CH714402A1

CH714402A1 - Procédé de détection de la présence d'un élément biochimique.

Info

Publication number: CH714402A1
Application number: CH01471/17A
Authority: CH
Inventors: Montagnier Luc
Original assignee: Fond Luc Montagnier; Montagnier Luc
Priority date: 2017-12-04
Filing date: 2017-12-04
Publication date: 2019-06-14
Also published as: WO2019110620A1

Abstract

L’invention concerne un procédé de détection d’un élément biochimique dans une solution, notamment un plasma sanguin, qui comprend les étapes suivantes: forte dilution (E2) de la solution, selon un taux de dilution inférieur ou égal à 10 – 3 ; amplification (E3) d’une certaine trace d’un élément biochimique dans la solution fortement diluée par réaction en chaîne par polymérase PCR; recherche de la présence d’un élément biochimique dans la solution amplifiée par une étape d’électrophorèse (E4) et/ou par séquençage (E5) d’un fragment obtenu, notamment par la méthode de Sanger, puis analyse (E6) du résultat. L’invention porte aussi sur un dispositif de détection de l’élément biochimique.

Description

Description [0001] La présente invention porte sur un procédé de détection de la présence d’un élément biochimique dans une solution. Elle est particulièrement applicable à la détection d’agents infectieux dans le sang d’un patient. Elle permet un diagnostic d’une certaine maladie, la découverte d’éléments responsables d’une maladie, et l’amélioration de la mise au point d’une thérapie associée à une maladie.

[0002] La recherche de la présence d’éléments biochimiques de type bactéries, ou de formes bactériennes, de virus, etc., est très utile dans de nombreuses situations, notamment pour des applications médicales, pour réaliser un diagnostic le plus pertinent possible. Dans ces applications médicales, la recherche bactérienne ou virale est par exemple souvent effectuée à partir d’un plasma sanguin dont on extrait de l’ADN. Une telle recherche est complexe car il faut éviter toute contamination bactérienne des prélèvements sanguins, qui fausserait les résultats. De plus, les procédés existants mettent en oeuvre des domaines de filtrations et autres étapes traditionnelles, qui s’avèrent insuffisantes dans certaines situations. Il en résulte que certaines bactéries ou certains virus, et plus généralement certains éléments biochimiques, notamment lorsqu’ils sont présents en faible quantité, restent très difficiles, voire impossibles à détecter, ce qui induit des erreurs de diagnostic et des traitements thérapeutiques inadaptés.

[0003] La présente invention vise à pallier ces inconvénients des procédures traditionnelles de l’état de la technique et cherche une solution de détection de la présence d’un élément biochimique plus sensible, plus précise, et donc plus fiable.

[0004] En outre, l’invention cherche aussi une solution de détection de la présence d’un élément biochimique facile à mettre en oeuvre, et pour un coût minimum.

[0005] A cet effet, l’invention porte sur un procédé de détection d’un élément biochimique dans une solution, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes: - forte dilution de la solution, selon un taux de dilution inférieur ou égal à 10-3; - amplification d’une certaine trace d’un élément biochimique dans la solution fortement diluée par réaction en chaîne par polymérase PCR; - recherche de la présence d’un élément biochimique dans la solution amplifiée par une étape d’électrophorèse et/ou par séquençage d’un fragment obtenu, notamment par la méthode de Sänger, puis analyse du résultat.

[0006] La forte dilution de la solution peut comprendre une dilution à un taux de dilution inférieur ou égal à 10-4, ou 10-8, ou 10_1°, ou 10-13, voire à un taux de dilution inférieur ou égal à 10-15 et/ou à un taux de dilution compris entre 10-3 et 1O-30 inclus, voire entre 10_1° et 1O-20 inclus.

[0007] Le procédé est avantageusement répété, à partir de l’étape d’amplification, avec plusieurs échantillons de la solution correspondant à plusieurs fortes dilutions différentes.

[0008] Le procédé peut de plus comprendre une sous-étape de forte agitation de la solution fortement diluée avant l’étape d’amplification.

[0009] L’étape de forte dilution peut comprendre une sous-étape de dilution qui comprend une série de dilutions successives de la solution, dans de l’eau non contaminée, avec une agitation pendant au moins 10 secondes, voire au moins 15 secondes, entre tout ou partie des dilutions de la série de dilutions successives.

[0010] L’étape d’amplification peut mettre en oeuvre une réaction en chaîne par polymérase PCR comprenant au moins 45 thermocycles, et/ou utilisant comme polymérase celle connue par son nom commercial de PerFecTa.

[0011] L’étape de forte dilution peut comprendre une sous-étape de filtration de l’eau stérile.

[0012] Le procédé de détection d’un élément biochimique peut comprendre une ou plusieurs étapes de filtration de la solution, notamment par des filtres de 450 nm et/ou 100 nm, avant l’étape d’amplification.

[0013] L’élément biochimique peut être de nature bactérienne ou virale.

[0014] La solution peut être un plasma sanguin.

[0015] Le procédé de détection d’un élément biochimique peut comprendre une étape de préparation de la solution par ajout d’un anti-coagulant à un échantillon de sang, puis la séparation du plasma par centrifugation du sang à une vitesse d’environ 3000 trs/min pendant environ cinq minutes à une température régulée d’environ 20 °C.

[0016] L’élément biochimique peut être la bactérie Borrelia burgdorferi ou la bactérie Sutterella.

[0017] L’invention porte aussi sur un procédé d’analyse d’un patient, notamment atteint de la maladie de Lyme ou d’autisme, caractérisé en ce qu’il comprend une étape d’analyse d’un plasma du patient par la mise en oeuvre d’un procédé de détection d’un élément biochimique dans ce plasma tel que décrit précédemment.

[0018] L’invention porte aussi sur un procédé d’analyse d’une maladie, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes: - procédé de détection d’au moins un élément biochimique tel que décrit précédemment sur des fluides corporels de plusieurs personnes souffrant de la maladie à analyser; - comparaison des résultats obtenus entre les différentes personnes, et détection du ou des élément(s) biochimique(s) commun(s) pour ces différentes personnes, pour conclure que la maladie est de type infectieuse causée par cet ou ces élément(s) biochimique(s) commun(s).

[0019] L’invention porte aussi sur une définition d’une médication à base d’antibiotique appliquée à la maladie de Lyme, l’autisme, la polyarthrite rhumatoïde, ou la maladie d’Alzheimer, après sa mise en évidence par un procédé tel que décrit précédemment.

[0020] L’invention porte aussi sur un traitement antibiotique appliqué à une maladie analysée par un procédé d’analyse tel que décrit ci-dessus.

[0021] Enfin, l’invention porte aussi sur un dispositif de détection d’un élément biochimique pour mettre en oeuvre le procédé de détection d’au moins un élément biochimique tel que décrit précédemment, caractérisé en ce qu’il comprend: - un robot diluteur, qui met en oeuvre la dilution d’une solution et une agitation d’un microtube comprenant la solution diluée; et - un thermocycleur mettant en oeuvre une amplification par réaction en chaîne par polymérase PCR.

[0022] Ces objets, caractéristiques et avantages de la présente invention seront exposés en détail dans la description suivante d’un mode d’exécution particulier fait à titre non-limitatif en relation avec les figures jointes parmi lesquelles:

La fig. 1 représente un logigramme des étapes du procédé de détection de la présence d’un élément bio chimique dans une solution selon un mode de réalisation de l’invention.

Les fig. 2a et 2b représentent respectivement les résultats de l’application du procédé selon le mode de réalisation de l’invention obtenus sur un patient de 14 ans et sa mère, tous deux atteints par la maladie de Lyme.

[0023] Selon un mode de réalisation de l’invention, le procédé de détection de la présence d’un élément biochimique va maintenant être décrit dans le cadre d’une recherche à titre d’exemple à partir d’un plasma sanguin.

[0024] Ce procédé comprend une première étape préalable de préparation E1 du plasma sanguin.

[0025] Pour cela, il est possible de prélever entre 2 et 5 ml de sang d’un patient en présence d’un anti-coagulant tel que l’EDTA (Acide éthylène Diamine Tetra Acétique). Le sang est ensuite centrifugé à une vitesse de 3000 trs/min pendant cinq minutes, à une température régulée de 20 °C. Cette opération permet de séparer et de récupérer le plasma sanguin. Le plasma sanguin est stocké à une température de -20 °C s’il n’est pas utilisé immédiatement. Il est stocké à une température de 4 °C s’il est utilisé immédiatement.

[0026] Ensuite, selon une première sous-étape de dilution E11 de cette étape de préparation E1, un échantillon de plasma est dilué dans de l’eau stérile selon un ratio de 1:100. Cette étape de dilution au niveau de la préparation a pour fonction d’obtenir une quantité plus importante de plasma, ce qui peut être utile si de nombreuses analyses sont prévues. Cette sous-étape reste donc optionnelle.

[0027] Une deuxième sous-étape de filtration E12 comprend le passage successif du plasma dilué à travers des filtres de 450 nm et 100 nm, par exemple à l’aide de filtres Millex commercialisés par la société Millipore. Cette filtration permet de supprimer potentiellement toute ou quasi-toute bactérie et une grande partie, voire la totalité, des virus du plasma. Il reste les corps les plus petits, notamment les traces d’ADN et d’ARN. Ainsi, comme cela va être détaillé par la suite, le procédé de détection repose d’abord sur la détection d’une trace d’un élément biochimique, particulièrement de l’acide nucléique ou des nucléotides, que nous appellerons aussi trace d’ADN, provenant de cet élément biochimique ou correspondant à cet élément chimique, avant de pouvoir conclure a posteriori à la présence initiale de l’élément biochimique dans le plasma analysé.

[0028] Cette étape préalable de préparation E1 étant finalisée, le procédé selon le mode de réalisation de l’invention, qui consiste en un procédé de détection ultrasensible d’un élément biochimique dans une solution, par l’intermédiaire de la détection d’une trace de cet élément, comme un nucléotide, un acide nucléique ou trace ou séquence d’ADN de cet élément dans la solution, va maintenant être décrit.

[0029] En remarque, ces étapes sont réalisées dans une enceinte de sécurité biologique de classe II. L’opérateur porte des vêtements de protection, comme une blouse de laboratoire, des gants en nitrile et un masque.

[0030] Le procédé comprend d’abord une deuxième étape de dilution E2.

[0031] Cette étape est mise en oeuvre à partir d’eau stérile. Le procédé met alors en oeuvre une première sous-étape de filtration E21 de l’eau stérile, par un filtre à 220 nm, pour éliminer les éventuels corps microbiens qui contamineraient l’eau. Cette sous-étape est conseillée mais optionnelle, elle dépend de la qualité de l’eau stérile disponible.

[0032] Enfin, le procédé met en oeuvre une deuxième sous-étape de dilution E22 en tant que telle. Selon le mode de réalisation, cette sous-étape comprend une série de dilutions successives dans l’eau non contaminée de la solution à analyser, résultant des étapes précédentes, c’est-à-dire le plasma sanguin dans ce mode de réalisation.

[0033] Selon le mode de réalisation de l’invention, plusieurs microtubes en polypropylène de 1,5 ml peuvent être remplis de 0,9 ml d’eau chacun. Ensuite, 0,1 ml d’un échantillon de plasma est ajouté au premier microtube, puis 0,1 ml de ce premier microtube est prélevé et reporté dans le deuxième microtube, et ainsi de suite. Cela permet donc d’enchainer en série plusieurs dilutions décimales. Avantageusement, après chaque remplissage d’un microtube, soit après chaque dilution décimale, le microtube rempli est agité au vortex à la vitesse maximale pendant au moins 10 secondes, de préférence au moins 15 secondes, avant de poursuivre avec une nouvelle dilution. Un nombre d’au moins 10 dilutions, voire au moins 20, est ainsi réalisé.

[0034] Selon le mode de réalisation, ce nombre de dilutions est avantageusement compris entre 10 et 20 inclus, voire au-delà de 20 dilutions. Autrement dit, le taux de dilution est inférieur ou égal à 10_1°, ou compris entre 10_1° et 1O-20 inclus, voire inférieur ou égal à 1O-20.

[0035] Toutefois, cette dilution dépend de l’élément biochimique recherché et le procédé pourra commencer à donner des résultats pour des fortes dilutions de quatre dilutions décimales, soit un taux de dilutions de 10-4. En remarque, ce taux de dilution correspond au taux de dilution total, c’est-à-dire prenant en compte les éventuelles dilutions réalisées avant la mise en oeuvre de cette deuxième étape E2, par exemple durant l’étape de préparation E1 mentionnée précédemment.

[0036] Cette deuxième étape E2 permet donc d’obtenir une solution très fortement diluée, que nous appellerons plasma fortement dilué dans ce mode de réalisation pour la suite de la description.

[0037] En remarque, le procédé selon le mode de réalisation prévoit une forte agitation de la solution avant l’étape d’amplification qui va être décrite ci-après. Ce procédé selon le mode de réalisation prévoit aussi avantageusement une forte agitation de la solution au cours de la réalisation de cette sous-étape de dilution, par la succession de sous-étapes de dilutions et d’agitations. L’agitation est plus généralement mise en oeuvre entre tout ou partie des dilutions successives. De plus, l’agitation est une forte agitation, au vortex à grande vitesse, par exemple dans un dispositif à 50 Hz à une vitesse de 2700 trs/min, pendant au moins dix secondes, voire au moins quinze secondes.

[0038] Naturellement, l’étape de dilution E2 peut en variante comprendre d’autres dilutions que des dilutions décimales.

[0039] Avantageusement, cette étape de dilution E2 est mise en oeuvre par un robot diluteur, qui comprend un bras permettant de réaliser automatiquement les opérations d’ouverture d’un microtube, de prélèvement d’une dose prédéfinie avec précision, fermeture du microtube, versement d’une dose dans un microtube voisin, etc. En complément, ce robot diluteur met de plus en oeuvre une fonction d’agitation de microtube. Pour cela, il peut comprendre un support rotatif pour microtube, permettant son agitation par sa mise en rotation. En variante, un autre moyen d’agitation est possible. Avantageusement, la vitesse et/ou la durée d’agitation est réglable.

[0040] Le procédé met alors en oeuvre une troisième étape E3 d’amplification de traces d’ADN au sein de la solution fortement diluée.

[0041] Selon le mode de réalisation de l’invention, cette troisième étape utilise un procédé de réaction en chaîne par polymérase PCR.

[0042] Pour cela, plusieurs échantillons de plasma fortement dilué peuvent être utilisés, pour augmenter la fiabilité du procédé. Ces échantillons peuvent correspondre à plusieurs forts taux de dilution distincts et/ou identiques.

[0043] A titre d’exemple, selon le mode de réalisation, un échantillon de plasma fortement dilué de 5 μΙ est versé dans un microtube de 0,2 ml, dans lequel on ajoute une polymérase adaptée au procédé PCR, comme celle connue par son nom commercial de PerFecTa ThoughMix de la société Quantabio, et 0,2 μΜ de chaque amorce choisie, pour obtenir un volume total de 20 μΙ.

[0044] A titre d’exemple, dans le cas où la bactérie recherchée est la Borrelia burgdorferi, responsable par exemple de la maladie de Lyme, alors le procédé PCR peut être mis en oeuvre dans un thermocycleur, par exemple tel que connu par son nom commercial Nexus GSX1/GX2e commercialisé par la société Eppendorf, de la manière suivante: une première étape de dénaturation est engagée à 95 °C pendant 5 minutes, suivie par 45 cycles de températures, comprenant chacun une période de 30 secondes à 95 °C, puis 30 secondes à 61 °C, puis 40 secondes à 72 °C, avant une incubation finale de 15 minutes à 72 °C. Le ou les échantillons ainsi traités sont alors refroidis à une température de 4 °C.

[0045] Cette démarche est menée simultanément ou parallèlement, à partir du même échantillon de la solution fortement diluée ou de plusieurs échantillons distincts, pour chaque élément biochimique recherché. Naturellement, les amorces utilisées lors du procédé PCR seront adaptées à l’élément biochimique recherché. En remarque, dans le cas où le ou les éléments biochimiques ne sont pas connus, le procédé utilise une amorce relativement générique, c’est-à-dire compatible avec une multitude de séquences d’ADN. Le procédé PCR peut aussi être mis en oeuvre plusieurs fois, avec des amorces différentes, pour rechercher une multitude d’éléments biochimiques potentiels. D’autre part, il est avantageux dans tous les cas de mettre en oeuvre au moins 45 thermocyles.

[0046] Cette troisième étape E3 utilise donc au moins partiellement une méthode connue de démultiplication, autrement dit d’amplification, de traces d’ADN. La méthode PCR est basée sur une polymérase thermorésistante, qui permet de recopier des séquences de brins d’ADN. La reconnaissance de cette séquence de manière très rapide parmi un grand nombre de séquences est un phénomène particulier qui a parfois été expliqué par le mouvement brownien, ce qui est controversé. Le procédé est ici mis en oeuvre avec succès de manière originale à partir d’un plasma fortement dilué, ce qui suggère la mise en œuvre potentielle d’autres phénomènes que le mouvement brownien. Il s’avère que cette mise en œuvre particulière permet d’obtenir de manière inattendue une plus grande sensibilité. Cet effet s’explique par un fonctionnement de la polymérase différent de celui traditionnellement admis, n’impliquant pas une simple copie d’une séquence d’un modèle mais une transmission d’information de nature différente. En remarque, la méthode PCR n’est pas mise en œuvre sur de l’ADN extrait du plasma, comme traditionnellement dans l’état de la technique, mais directement sur le plasma fortement dilué.

[0047] Naturellement, le procédé peut utiliser différentes variantes d’amplifications PCR, ou tout procédé d’amplification équivalent ou alternatif.

[0048] A la fin de cette troisième étape E3, l’amplification permet d’atteindre une quantité suffisante de séquences d’ADN pour leur détection et analyse. Nous appellerons simplement solution amplifiée la solution issue de cette troisième étape.

[0049] Le procédé selon le mode de réalisation met alors en œuvre une quatrième étape E4 d’électrophorèse. Une quantité de 5 pi de chaque échantillon issu de l’étape précédente est mélangée avec 1 ml d’un tampon connu par son nom commercial 6X, formant un marqueur, et soumise à une électrophorèse sur gel d’aragose à 1,2%, en présence d’un colorant fluorescent de l’ADN, connu par son nom anglais de SybrSAFE commercialisé par la société InVitrogen. Une échelle de marqueurs, par exemple connue par sa dénomination 100 bp ladder, commercialisée par la société InVitrogen, est utilisée en parallèle pour estimer la taille des fragments. Cette étape permet la séparation des éléments biochimiques en fonction de leur poids moléculaire et la visualisation du fragment d’ADN présent dans le plasma fortement dilué amplifié (amplicon). Il peut notamment être vérifié que la hauteur de la bande correspond à celle d’un témoin positif.

[0050] Dans certains cas, selon l’élément biochimique recherché, cette quatrième étape E4 s’avère suffisante, c’est-à-dire transmet une information suffisante pour l’identification d’un élément biochimique lors de l’étape d’analyse de résultat E6.

[0051] Le procédé peut mettre en œuvre une cinquième étape E5, en complément ou remplacement de la quatrième étape E4, de séquençage des amplicons produits par le procédé PCR de la troisième étape. Pour cela, les amplicons sont purifiés avec un kit de purification, par exemple celui dénommé «QIAquick PCR purification kit» commercialisé par la société QIAGEN. Les amplicons purifiés sont ensuite séquences directement par la méthode de Sänger, en utilisant les amorces du procédé PCR.

[0052] En variante, particulièrement s’il s’avère que le nombre d’amplicons est faible, les amplicons purifiés sont clones dans un vecteur de plasmide pCR2.1, par exemple en utilisant le kit de clonage connu par son nom commercial TOPO TA commercialisé par la société InVitrogen, qui est utilisé pour transformer des bactéries compétentes qui sont cultivées sur des boites de sélection de milieu gélose LB contenant de l’ampicilline. Des colonies sont isolées et cultivées à partir d’une seule bactérie dans des bouillons de culture LB de 4 ml contenant également de l’ampicilline et des clones de plasmide sont purifiés et dépistés par digestion par l’endonucléase de restriction EcoRI pour vérifier la présence d’inserts. Les plasmides positifs sont séquences par la méthode de Sänger en utilisant des amorces universelles directes et inverses M13.

[0053] Le procédé met ensuite en œuvre une sixième étape E6 d’analyse de résultat. Cette étape peut comprendre la simple comparaison du résultat de la quatrième étape E4 par rapport à des témoins. Elle peut aussi, ou en variante, comprendre une analyse des séquences obtenues par la cinquième étape E5, ce qui peut se faire par une recherche dans une banque de données, par exemple avec l’outil Blast. La séquence des nucléotides des amplicons purifiés ou clones est analysée avec cet outil pour comparer les éléments obtenus par le procédé avec des données mémorisées, et identifier des rapprochements significatifs qui permettent de conclure à l’identification des séquences de l’espèce bactérienne impliquée.

[0054] Le procédé décrit précédemment permet donc finalement de détecter tout élément biochimique, notamment de nature bactérienne ou virale. Il permet par exemple de détecter la bactérie Borrelia burgdorferi, ou les espèces voisines, ou la bactérie Sutterella. En remarque, le procédé sera naturellement adapté à l’élément biochimique recherché. Notamment, comme explicité précédemment, l’étape d’amplification E3 utilise des amorces adaptées. De plus, les filtrations seront de même adaptées à la dimension de l’élément recherché, de sorte à éliminer de la solution le maximum d’éléments, tout en conservant des traces de type acide nucléique microbien, pour pouvoir les détecter par la suite. Ainsi, dans le cas d’une recherche d’un élément biochimique de type virus, le procédé décrit selon ce mode de réalisation pourra être mis en œuvre de manière identique en remplaçant le filtrage à 100 nm par un filtrage à 20 nm (sous-étape de filtration E12), pour tenir compte de la plus petite dimension de l’élément biochimique.

[0055] Le procédé a été décrit sur la base de plasma sanguin, mais peut être implémenté à partir de toute solution.

[0056] En remarque, une caractéristique essentielle du procédé consiste à procéder à une forte dilution de la solution à tester. Nous appelons forte dilution toute dilution d’au moins trois ou quatre fois la dilution décimale, soit un taux de dilution inférieur ou égal à 10-3 ou 10-4. En variante, le taux de dilution pourra être inférieur ou égal à 10-8, voire à 10-10, voire à 10-13, voire à 10-15, c’est-à-dire une dilution équivalente à une dilution supérieure ou égale à 8, voire 10 ou 13 ou 15, dilutions décimales. De préférence, le taux de dilution est compris entre 10_3et 1O-30 inclus, voire entre 10_1°et 1O-20 inclus. Cette forte dilution apporte l’effet inattendu d’une plus forte sensibilité de la détection d’un élément biochimique qu’un même procédé mis en œuvre sans forte dilution, comme mentionné précédemment. En remarque, cet effet est vérifié quel que soit l’élément biochimique concerné, et plus précisément quelle que soit la trace ADN de l’élément biochimique dans la solution.

[0057] En remarque, le procédé est avantageusement répété avec plusieurs échantillons de la solution fortement diluée, caractérisés par plusieurs taux de dilution différents. Il peut alors être conclu lors de la sixième étape E6 d’analyse de résultat que l’élément biochimique était bien présent dans la solution initiale, dès lors que au moins un, voire ou au moins deux ou trois, échantillon(s) permet(tent) sa détection. Cette approche permet ainsi d’obtenir un résultat positif même lorsque l’élément biochimique est présent en très faible quantité dans la solution.

[0058] Un exemple d’application du procédé décrit précédemment à un patient de 14 ans souffrant de la maladie chronique de Lyme, se manifestant par de la fatigue, des douleurs articulaires, ainsi qu’une inflammation intestinale, va maintenant être décrit, en référence avec la fig. 2a.

[0059] Si on applique de manière classique le procédé PCR pour ce patient, ce qui n’est pas représenté, on n’obtient aucune détection en résultat de la quatrième étape d’électrophorèse E4. Autrement dit, le procédé de l’état de la technique ne permet pas de détecter la présence de la bactérie Borrelia burgdorferi.

[0060] La fig. 2a représente les résultats obtenus pour ce patient, en appliquant le procédé selon le mode de réalisation de l’invention, à partir du plasma fortement dilué. Les différentes colonnes numérotées de 1 à 20 représentent les différentes dilutions décimales appliquées au plasma déjà dilué au centième dans la sous-étape E11. Ainsi, la colonne 1 correspond à une troisième dilution décimale et à un taux de dilution de 10-3, et ainsi de suite. La fig. 2a montre qu’une bande à 499 bp est détectée pour la colonne 3, puis pour les colonnes 14 à 20. Le séquençage de Sänger de l’amplicon purifié (cinquième étape E5) et l’analyse par l’outil Blast (sixième étape E6) indiquent finalement la plus forte homologie de la séquence de type Borrelia ribosomale 16s attendue à +/- 1 bp en comparaison avec la séquence de référence de la séquence de Borrelia burgdorferi B31 fournie par ATCC, qui correspond bien à la maladie de Lyme.

[0061] Il ressort donc que le diagnostic de la maladie ne peut pas être établi ou confirmé avec les techniques traditionnelles, notamment avec le procédé PCR traditionnel, qui ne met pas en évidence la présence de la bactérie Borrelia burgdorferi. Au contraire, avec le procédé selon le mode de réalisation de l’invention, une infection par la bactérie Borrelia burgdorferi a pu être mise en évidence, ce qui a pu permettre de conclure qu’il s’agit de la maladie de Lyme. Le procédé selon le mode de réalisation de l’invention permet donc d’améliorer le diagnostic d’une maladie, puis naturellement la médication associée.

[0062] En complément, il faut noter que la mère du patient développait aussi sensiblement les mêmes symptômes que son fils. La fig. 2b illustre les résultats obtenus par la quatrième étape d’électrophorèse pour plusieurs taux de dilution sur le plasma de la mère, lors de la mise en oeuvre du procédé selon le mode de réalisation de l’invention de manière similaire au procédé de la fig. 2a. On obtient une détection d’une faible bande à 499 bp avec un taux de dilution de 10-3, puis une détection pour de nombreux autres taux de dilution. En remarque, si on applique de manière classique le procédé PCR pour cette patiente, ce qui n’est pas représenté, on n’obtient aucune détection en résultat de la quatrième étape d’électrophorèse E4.

[0063] Cet exemple illustre que le procédé de détection de l’invention atteint contre toute attente une très forte sensibilité en utilisant des forts taux de dilution, ce qui permet la détection de la présence d’un élément biochimique qui n’était pas possible auparavant. Il en résulte donc un diagnostic nouveau et plus fiable, comme illustré dans cet exemple avec la maladie de Lyme, permettant de définir une médication adaptée, contrairement à ce qui était proposé précédemment.

[0064] Il résulte de l’invention de nombreuses applications, dont naturellement une méthode de compréhension de maladie et de recherche de maladie améliorée. Ce procédé de l’invention permet par exemple de mettre en évidence des éléments de nature bactérienne ou virale en relation avec différentes maladies, démontrant que ces maladies sont de nature infectieuse, alors qu’elles étaient considérées non infectieuses auparavant du fait de l’impossibilité de détecter les microorganismes à l’origine de l’infection. A titre d’exemples, on peut citer l’autisme, la polyarthrite rhumatoïde, et la maladie d’Alzheimer.

[0065] Le procédé est donc aussi utilisé comme procédé de diagnostic d’une maladie.

[0066] L’invention porte aussi sur un procédé d’analyse d’une certaine maladie. Ce procédé comprend les étapes suivantes: - application du procédé de détection d’éléments biochimiques tel que décrit précédemment sur des fluides corporels de plusieurs personnes souffrant de la maladie à analyser. Ce procédé pourra être répété sur tous les prélèvements de sorte à chercher une multitude d’éléments biochimiques potentiels, notamment de nature microbienne; - comparaison des résultats obtenus pour chaque personne, et détection de la ou des éléments biochimiques communs pour ces différentes personnes, pour conclure que la maladie est de type infectieuse, causée par cet (ou ces) élément biochimique commun.

[0067] Ainsi, l’invention permet d’identifier les éléments biochimiques responsables d’une certaine maladie qui peut être nouvelle ou mal comprise à ce jour. A titre d’exemples, on met en évidence par le procédé selon le mode de réalisation de l’invention que les personnes souffrant d’autisme portent la bactérie Sutterella.

[0068] Cette amélioration du diagnostic et de la connaissance des maladies permet naturellement de définir une médication plus adaptée que ce n’est le cas actuellement.

[0069] Ainsi, le procédé de détection d’éléments biochimiques selon l’invention est aussi utile pour définir une médication, particulièrement à base d’antibiotique, dans les cas de maladies identifiées comme de source bactérienne.

[0070] L’invention porte aussi sur un dispositif de détection d’un élément biochimique pour mettre en oeuvre le procédé de détection d’au moins un élément biochimique tel que décrit précédemment, de manière au moins partiellement automatique, qui comprend: - un robot diluteur, qui met en oeuvre la dilution d’une solution dans un tube et une agitation d’un tube comprenant la solution diluée; et - un thermocycleur mettant en oeuvre une amplification par réaction en chaîne par polymérase PCR.

[0071] Ce dispositif peut aussi comprendre un dispositif d’analyse de résultats par électrophorèse et/ou séquençage, de manière connue.

Claims

Revendications

1. Procédé de détection d’un élément biochimique dans une solution, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes: - forte dilution (E2) de la solution, selon un taux de dilution inférieur ou égal à 10-3; - amplification (E3) d’une certaine trace d’un élément biochimique dans la solution fortement diluée par réaction en chaîne par polymérase PCR; - recherche de la présence d’un élément biochimique dans la solution amplifiée par une étape d’électrophorèse (E4) et/ou par séquençage (E5) d’un fragment obtenu, notamment par la méthode de Sänger, puis analyse (E6) du résultat.
2. Procédé de détection d’un élément biochimique selon la revendication précédente, caractérisé en ce que la forte dilution de la solution comprend une dilution à un taux de dilution inférieur ou égal à 10-4, ou 10-8, ou 10_1°, ou 10-13, voire à un taux de dilution inférieur ou égal à 10-15 et/ou à un taux de dilution compris entre 10-3 et 1O-30 inclus, voire entre 10_1° et 1O-20 inclus.
3. Procédé de détection d’un élément biochimique selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le procédé est répété, à partir de l’étape d’amplification (E3), avec plusieurs échantillons de la solution correspondant à plusieurs fortes dilutions différentes.
4. Procédé de détection d’un élément biochimique selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le procédé comprend une sous-étape de forte agitation de la solution fortement diluée avant l’étape d’amplification (E3).
5. Procédé de détection d’un élément biochimique selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’étape de forte dilution (E2) comprend une sous-étape de dilution (E22) qui comprend une série de dilutions successives de la solution, dans de l’eau non contaminée, avec une agitation pendant au moins 10 secondes, voire au moins 15 secondes, entre tout ou partie des dilutions de la série de dilutions successives.
6. Procédé de détection d’un élément biochimique selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’étape d’amplification (E3) met en oeuvre une réaction en chaîne par polymérase PCR comprenant au moins 45 thermocycles, et/ou utilisant comme polymérase celle connue par son nom commercial de PerFecTa.
7. Procédé de détection d’un élément biochimique selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’étape de forte dilution (E2) comprend une sous-étape (E21) de filtration de l’eau stérile.
8. Procédé de détection d’un élément biochimique selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il comprend une ou plusieurs étapes de filtration (E12) de la solution, notamment par des filtres de 450 nm et/ou 100 nm, avant l’étape d’amplification (E3).
9. Procédé de détection d’un élément biochimique selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’élément biochimique est de nature bactérienne ou virale.
10. Procédé de détection d’un élément biochimique selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la solution est un plasma sanguin.
11. Procédé de détection d’un élément biochimique selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de préparation (E1) de la solution par ajout d’un anti-coagulant à un échantillon de sang, puis la séparation du plasma par centrifugation du sang à une vitesse d’environ 3000 trs/min pendant environ cinq minutes à une température régulée d’environ 20 °C.
12. Procédé de détection d’un élément biochimique selon l’une des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que l’élément biochimique est la bactérie Borrelia burgdorferi ou la bactérie Sutterella.
13. Procédé d’analyse d’un patient, notamment atteint de la maladie de Lyme ou d’autisme, caractérisé en ce qu’il comprend une étape d’analyse d’un plasma du patient par la mise en oeuvre d’un procédé de détection d’un élément biochimique dans ce plasma selon l’une des revendications précédentes.
14. Procédé d’analyse d’une maladie, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes: - procédé de détection d’au moins un élément biochimique selon l’une des revendications 1 à 12 sur des fluides corporels de plusieurs personnes souffrant de la maladie à analyser; -comparaison des résultats obtenus entre les différentes personnes, et détection du ou des élément(s) biochimique(s) commun(s) pour ces différentes personnes, pour conclure que la maladie est de type infectieuse causée par cet ou ces élément(s) biochimique(s) commun(s).
15. Définition d’une médication à base d’antibiotique appliquée à la maladie de Lyme, l’autisme, la polyarthrite rhumatoïde, ou la maladie d’Alzheimer, après sa mise en évidence par un procédé selon l’une des revendications 9 à 12.
16. Traitement antibiotique appliqué à une maladie analysée par un procédé d’analyse selon la revendication 14.
17. Dispositif de détection d’un élément biochimique pour mettre en oeuvre le procédé de détection d’au moins un élément biochimique selon l’une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu’il comprend: - un robot diluteur, qui met en oeuvre la dilution d’une solution et une agitation d’un microtube comprenant la solution diluée; et - un thermocycleur mettant en oeuvre une amplification par réaction en chaîne par polymérase PCR.