5个Jκ片段的Jκ5)或Kde引物(图5B)联合使用。为分析Kde重排，制备了识别内含子RSS上游序列的另一正向引物。为显示与其它Vκ家族片段的最小交叉退火并仍可用于多元反应，可设计位于相似的RSS元件相对位置的各种引物(图5B)。Vκ-Jκ连接的预期PCR产物大小为～115-135bp(对于Vκ7-Jκ连接)到～280-300bp(Vκ2-Jκ重排)。对于Kde重排，产物大小为～195-215bp(Vκ7-Kde)到～360-380bp(Vκ2-Kde)，而内含子RSS-Kde产物为～275-295bp。
初始检测阶段的结果
对于单个引物的初始检测，使用数个细胞系以及具有精确确定的克隆Vκ-Jκ，或Vκ-Kde/内含子RSS-Kde重排的患者样品。具有Vκ-Jκ连接的患者样品大多与慢性B-细胞白血病有关，其另外基于高肿瘤负荷进行选择以便快速并敏感地检测所涉及的重排。不幸的是，克隆性参照样品不可用于所有Vκ-Jκ靶；尤其是涉及Vκ5，Vκ7和/或Jκ5的更少见的重排不在参照样品系列中显示。对于这些靶以及可利用克隆参照样品的靶，利用健康对照扁桃体或MNC DNA样品，其中确实观察到正确预期大小的PCR产物。唯一的例外是Vκ7/Jκ5引物组合；最可能是Vκ7-Jκ5连接在正常B细胞非常少见，使得这些PCR产物几乎不能或不能在扁桃体中检测到。大小在预期范围内的经重排的产物可在所有克隆参照样品中检出，所述检测在标准PCR条件利用1.5mM MgCl2和ABI Gold缓冲液或ABI缓冲液II进行。然而，在一些病例中具体Vκ-Jκ重排的弱扩增可用其它Vκ家族/Jκ引物组观察到，这是由于Vκ3引物与一些Vκ1基因片段的轻微交叉退火。此外，在一些克隆性参照样品中，用其它Vκ/Jκ或甚至Vκ/Kde以及内含子RSS/Kde引物组可见明显的其它克隆性PCR产物；在大多数样品中，这可通过两种IGK等位基因的完整构型来解释。多种克隆性PCR产物的出现说明IGK重排模式在给定细胞样品中的复杂性，这主要由两种克隆重排出现在一种等位基因(Vκ-Jκ和内含子RSS-Kde)上的可能性导致。这种复杂生并不阻碍反而支持了多克隆系(polyclonality)和单克隆系(monoclonality)的区分。
利用HeLa DNA作为非-模板特异性对照时，对于Vκ-Jκ和Vκ-Kde/内含子RSS-Kde引物组没有观察到引物的非特异性退火。在扁桃体DNA中连续稀释克隆性参照样品的DNA通常导致利用HD分析时Vκ-Jκ重排的敏感性为5-10％而Vκ-Kde重排的敏感性为1-10％。通常，GS分析的敏感性在大约一步稀释时更好(one dilution step better)。唯一稍有问题的靶是内含子RSS-Kde靶，其仅可在所用患者样品中的10％连续稀释中检测到。这可能由内含子RSS-Kde重排大量在来自用于稀释实验的Igκ+和Igλ+扁桃体B细胞的DNA中较充足这一事实造成。
检测两个不同多元PCR反应试管组成的数种方法后选出多元策略。在Vκ-Jκ试管(试管A)中，所有Vκ引物都与两种Jκ引物组合，而试管B含有所有Vκ引物以及内含子RSS引物与Kde反向引物的组合(图5B)。所有前述克隆性参照样品可利用该两-试管多元方法检测。需要注意的是这样一个观察，即非-克隆性扁桃体样品中，占优势的、似乎是克隆性的～150bp带可利用Vκ-Jκ多元试管A分析检出。该产物的存在(可见于HD分析但尤其可见于GS分析)，可通过Vκ-Jκ连接区的有限制的异源性解释，所述异源性导致高频率的平均大小为～150bp的产物。此外，一些样品中，有时在试管B中观察到弱404bp非特异性带。尽管平均来看敏感性稍好于其它多元方法(其中的Vκ引物被进一步分入多个试管)中的敏感性，仅用两个试管分析所有相关IGH重排的可能性最终是选择如图5B所示的两-试管多元方法的最重要依据。两-试管多元方法中的各种克隆性靶的检测限对于大多数克隆性Vκ-Jκ重排(Vκ1-Jκ4，Vκ2-Jκ4，Vκ3-Jκ4)而言为～10％，所述重排来自具有高肿瘤负荷的可提供信息的样品；数种Vκ-Kde靶可以以仍合理的敏感性～10％进行检测，但一些含有Vκ2-Kde，Vκ5-Kde以及内含子RSS-Kde靶的其它样品显示检测限高于10％。即使利用500ng而非100ng连续稀释的DNA几乎不能产生更好的敏感性，而MNC DNA中的连续稀释不影响所述检测限。然而，参照DNA在水中的连续稀释的检测限均为0.5-1％的级别，其显示所选多元IGK PCR检测等较好。重要的是要注意所用淋巴结或外周血中潜在的克隆性细胞群必须在多克隆细胞的背景中检出，其可阻碍敏感的克隆系检测，尤其是在具有相对高的多克隆B细胞本底(background)的样品中。
一般检测阶段的结果
初始检测以后在参与引物设计的四个实验室中，进一步用90个Southern印迹确定的样品来评估开发的IGK多元PCR检测。每种样品通过HD(五个实验室)和GS(两种实验室)分析进行平行分析，在另外四个实验室通过所述两种技术分析所有样品。总的来看，每种样品每试管可得8个HD和5个GS分析结果。在大多数样品中，＞80％的实验室产生相同的结果，即在一个或两个试管中的克隆带/峰或多克隆成片条带/曲线。然而，发现9个(～10％)样品存在实验室间的不一致，其在重复分析这些样品后保持。更详细的分析显示在至少6个病例中，不能容易地区分管A中大约150和200bp大小的克隆产物与大小几乎相同的多克隆产物。这是具体Vκ-Jκ分析中的固有困难，其由这些重排的相对限制的连接异源性导致。然而在两种样品中，试管B的结果在所有利用两种技术的实验室中非常明确，表明实际上没有差异。在一个样品中(ES-8)约500bp的大产物为造成不一致的实验室间结果的原因；进一步测序显示从下游Jκ片段开始的扩增导致延长的Vκ1-Jκ3-Jκ4 PCR产物的产生。
当评估来自HD和GS分析的结果时，这些似乎是可比的，但通常在显示相同结果的实验室中，利用HD分析的实验室的数目高于利用GS分析的实验室的数目(图5C和D)。值得注意地，在一个样品中(GBS-4)HD分析在两个试管中都显示明确的产物，而GS分析仅显示多克隆系。HD产物的克隆显示具体的Vκ3-Vκ5 PCR产物，其不能在其它任何样品中观察到；该产物的Vκ-Vκ构型解释了为什么它不能由标记的Jκ引物在GS分析中检测到。
PCR结果与SB数据的比较显示在前滤泡性B-细胞恶性疾病和B-CLL样品中没有SB-PCR差异；与SB分析中经重排的IGK带的存在一致，所有样品含有克隆性IGKPCR产物。反之，在25个(后-)滤泡性B-细胞恶性疾病样品中，利用两种技术时克隆性IGKPCR产物在四个DLCL病例(ES-5，PT-13，PT-14，FR-7)以及一个PC白血病(NL-19)病例中缺失，而仅在利用GS分析时在另一DLCL病例(GBS-4，见上文)中缺失。在所有病例中，这最可能由体细胞高变引起。有趣的是，在一个FCL病例(NL-4)中，发现克隆性PCR产物，而SB分析显示IGK基因的种系带(germline band)而在对IGH分析时显示弱的克隆带。在所有18个T-细胞恶性疾病病例和所有15个反应性病例(类别C)中，发现除了一个外周T-NHL病例(FR-10)外多克隆IGK PCR产物与SB结果一致。克隆TCR和IGK产物之后，该样品还显示克隆IGH和IGL PCR产物，但SB分析中没有克隆Ig重排，很可能反映了小的其它B-细胞克隆存在于该样品中。最后，在诊断较为困难的类别(D)中，两种样品(GBS-10和GBN-8)显示克隆性IGK PCR产物，这与SB数据一致；然而，在另外两种样品(PT-6和GBS-9)(均为富含T-细胞的B-NHL病例)中，发现了克隆性IGK PCR产物以及克隆性IGH和/或IGL产物，但没有来自SB分析的克隆系的证据。所述差异还很可能通过在这两个患者样品中的B细胞克隆体积较小来解释。
为确定分析IGK基因座的附加价值，我们比较了IGK PCR分析与IGHPCR分析的结果。在九个样品的五个(ES-2，NL-4，PT-8，GBN-2，ES-8)中(其中没有发现克隆性VH-JH PCR产物)，克隆产物可轻易在IGK分析中观察到。当同时考虑VH-JH和DH-JH分析时，在这些用于检测克隆性Ig PCR产物的三个病例中，IGK PCR分析仍与IGH PCR分析互补。
结论
结论是，基于初始和一般检测阶段以及利用这些多元分析在病例确定的淋巴组织增生系列中所得的初步证据，IGK基因座的PCR分析对于克隆系检测具有明确(附加)的价值。然而，应注意具体对在试管A中的似乎是克隆性的带的说明，这是由于固有的有限IGK连接异源性。由于该问题在GS分析中尤其明显，HD分析稍稍由于GS分析，但应该指出一些情况下，GS分析可促进结果的适当解释。另一可能的陷阱是预期经重排的IGK产物的相对较大的大小范围，这是由于分散的(scattered)引物位置，以及从下游Jκ基因片段开始的延长的扩增。这表明对于GS分析推荐较长距离(long run)。最后，IGK基因座中的多重重排(在同一等位基因上的Vκ-Jκ和Kde重排)的固有复杂性，以及Vκ引物的低水平交叉退火，有时可导致具有多重带或峰的模式，这与寡克隆系(oligoclonality)相似。然而，考虑到这些，两-试管IGK多元PCR系统在基于PCR的克隆系诊断中是有价值的。
实施例4.IGL基因重排
背景
IGL基因重排存在于5-10％的Igκ+B-细胞恶性疾病和所有Igλ+B-细胞恶性疾病中。75因此Vλ-Jλ重排可代表用于克隆系研究的另一有吸引力的PCR靶，以补偿主要由体细胞突变导致的假阴性IGH VH-JH PCR结果。IGL基因座在染色体22q11.2占据1Mb。77-79在900kb的长度上有73-74个Vλ基因，其中有30-33个是功能性的(图6A)。根据序列同源性，Vλ基因可分为11个家族和三个异种集团(clans)。同一家族的成员倾向于在染色体上形成簇。Jλ和Cλ基因串联排列，Jλ片段位于Cλ基因前。通常有7个J-Cλ基因片段，其中J-Cλ1，J-Cλ2，J-Cλ3和J-Cλ7是功能性的，并编码四个Ihλ同种型(图6A)。80，81然而在许多J-Cλ基因片段中存在多态性变异，这是由于一些个体可携带多至11个所述基因片段，这是由于Cλ2-Cλ3区的扩增导致的。82 83
一些研究显示正常和恶性B细胞的IGL基因库都是被偏向的(bias)。48，49，84，85因此正常B细胞利用的Vλ基因的90％以上属于Vλ1，Vλ2和Vλ3家族，其中包括60％的功能性基因。此外，三种基因(2-14，1-40，2-8)占表达的库的一半。而正常B细胞利用基本相同比例的J-Cλ1，J-Cλ2和J-Cλ3基因片段，肿瘤B细胞倾向于主要利用J-Cλ2和J-Cλ3基因片段。49在正常和恶性B细胞中，J-Cλ7都很少使用(1％)。然而后一发现受到正常细胞的单个-细胞研究(single-cell study)的挑战，所述单个-细胞研究发现一半以上的重排利用J-Cλ7基因片段。86反之对于小鼠，由于外切核酸酶活性和人IGL基因重排中的N核苷酸添加，存在一些连接多样性(junctional diversity)。82，85-87然而，它的广泛性比IGH基因座的广泛性小很多，且许多重排由种系Vλ和Jλ基因片段的直接偶联导致。然而，IGL基因座可能代表用于B细胞克隆系研究的、与IGH互补的可选基因座。
引物设计
考虑到被偏向的Vλ库，我们选择仅扩增利用Vλ1，Vλ2和Vλ3基因片段的重排。在相同家族成员之间高同源性的区中设计识别Vλ1和λ2基因片段的单个共有序列引物以及Vλ3引物(图6B)。初始检测显示它们在多元检测法中分别起到良好作用。实际上，当分别使用Vλ引物时，可观察到与Vλ1或Vλ2基因(或反之)杂交的Vλ3引物的交叉退火；但在多元PCR中不能见到。
为Jλ1，Jλ2和Jλ3基因片段设计单个共有序列引物，并且所述引物与每个种系序列相比在其中心部分具有一个错配。在初步的检测中，发现所述引物所得结果比完美匹配的Jλ1和Jλ2-Jλ3引物组合所得结果更好。由于单检测报道了在正常B细胞中频繁利用Jλ7基因，86我们还设计了Jλ7特异性引物。当在各种多克隆B细胞样品上检测时，我们几乎不能在HD分析中检测到信号，这与利用Jλ1，Jλ2-Jλ3或Jλ共有序列引物在相同样品上进行的扩增相反。类似地，当分析单克隆B细胞肿瘤的集合时，我们不能利用该引物检测到任何重排。基于这些结果以及文献中的报道49，我们推论未经证实的高频率Jλ7重排(在单个研究中)86由技术缺陷导致，并因此我们决定不包括Jλ7引物。PCR检测法用于检测IGL基因重排克隆系研究因此由含有三种引物的单个试管组成(图6B)。预期该单个试管可检测绝大多数重排。
初始检测阶段的结果
对于一组单克隆和多克隆样品的初始检测显示它们可通过在10％聚丙烯酰胺凝胶电泳上对PCR产物进行HD分析来很好地区分(图6C)。克隆性IGL重排见于同源双链区，在异源双链区有一种或有时两种较弱的带，而多克隆重排显示为异源双链区中的成片条带(图6C)。没有观察到非特异性带。应注意由于连接区大小有限，很难通过单纯的聚丙烯酰胺凝胶电泳而不进行异源双链形成来区分多克隆与单克隆重排。由此，证实通过GS分析PCR产物较不直接(图6C)。可明确鉴定单克隆重排，而多克隆重排模式由于有限的连接多样性具有寡克隆的方式(oligoclonal aspect)。其解释更为困难，尤其是对于区别多克隆病例与具有多克隆B-细胞背景中的次要(minor)克隆性B-细胞群的那些病例而言。我们因此推荐HD分析作为分析IGL基因重排的方法。
当肿瘤DNA在PB-MNC稀释时，在数个病例上进行的所述检测的敏感性证明约5％(2.5％-10％)，当在淋巴结DNA中稀释时所述敏感性为约10％(5％-20％)。
一般检测阶段的结果
单-试管IGL PCR检测法在一系列90 Southern印迹确定的淋巴系统增生进行评估。该检测法由9个实验室进行。四个仅利用HD分析，一个仅利用GS分析，四个利用所述两种技术。克隆性IGL基因重排在19个病例中检出。其中的15个病例在9个实验室中获得高于70％的一致性。在4个病例中获得低于70％的一致性，这可通过其中三个(ES-12，GB-10和FR-10)中的次要克隆性IGL基因重排解释。在第四个病例中的不一致性病例(PT-11)没有得到解释，具体因为没有通过Southern印迹检测到IGL基因重排。如从初始检测推定的，GS分析的解释比HD分析的解释更难，尤其在次要克隆群的病例中。在这19个克隆性IGL基因病例中，17个为B-细胞增生(16个为成熟B细胞，1个为前体B细胞)。一个病例(ES12)符合霍杰金氏病(Hodgkin’sdisease)，而另一个(FR-10)符合T-NHL。两种都仅具有次要克隆IGL基因重排，且FR-10还显示克隆性IGK基因重排。
比较Southern印迹数据显示一些不一致性。6个通过PCR显示为具有克隆性IGL基因重排的病例通过Southern印迹分析显示为多克隆的。其中三个(PT-6，ES-12，FR-10)涉及次要克隆群，其可低于Southern印迹技术的敏感性水平。在三个其它病例(NL-19，ES-1，PT-11)中，在Southern印迹上由于IGL基因座的相当复杂的重排模式而没有见到克隆重排的带。26，49反之PCR检测法不能检测克隆重排，所述克隆重排可通过Southern印迹分析在两个病例(GBS-6，FR-5)中显示。然而存在这样的滤泡性淋巴瘤，其中高程度体细胞高变可阻止IGL基因引物的退火。
结论
结论是，仅含有三种引物(图6B)的、用于检测IGL基因重排的单-试管PCR检测法允许检测绝大多数IGL基因重排(Vλ1，Vλ2，和V3基因重排)。异源双链分析是优选的分析方法，尽管可利用GeneScanning分析，但最重要的是注意避免由于有限的连接多样性而不合理地解释(overinterpretation)克隆系。
实施例5：TCRB基因重排：Vβ-Jβ，Dβ-Jβ
背景
TCRB基因的分子分析是评估可疑T-细胞增生中的克隆系的重要方法。TCRB基因重排不仅出现在几乎所有成熟T-细胞恶性疾病中也见于约80％的CD3阴性T-细胞急性淋巴母细胞白血病(T-ALL)以及95％的CD3阳性T-ALL中。28TCRB重排不限于T-系恶性疾病，这是由于约三分之一的前体B-ALL含有经重排的TCRB基因。30它们的频率在成熟B细胞增生中要低得多(0到7％)。21
人TCRB基因座位于染色体7的长臂、带7q34并占据685kb的区。与TCRG和TCRD基因座相反，TCRB基因座的V区基因簇要复杂得多(图7A)。1它包含约65个Vβ基因元件，所述元件采用两种不同命名法：一种由Arden等总结50，其根据Wei等的基因命名88并将Vβ基因分成34个家族。另一命名法由Rowen等提议，51进一步将30种Vβ基因分成亚组并后来被IMGT采纳，IMGT为International ImMunoGeneTics数据库 http://imgt.cines.fr(发起人和协作者：Marie-Paule Lefranc，Montpellier，France).[Lefranc，2003#212；Lefranc，2003#219]最大的家族Vβ5，Vβ6，Vβ8和Vβ13(Arden命名法)分别达到7，9，5和8个成员。有12个Vβ家族仅含单个成员。通常，所述家族相互之间有明显的界限。50在本报告中我们遵循Arden命名法。50
39-47个Vβ基因元件为功能性的并属于23个家族。7-9个非功能性Vβ元件具有开放读框但在拼接位点、重组信号和/或调节元件包含变异。10-16种被分类为假基因。此外，据报道6个非-功能性孤儿Vβ基因的簇位于染色体9的短臂(9p21)。89，90它们不在转录物中检测到。50，51
除了一个Vβ基因以外的所有Vβ基因都位于两个Dβ-Jβ-Cβ簇的上游。图7A显示了两种Cβ基因片段(Cβ1和Cβ2)的前接Dβ基因(Dβ1和Dβ2)以及包含6个(Jβ1.1-Jβ1.6)和7个(Jβ2.1-Jβ2.7)功能性Jβ片段的Jβ簇。Jβ区基因座根据它们的基因组定位而不是序列相似性而分成两个家族。51，88，91
由于大的种系编码的库，TCRB基因重排的组合多样性与TCRG和TCRD重排的相比更为广泛。TCRβ分子的初级(primary)库通过添加平均3.6(V-D连接)和4.6(D-J连接)个核苷酸并缺失平均3.6(V)，3.8(D的5′)，3.7(D的3′)和4.1(J)个核苷酸进一步扩大。51完整高变区是V，D和J片段的连接的结果，所述片段特征性地包括9个或10个密码子。大小变化是有限的，这是由于7-12个残基占所有功能性重排的80％以上，与IGH CDR3区的广泛(broad)长度库相反。92
在早期T-细胞发育过程中，TCRB基因的重排由两个连续步骤组成：Dβ与Jβ重排以及Vβ与D-Jβ重排，这两个步骤间隔一到两天。93Dβ1基因片段可连接Jβ1或Jβ2基因片段，但Dβ2基因片段通常仅与Jβ2基因片段连接，这是由于Dβ2基因片段的位置在TCRB基因的基因座中。28，51由于存在两个连续的TCRB D-J簇，还可能在一个等位基因中检测到两种重排：不完全TCRBDβ2-Jβ2重排以及TCRBDβ1-Jβ1区中的完全或不完全重排。1
在TCRB基因重排中，可见非随机分布基因片段的利用。健康个体中，一些Vβ家族(例如Vβ1-Vβ5)在外周血T-细胞库中占优势，而另一些仅仅很少使用(例如Vβ11，Vβ16，Vβ18，Vβ23)。Vβ库的平均值在老化(aging)过程中似乎稳定，但老年人中的标准偏差增加。13，94人胸腺中一些Vβ基因片段也占优势：最有优势的七个Vβ基因(Vβ3-1，Vβ4-1，Vβ5-1，Vβ6-7，Vβ7-2，Vβ8-2，Vβ13-2)占完整功能性TCRB库的将近一半。95J片段通常也远远超过相等(farfrom even)。Jβ2家族是比Jβ1家族更常用(对于TCRB重排为72％相对于28％)。96具体地，Jβ2.1的比例高于预期(24％)，然后是Jβ2.2(11％)和Jβ2.3和Jβ2.5(10％每种)。95
TCRB基因重排模式在各种类型的T细胞恶性疾病之间有差异。TCRBDβ-Jβ2簇中的完全TCRB Vβ-Jβ1重排和不完全重排的等位基因在TCRαβ+T-ALL中比CD3-T-ALL和TCRγδ+T-ALL中更为常见。28所有T-ALL的组中，TCRBDβ-Jβ1区相对频繁地参与重排，这与前体-B-ALL中的交叉系TCRB基因重排相反，后者仅仅涉及TCRBDβ-Jβ2区。30，73
抗大多数Vβ区单克隆抗体的开发有助于鉴定Vβ家族扩大。13然而，TCR基因重排分析对于T细胞淋巴组织增生性疾病中的克隆系评估必不可少。由于限制的种系编码的TCRG和TCRD基因座库促进基于DNA的PCR方法，建立各种PCR方法以检测TCRG和TCRD基因重排。97-99然而，TCRG重排的有限的连接多样性导致正常T细胞中类似重排的高背景扩增(background amplification)(实施例6)。另一方面TCRD基因在大多数成熟T细胞恶性疾病中缺失。21因此基于DNA的TCRBPCR技术是克隆系评估所需的。此外，TCRB重排对于淋巴组织增生性疾病的随诊研究很有用，因为TCRB重排的广泛组合库以及大的高变区使得可高度特异性地检测临床隐蔽的(occult)残留肿瘤细胞。然而，广泛的种系编码的库使得PCR检测法更加困难。一些公开的PCR方法采用耗时的多试管法，所述方法利用一组家族-或亚家族-特异性引物。96，100利用高度简并的共有序列引物限制了在理论上可由引物检测出的可检测的重排数，这是由于没有具有足够同一性的单个共同序列以允许对所有可能的重排的可信的扩增。42，101，102一些公开的实验利用需要附加PCR反应的嵌套(nested)PCR。42，102其它实验的焦点在于分析TCRB Vβ-Dβ-Jβ-Cβ转录物以限制所需引物数。16，100，103然而，这些基于mRNA的方法的主要缺陷在于需要新鲜或冷冻物质以及PCR扩增以前的反转录步骤。
我们试图克服这些限制通过创造完全新的且方便的基于DNA的TCRBPCR。我们设计了多重Vβ和Jβ引物，其包括所有功能性Vβ和Jβ基因片段并适合在多元PCR反应中组合。此外，所述实验可用于HD和GS分析，并也可利用相同Jβ引物组检测不完全TCRBDβ-Jβ重排。为了避免由于交叉引发(cross priming)造成的问题，我们决定设计位于每个基因片段的相同保守区的所有Vβ和Jβ引物。
引物设计
开始设计了总共23种Vβ，2种Dβ(Dβ1和Dβ2)和13种Jβ(Jβ1.1-1.6和Jβ2.1-2.7)引物，所述所有Vβ和Jβ引物位于每个Vβ和Jβ基因片段的相同保守区，使得多元反应中交叉退火的影响可忽略。此外，罕见的多克隆TCRB V-J重排即使不产生完全多克隆Gaussian峰模式也不会被误认为是克隆重排，因为所有可能的经重排的PCR产物在相同大小范围内。对于引物设计，只要可能就将可重排的假基因或开放读框基因考虑在内，其在剪接位点，重组信号和/或调节性元件中具有变异或保守氨基酸的改变。然而，主要的目的是覆盖(cover)所有功能性Vβ基因。利用寡6.2软件检测每种Vβ引物对于每种Vβ基因的引发效率。这导致不严格Vβ家族特异性的引物，其中一些覆盖一个以上家族的Vβ基因片段(图7B)。由于13Jβ引物与每种Jβ基因引物的相同片段退火，二聚化使得需要将J引物分入两个试管。开始，计划在四组多元反应中如下利用所述引物：所有23种Vβ引物和6种Jβ1家族引物(240-285bp)的组合，所有23种Vβ引物和7种Jβ2家族引物(240-285bp)，Dβ1(280-320bp)和6种Jβ1引物，和Dβ1(280-320bp)加Dβ2(170-210bp)及7种Jβ2家族引物。
初始实验阶段的结果
每种可能引物组合的初始单元(monoplex)实验利用已知具有单克隆TCRB重排和多克隆对照的样品进行。产生的预期大小范围的PCR产物，其中多克隆样品的产物强度和信号图谱有差异，所述差异有赖于利用不同Vβ和Jβ基因片段的频率。然而，当引物在多元反应中组合时，一些Jβ2重排具体地被遗漏(miss)，并观察到试管B和D中的非特异性产物。此外Jβ1和Jβ2引物之间的交叉引发导致解释问题。结果，须重新设计Jβ2引物，且不同试管中的引物组合须重排：Jβ引物Jβ2.2，2.6和2.7稍经修饰并加入试管A。引物Jβ2.1，2.3，2.4和2.5的定位向下游移动4bp以避免引物二聚化以及剩余Jβ引物的交叉引发。利用特异性模板DNA，仅大小在预期范围以外的、具有不同的强度的非特异性带保持在试管B(带＜150bp，221bp)和试管C(128bp，337bp)中。然而，因为所有非特异性扩增产物的大小在TCRB特异性产物的范围以外，它们不影响解释并且认为它们不是问题。然而，利用非特异性模板对照，一个另外的弱273bp带非特异性(aspecific)峰在试管A中可通过GS显示。该产物当所述DNA含有足够的克隆或多克隆TCRB重排时被完全抑制，但可出现在包含少量淋巴细胞的样品中。在初始试验阶段，产生相对弱的V-D-J PCR产物。因此我们通过增加MgCl2浓度和Taq聚合酶的量优化了用于完全V-D-J重排的PCR条件。利用高度纯化的引物以及应用ABI缓冲液II取代ABI Gold缓冲液也非常重要。对于不完全Dβ-Jβ重排的检测，最终可将所有Jβ引物混合到一只试管中而不会丧失敏感性或信息。因此，多元反应的总数可减少到三个试管。
最终确定的引物组是(图7B)：
试管A：23种Vβ引物和9种Jβ引物：Jβ1.1-1.6，2.2，2.6和2.7
试管B：23种Vβ引物和4种Jβ引物：Jβ2.1，2.3，2.4和2.5
试管C：Dβ1，Dβ2和所有13种Jβ引物。
由于试管A和C含有Jβ1和Jβ2引物，用不同染料差异标记Jβ1和Jβ2引物(TET用于Jβ1.1-1.6和FAM用于Jβ2.1-2.7引物)允许在试管A和C反应中通过GS区分Jβ1或Jβ2利用(见图13A)。
敏感性检测通过稀释实验利用各种细胞系和患者样品以及MNC中克隆重排的TCRB基因进行。单PCR稀释试验(single PCR dilution experiment)的敏感性水平通常为至少0.1％-1％。如所预期的，敏感性在多元检测法中降低，这可能是由于背景扩增的增加。尤其在GS分析中，由于TCRB PCR产物相对小的长度变化该背景会阻碍解释。然而，利用异源双链分析或GeneScanning检出的46个阳性对照中有40个的敏感性为至少1％-10％(表6)。
一般实验阶段的结果
参与DNA的分析的11个组利用TCRB多元方案，所述DNA来自90例Southern印迹确定的恶性和反应性淋巴组织增生性疾病。两个实验室中通过HD分析每个样品，6个实验室中利用GS分析每个样品。其它三种实验室利用两种技术进行PCR分析(图7C，D和E)。该实验阶段以及使用这些TCRB PCR检测法所得的经验激发了关于该方案的一些一般问题，所述问题的一部分已经在初始试验阶段描述过：1.TCRB PCR产物的有限的长度变化可阻碍在多克隆背景中通过GS检测克隆信号。2.仅预期大小范围内的带/峰代表克隆性TCRB基因重排。尤其对于试管A，非特异性对照DNA必须被包含以定义出现在没有竞争的情况下的非特异性273bp峰。3.非常重要的是利用高度纯化的引物和ABI缓冲液II(和不是ABI Gold缓冲液)以获得良好的PCR结果，并利用推荐的PCR产物制备方案进行HD分析。所给的90个Southern印迹-确定的病例中，29例对于单克隆TCRB重排是SB阳性的。这些克隆重排中有25种(86％)也可通过TCRB PCR检测法。23种重排通过GS和HD分析显示，两种另外的病例仅通过HD显示。一个GS阴性HD阳性病例(FR-9)通过参与一般实验阶段的9个实验室中的4个进行的GS分析而被解释为是单克隆的(图7C)。然而，由于明显多克隆背景，GS模式的解释在该具体病例中较困难。其它GS阴性HD阳性病例显示试管C中大小约400bp的不典型PCR产物(图7E)。PCR产物在琼脂糖凝胶和HD分析中明显可见但在GS中不明显。对该片段进行DNA测序后，鉴定了TCRBDβ1-Dβ2扩增产物，其可解释未标记的PCR产物。四个SB阳性病例(NL-15，NL-16，GBN-2和FR-6)既不能通过GS也不能通过HD分析检测，它们都具有潜在的(underlying)B淋巴系统恶性疾病。可能解释该失败的是不典型重排(例如不完全Vβ-Dβ重排)，28，104重排的Vβ基因片段的序列变异51或对于具体重排缺乏敏感性。
通过SB，认为62个样品是多克隆的。这些病例中的61(98％)的PCR结果在利用至少一种方法的分析时一致，57(92％)个病例结果在利用两种方法时是一致的。通过HD和GS分析发现一个单克隆的SB阴性样品(ES-14)显示不完全Dβ2-重排。对于四个样品获得不一致的结果：通过GS发现一种样品(GBS-4)是克隆的，但所述结果仅由50％通过HD分析PCR产物的实验室获得。仅可通过HD分析发现三个样品(ES-6，GBS-9和DE-2)产生弱克隆信号。TCRB重排的亚克隆对于通过SB分析的检测而言太小，其仅可通过更敏感PCR方法学显示。在B细胞恶性疾病中，检测到的重排也可代表残留T细胞的克隆性或寡克隆性扩增。105在该病例中，这些弱克隆PCR产物应不被认为是克隆性T细胞疾病的证据。这强调了根据其它诊断实验以及患者临床情况解释PCR结果的重要性。TCRB重排的最佳PCR评估是通过联合利用HD和GS分析获得的。敏感性在两种检测方法中可存在差异，其可分别作为克隆PCR产物大小和多克隆大小分布的函数：一方面HD分析分散来自克隆产物的多克隆背景，另一方面大小在主要范围之外的PCR产物允许更敏感的GS检测。假-阳性结果的可能性在联合利用HD和GS分析时也降低。此外，HD分析允许检测一些其它不典型TCRB Dβ1-Dβ2重排，所述不典型的重排不能通过PCR产物的GS分析检测，这是由于标记的引物不参与扩增。然而，GS分析是通常能为具有高肿瘤负荷的样品提供更多信息的方法，这是因为显示了单克隆PCR产物的确切大小(其可用于监测目的)，并且区别标记的Jβ引物提供关于了Jβ基因利用的其它信息。
结论
结论是，三-试管TCRB多元PCR系统提供了具有空前高的克隆系检出率的、新的且方便的实验，所述实验可用于评估可疑T细胞增生中的克隆系。
实施例6：TCRG基因重排
背景
TCRG基因重排长期用于淋巴系统克隆系的DNA PCR检测法并代表有限制的库靶的“原型”。其为克隆系分析的优选靶，这是由于它在早期T淋巴细胞发育中于TCRαβ和TCRγδ1系前体中进行重排，很可能就在TCRD之后。106其在超过90％T-ALL，T-LGL和T-PLL，50-75％外周T-NHL和蕈样肉芽肿中进行重排，但不在真正的NK细胞增生中进行重排。它也在B系ALL的主要部分中重排，但在B-NHL中要少得多。1，30，73和数种其它IIg/T-CR基因座不同，完整的基因组结构已经已知多年。其包含有限数目的Vγ和Jγ片段。利用有限数目的4Vγ和3Jγ引物可扩增所有主要Vγ-Jγ组合。
染色体7p14上的人TCRG基因座包含14个Vγ片段，仅其中的10个显示经历重排(图8A)。表达的Vγ库包括仅6个Vγ基因(Vγ2，Vγ3，Vγ4，Vγ5，Vγ8和Vγ9)，但重排也见于ψVγ7，ψVγ10，γψVγ11片段。107，108ψVγB(也已知为Vγ12)的重排107是非常少见的，其很少用于诊断性PCR策略中。重排的Vγ片段可在分成属于VγI家族的那些(VγfI：Vγ2，Vγ3，Vγ4，Vγ5，ψVγ7和Vγ8；总体同源性＞90％，且最高同源性存在于Vγ2和Vγ4之间以及Vγ3和Vγ5之间)，单成员Vγ9，ψVγ10，ψVγ11家族的那些。TCRG基因座含有五个Jγ片段：Jγ1.1(JγP1)，Jγ1.2(JγP)，Jγ1.3(Jγ1)，Jγ2.1(JγP2)，Jγ2.3(Jγ2)，其中Jγ1.3和Jγ2.3高度同源，Jγ1.1和Jγ2.1也高度同源。109
虽然限制性TCRG种系库促进PCR扩增，TCRG重排的有限的连接多样性使得克隆的和多克隆的PCR产物之间的区分复杂化。TCRG基因座不含有D片段并显示相对有限的核苷酸添加。TCRG V-J连接长度因此可改变20-30bp，而对IGH和TCRD而言可改变大约60bp。区别克隆的与多克隆的TCRG重排有赖于多克隆库的复杂性。通常，利用频繁的Vγ-Jγ重排诸如VγfI-Jγ1.3/2.3的次要克隆群可能在多克隆库中丢失(lost)，而少见的组合将以更高的敏感性检出。然而，有时显示很少的Vγ-Jγ重排的多克隆T淋巴细胞可与克隆性重排混淆，这是由于对于该类型的重排缺乏多克隆背景。假阳性结果的另一可能来源由于显示“规范的(canonical)”TCRG重排的TCRγδ表达型T淋巴细胞的存在造成，其不显示N核苷酸添加。最常被识别的人规范TCRG重排包括Vγ9-Jγ1.2片段并出现于大约1％的血T-淋巴细胞。110，111因此注意利用高分辨率电泳技术分析TCRG PCR产物或根据标准而不是仅仅根据大小来分离PCR产物以降低假阳性结果的可能性是非常重要的。注意规范重排的图谱以及它们通常出现的情况也是重要的。规范的Vγ9-Jγ1.2重排，例如主要见于外周血并其频率随年龄增加，这是由于它们导致TCRγδ+T-淋巴细胞的累积。19
与TCRD不同，TCRG在TCRαβ系细胞不被缺失。由于TCRG重排出现在TCRαβ和TCRγδ系前体中，它们的鉴定不能用于确定T细胞系类型。类似地，TCRG重排出现在60％的B系ALL中，30表明它们不能用于评估不成熟增生中的B对(vs.)T细胞系。然而，它们出现在成熟B淋巴组织增生包括大部分B-NHL1中的频率低得多，并可由此与临床以及免疫基因分型数据联合使用以确定参与成熟淋巴组织增生的系。
有限的种系库允许确定Vγ和Jγ片段的利用，可通过Southern印迹或PCR分析来进行。鉴定Vγ和Jγ利用不是为纯研究目的，这是由于特异性扩增是MRD分析所需的。112
我们着手开发最少数目的多元TCRG策略，其可保持最佳敏感性和信息性(informativity)，最小化出现假阳性结果的可能性，并允许简单的Vγ和Jγ鉴定，包括通过HD分析或单荧光(monofluorescent)GS策略。我们选择包括Vγ引物，其可检测除ψVγB(ψVγ12)以外的所有重排片段，这是由于ψVγB(ψVγ12)的罕见性所致的。为了降低错误鉴定规范的重排作为克隆产物的可能性，我们排除了Jγ1.2引物，由于它很少与淋巴系统肿瘤相关并通常但不总是与其它等位基因上的TCRG重排相关。113
引物设计
我们最初开发了3Vγ和2Jγ引物，所述引物用于两种多元反应，如下：一个试管具有Jγ1.3/2.3以及Vγ9特异性(160-190bp)，VγfI共有序列(200-230bp)和Vγ10/11共有序列(220-250bp)，第二个试管具有Jγ1.1/2.1以及Vγ9特异性(190-220bp)，VγfI共有序列(230-260bp)和Vγ10/11共有序列(250-280bp)。Vγ利用是为由HD分析通过PCR产物大小进行鉴定。意图使得Jγ1.3和Jγ2.3或Jγ1.1和Jγ2.1之间没有区别。
初始实验阶段的结果
虽然所有Vγ-Jγ组合都可在单次PCR扩增上产生预期图谱，多元扩增导致较大PCR产物的竞争，同时优先扩增较小的片段，并不能检测一些VγfI和Vγ10/11重排。这通过Vγ10/11共有序列和VγfI引物之间有意义的引物二聚物形成而被进一步复杂化。大小不同的片段之间的竞争以及引物二聚物形成都导致不满意的敏感性及信息性，并且该策略由此被放弃。
我们推定竞争可通过分离大多数常用Vγ引物(VγfI和Vγ9)并将它们分别与Vγ10和Vγ11特异性引物结合而被最小化。后一重排很少使用，并因此可最小化优势(predominant)库的竞争。Vγ10/11共有序列引物因此被两种特异性Vγ引物置换，后者产生较小的PCR产物(图8B)。通过混合Jγ1.3/2.3和Jγ1.1/2.1，可能保持两-试管多元，其允许基于Vγ利用的产物大小通过HD分析以及基于Jγ和Vγ利用的产物大小通过GS分的大致鉴定。
认可的、具有四种Vγ和两种Jγ引物的多元TCRG PCR试管组包括(图8B)：
试管A：VγfI+Vγ10+Jγ1.1/2.1+Jγ1.3/2.3
试管B：Vγ9+Vγ11+Jγ1.1/2.1+Jγ1.3/2.3
引物的位置和序列显示于图8B。这些引物在单和多元PCR模式中产生令人满意的扩增并允许检测几乎所有已知Vγ-Jγ组合。较大PCR片段的竞争不再出现，尽管不能排除可出现Vγ9或VγfI重排的一些竞争，条件是它们存在于次要群体中。敏感性检测可在1％-10％之间变化，其可作为多克隆库和克隆重排相对于多克隆Gaussian峰的位置的函数。114解释ψVγ11重排可较困难，这是由于正常库非常有限并由于这些最初的重排通常存在于亚克隆中。
由于Vγ4片段比其它VγfI成员长大约40bp，且Vγ4重排在生理性和病理性淋巴细胞中相对常见，多克隆库倾向(skewed towards)体积较大的片段，而且克隆性Vγ4-Jγ1.3/2.3重排可在理论上被误认为是VγfI-Jγ1.1/2.1重排。不同库的接近性使得Vγ和Jγ鉴定更可信，条件是使用差异标记的Jγ引物。例如，在单个中心中检测TET-la为led Jγ1.1/2.1和FAM标记的Jγ1.3/2.3的利用并显示其可产生令人满意的结果(图13B)。然而可根据GS分析仅基于大小来估计Vγ和Jγ的利用(图8C和D)。
一般实验阶段的结果
由于有限的种系TCRG库和有限的连接多样性，经过TCRG重排的反应性T淋巴细胞将作为通过GS分析的明显的克隆群而进行迁移，所述重排利用具有长度相同的可变CDR3序列的单个Vγ和Jγ片段。HD形成将更容易地分散这些重排，并从而将防止它们被错误地解释作为淋巴克隆系的证据。反之，与HD分析相比，GS分析提供改进的分辨率和敏感性。如果这不可能，可优选单独的HD分析，这是由于其可与假阴性结果的可能性相关，而单独的GS分析将增加假阳性结果的几率。
通过Southern印迹在90个病例种检出的18种TCRG重排种，16种也可通过PCR检出。通过Southern在NL-1寡克隆病例中检出的次要Vγf1-Jγ1.3/2.3重排，仅通过PCR在部分进行GS分析的实验室中检出。HD和GS所有实验室都发现在GBS-6中检出的主要Vγ9-Jγ1.3/2.3重排是多克隆的，因此可能代表假阴性结果。
比较等位基因鉴定显示，对于通过Southern印迹鉴定的所有等位基因，基于大小的PCR Vγ和Jγ鉴定给出一致的结果。7种重排可通过Southern印迹检出，但精确的等位基因鉴定是不可能的。其中的6种是由于Jγ1.1/2.1的利用，提示PCR允许优先检测该该类型的重排。
通过Southern发现72种样品为多克隆的。通过TCRG PCR显示其中的16个(22％)具有总共24种重排。其中，13种(81％)是B淋巴系统增生。24种克隆重排中的16种是次要的，其中的15种仅可通过GS在大部分实验室中检出。值得注意，在这些次要重排中，9种(39％)涉及ψVγ10片段且8种(33％)Vγ9.ψVγ11重排没有被检出。没有ψVγ10重排是通过Southern印迹分析检出的。因此PCR允许更敏感地检测次要克隆ψVγ10重排，具体是通过GS分析。很可能这些重排代表残留的、占优势的TCRαβ系，T淋巴细胞具有限制的库，其可能于潜在的B淋巴系统恶性疾病相关或不相关。这些次要峰应当明显不能解释为克隆性T细胞疾病的证据。它们强调了在利用TCRG基因座作为淋巴克隆系诊断装置(lymphoid clonality diagnostic setting)之前理解TCRG重排性质的重要性。因此，在它们的临床背景中解释TCRG基因结果也是非常重要的。
结论
结论是，两个TCRG多元试管允许检测绝大多数克隆性TCRG重排。由于不合理地解释次要克隆峰导致的假阳性结果的潜在可能性可通过联用异源双链分析和GeneScanning以及通过在它们的临床背景中解释结果而最小化，具体是当明显克隆系涉及ψVγ10和ψVγ11片段时。与TCRB分析相比，TCRG对检测克隆性T淋巴组织增生疾病相对优点应当预期性地(prospectively)研究。它们很可能代表互补的策略。
实施例7.TCRD基因重排：Vδ-Dδ-Jδ，Dδ-Dδ，Vδ-Dδ和Dδ-Jδ
背景
人TCRD基因基因座位于染色体14q11.2的Vα和Jα基因片段之间。TCRD基因座的主要部分(Dδ-Jδ-Cδ)由TCRD-缺失元件，ψJα和δREC侧接，使得缺失元件彼此之间的重排或Vα与Jα基因片段的重排造成中间TCRD基因基因座的缺失(图9A)。编码TCRD基因座的种系由8Vδ，4Jδ，和3Dδ基因片段组成，其中8个Vδ基因片段中的至少5个也可与Jα基因片段重排。115在罕见的情况下，其它Vα基因片段也可用于TCRD基因重排中。TCR基因片段的WHO-IUIS命名法116对于那些主要或唯一地用于TCRδ链的V基因利用不同编号系统，所述V基因来自可用于TCRα或TCRδ链的那些。因此TCRDV101S1(Vδ1)，TCRDV102S1(Vδ2)和TCRDV103S1(Vδ3)几乎唯一地用于TCRD重排，而TCRADV6S1(Vδ4)，TCRADV21S1(Vδ5)和TCRADV17S1(Vδ6)可用于TCRδ或α链。TCRADV28S1(Vδ7)和TCRADV14S1(Vδ8)极其少见地用于TCRD重排。
TCRγδ+T细胞的种系-编码的库与TCRαβ+T细胞的相比较小，且由于在外周血和胸腺细胞TCRγδ+T细胞中的优选重组所述组合库甚至更受限制。出生时，脐带血(cord)TCRγδ+T细胞的库较广泛，没有明显限制或具体Vγ/Vδ组合的优选表达。然而在儿童期，外周血TCRγδ+T细胞库的明显形状(strikingly shaped)使得Vγ9/Vδ2细胞在成人中占明显优势。117研究显示Vδ1和Vδ2库随年龄而逐渐受到限制，导致血液和小肠中出现寡克隆Vδ1+和Vδ2+细胞。118TCRγδ+T细胞在人淋巴系统组织中均匀分布，但没有具体Vδ片段在具体解剖位点的优选表达。值得注意的是，出现在小肠和结肠中的大多数上皮内TCRγδT细胞表达Vδ1。类似地，Vδ1由正常脾TCRγδ+T细胞表达，但皮肤中的TCRγδ+T细胞表达Vδ2基因。
尽管少量可用于重组的V，D和J基因片段限制了可能的组合多样性，由于重组酶导致的N区、P区的添加以及核苷酸的随机缺失，CDR3或连接多样性是广泛的。该多样性也通过多至3个Dδ片段且因此多至四个N-区的重组在重排的TCRD基因座内的重组而得以扩展。在TCRD基因座编码的该有限的种系多样性以及广泛的连接多样性产生了有用的PCR分析的靶，且TCRD重组事件已非常广泛地在T和B细胞急性淋巴母细胞白血病(所有)中用作克隆性标记。119，120TCRD基因座是所有TCR基因座中第一个在T细胞个体发生(ontogeny)过程中发生重排的基因座。第一个事件是Dδ2-Dδ3重排，然后通过Vδ2-(Dδ1-Dδ2)-Dδ3重排，且最后是Vδ-Dδ-Jδ重排。不成熟的重排(Vδ2-Dδ3或Dδ2-Dδ3)出现在70％前体B-ALL中(并由此为非系限制性)30，而在T-ALL中没有发现包含不完全Dδ2-Jδ1和完全Vδ1，Vδ2，Vδ3-Jδ1的成熟重排占优势。23，121因此特异性引物组也可用于鉴定对应于不同类型ALL的不同类型的完全和不完全重排。122
TCRγδ+T-ALL形成相对较小的ALL亚组，代表10-15％的T-ALL，但仍仅构成所有ALL的2％。Vδ1-Jδ1重排在TCRγδ+T-ALL中占优势；有趣的是，从没有发现Vδ1与除Jδ1以外的Jδ片段的组合。15，20其它重组出现在少于25％的等位基因中。此外，Vδ1-Jδ1-Cδ链几乎总是通过二硫键与和Jγ2.3-Cγ2重组的VγI或VγII基因家族相连。这种基因利用与这些白细胞的不成熟胸腺来源一致。
大多数T细胞淋巴瘤表达TCRαβ，而少数表达TCRγδ并包含数种不同的实体。表达TCRγδ的外周T细胞淋巴瘤(PTCL)包含所有PTCL的8-13％，并且已经公开了Vδ1-Jδ1以及其它Vδ与Jδ1的重组。123，124肝脾(heptosplenic)γδT-细胞淋巴瘤来自脾TCRγδT细胞，其通常表达Vδ1。这是一种不寻常的实体，其显示独特的临床病理特征，基因利用分析显示克隆性Vδ1-Jδ1重排与这些淋巴瘤相关。125此外，少见类型的皮肤TCRγδ+T细胞淋巴瘤表达Vδ2并因此显示代表通常存在皮肤中的TCRγδ+T细胞的克隆性扩增。126其它克隆性TCRγδ增生包括CD3+TCRγδ+大颗粒淋巴细胞(LGL)增生，其包含所有CD3+LGL的约5％并通常显示Vδ1-Jδ1重排。127
单克隆抗体向TCRγδ框架区以及最近向特异性Vδ基因片段的发展有助于通过流式细胞分析鉴定TCRγδ+T细胞群，15但PCR克隆系研究仍需要鉴定这些群代表克隆的或是多克隆的扩增。128
引物设计
由8个Vδ，4个Jδ3和3个Dδ基因片段组成的TCRD基因片段相互之间的同源性很小或没有同源性，并且设计了不与其它基因片段交叉退火的片段-特异性引物。利用Vδ7和Vδ8基因片段被认为太少见而不能说明包括用于这些片段的引物是正确的，因此根据本发明的引物设计的常用方案，设计了总共16bp的引物：6Vδ，4Jδ以及3Dδ基因片段的5′和3′(图9B)。所有引物被设计为在任何组合中用于以多元方式使用(multiplex)，但最初计划是利用具有所有V和所有J引物的一个试管(A)，其可扩增所有完全V(D)J重排，以及另一个具有Vδ2，Dδ2-5’，Dδ3-3’和Jδ1引物的第二试管(B)，以扩增主要的部分重排(Vδ2-Dδ3，Dδ2-Dδ3和Dδ2-Jδ1)。这些试管共同可扩增95％的已知重排。其它引物(Dδ1-5’，Dδ3-5’，Dδ1-3’和Dδ2-3’)可用于扩增其它Dδ-Jδ，Vδ-Dδ或Dδ-Dδ重排，但总被认为是可选的。
初始实验阶段的结果
利用多克隆DNA(扁桃体和MNC)检测所有引物对的组合。大多数产生预期大小的产物，但一些在(Dδ1-5’，Dδ1-3’和Dδ2-3’)与其它任何引物组合时不产生可见的产物。涉及这些引物区的重组很可能非常少见，并因此这些以及Dδ3-5’被排除在随后的实验之外。6种主要重排(Vδ1-Jδ1，Vδ2-Jδ1，Vδ3-Jδ1，Dδ2-Dδ3，Vδ2-Dδ3和Dδ2-Jδ1)的克隆性病例最初在多元PCR中检测并随后在多元试管A和B(见上文)中检测。克隆性DNA在多克隆DNA(扁桃体或MNC)中的连续稀释显示在所有病例中的敏感性均为至少5％。然而，在具有双等位基因重排(biallelic rearrangement)(其可在单PCR反应中明显检出)的克隆性疾病中，通常更大的第二个等位基因通常不能在多元反应时扩增。此外，利用不同克隆性病例组发现数种Vδ2-Jδ1重排不能扩增。随后在最初的Vδ2引物的位置鉴定了多态性位点；129该多态性在常见群中的频率未知，且因此该引物重新设计成具有Vδ2基因片段的新的区，重新放置(rerest)并发现其可扩增所有病例。不能扩增第二个等位基因的问题通过将MgCl2浓度从1.5mM增加到2.0mM而得以解决。
我们还检验了将两个试管结合到一个多元反应中的可能性。检测了12个克隆，所述克隆之间总共具有21种基因重排。含有12种引物(6Vδ，4Jδ，Dδ2-5’和Dδ3-3’)的单个多元试管与ABI Gold缓冲液和2.0mM MgCl2一起使用以扩增所有病例。当在多克隆MNC DNA(表7)中稀释时，所有基因重排的HD分析实际上具有0.5-10％的敏感性。将所有TCRD引物混合在一个试管中的唯一问题为在所有扩增中出现约90bp的非特异性带，当使用两个分离的多元试管时所述带不存在。由于该带的大小在TCRD产物的范围以外且不干扰解释，不认为它是问题。
一般实验阶段的结果
十个实验室中对90个Southern印迹-确定的样品的检验产生出关于TCRD方案的一些问题：
一些GS结果的解释较为困难。因为TCRD基因座的产物的大小范围较大，对于多克隆样品没有经典Gaussian分布(见图9C)，并且上述原因结合许多样品中的TCRD低利用表示在一些病例中，很难确定样品是多克隆或是克隆的。HD分析中没有相同的问题，并且因此推荐GS仅在非常小心的情况下用于TCRD，并注意可能的问题。
90bp非特异性带在一些实验室中非常强(intense)，但在其它实验室中不是这样。所述带在利用缓冲液II而不是Gold缓冲液(通过随后实验确定)时较弱并且对MgCl2浓度也敏感，并随MgCl2浓度增加而变强。该产物现在正进行测序并利用Dδ2和Jδ3引物发现不相关的基因。
90个Southern印迹确定的样品的一般实验的结果显示所有参与该实验的PCR组的总体一致性非常高(95％)。90个病例中，6个的TCRD克隆性重排为Southern印迹阳性的，五个通过PCR发现为克隆性的。余下的病例(DE-10，具有高肿瘤负荷的T-ALL)在所有实验室中均被发现为多克隆的。84个Southern印迹阴性病例中75个通过PCR发现为多克隆的，4个被发现为克隆性的，余下5个病例显示GS和HD结果不一致。克隆性病例中，两个(DE-2和GBS-9)是具有推定的低肿瘤负荷的富含T的B-NHL，因此结果可反映增加的PCR敏感性高于Southern印迹的敏感性。其它两个克隆性病例(GBS-15和ES-7)具有高肿瘤负荷。在显示GS和HD结果有差异的五个病例中，一种(NL-1)是困难的寡克隆病例，其导致了数个其它基因座的问题。其余的四个通过HD被发现为多克隆的而通过GS被发现为克隆的。在三个病例(NL-13，NL-15和NL-18)中，这可反应GS的敏感性高于HD分析的敏感性，但其余的病例(PT-1，反应性淋巴结)对“假克隆性”GS分析有贡献，这是因为一些样品中有限的TCRD库的利用。
结论
结论是，推荐的检测TCRD基因重排的方案是利用缓冲液II和2.0mMMgCl2的单试管实验以保证最大特异性和检测，所述试管含有12种用于检测所有主要Vδ(D)Jδ，Vδ-Dδ，Dδ-Dδ Dδ-Jδ重排的引物。优选的分析方法是HD，但GS可小心使用，条件是考虑到一些样品中TCRD的有限利用导致的假克隆系问题。然而，利用多色GeneScanning(见图13C)有助于快速识别不同类型ALL中不同类型的完全和不完全TCRD基因重排。考虑到这些限制，TCRD仍可作为有价值的靶用于更加不成熟的T-细胞白血病以及TCRγδ+T-细胞增生。
实施例8.具有BCL1-IGH重排的t(11；14)
背景
t(11；14)(q13；q32)是套细胞淋巴瘤(MCL)的特征，因为该细胞遗传交互转位(cytogenetic reciprocal translocation)见于60-70％的MCL病例并且在其它B-细胞NHL中仅为偶发的。130断点区最早由Tsujimoto等(1983)克隆，并称为BCL1-区。131然而仅在少数具有细胞遗传(cytogenetic)t(11；14)的病例中鉴定了BCL1-区中的基因组断点。利用纤维(fiber)和分裂间期(interphase)FISH以及覆盖大约750kb 11q13-BCL1区的探针，在几乎所有MCL(34个中的33个)观察到断点且所有断点都限于细胞周期蛋白D1基因5′的360kb区。132，133将近一半的MCL病例(41％)中，所述断点簇集在85bp区中，所述区称为主要转位簇集区(major translocation cluster region)即BCL1-MTC。130，134，135大多数(如果不是全部)MCL病例中，位于14q32的IGH基因座处的断裂包括使得IGH-Eμ增强子与染色体11q13并置的JH基因，并因此导致细胞周期蛋白D1基因的转录活化。136细胞周期蛋白D1与CDK4一起使得pRB磷酸化(和失活)，并允许其经过细胞周期的G1期。因为细胞周期蛋白D1在B-淋巴细胞和B-细胞NHL而并非MCL中是沉默的，并且该转位的存在与细胞周期蛋白D1的表达之间的相关性良好，该基因被认为是MCL中的生物相关靶。136细胞周期蛋白D1的表达和/或t(11；14)(q13；q32)的存在被用作NHL区别诊断中的另外工具。2在新鲜或冷冻物质中133以及保存的(archival)样品中，可鉴定几乎所有断点的t(11；14)存在的金标准检测策略是利用断点-侧接型探针的分裂间期FISH。137然而，用于t(11；14)的基于PCR的检测策略可用于例如残留病变的监测。许多组已经开发了基于PCR的实验以检测BCL1/JH-断点，通常联用共有序列JH-引物以及BCL1-MTC区中的引物(都位于392bp的区中)。54，55BCL1-MTC区中的断裂可出现在MTC区下游2kb处，但大多数断点紧凑地簇集在85bp片段中，紧接着位于报道的最3′-引物(54，134中的″引物B″)下游。因为该BCL1-MTC-区中的断裂仅造成MCL病例中11q13-BCL1区中的部分断点(41％)，用于t(11；14)的基于PCR的策略与FISH相比由于高假阴性结果率而严重阻碍诊断能力。
据报道t(11；14)(q13；q32)见于其它B-细胞增生性疾病诸如多发性骨髓瘤(20％)，SLVL(30％)，B-PLL(33％)和B-CLL(8％)中。130，138，139一些研究中B-CLL中存在t(11；14)的一个理由可由不正确的B-CLL分类导致。130骨髓瘤中的断点与MCL中的断点有很大差异，这是由于(i)频率低得多；(ii)大多数断裂涉及类型转换(swith-class)重组位点；和(iii)尽管所有检测的病例位于相同360kbBCL1-区中，似乎没有在BCL1-MTC区中的优选簇集。另一方面，所有具有断裂的病例中，细胞周期蛋白D1基因被活化。需要注意，具有IGH-转换-断裂myeov的多发性骨髓瘤亚组中，涉及11q13-BCL1区中的其它区。138
引物设计
基于所报道的最远端5′-断点的位置和来自BCL1-MTC区的可得核苷酸序列(GenBank登录号S77049)，我们利用引物设计程序OL1GO6.2在该断点5′的472-bp区中相对于共有序列JH引物设计了单个BCL1引物(5’-GGATAAAGGCGAGGAGCATAA-3’)。
初始实验阶段的结果
利用共有序列JH-引物以及单个BCL1-MTC-引物的组合，我们首先在较小系列的MCL(n＝5)上平行比较了两种实验，所述MCL以前利用类似的共有序列JH18-引物(18nt)和5′-GCACTGTCTGGATGCACCGC-3′作为BCL1-MTC-引物由内部BCL1/JH-PCR鉴定为阳性的。与通过GS和/或HD分析对Ig/TCR基因重排进行的分析相反，BCL1-JH PCR产物(BCL2-JH产物)通过琼脂糖凝胶电泳仅利用溴化乙锭(ethidium bromide)染色而被鉴定。五个阳性和两种阴性样品的结果相同但所述PCR产物明显更弱。为评估我们可否增加PCR的敏感性，我们在Stratagene-Robocycler PCR-仪器(所有其它PCR在ABI-480或ABI-9700上进行)中确定了不同浓度的MgCl2及引物以及不同温度的影响。最令人感兴趣的是由于MgCl2浓度改变较小导致的变异。2.0mM时550bp的弱非特异性产物逐渐明显，而在2.5mM或更高浓度时该非特异性产物在包括非-模板DNA对照在内的所有DNA中都非常明显。在较低浓度(低于1.5mM)没有观察到非特异性片段，但预期的特异性产物非常弱。与BCL1-MTC-内部寡-探针(5’-ACCGAATATGCAGTGCAGC-3’)的杂交没有显示与该550bp产物的杂交。利用每种引物进行的PCR分别显示550bp产物可仅利用JH-共有序列引物产生。一些MCL病例中，除150-350bp的PCR-产物以外(图10B)，较大的特异性PCR-产物可由于共有序列JH-引物与下游JH5和JH6片段的退火(如对BCL2/JH所述)而明显。140从初始实验阶段来看，用于BCL1-MTC/JH-PCR的最佳PCR-条件是：退火温度60℃，2.0mM MgCl2且每种引物10pmol(在ABI9700中进行35个PCR-循环)。
为评估PCR在较大的病例系列上的特异性，在三种实验室中对来自总共25例MCL以及18个阴性对照的DNA进行BCL1-MTC/JH-PCR，所述病例以前通过内部BCL1/JH-PCR而被鉴定为阳性的。没有阴性病例显示PCR-产物，而25个阳性病例中有22个显示预期大小的产物。三个没有在琼脂糖-凝胶上显示产物的病例中，利用GS检测到的产物提示敏感性低于内部PCR。
PCR敏感性通过扩增正常扁桃体DNA中MCL的DNA稀释物进行评估。在琼脂糖凝胶上利用开发的PCR-引物观察到10-3和10-4之间的敏感性。对相同样品平行进行的内部PCR至少更敏感10倍。与内部BCL1-MTC-寡-探针的杂交显示两种PCR的敏感性高10-100倍。用具有BCL1-MTC/JH4-断点53的确定细胞系JVM2(得自DSMZ； http://www.dsmz.de)的DNA的稀释用作我们的标准阳性对照。作为阴性，可使用对照正常扁桃体组织或外周血细胞，但几乎任何非-MCL B-细胞NHL应为适合的，这是因为该异常的频率非常低。130
一般实验阶段的结果
为评估检测BCL1-MTC区断点的实验室间变异，十个组参与了利用BCL1-MTC/JH-PCR方案进行的DNA分析，所述DNA来自一系列90个组织学确定的恶性和反应性淋巴组织增生。利用Southern杂交技术确定所有病例在Ig和TCR基因座的状态(status)。在90病例中，7个的组织学特征为MCL。通过Southern杂交发现所有7个MCL病例都具有克隆性IGH重排。通过Southern杂交或FISH评估染色体11q13的BCL1-MTC-区中的重排不是对所有病例都进行的。7个MCL病例中的6个病例中，在所有10个实验室中鉴定了PCR-产物。在MCL病例NL-15中，在6个实验室中鉴定了预期的1.8kb PCR产物。该具体病例携带具有异常大的PCR产物(通常为150-350bp)的异常断点，并且据我们所知代表3′-最(most)-远(far)的可检测的BCL1-MTC-断点。6个实验室中的2个观察到所述PCR产物，但最初由于其异常的大小而认为其为非特异性的。在所有十个实验室中都不能通过组织学而定性成MCL的ES-4中，可检测到PCR产物提示该病例携带位于BCL1-MTC以外的断点。应强调用于一般实验阶段的该系列的MCL病例被选出，并因此预期其携带位于BCL1-MTC区的断点的可能性高于正常。重要的是，除了一个病例(FR-1)以外，在包括16个在组织学上定性为B-CLL的病例的所有83个其它的非-MCL病例中，没有在任何实验室检测到BCL1-MTC/JH-PCR产物。如果FR-1在组织学上鉴定为B-CLL，在10个实验室中的3个中鉴定了产物，其表明该断裂中的细胞数目较低。通过Southern印迹分析确定的IGH状态显示该样品由90％的克隆B-细胞组成，这于组织学检查很好地符合。对于IGH和IGK的基于PCR的B-细胞克隆性分析(敏感性为大约1％)显示单克隆，且对IGK的Southern印迹分析显示单个主要IGK重排。此外，对细胞周期蛋白D1的表达的Northern印迹分析没有显示过表达。所有这些数据提示非常少(低于1％)的t(11；14)-阳性细胞代表(i)来自B-CLL的亚克隆，(ii)独立的第二B-恶性疾病或(iii)正常B-细胞，如对正常个体中的t(14；18)-阳性B-细胞所述的那样。140然而，根据该患者目前可得的数据，我们不能区分这三种可选情况(alternatives)。总之，10个实验室的分析显示BCL1-MTC/JH-PCR策略的高特异性。
为评估由PCR的相对低的敏感性造成的可能的假阴性病例的存在，在一个实验室中，对全部90个病例的DNA进行前述内部PCR(具有约高10倍的敏感性)，并且两种实验的PCR产物也都与内部-BCL1-MTC寡-探针进行杂交，所述探针可将敏感性再提高10-100倍。该分析显示其它病例中没有PCR产物。
结论
我们的结论是BCL1-MTC/JH PCR的敏感性(10-3和10-4之间)对于检测诊断物质中的BCL1-MTC/JH-断点而言足够高。该方法的结果非常鼓舞人心并且提示常用方法和反应条件的确定(definition)可最小化错误结果。然而，应记住最多可检测MCL中的t(11；14)断点的约50％，并且对于诊断而言推荐其它检测工具。
实施例9.具有BCL2-IGH重排的t(14；18)
背景
t(14；18)是外周B细胞淋巴组织增生性疾病中最为确定的(characterized)复发性细胞遗传异常之一。141根据所用诊断实验，它可在达90％的滤泡性淋巴瘤和20％的大细胞B-细胞淋巴瘤中检出。142转位导致来自18q32的BCL2基因位于IGH基因座的强增强子的控制下，导致其正常表达模式的去调节(deregulation)。143，144BCL2位于外侧线粒体膜且其功能是拮抗凋亡，并且在去调节时，其与肿瘤的发病密切相关。145-148其在发病中的所述作用使得t(14；18)提供了残留病变的诊断和分子监测(molecular monitoring)的理想靶。
IGH基因座位于14q32.3，其VH区的位置靠近端粒侧(telomeric)，DH，JH和恒定区的位置靠近中心粒侧(centromeric)。转录方向是从端粒到中心粒，增强子位于V区的5’以及每个恒定区之间。最常见的转位形式涉及VDJ重组过程，且6个种系JH区之一与BCL2紧密相对。大多数基于PCR的检测策略利用共有序列JH引物，所述引物将检测大部分转位。149，150与IGH基因座相反，BCL2中的断裂模式更为复杂。BCL2位于染色体18q21并且其方向是5’到3’由中心粒到端粒。大多数断点在位于外显子3的3’未翻译区中的150bp MBR中。151作为转位的结果，位于JH区3’的Sμ增强子被置于与导致其去调节的BCL2基因紧邻处。随着更多转位得到研究，很明显由许多必须考虑在有效PCR检测法策略之内的其它断点区。位于MBR下游4kb的是另一个断点区3’MBR亚簇，其包含3.8kb的区。152mcr位于MBR3’20kb并覆盖500bp的区。153然而，尽管与MBR同源，mcr比最初设想的更大，并且mcr上游的10kb区即5’mcr亚簇已有描述。154，155除了这些经典断点以外，描述了许多变体转位，其中断裂出现在BCL2的5’。156然而，这些是非常少见的，并且因此在利用基于PCR的检测策略时不考虑在内。
对于t(14；18)没有单独的金标准检测策略，且细胞遗传学和Southern印迹的组合已经是常用的。157，158分裂间期FISH检测策略提供了可用的选择，其具有检出更多转位的潜力159。与基于DNA的纤维相反，FISH已经可提供确定变体转位的信息，但不适合常规应用。160对于分子诊断实验室，基于PCR的检测策略提供了快速的结果，其通常可使用并可用于残留病变的监测。然而，通常使用的引物已经源自具体的(ad hoc)的基础，并且没有被设计成考虑近期关于断点分子解剖的信息。结果，当与金标准方法比较时，基于PCR的技术只能检出最多60％的转，这严重妨碍了PCR的诊断能力。与假阴性的高百分比结合导致了由其它样品和以前扩增的PCR产物的污染引起的假阳性结果的问题。
引物设计
我们开始评估了两试管多元系统，一个试管设计为检测MBR中的断点，而另一个用于鉴定该区以外的断点。MBR策略含有三种引物MBR1，MBR2和共有序列JH引物。另一多重反应含有五种引物，MCR1，MCR2，5’mcr，3’MBR1和共有序列JH(图11A)，并设计为检测mcr，5’mcr和3’MBR区中的断点。
初始实验阶段的结果
这些引物的评价在三种实验室中对来自总共124个已知携带t(14；18)的滤泡性淋巴瘤病例的DNA进行。109个病例(88％)被鉴定为具有BCL2-IGH融合，利用MBR多元检测法(MBR multiplex)发现83/124(67％)是阳性的，而利用非-MBR多元检测法发现26/124(21％)是阳性的。15/14(12％)病例中，没有可扩增的PCR产物。对用非-MBR多元检测法鉴定的病例的进一步检测显示11个病例(9％)具有mcr中的断点，五个病例(4％)具有5’mcr中的断点而10/124(8％)具有3’MBR中的断点。
为进一步研究该组引物对于检测5’mcr和3’MBR亚-簇区中的断点的价值，在一个实验室中通过Southern杂交在MBR和mcr分析已知为种系的一系列32个t(14；18)阳性滤泡性淋巴瘤病例。所述病例中的五个在5’mcr(260-490bp)中具有断点并且利用分离的5’mcr引物并由多元反应进行扩增。在32个病例的系列中，9个已知具有3’MBR区中的断点并且所述多元方法可检测这些病例5/9。
为改善该区的实验中的敏感性，我们设计了另外3种引物，其占据3’MBR亚-簇区：3’MBR2，3’MBR3和3’MBR4，并在另外的多元反应中将它们与3’MBR1和共有序列JH结合；3’MBR多元(图11)。这种新方法确定了32个病例中的8个是阳性的但遗漏了9个病例。所述引物随后单独使用，并且在该实验中32个病例中有11个是阳性的。所述断点分布如下：2/11病例具有位于引物3’MBR1和3’MBR2之间的断点，3/11病例具有位于引物3’MBR2和3’MBR3之间的断点，2/11病例具有位于引物3’MBR3和3’MBR4之间的断点，其余四个病例利用引物3’MBR4扩增并分布在该引物3’200-1000bp。利用3’MBR多元策略，这个系列的病例中有三个假阳性结果。所述病例之一是真假阴性(true false negative)的，其中的断裂出现在3’MBR中间，与Alu重复序列接近。转位利用单独的3’MBR3引物检测，并产生450bp的产物，提示多元策略的敏感性降低。利用3’MBR4引物，余下的两个假阴性病例产生的产物大于1000bp，使得它们位于该方法不能完全覆盖的远(far)3’MBR。3’MBR实验敏感性的进一步改进已经由该研究的一般实验阶段获得。用新的下游引物
5’-GGTGACAGAGCAAAACATGAACA-3’(见图11A)取代引物3’MBR3可明显改善3’MBR实验的敏感性和特异性。
基于此，3’MBR多元策略并入我们的诊断策略中。对Southern印迹确定的病例的分析因此利用图11A中的所述三试管多元系统进行。
一般实验阶段的结果
实验室间变异是诊断性PCR策略的明显特征。为评估它，11个组参与了大量外部质量控制实践。DNA提取自一系列90个组织学确定的恶性和反应性淋巴组织增生，并利用t(14；18)多元方案(图11B，C和D)分析。利用Southern杂交技术确定所有病例在Ig和TCR基因座的情况。t(14；18)的核型确认(Karyotypic confirmation)不能用于该系列。我们因此采用需要网络(network)成员之间具有高于70％的一致性以接受t(14；18)的方法。在90个病例中，11个在组织学上定性为滤泡性淋巴瘤。通过Southern杂交发现所有11个病例具有克隆性IGH重排。评估BCL2基因中的重排也通过Southern杂交利用MBR，mcr和3’MBR的特异性探针在10/11病例中进行。4/10个病例显示与PCR结果一致的MBR中的重排。利用mcr探针，显示为mcr多元阳性的单个病例GBS-7给出不确定的SB结果。从免疫分型角度来看，该病例显示两种完全不同的克隆群，代表最初诊断物质的大约5％和15％。在该病例中两种技术之间的差异很可能代表与PCR相比SB的敏感性降低。通过SB分析，在任何的其余病例中都没有发现3’MBR重排的证据。
利用MBR多元策略发现，在6个SB阴性FCL病例中，单个病例ES-7显示t(14；18)。通过SB或PCR显示，5/11 FCL病例显示没有t(14；18)的证据。t(14；18)通过PCR是在另外两个病例中检出；DLBCL病例FR-6显示MBR断点并被所有11实验室鉴定，该发现与以前的研究一致，后者已经在20-40％的DLBCL病例检测出t(14；18)。161，162利用3’MBR多元策略，10/11实验室对于样品ES-12报道了阳性结果，ES-12为霍杰金淋巴瘤病例，其含有非常少的B细胞。难以通过Southern印迹在不存在IGH重排的情况下解释该结果。对样品来源的污染或错误标记很可能是解释。
总而言之，在网络中有很好的一致性，尽管出现了少量假阳性和假阴性结果。总共鉴定了12个假阳性结果，代表低于总分析数的0.4％(12/3036)。这由五个实验室报道并且涉及6个样品。大多数假阳性(9/12)见于三个病例。五个假阴性结果，代表6％(5/88)的失败率，由三种实验室报道，两个实验室没有检测到ES-7，网络中的三个其它组认为利用MBR多元策略时该病例显示弱扩增信号。其余的三个假阴性病例由各个实验室分别报道。利用该方法的诊断结果非常鼓舞人心，并提示常用方法和反应条件的限定可最小化错误结果。
结论
结论是，我们设计并评估了稳定(robust)的三-试管多元PCR，以便最大化t(14；18)的检出。该策略能够在大多数具有细胞遗传学确定的转位的FCL病例中跨(across)断点区扩增。尽管该策略敏感性低于常用的单循环或嵌套d的PCR方法，其对于诊断方法仍为非常可接受的。广泛采用标准化试剂和方法学有助于最小化该大的多中心网络(network)中不准确的结果。然而，从该研究的一般实验阶段可注意到，可能在所有病例中检测t(14；18)。这肯定受其它能够使BCL2基因去调节的分子机制的影响。163，164
实施例10：提取自石蜡包埋组织活检样品的DNA的用途以及对照基因引物组的研发
背景
新鲜/冷冻组织被认为是提取用于基于PCR的克隆系分析的DNA的理想样品类型。然而，新鲜/冷冻物质不总用于诊断实验室，且在欧洲的许多实验室中，石蜡包埋的组织样品组成用于分析的诊断活检的主要部分。提取自石蜡包埋的物质的DNA通常质量较差，并且因此在PCR方法广泛用于诊断实验室以前，需要利用这些样品评估PCR方案。
提取自石蜡包埋的样品的DNA的完整性以及其由PCR的扩增受多种因素的影响，诸如组织厚度，固定类型，固定时间，分析前储存的时间，，DNA提取方法和PCR抑制物的共-提取。165-172 10％中性缓冲的福尔马林液(10％NBF)是最常用的固定剂，尽管实验室也利用许多其它固定剂，包括未经缓冲的福尔马林以及Bouins。利用10％NBF允许扩增大小范围较广的DNA片段，而Bouins似乎至少可用于PCR分析。167，168，171，173提取自石蜡包埋的样品的DNA片段的完整性也有赖于石蜡块保存的时间，最好的结果通常来自保存时间低于2年的石蜡块，而超过15年的石蜡块倾向于产生降解程度较高的片段。174
引物设计
最初，设计五对对照基因PCR引物以扩增大小确切为100，200，400，600和1,000bp的产物以评估用于分析的DNA的质量。靶基因基于具有带开放读框的大外显子选择，以降低选出多样性区的可能性，且所述引物被设计为用于多元检测法的标准化方案中。选择以下靶基因：人血栓烷(thromboxane)合酶基因(TBXAS1，外显子9；GenBank登录号D34621)，人重组活化基因(RAG1，外显子2；GenBank登录号M29474)，人早幼粒(promyelocytic)白血病锌指基因(PLZF，外显子1；GenBank登录号AF060568)，和人AF4基因(外显子3；GenBank登录号Z83679，和外显子11；GenBank登录号Z83687)。
初始实验阶段的结果
引物对在分别的反应中检测并随后在多元反应中利用高分子量DNA检测。由于产物大小范围较大(100-1,000bp)，需要改变引物浓度以在多元反应中获得等强度的带。然而，证明可重复地扩增所有带是非常困难的，并决定1,000bp产物可能是非必要的，这是由于本发明所有PCR方案都产生小于600bp的产物。因此决定排除1,000bp产物以便挨近该实验的可重复性。通过增加MgCl2浓度到2mM并以1∶1∶1∶2的比例加入引物，可能从高分子量DNA样品可重复地扩增等强度的四个带(100，200，400和600bp)。然而，对于提取自石蜡块的DNA，认为300bp的特大标记可提供非常多的信息，并且600bp的引物可为非必要的。利用用于1,000bp标记(PLZF)的基因序列，将所述引物重新设计为产生300bp产物。这些引物与100，200，300，400和600bp引物的结合在单元反应以及多元反应中都获得了成功(见图12A)。
因此两个引物组可用于评估用于扩增的DNA的质量：以每种2.5pmol利用的100，200，300和400bp引物可用于评估来自石蜡包埋组织的DNA。添加5pmol 600bp引物允许该组用于检测任何利用本发明的引物和方案的DNA样品的质量。两个引物组豆科在标准扩增条件下与ABI缓冲液II和2.0mM MgCl2一起使用。产物可在6％PAGE或2％琼脂糖上分析(见图12B)。
一般实验阶段的结果
收集对应于30种B细胞恶性疾病的55个石蜡包膜的活检样品，以8种T细胞恶性疾病和7种反应性淋巴组织增生作为新鲜/冷冻组织样品。石蜡块的保存时间(the age of paraffin block)以及固定方法和组织的包埋在National Networks之间不同。将ES样品作为预切割切片(pre-cut section)，NL-14，15和16作为DNA样品，余下的活检样品为石蜡块的形式。从石蜡块上切下五个切片(每个10μm)并利用QIAamp DNA Mini试剂盒(QIAGEN)根据生产商的从石蜡包埋的组织分离基因组DNA的方案来提取DNA。选择这种DNA提取方法是由于所述试剂盒可从血液，新鲜/冷冻组织和石蜡包埋的组织快速提取较好质量的DNA，并且由此使得可在质量控制得以保证的条件下平行加工各种样品类型。各种用于从用于PCR分析的石蜡包埋的组织提取DNA的方案已经公开。171，172，175-177其中许多的目的在于减少DNA降解以及PCR抑制物的共提取(co-extraction)，但这些方法中许多需要延长的提取步骤并不适合用于常规诊断实验室。166，178，179
DNA样品浓度和完整性通过分光光度法并在琼脂糖凝胶电泳上比较样品DNA与已知的标准品而进行评估。随后利用对照基因PCR引物(100-400bp)分析DNA样品(100ng)的完整性和可扩增性，并利用PCR方案评估所有靶基因座的克隆系。
24/45病例的对照基因PCR反应中，经扩增的产物至少300bp，而余下的21个样品中经扩增的产物是200bp或更小。DNA重量和块的保存时间(block age)或固定方法之间没有显示明显的相关性。因此很可能多种因素的组合导致了这些样品中的DNA质量。
利用18多元PCR反应对DNA样品进行克隆系评估，并利用HD和GS进行分析。将在9个靶基因座显示克隆系和转位的石蜡样品的数目与相应的新鲜/冷冻样品的数据进行比较。在具有达200bp的对照基因PCR产物的样品中，在9个靶基因座克隆系的总体检出率为9/55(16％)。在46个遗漏的(missed)重排中，45个可通过预期的克隆PCR产物的分子量高于对照基因PCR中自所述样品扩增的最大尺寸(size)这一事实来解释。在对照基因PCR中余下的样品(PT-9)扩增到100bp，但没有检测到预期的81bp TCRG克隆产物。在具有至少300bp的对照基因PCR产物的样品中，在9个靶基因座的克隆系总体检出率为42/55(76％)。在13个遗漏的重排中，5个可仍通过预期克隆的PCR产物的分子量高于对照基因PCR中自所述样品扩增的最大尺寸这一事实来解释。余下的8个遗漏的重排不能直接通过DNA质量得以解释。在反应性淋巴结中检出一个假阳性克隆结果(GBN-9；IGL)，其可代表假克隆系。
已知PCR抑制物存在于提取自石蜡样品的DNA。DNA样品的稀释可降低这些抑制物的浓度到允许出现成功扩增的水平。为研究稀释DNA样品对于扩增效率的影响，在对照基因PCR反应中检测了4种不同浓度的DNA：5，50，100和500ng。我们观察到DNA样品的稀释对于对照基因PCR中的PCR产物有明显的影响。总的来看，当从100ng稀释到50ng时24/45病例(53％)显示扩增效率增加。最佳DNA浓度似乎为50ng到100ng之间，而利用500ng似乎可抑制较大产物的扩增(300bp或以上)。尽管利用5ngDNA的对照基因PCR产生可接受的结果，其可导致由于总淋巴细胞DNA的低表现(representation)导致的基于PCR的克隆系实验中的假阳性。180，181更重要的是，5ng DNA与稀释成50ng DNA相比没有优势。
为评估利用50ng DNA是否也增加克隆系的检出，所有样品在IGH V-J基因座利用所述DNA浓度进行再检测。在三个IGH V-J试管中利用100ngDNA检出的克隆重排数目为12，而利用相应的新鲜/冷冻样品时检出的克隆重排数目为23。克隆系在该基因座的总体检出率增加到23种中检出17种，其可检出另外的9种FR1，6种FR2和4种FR3克隆产物。由此DNA的稀释可增加克隆性产物的检出，推定是由于PCR抑制物的稀释。符合逻辑地，DNA的稀释仅可能改进对照基因DNA结果以及克隆系的检出，条件是PCR抑制物存在，而不是DNA样品是否是高度降解的。因此，推荐利用对照基因PCR检测至少两个DNA的稀释度，并且将给出较好结果的稀释度用于随后的克隆系分析。
9个克隆重排在初始分析后仍未被检测到，这不能通过DNA质量得到解释(PT-9和NL-11中的TCRG；GBS-4中的TCRB；NL-15中的TCRD；GBN-4，NL-4和NL-5中的IGK；GBS-6和GBS-8中的IGHV-JH)。这些样品利用50ng DNA进行再次检验，但仅一个样品(GBS8；IGH)显示改进的检测，提示其它未知因素可组织具体靶在少量病例中的扩增。然而，应注意对于这些样品中的7个样品(NL-11，GBS-4，NL-15，GBN-4，NL-5，GBS-6&GBS-8)，可在至少一个另外的基因座中检测到克隆性产物。这证实了在多重靶基因座对克隆系的检测增加了检出克隆性淋巴细胞群的可能性。
结论
结论是，本文推荐的方案适合于提取自石蜡包埋的物质的DNA，条件是所述DNA可在对照基因PCR中扩增300bp或更大的产物。优选在对照基因PCR中检测两种浓度的DNA，且更“可扩增”(more“amplfiable)的浓度应当用于进一步的检测中，尽管条件是低于20ng的DNA浓度有助于检出由于靶淋巴DNA的低表现(low representation)导致的假克隆系。180，181总的来看所述数据显示利用对照基因PCR进行的DNA质量评估较好地指示了所述DNA对于利用所提供方案的克隆系分析的适宜性。注意到对照基因PCR不能指示存在于样品中的淋巴细胞DNA的量，并因此良好质量的DNA对于克隆系分析仍可产生阴性结果也是重要的。为保证单克隆结果可重复(并避免可能的假克隆系)，所有克隆系检测，具体是利用石蜡提取的DNA，优选以一式两份进行并且只要可能就通过HD和GS进行分析。
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表1B、T和NK细胞系的淋巴组织恶性疾病a
细胞系 儿童期     ALL          慢性淋巴        非霍杰金淋巴瘤   多发性
   成人   细胞白血病   结节性     结节外   皮肤   骨髓瘤
 BTNK 82-86％14-18％＜1％    75-80％20-25％＜1％   95-97％3-5％1-2％   95-97％3-5％＜2％     90-95％5-10％＜2％   30-40％60-70％＜2％    100％0％0％
a见Van Dongen等，19911，Jaffe等，20012和Van Dongen等，20025
表2可参与Ig或TCR基因重排a的非多态性人V，D和J基因片段的估计数目
基因片段  IGH  IGK  IGL    TCRA    TCRB    TCRG  TCRD
V片段-功能性(家族)-可重排的(家族)D片段-可重排的(家族)J片段-功能性-可重排的 44(7)66(7)276c6c 43(7)76(7)-5d5d 38(10)56(11)-45e 46(32)54(32)-5361 47(23)67(30)-1313 6(4)9(4)-55 88-44
a.仅具有适宜RSS的非多态性基因片段包含在本表中。
b.该评估不包括最近发现的(通常为截短的)VH假基因，其在三个异种集团中聚集
c.6个JH基因片段在约20核苷酸的长度上高度同源，所述长度足以设计共有序列引物。
d.Jκ片段具有高度同源性，其允许设计2-3个Jκ共有序列引物。
e.七种Jλ基因片段中有5个具有适宜的RSS。
表3.标准化的PCR方案
反应条件
●  缓冲液：ABI缓冲液II或ABI Gold缓冲液●  50μl终体积●  100ng DNA●  每种引物10pmol/(未标记或6-FAM标记的)(不考虑每个多元PCR管中的总引物数)●  dNTP：200μM终浓度●  MgCl2：1.5mM终浓度(待优化每种靶物)●  Taq酶a：大多数管中为1U；具有许多引物(＞15)的管中为2U
循环条件
●  在95℃预活化7分钟●  退火温度60℃●  循环时间                  “经典”    “较新的”PCR仪器     PCR仪器变性         45秒        30秒退火         ≥45秒      ≥30秒延长         1.30分      ≥30秒最后延长     ≥10分钟    ≥10分钟
●  循环数：35●  保持在15℃(或室温)
a.根据靶，联用AmoliTaq Gold(Applied Biosystems，Foster City，CA)与1×ABI缓冲液II或1×ABI Gold缓冲液(Applied Biosystems)。
表4用于PCR产物的异源双链分析的标准化方案
PCR产物制备●  含有10-20μl PCR产物●  PCR产物变性：95℃、5min●  PCR产物再退火：4℃、60分钟电泳条件(非商业化聚丙烯酰胺凝胶)●  凝胶：6％非变性型聚丙烯酰胺(丙烯酰胺∶双丙稀酰胺29∶1)●  缓冲液：0.5×TBE●  上样缓冲液：5μl冰冻非变性型溴苯酚蓝(bromophenol blue)上样缓冲液●  电泳：通常在110V 2-3小时或在40-50Va过夜电泳条件(商业化聚丙烯酰胺凝胶)●  凝胶：非变性型聚丙烯酰胺(例如BioRad前Cast凝胶System或Amersham PharmaciaBiotech Gene凝胶Excel Kit)●  缓冲液：1×TBE●  上样缓冲液：冰冻非变性型溴苯酚蓝上样缓冲液●  电泳：通常在100V 1.5小时显示●  染色：H2O中的0.5μg/ml EtBr中，5-10min●  脱色/洗涤：2×5-10min，H2O中●  显示：UV照射●  其它选择：利用Amersham PharmaciaBiotech DNA silver staining试剂盒进行银染
a.电压及电泳时间有赖于PCR扩增子大小，聚丙烯酰胺凝胶厚度，以及PCR仪器的类型，并应相应地使用。
表5.PCR产物的GeneScanning的标准化方案
A.基于凝胶的测序仪PCR产物制备1.PCR产物稀释：初始在甲酰胺或H2O中1∶10(如果荧光信号超出最优范围可改变；
    见电泳条件)2.  样品体积：2μl稀释的PCR产物3.  上样缓冲液体积：0.5μl蓝色葡聚糖(blue dextran)上样缓冲液+0.5μlTAMRA内部标准品+2μl去离子化的甲酰胺4.  PCR产物变性：2min，在95℃或更高温度5.  PCR产物在4℃冷却电泳条件6.  凝胶：5％变性型聚丙烯酰胺7.  缓冲液：1×TBE8.  电泳：2-3.5小时a(见表25)9.  最佳荧光信号强度：-600-4,000荧光单位(373平台(platform))-400-7,000荧光单位(377平台(platform))
B.  毛细管测序仪(待被优化每测序仪)PCR产物制备1.  1μl PCR产物(如果荧光强度在最佳范围之外，PCR产物体积或取样时间可改变；见电泳条件)2.  样品体积：1μl PCR产物+9.5μl(Hi-Di)甲酰胺+0.5μl ROX-400异源双链分析内部标准品3.  PCR产物变性：PCR产物变性：2min，在95℃或更高温度4.  PCR产物在4℃冷却1小时电泳条件5.  凝胶：3100 POP4聚合物6.  缓冲液1×3100缓冲液和EDTA7.  电泳：45分钟a(见表25)8.  最佳荧光信号强度：-直到10,000荧光单位
a电泳时间有赖于扩增子大小以及所用平台(platform)。
b对于36cm的毛细管；在毛细管上所用时间。
表6.克隆性TCRB重排的检测的敏感性
TCRB试管 涉及的引物对 克隆性对照 PCR产物大小 检测敏感性
 V J 单PCRa 多元PCR
试管A  Vβ2Vβ2Vβ2Vβ7Vβ8aVβ8aVβ10Vβ3/12a/13a/15Vβ3/12a/13a/15Vβ17Vβ17Vβ18Vβ22Vβ8b/23Vβ24 Jβ1.2Jβ1.3Jβ1.6Jβ2.2Jβ1.2Jβ2.7Jβ2.7Jβ1.6Jβ2.7Jβ2.7Jβ1.1Jβ1.2Jβ1.1Jβ1.2Jβ1.5 患者患者患者患者Jurkat患者PEER患者患者RPMI-8402患者DND41患者H9RPMI-8402 261nt267nt267nt254nt267nt264nt263nt278nt286nt260nt260nt261nt265nt257nt264nt 1-5％5％0.1％＜5％1％1％0.1％0.1％0.5％ 5％5％＜5％10％0.5-1％10％20％5％10％10％10％10％10％0.5％10％
试管B  Vβ2Vβ1/5Vβ6a/11Vβ6a/11Vβ7Vβ8aVβ3/12a/13a/15 Jβ2.1Jβ2.1Jβ2.1Jβ2.5Jβ2.3Jβ2.1Jβ2.1 Molt-4患者患者患者PEER患者患者 267nt266nt265nt258nt271nt293nt258nt 5％5％1％0.1％5％ 5％1-5％5％5％＜5％1％10％
TCRB试管 涉及的引物对 克隆性对照 PCR产物大小 检测敏感性
 V J   单PCRa   多元PCR
 Vβ3/12a/13a/15Vβ16Vβ17Vβ21 Jβ2.3Jβ2.1Jβ2.5Jβ2.3 患者患者CML-T1患者 258nt258nt270nt282nt 0.5％0.1-1％0.5％ ＜5％10％1％＜10％
试管C  Dβ1Dβ1Dβ1Dβ1Dβ1Dβ1Dβ1Dβ2Dβ2Dβ2 Jβ1.1Jβ1.2Jβ1.4Jβ1.6Jβ2.1Jβ2.7Jβ2.5Jβ1.4Jβ2.1Jβ2.5 患者患者患者患者患者患者患者患者患者患者 304nt306nt310nt320nt309nt307nt310nt182nt185nt191nt   0.10％5％5％1％   ＜5％5％5-10％20％20％＜5％＜1％＜1％＜5％5％
a.评估单PCR敏感性的稀释实验在每个病例中进行。
表7.克隆性TCRD基因重排的检测的敏感性
TCRD重排   克隆性对照样品(大约大小) 异源双链检测的敏感性
Vδ1-Jδ1Vδ2-Jδ1   患者    (200nt)患者    (190nt)患者    (200nt)患者    (200nt)患者    (220nt)患者    (210nt) 5％1-5％5％5％5％5％
 Vδ2-Jδ3Vδ3-Jδ1Vδ6-Jδ2Dδ2-Jδ1Dδ2-Jδ3Dδ2-Dδ3Vδ2-Dδ3     患者    (220nt)患者    (270nt)Loucy   (210nt)患者    (210nt)Loucy   (150nt)患者    (160nt)患者    (135nt)患者    (150nt)NALM-16 (170nt)患者    (200nt)患者    (190nt)患者    (170nt)REH     (240nt)NALM-16 (230nt)患者    (250nt) 5％5％0.5％10％0.2％0.5％0.5％5％1％1％0.5％0.5％5-10％1-5％5％
表8.所包括的冰冻样品的每种(亚)分类的Ig/TCR基因重排的多元PCR结果与Southern印迹(SB)分析结果(PCR/SB)之间的一致性
  诊断   IGHa   IGK   IGL   TCRB   TCRG   TCRD
  前-滤泡性(n＝8)   Cb：8/8Pb：0/0   C：8/8P：0/0   C：4/4P：4/4   C：2/4bP：4/4   C：0/0P：8/8   C：0/0P：8/8e
  B-CLL(n＝16)   C：15/16P：0/0   C：16/16P：0/0   C：5/5P：9/11   C：1/1P：15/15   C：0/0P：16/16   C：2/2P：14/14
  (后-)滤泡性(n＝25)   C：22/25b   C：19/24c   C：3/5P：   C：2/4P：   C：0/1P：   C：0/0
 P：0/0  P：0/1  19/20  21/21d，e  22/24  P：24/25e
所有B-细胞恶性疾病(n＝49)  C：45/49P：0/0  C：43/48P：0/1  C：12/14P：32/35  C：4/8P：41/41  C：0/1P：46/48  C：2/2P：46/47
T-细胞恶性疾病(n＝18)  C：2/2P：15/16e  C：0/0P：17/18  C：0/0P：17/18  C：17/17cP：1/1  C：15/16bP：1/2  C：2/3P：14/15e
反应性样品(n＝15)  C：0/0P：15/15  C：0/0P：15/15  C：0/0P：15/15  C：0/0P：14/15  C：0/0P：15/15  C：0/0P：15/15
其它(n＝8)  C：3/3P：3/5  C：2/2P：4/6  C：0/0P：6/8  C：3/3P：5/5d，d  C：1/1P：6/7  C：1/1P：5/7
所有样品(n＝90)  C：50/54P：33/36  C：45/50P：36/40  C：12/14P：70/76  C：25/29P：60/61  C：16/18P：68/72  C：5/6P：80/84
a.包括VH-JH以及DH-JH PCR分析
b.C，克隆重排；P，多克隆重排
c.一个样品中仅GeneScanning中的克隆系
d.一个样品中仅异源双链分析中的克隆系
e.一个样品中仅GeneScanning中的多克隆系
f.一个样品中仅异源双链分析中的多克隆系
表9.Southern印迹确定的B细胞恶性疾病中用于克隆系检测的不同Ig多元PCR靶的互补性
多元PCR试管                                  诊断
 前-生发中心B(n＝8) B-CLL(n＝16) (后-)生发中心B(n＝25) 所有B-细胞恶性疾病(n＝49)
IGH  VH-JHFR1  8/8b(100％) 14/16c(88％) 15/25b(60％) 37/49(76％)
IGH  VH-JHFR2  8/8(100％) 15/16(94％) 14/25b(56％) 37/49(76％)
IGH  VH-JHFR3  8/8(100％) 14/16(88％) 11/25c(44％) 33/49(67％)
IGH  VH-JH3FR  8/8(100％) 15/16(94％) 17/25(68％) 40/49(82％)
IGH  DH-JH  0/8(0％) 11/16(69％) 11/25(44％) 22/49(45％)
IGH  VH-JH+IGH  DH-JH  8/8(100％) 15/16(94％) 22/25(88％) 45/49(92％)
IGK  8/8(100％) 16/16(100％) 21/25d(84％) 45/49(92％)
IGL  4/8(50％) 7/16e(44％) 4/25f(16％) 15/49(31％)
IGH  VH-JH+IGK  8/8(100％) 16/16(100％) 21/25(84％) 45/49(92％)
IGH  VH-JH+IGL  8/8(100％) 15/16(94％) 17/25(68％) 40/49(82％)
IGH  VH-JH+IGH  DH-JH+IGK  8/8(100％) 16/16(100％) 24/25(96％) 48/49(98％)
IGH  VH-JH+IGH  DH-JH  8/8(100％) 16/16(100％) 24/25(96％) 48/49(98％)
+IGK+IGL
a.通过Southern印迹分析显示，所有样品都具有至少IGH基因座中的克隆性基因重排
b.两个病例显示GeneScanning中的克隆性产物，但多克隆产物见于异源双链分析
c.一个病例在GeneScanning中显示的克隆产物，但在异源双链分析中为多克隆产物
d.包括在Southern印迹分析中具有弱克隆IGH而无多克隆IGK基因重排的病例25-NL-4
e.包括在Southern印迹分析中具有克隆IGH+IGK而无多克隆IGK基因重排的病例11-NL-19和12-ES-1
表10.Ig/TCR基因重排以及转位t(11；14)和t(14；18)的多元PCR分析的条件以及对照样品
多元PCR 试管          PCR条件       阳性对照(实例)
缓冲液   TaqGold(U)  MgCl2(mM)   多克隆的 单克隆的a
IGHVH-JH A/B/C Gold/II   1  1.5   扁桃体 A：NALM-6；SU-DHL-5；SU-DHL-6B：NALM-6；SU-DHL-5；SU-DHL-6C：NALM-6；SU-DHL-5；SU-DHL-6
IGHDH-JHIGKIGLTCRBTCRGTCRDBCL1-IGHBCL2-IGH   D/EA/BAA/B/CA/BAAA/B/C  GoldGold/IIGold/IIIIIIIIIIII  1112(A，B)b1(C)1111     1.51.52.53.0(A，B)1.5(C)1.52.02.01.5 扁桃体扁桃体扁桃体PB-MNCcPB-MNCcPB-MNCcNAcNAc D：KCA；ROS15E：HSB-2，HPB-ALLA：KCA；ROS15B：ROS15，380A：CLL-1；EB-4B；KCAA：RPMI-8402；Jurkat；PEER；DND-41B：PEER；CML-T1，MOLT-3C：JurkatA：MOLT-3；RPMI-8402；Jurkat；PEERB：Jurkat；PEERA：PEER，REHA：JVM2A：DoHH2；SU-DHL-6B：K231dC：OZ；SC1d；SU-DHL-16
a.大多数克隆细胞系对照可通过Deutsche Sammlung vonMikeroorganismen und Zellkulturen GmbH获得；联系人：dr.H.G.Drexler(地址：Department of Human and Animal Cell Cultures，Mascheroder Weg 1B，38124，Braunschweig，Germany).192，193
b.大多数多元管仅需要1U TaqGold，但TCRB管A和B需要2UTaqGold，因为它们含有＞15种不同引物。
c.缩写：PB-MNC，外周血单核细胞；NA，不可应用
d.t(14；18)阳性细胞系K231，OZ和SC1由prof.Martin Dyer，Universityof Leicester，Leicester，GB馈赠。
表11.Ig/TCR基因重排以及染色体异常t(11；14)和t(14；18)的多元PCR分析中的大小范围，非特异性带，以及检测方法
多元PCR 大小范围(bp) 非特异性带(bp) 优选分析方法 GeneScan进行时间：凝胶/毛细管
IGHVH-JH 试管A：310-360试管B：250-295试管C：100-170 试管A：～85试管B：-试管C：- GeneScanning以及异源双链分析同样适合 3-3.5h/45min
IGHDH-JH 试管D：110-290(DH 1/2/4/5/6-JH)+390-420(DH 3-JH)试管E：100-130 试管D：350a试管E：211b 异源双链分析稍优于GeneScanning(产物大小变化阻碍GeneScanning) 3-3.5h/45min
IGK 试管A：120-160(Vκ1f/6/Vκ-Jκ)+190-210(Vκ3f-Jκ)+260-300(Vκ2f/Vκ4/Vκ5-Jκ)试管B：210-250Vκ1f/6/Vκ7-Kde+270-300(Vκ3f/内含子-Kde)+350-390(Vκ2f/Vκ4/Vκ5-Kde) 试管A：-试管B：～404 异源双链分析稍优于GeneScanning(小连接体积+产物大小变化阻碍GeneScanning) 3-3.5h/45min
IGL 试管A：140-165 试管A：- 异源双链分析明显优于GeneScanning(小连接体积阻碍GeneScanning) 2h/45min
 TCRB 试管A：240-285试管B：240-285试管C：170-210(Dβ2)+285-325(Dβ1) 试管A：(273)c试管B：＜150，221d试管C：128，337d 异源双链分析稍优于GeneScanning(有限的库，尤其是在ψVγ10和ψVγ11利用的情况中) 2h/45min
 TCRG 试管A：145-255试管B：80-220 试管A：-试管B：- GeneScanning以及异源双链分析同样适合 2h/45min
 TCRD 试管A：120-280 试管A：～90 异源双链分析优于GeneScanning(低模板量+产物大小变化阻碍GeneScanning) 2h/45min
 BCL1-IGH 试管A：150-2000 试管A：～550(weak) 琼脂糖 NAe
 BCL2-IGH 试管A：可变试管B：可变试管C：可变 试管A：-试管B：-试管C：- 琼脂糖 NAe
a.非特异性350bp带是DH2引物与JH4上游区域中的序列的交叉退火的结果。在GeneScanning中，该特异性带不与D-J产物共迁移(见图5B)。
b.211bp PCR产物代表来自种系DH7-JH1区的最小背景带。当PCR扩增非常有效时，由于引物与下游JH基因重排的退火，也可获得较长的PCR产物；例如419bp(DH7-JH2)，1031bp(DH7-JH3)等。
c.273bp带(主要通过GeneScanning显示)具体见于具有少量污染性淋巴细胞的样品中。
d.非特异性带的强度有赖于引物质量。
e.NA，不可用。

Claims (42)

1.能够扩增VH-JH IGH重排的核酸扩增引物组，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物选自图3B所示VH家族引物或其变体，且其中所述反向引物是图3B所示JH共有序列引物或其变体。
2.能够扩增DH-JH IGH重排的核酸扩增引物组，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物选自图4A所示DH家族引物或其变体，且其中所述反向引物是图4A所示JH共有序列引物或其变体。
3.能够扩增Vκ-JκIGK重排的核酸扩增引物组，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物选自图5B所示Vκ家族引物或其变体，且其中所述反向引物是图5B所示Jκ引物或其变体。
4.能够扩增Vκ/内含子-Kde IGK重排的核酸扩增引物组，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物选自图5B所示Vκ引物或INTR引物或其变体，且其中所述反向引物是图5B所示Kde引物或其变体。
5.能够扩增Vλ-JλIGL重排的核酸扩增引物组，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物选自图6B所示Vλ引物或其变体，且其中所述反向引物是图6B所示Jλ引物或其变体。
6.能够扩增Vβ-JβTCRB重排的核酸扩增引物组，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物选自图7B所示Vβ家族引物或其变体，且其中所述反向引物选自图7B所示引物JβA或JβB或所述引物的变体。
7.能够扩增Dβ-JβTCRB重排的核酸扩增引物组，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物选自图7B所示Dβ引物或其变体，且其中所述反向引物选自图7B所示引物JβA或JβB或所述引物的变体。
8.能够扩增Vγ-JγTCRG重排的核酸扩增引物组，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物选自图8B所示Vγ家族引物或其变体，且其中所述反向引物选自图8B所示Jγ引物或其变体。
9.能够扩增Vδ-JδTCRD重排的核酸扩增引物组，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物选自图9B所示Vδ引物或其变体，且其中所述反向引物选自图9B所示Jδ引物或其变体。
10.能够扩增Dδ-DδTCRD重排的核酸扩增引物组，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物是图9B所示Dδ2引物或其变体，且其中所述反向引物是图9B所示Dδ3引物或其变体。
11.能够扩增Dδ-JδTCRD重排的核酸扩增引物组，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物是图9B所示Dδ2引物或其变体，且其中所述反向引物选自图9B所示Jδ引物或其变体。
12.能够扩增Vδ-DδTCRD重排的核酸扩增引物组，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物选自图9B所示Vδ引物或其变体，且其中所述反向引物是图9B所示Dδ3引物或其变体。
13.能够扩增染色体转位(11；14)(BCL1-IGH)的核酸扩增引物组，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物是图10A所示BCL1/MTC引物或其变体，且其中所述反向引物是图10A所示JH共有序列引物或其变体。
14.能够扩增染色体转位t(14；18)(BCL2-IGH)的核酸扩增引物组，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物选自图11A所示的MBR引物、3′MBR引物或mcr引物或所述引物的变体，且其中所述反向引物是图11A所示JH共有序列引物或其变体。
15.能够扩增人TBXAS1基因的核酸扩增引物组，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物是图12A所示TBXAS1/X9U引物或其变体，且其中所述反向引物是图12A所示TBXAS1/X9L引物或其变体。
16.能够扩增人重组活化蛋白(RAG1)基因的核酸扩增引物组，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物是图12A所示RAG1/X2U引物或其变体，且其中所述反向引物是图12A所示RAG1/X2L引物或其变体。
17.能够扩增人早幼粒细胞白血病锌指蛋白(PLZF)的核酸扩增引物组，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物是图12A所示PLZF/X1U引物引物或其变体，且其中所述反向引物是图12A所示PLZF/X1L引物或其变体。
18.能够扩增人AF4基因(外显子3)的核酸扩增引物组，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物是图12A所示AF4/X3U引物或其变体，且其中所述反向引物是图12A所示AF4/X3L引物或其变体。
19.能够扩增人AF4基因(外显子11)的核酸扩增引物组，其包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物是图12A所示AF4/X11U引物或其变体，且其中所述反向引物是图12A所示AF4/X11L引物或其变体。
20.一种核酸扩增检测方法，优选PCR检测法，更优选多元PCR检测法，所述检测方法利用至少一个根据权利要求1-19之一的引物组。
21.检测VH-JH IGH重排的方法，包括在权利要求20的核酸扩增检测方法中利用一或多个根据权利要求1的引物组。
22.检测DH-JH IGH重排的方法，包括在权利要求20的核酸扩增检测方法中利用一或多个根据权利要求2的引物组。
23.检测Vκ-JκIGK重排的方法，包括在权利要求20的核酸扩增检测方法中利用一或多个根据权利要求3的引物组。
24.检测Vκ/内含子-Kde IGK重排的方法，包括在权利要求20的核酸扩增检测方法中利用一或多个根据权利要求4的引物组。
25.检测Vλ-JλIGL重排的方法，包括在权利要求20的核酸扩增检测方法中利用一或多个根据权利要求5的引物组。
26.检测Vβ-JβTCRB重排的方法，包括在权利要求20的核酸扩增检测方法中利用一或多个根据权利要求6的引物组。
27.检测Dβ-JβTCRB重排的方法，包括在权利要求20的核酸扩增检测方法中利用一或多个根据权利要求7的引物组。
28.检测Vγ-JγTCRG重排的方法，包括在权利要求20的核酸扩增检测方法中利用一或多个根据权利要求8的引物组。
29.检测Vδ-JδTCRD重排的方法，包括在权利要求20的核酸扩增检测方法中利用一或多个根据权利要求9的引物组。
30.检测Dδ-DδTCRD重排的方法，包括在权利要求20的核酸扩增检测方法中利用一或多个根据权利要求10的引物组。
31.检测Dδ-JδTCRD重排的方法，包括在权利要求20的核酸扩增检测方法中利用一或多个根据权利要求11的引物组。
32.检测Vδ-DδTCRD重排的方法，包括在权利要求20的核酸扩增检测方法中利用一或多个根据权利要求12的引物组。
33.检测染色体转位(11；14)(BCL1-IGH)的方法，包括在权利要求20的核酸扩增检测方法中利用一或多个根据权利要求13的引物组。
34.检测染色体转位t(14；18)(BCL2-IGH)的方法，包括在权利要求20的核酸扩增检测方法中利用一或多个根据权利要求14的引物组。
35.检测选自人AF4基因(外显子3)，人AF4基因(外显子11)，人PLZF1基因，人RAG1基因或人TBXASI基因的基因的方法，包括在权利要求20的核酸扩增检测方法中利用一或多个根据权利要求15-19之一的引物组。
36.权利要求35的方法在评估DNA样品的质量中的用途，所述DNA样品提取自生物样品、优选石蜡包埋的生物样品。
37.检测选自下组的两种或两种以上重排、两种或两种以上转位或至少一种重排与至少一种转位的方法：VH-JH IGH重排，DH-JH IGH重排，Vκ-JκIGK重排，Vκ/内含子-Kde IGK重排，Vλ-JλIGL重排，Vβ-JβTCRB重排，Dβ-JβTCRB重排，Vγ-JγTCRG重排，Vδ-JδTCRD重排，Dδ-DδTCRD重排，Dδ-JδTCRD重排，Vδ-DδTCRD重排，t(11；14)(BCL1-IGH)转位或t(14；18)(BCL2-IGH)转位，所述检测利用至少两个根据权利要求1或14之一的引物组。
38.评估克隆重排和/或染色体异常的方法，所述方法利用至少一个根据权利要求1-14之一的引物组，以及可选至少一个根据权利要求15-19之一的引物组。
39.权利要求38的方法，其用来检测微小残留病变或者鉴定经由实时定量PCR进行MRD检测所用的PCR靶。
40.权利要求38或39的方法，其中经扩增的核酸利用自动高分辨率PCR片段分析来检测。
41.试剂盒，其用于检测选自下组的至少一种重排：VH-JH IGH重排，DH-JH IGH重排，Vκ-JκIGK重排，Vκ/内含子-Kde IGK重排，Vλ-JλIGL重排，Vβ-JβTCRB重排，Dβ-JβTCRB重排，Vγ-JγTCRG重排，Vδ-JδTCRD重排，Dδ-DδTCRD重排，Dδ-JδTCRD重排，Vδ-DδTCRD重排，和/或其用于检测选自下组的至少一种转位：t(11；14)(BCL1-IGH)或t(14；18)(BCL2-IGH)，所述试剂盒包括至少一个根据权利要求1-14之一的引物组。
42.权利要求41的试剂盒，还包含至少一个根据权利要求15-19之一的引物组。
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