JPWO2020138435A1 - 眼内悪性リンパ腫の補助的診断法 - Google Patents
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Abstract
Description
さらに、本発明者らは、眼内悪性リンパ腫の遺伝子解析のために調製できるDNA量が非常に微量であることに鑑み、この点を解決すべく、複数の遺伝子変異を同時に検出可能とするために、デジタルPCR(digital PCR;digital polymerase chain reaction)等による解析の前に、微量検体由来のサンプルDNAをmultiplex PCR法などにより前増幅することによって、1回のデジタルPCR等による解析で複数の変異遺伝子が同時に検出可能となることを見出した。
(1)被験者由来の検体において、以下の(A)ないし(I)のいずれかの遺伝子変異の1または複数を検出することを含む、眼内悪性リンパ種の診断を補助する方法。
(A)CD79Bのc.586T>A変異、
(B)CD79Bのc.586T>C変異、
(C)CD79Bのc.587A>C変異、
(D)CD79Bのc.587A>G変異、
(E)BTG2のc.133G>A変異、
(F)BTG2のc.142G>A変異、
(G)MYD88のc.794T>C変異、
(H)MYD88のc.728G>A変異、および
(I)PIM1のc.550C>T変異
(2)前記遺伝子変異が、少なくとも、前記(E)、(F)または(I)のいずれかであることを特徴とする上記(1)に記載の方法。
(3)被験者由来の検体において、以下の(a)ないし(i)のいずれかの遺伝子変異の1または複数を検出することを含む、眼内悪性リンパ種の診断を補助する方法
(a)CD79Bタンパク質のY196Nのアミノ酸置換を伴うCD79B遺伝子変異、
(b)CD79Bタンパク質のY196Hのアミノ酸置換を伴うCD79B遺伝子変異、
(c)CD79Bタンパク質のY196Sのアミノ酸置換を伴うCD79B遺伝子変異、
(d)CD79Bタンパク質のY196Cのアミノ酸置換を伴うCD79B遺伝子変異、
(e)BTG2タンパク質のA45Tのアミノ酸置換を伴うBTG2遺伝子変異、
(f)BTG2タンパク質のE48Kのアミノ酸置換を伴うBTG2遺伝子変異、
(g)MYD88タンパク質のL265Pのアミノ酸置換を伴うMYD88遺伝子変異、
(h)MYD88タンパク質のS243Nのアミノ酸置換を伴うMYD88遺伝子変異、および
(i)PIM1タンパク質のL184Fのアミノ酸置換を伴うPIM1遺伝子変異
(4)前記遺伝子変異が、少なくとも、前記(e)、(f)または(i)のいずれかであることを特徴とする上記(3)に記載の方法。
(5)前記遺伝子変異の検出を、デジタルPCR法により検出することを特徴とする上記(1)ないし(4)のいずれかに記載の方法。
(6)上記(5)の検出を行う前に、予め検体由来のDNAを増幅することを特徴とする(5)に記載の方法。
(7)前記検体が眼内液、髄液、末梢血または骨髄であることを特徴とする上記(1)ないし(6)のいずれかに記載の方法。
(8)眼内悪性リンパ種の診断を補助する方法を実施するためのキット。
(9)以下の(A)ないし(I)のいずれかの遺伝子変異の1または複数を検出するためのプローブおよび/またはプライマーを含むことを特徴とする上記(8)に記載のキット。
(A)CD79Bのc.586T>A変異、
(B)CD79Bのc.586T>C変異、
(C)CD79Bのc.587A>C変異、
(D)CD79Bのc.587A>G変異、
(E)BTG2のc.133G>A変異、
(F)BTG2のc.142G>A変異、
(G)MYD88のc.728G>A変異、
(H)MYD88のc.794T>C変異、および
(I)PIM1のc.550C>T変異
(A)CD79B(CD79b Molecule)のc.586T>A変異、
(B)CD79Bのc.586T>C変異、
(C)CD79Bのc.587A>C変異、
(D)CD79Bのc.587A>G変異、
(E)BTG2(BTG Anti-proliferation Factor 2)のc.133G>A変異、
(F)BTG2のc.142G>A変異、
(G)MYD88(MYD88 Innate Immune Signal Transduction Adaptor;Myeloid Differentiation Primary Response 88)のc.794T>C変異
(H)MYD88のc.728G>A変異、および
(I)PIM1(Pim-1 Proto-oncogene, Serine/Threonine kinase)のc.550C>T変異
(a)CD79Bタンパク質のY196Nのアミノ酸置換を伴うCD79B遺伝子変異、
(b)CD79Bタンパク質のY196Hのアミノ酸置換を伴うCD79B遺伝子変異、
(c)CD79Bタンパク質のY196Sのアミノ酸置換を伴うCD79B遺伝子変異、
(d)CD79Bタンパク質のY196Cのアミノ酸置換を伴うCD79B遺伝子変異、
(e)BTG2タンパク質のA45Tのアミノ酸置換を伴うBTG2遺伝子変異、
(f)BTG2タンパク質のE48Kのアミノ酸置換を伴うBTG2遺伝子変異、
(g)MYD88タンパク質のL265Pのアミノ酸置換を伴うMYD88遺伝子変異、
(h)MYD88タンパク質のS243Nのアミノ酸置換を伴うMYD88遺伝子変異、および
(i)PIM1タンパク質のL184Fのアミノ酸置換を伴うPIM1遺伝子変異
なお、本明細書においては遺伝子名を表す場合には、遺伝子名に下線を付し、その遺伝子産物を表す場合には、遺伝子名に下線を付さずに記載する、または遺伝子名の後に「タンパク質」を記載することとする。
以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、本実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
1−1.硝子体液の検体処理とDNA抽出
眼内悪性リンパ腫と診断された患者の硝子体手術により得た硝子体液中に細胞を48 μmのナイロンメッシュのフィルターに通過させ、MACS bufferで洗浄し、1500 rpm、4℃で5分間遠心分離した。MACS bufferで更に2回洗浄し、2500rpm、4℃で5分間遠心分離し上清を破棄した。下液をAllPrep DNA/RNA Micro Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA)を用いてDNA抽出した。
上記眼内悪性リンパ種の診断は、以下の基準を用いて行った;(1)細胞診クラス4以上であること、または(2)細胞診クラス3、(3)IL10/IL6>1、(4)IgH遺伝子再構成(PCR法)陽性(LSIメディエンス)、(5)FACSでkappa/lambda ratio >3 or<05) (Davis et al, Am J Ophthalmol 2005, 140:822-29:Sagoo et al, Surv Ophthalmol 2014, 59:503-16)の(2)から(5)の4項目中2項目以上陽性であること。なお、細胞診クラス3とは異型性があり、悪性の疑いあり、クラス4とは悪性細胞の可能性が高いものをいう。
本実施例ではいくつかの眼内悪性リンパ腫と関連する候補遺伝子(CD79B、BTG2、MYD88および PIM1など)および変異箇所を選定し、表1に示す通り4遺伝子9箇所を解析箇所として選出した。4遺伝子9箇所はすべて一塩基置換である。
MYD88 L265P以外の4遺伝子8箇所のプローブおよびプライマー配列は、Custom TaqMan(登録商標)Assay Design Tool(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)を用いて合成した。MYD88 L265Pのプローブおよびプライマーは、中枢性悪性リンパ腫のMYD88 L265P検出を行った既報と同じ配列を設計した。
プライマーおよびプローブ配列(FAMは変異体のプローブ、VICは野生型のプローブを表す)を以下に示す。また、表2および表3には、各遺伝子の変異領域とDigital PCR解析のためのプライマーおよびプローブの設定位置を示す(なお、表2および表3に示す配列領域は、CD79B(c.586T>A、c.586T>C、c.587A>C、c.587A>G:配列番号33)、BTG2(c.133G>A、c142G>A:配列番号34)、MYD88(c.794T>c:配列番号35、c.728G>A:配列番号36)およびPIM1(c.550C>T:配列番号37)として配列表に示す)。表2および3において、変異箇所を[T/A](TからAへの変異)、[A/C](AからCへの変異)などのように示した。
CD79B c.586T>A
Forward;5’- GGGCCTGCCCCTCTC -3’(配列番号1)
Reverse;5’- AGCAAGGCTGGCATGGA -3’(配列番号2)
CD79B c.586T>C
Forward;5’- GGGCCTGCCCCTCTC -3’(配列番号1)
Reverse;5’- AGCAAGGCTGGCATGGA -3’(配列番号2)
CD79B c.587A>C
Forward;5’- CTGACCCCGAGGACTCAGA -3’(配列番号3)
Reverse;5’- GGCTGGCATGGAGGAAGA -3’(配列番号4)
CD79B c.587A>G
Forward;5’- CTGACCCCGAGGACTCAGA -3’(配列番号3)
Reverse;5’- GGCTGGCATGGAGGAAGA -3’(配列番号4)
BTG2 c.133G>A
Forward;5’- GAGCAGAGGCTTAAGGTCTTCA -3’(配列番号5)
Reverse;5’- GGCATGCGCTCACCTG -3’(配列番号6)
BTG2 c.142G>A
Forward;5’- GAGCAGAGGCTTAAGGTCTTCAG -3’(配列番号7)
Reverse;5’- AGGCCCCTCGGCATG -3’(配列番号8)
MYD88 c.794T>C
Forward;5’- CCTTGGCTTGCAGGT -3’(配列番号9)
Reverse;5’- TCTTTCTTCATTGCCTTGT -3’(配列番号10)
MYD88 c.728G>A
Forward;5’- GGTGGTGGTTGTCTCTGATGATTAC -3’(配列番号11)
Reverse;5’- TGAGTGCAAATTTGGTCTGGAAGT -3’(配列番号12)
PIM1 c.550C>T
Forward;5’- GAAAACATCCTTATCGACCTCAATCG -3’(配列番号13)
Reverse;5’- CGTGTAGACGGTGTCCTTGAG -3’(配列番号14)
CD79B c.586T>A
FAM;5’- AGATCACACCTTCGAGGTA -3’(配列番号15)
VIC;5’- AAGATCACACCTACGAGGTA -3’(配列番号16)
CD79B c.586T>C
FAM;5’- TCACACCTGCGAGGTA -3’(配列番号17)
VIC;5’- AAGATCACACCTACGAGGTA -3’(配列番号18)
CD79B c.587A>C
FAM;5’- CTTACCTCGTCGGTGTGA -3’(配列番号19)
VIC;5’- TCCTTACCTCGTAGGTGTGA -3’(配列番号20)
CD79B c.587A>G
FAM;5’- CTTACCTCGTGGGTGTG -3’(配列番号21)
VIC;5’- CCTTACCTCGTAGGTGTG -3’(配列番号22)
BTG2 c.133G>A
FAM;5’- CTCCAGGAGACACTCA -3’(配列番号23)
VIC;5’- CTCCAGGAGGCACTCA -3’(配列番号24)
BTG2 c.142G>A
FAM;5’- CACTCACAAGTGAGCG -3’(配列番号25)
VIC;5’- CACTCACAGGTGAGCG -3’(配列番号26)
MYD88 c.794T>C
FAM;5’- TGGGGATCGGTCGC -3’(配列番号27)
VIC;5’- TGGGGATCAGTCGCTT -3’(配列番号28)
MYD88 c.728G>A
FAM;5’- CACATTCCTTGTTCTGCA -3’(配列番号29)
VIC;5’- CACATTCCTTGCTCTGCA -3’(配列番号30)
PIM1 c.550C>T
FAM;5’- AAGTCGATGAACTTGAG -3’(配列番号31)
VIC;5’- AAGTCGATGAGCTTGAG -3’(配列番号32)
デジタルPCR解析において、複数の遺伝子変異の有無を確認する場合、これまで各遺伝子変異について、各々デジタルPCR解析を行うことが必須であったが、これには解析に十分なDNA量が必要であった。しかし、発明者らは、微量なDNA量しか得ることができない微量検体から、複数の遺伝子変異を、同時に検出可能なデジタルPCR解析の検出系を初めて確立した。すなわち、微量検体より抽出した微量DNAを、デジタルPCRのドロップレット内で、multiplex PCR法を応用して前増幅することで、増幅効率を上げ、解析箇所として選定した4遺伝子9箇所を、一度のデジタルPCR解析で検出することに成功した。具体的には、以下の方法となる。
デジタルPCR解析に当たり、DNA総量が10 ngに満たない場合、既報を参考にmultiplex PCR法による前増幅を行った。multiplex PCRは、各プライマーの終濃度が5μMになるよう調整し、Master mixである2xddPCR SuperMix For Probe (no dUTP; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)を用い、鋳型DNA、5μMのプライマー、nuclease free waterを含め20μlになるように調整した。この調整液20μlにDroplet Generator オイル For Probe (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)を70μl加え、QX200 Droplet Generator (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)にてドロップレットを作成した。このドロップレットを、MiniAmp Thermal Cycler applied biosystems (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)を用いて、95℃で10分反応させた後、94℃30秒と60℃1分を10サイクル行い、98℃で10分反応させ、PCRによる前増幅を行った。
前増幅後のアンプリコンをDNA Clean & Concentrator -5 Kit(Zymo Research, Irvine, CA, USA)を用いて精製し、最終量が20 μlとなるように調整した。
前増幅し生成したアンプリコンを鋳型として、以下のようにドロップレットを作製後、デジタルPCR解析を行い、蛍光強度を読み取り解析した。
まず、プローブ7(MYD88 c.794T>C L265P)のアッセイについては、溶出した20 μlのアンプリコンの内5 μlを、それ以外の8アッセイについては溶出した20 μlのアンプリコンを10倍希釈した5 μlを鋳型DNAとして用い、この鋳型DNAに、2xddPCR SuperMix For Probe(no dUTP;Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)、TaqMan Assay 40x(Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA;FAMまたはVICのプローブ8 μM、各プライマー36 μMのミックス)、nuclease free waterを加え、全量が20 μlになるように調整した。この調整液20 μlにDroplet Generator オイル For Probe(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)を70 μl加え、QX200 Droplet Generator(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)にてドロップレットを作成した。このドロップレットを、MiniAmp Thermal Cycler applied biosystems(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)を用いて、95℃で10分反応させた後、94℃30秒と60℃1分を40サイクル行い、98℃で10分反応させ、QX200 Droplet Reader(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)にて蛍光強度を読み取り、QuantaSoft Software version 1.7(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)にて解析した。
デジタルPCR解析により、28例の眼の検体から変異遺伝子の検出を行った。プローブ6 (BTG2 c.142G>A E48K)を用いて解析した眼内悪性リンパ腫の代表的な解析結果を、図1に示す。本解析結果では、FAM陽性ドロップレットを多数みとめ、変異有りと判定できた。デジタルPCR解析結果から、変異遺伝子ごとに、変異をみとめた症例数と変異率を求めたところ、CD79Bは37%、BTG2は15%、MYD88は79%、PIM1は26%で変異をみとめ、眼内悪性リンパ腫と診断された症例の96%の症例で、4遺伝子9箇所のいずれかに少なくとも1つの変異が認められた。
以上の結果はから、MYD88やCD79B だけでなく、BTG2、PIM1変異遺伝子を用いることで、高率に眼内悪性リンパ腫の診断を補助できる補助的診断方法と考えられた。
Claims (9)
- 被験者由来の検体において、以下の(A)ないし(I)のいずれかの遺伝子変異の1または複数を検出することを含む、眼内悪性リンパ種の診断を補助する方法。
(A)CD79Bのc.586T>A変異、
(B)CD79Bのc.586T>C変異、
(C)CD79Bのc.587A>C変異、
(D)CD79Bのc.587A>G変異、
(E)BTG2のc.133G>A変異、
(F)BTG2のc.142G>A変異、
(G)MYD88のc.794T>C変異、
(H)MYD88のc.728G>A変異、および
(I)PIM1のc.550C>T変異 - 前記遺伝子変異が、少なくとも、前記(E)、(F)または(I)のいずれかであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 被験者由来の検体において、以下の(a)ないし(i)のいずれかの遺伝子変異の1または複数を検出することを含む、眼内悪性リンパ種の診断を補助する方法
(a)CD79Bタンパク質のY196Nのアミノ酸置換を伴うCD79B遺伝子変異、
(b)CD79Bタンパク質のY196Hのアミノ酸置換を伴うCD79B遺伝子変異、
(c)CD79Bタンパク質のY196Sのアミノ酸置換を伴うCD79B遺伝子変異、
(d)CD79Bタンパク質のY196Cのアミノ酸置換を伴うCD79B遺伝子変異、
(e)BTG2タンパク質のA45Tのアミノ酸置換を伴うBTG2遺伝子変異、
(f)BTG2タンパク質のE48Kのアミノ酸置換を伴うBTG2遺伝子変異、
(g)MYD88タンパク質のL265Pのアミノ酸置換を伴うMYD88遺伝子変異、
(h)MYD88タンパク質のS243Nのアミノ酸置換を伴うMYD88遺伝子変異、および
(i)PIM1タンパク質のL184Fのアミノ酸置換を伴うPIM1遺伝子変異 - 前記遺伝子変異が、少なくとも、前記(e)、(f)または(i)のいずれかであることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記遺伝子変異の検出を、デジタルPCR法により検出することを特徴とする請求項1ないし4のいずれかに記載の方法。
- 請求項5の検出を行う前に、予め検体由来のDNAを増幅することを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記検体が眼内液、髄液、末梢血または骨髄であることを特徴とする請求項1ないし6のいずれかに記載の方法。
- 眼内悪性リンパ種の診断を補助する方法を実施するためのキット。
- 以下の(A)ないし(I)のいずれかの遺伝子変異の1または複数を検出するためのプローブおよび/またはプライマーを含むことを特徴とする請求項8に記載のキット。
(A)CD79Bのc.586T>A変異、
(B)CD79Bのc.586T>C変異、
(C)CD79Bのc.587A>C変異、
(D)CD79Bのc.587A>G変異、
(E)BTG2のc.133G>A変異、
(F)BTG2のc.142G>A変異、
(G)MYD88のc.728G>A変異、
(H)MYD88のc.794T>C変異、および
(I)PIM1のc.550C>T変異
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