JP3351773B2 - Ｈｉｖ−１のサブタイプ決定法 - Google Patents
Ｈｉｖ−１のサブタイプ決定法Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
- C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＨＩＶ−１のサブ
タイプ決定法およびＨＩＶ−１のサブタイプを決定する
ためのキットに関する。
タイプ決定法およびＨＩＶ−１のサブタイプを決定する
ためのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒト免疫不全ウイルス（以下、「ＨＩ
Ｖ」と記す。）は、後天性免疫不全症候群（以下、「Ａ
ＩＤＳ」と記す。）の原因ウイルスで、１型（ＨＩＶ−
１）と２型（ＨＩＶ−２）が知られている。このうち、
症例が多く、種々のサブタイプが見つかっているのは、
ＨＩＶ−１である。感染個体内のＨＩＶ−１のサブタイ
プを決定することは、ウイルス学的検査結果（特に血漿
ＨＩＶ−１ＲＮＡ濃度や遺伝型による薬剤耐性）の信頼
性や、感染経路を推測するために重要である。−般にＨ
ＩＶ−１のサブタイプ決定はウイルスゲノムの特定領域
をシークエンシングし、その結果を系統樹解析すること
によって判定されているが、これらの操作は煩雑で費用
もかかることが問題となっていた。
Ｖ」と記す。）は、後天性免疫不全症候群（以下、「Ａ
ＩＤＳ」と記す。）の原因ウイルスで、１型（ＨＩＶ−
１）と２型（ＨＩＶ−２）が知られている。このうち、
症例が多く、種々のサブタイプが見つかっているのは、
ＨＩＶ−１である。感染個体内のＨＩＶ−１のサブタイ
プを決定することは、ウイルス学的検査結果（特に血漿
ＨＩＶ−１ＲＮＡ濃度や遺伝型による薬剤耐性）の信頼
性や、感染経路を推測するために重要である。−般にＨ
ＩＶ−１のサブタイプ決定はウイルスゲノムの特定領域
をシークエンシングし、その結果を系統樹解析すること
によって判定されているが、これらの操作は煩雑で費用
もかかることが問題となっていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、よ
り簡便なＨＩＶ−１のサブタイプ決定法を提供すること
を目的とする。また、本発明は、ＨＩＶ−１のサブタイ
プを決定するためのキットを提供することも目的とす
る。
り簡便なＨＩＶ−１のサブタイプ決定法を提供すること
を目的とする。また、本発明は、ＨＩＶ−１のサブタイ
プを決定するためのキットを提供することも目的とす
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、各サブタ
イプに特異的なプライマーを設計し、これを用いてサン
プル中の核酸の増幅反応を行うことによって、ＨＩＶ−
１のサブタイプを迅速に決定することに成功し、本発明
を完成させるに至った。すなわち、本発明は、ＨＩＶ−
１のenv遺伝子のヌクレオチド配列の一部であって、5'
末端部および3'末端部のうちの少なくとも片方のヌクレ
オチド配列がＨＩＶ−１のサブタイプにより異なる一部
を標的配列として核酸の増幅反応を行い、核酸の増幅の
有無によりサブタイプの検出を行うことを特徴とする、
ＨＩＶ−１のサブタイプを決定する方法を提供する。標
的配列は100〜2500塩基対の長さであるとよく、好まし
くは150〜500塩基対の長さである。上記の方法におい
て、標的配列の3'末端および／または5'末端から１番目
〜３０番目の塩基までの配列がサブタイプによって異な
るとよい。例えば、標的配列の3'末端はＨＩＶ−１のen
v遺伝子のC3領域にあってもよい。また、標的配列の5'
末端がＨＩＶ−１のenv遺伝子のC2領域にあってもよ
い。異なるプライマー対を用いて異なる増幅反応を行っ
て、異なるサブタイプを検出することができる。例え
ば、ＨＩＶ−１のenv遺伝子のC3領域の一部のサブタイ
プによって異なるヌクレオチド配列（ヌクレオチド配列
１）に相補的な配列を含むプライマー（プライマー１）
とＨＩＶ−１のenv遺伝子のC2領域の一部のヌクレオチ
ド配列（ヌクレオチド配列２）に相補的な配列を含むプ
ライマー（プライマー２）とからなるプライマー対を用
いる増幅反応を少なくとも２回プライマー対を変えて行
い、少なくとも２つのサブタイプを検出することができ
る。
イプに特異的なプライマーを設計し、これを用いてサン
プル中の核酸の増幅反応を行うことによって、ＨＩＶ−
１のサブタイプを迅速に決定することに成功し、本発明
を完成させるに至った。すなわち、本発明は、ＨＩＶ−
１のenv遺伝子のヌクレオチド配列の一部であって、5'
末端部および3'末端部のうちの少なくとも片方のヌクレ
オチド配列がＨＩＶ−１のサブタイプにより異なる一部
を標的配列として核酸の増幅反応を行い、核酸の増幅の
有無によりサブタイプの検出を行うことを特徴とする、
ＨＩＶ−１のサブタイプを決定する方法を提供する。標
的配列は100〜2500塩基対の長さであるとよく、好まし
くは150〜500塩基対の長さである。上記の方法におい
て、標的配列の3'末端および／または5'末端から１番目
〜３０番目の塩基までの配列がサブタイプによって異な
るとよい。例えば、標的配列の3'末端はＨＩＶ−１のen
v遺伝子のC3領域にあってもよい。また、標的配列の5'
末端がＨＩＶ−１のenv遺伝子のC2領域にあってもよ
い。異なるプライマー対を用いて異なる増幅反応を行っ
て、異なるサブタイプを検出することができる。例え
ば、ＨＩＶ−１のenv遺伝子のC3領域の一部のサブタイ
プによって異なるヌクレオチド配列（ヌクレオチド配列
１）に相補的な配列を含むプライマー（プライマー１）
とＨＩＶ−１のenv遺伝子のC2領域の一部のヌクレオチ
ド配列（ヌクレオチド配列２）に相補的な配列を含むプ
ライマー（プライマー２）とからなるプライマー対を用
いる増幅反応を少なくとも２回プライマー対を変えて行
い、少なくとも２つのサブタイプを検出することができ
る。
【０００５】また、第一のプライマー対を用いて、ＨＩ
Ｖ−１のenv遺伝子のヌクレオチド配列の一部を標的配
列とする第一の増幅反応を行った後、第二のプライマー
対を用いて、前記標的配列の一部であって、5'末端部お
よび3'末端部のうちの少なくとも片方のヌクレオチド配
列がサブタイプにより異なる一部を標的配列とする第二
の増幅反応を行い、第二の増幅反応による核酸の増幅の
有無によりサブタイプの検出を行ってもよい。例えば、
第二のプライマー対が、ＨＩＶ−１のenv遺伝子のC3領
域の一部のサブタイプによって異なるヌクレオチド配列
（ヌクレオチド配列１）に相補的な配列を含むプライマ
ー（プライマー１）とＨＩＶ−１のenv遺伝子のC2領域
の一部のヌクレオチド配列（ヌクレオチド配列２）に相
補的な配列を含むプライマー（プライマー２）とからな
り、第一のプライマー対が、ＨＩＶ−１のenv遺伝子の
ヌクレオチド配列１の3'末端の下流の領域の一部のヌク
レオチド配列（ヌクレオチド配列３）に相補的な配列を
含むプライマー（プライマー３）とＨＩＶ−１のenv遺
伝子のヌクレオチド配列２の5’末端の上流の領域の一
部のヌクレオチド配列（ヌクレオチド配列４）に相補的
な配列を含むプライマー（プライマー４）とからなって
もよい。
Ｖ−１のenv遺伝子のヌクレオチド配列の一部を標的配
列とする第一の増幅反応を行った後、第二のプライマー
対を用いて、前記標的配列の一部であって、5'末端部お
よび3'末端部のうちの少なくとも片方のヌクレオチド配
列がサブタイプにより異なる一部を標的配列とする第二
の増幅反応を行い、第二の増幅反応による核酸の増幅の
有無によりサブタイプの検出を行ってもよい。例えば、
第二のプライマー対が、ＨＩＶ−１のenv遺伝子のC3領
域の一部のサブタイプによって異なるヌクレオチド配列
（ヌクレオチド配列１）に相補的な配列を含むプライマ
ー（プライマー１）とＨＩＶ−１のenv遺伝子のC2領域
の一部のヌクレオチド配列（ヌクレオチド配列２）に相
補的な配列を含むプライマー（プライマー２）とからな
り、第一のプライマー対が、ＨＩＶ−１のenv遺伝子の
ヌクレオチド配列１の3'末端の下流の領域の一部のヌク
レオチド配列（ヌクレオチド配列３）に相補的な配列を
含むプライマー（プライマー３）とＨＩＶ−１のenv遺
伝子のヌクレオチド配列２の5’末端の上流の領域の一
部のヌクレオチド配列（ヌクレオチド配列４）に相補的
な配列を含むプライマー（プライマー４）とからなって
もよい。
【０００６】第一のプライマー対を用いてＨＩＶ−１の
env遺伝子のヌクレオチド配列の一部を標的配列とする
第一の増幅反応を行った後、第二のプライマー対を用い
て前記標的配列の内部のヌクレオチド配列を標的配列と
する第二の増幅反応を行い、第二の増幅反応による核酸
の増幅の有無によりサブタイプの検出を行う一連の操作
を第二のプライマー対を変えて少なくとも１回繰り返す
ことにより、少なくとも２つのサブタイプの鑑別を行う
ことができる。例えば、（a）第一のプライマーとし
て、GCAATAGAAAAATTCTCCTC（配列番号５）のヌクレオチ
ド配列を含むプライマー12A、ACAGTAGAAAAATTCCCCTC
（配列番号６）のヌクレオチド配列を含むプライマー12
B、CACAGTACAATGCACACATG（配列番号８）のヌクレオチ
ド配列を含むプライマー9AEおよびCACAGTACAATGTACACAT
G（配列番号９）のヌクレオチド配列を含むプライマー9
Bの混合物を用い、第二のプライマー対として、CTCCTGA
GGAGTTAGCAAAG（配列番号２７）のヌクレオチド配列を
含むプライマー11QA1およびCTGTTAAATGGCAGTCTAGC（配
列番号２０）のヌクレオチド配列を含むプライマー10U
を用いてサブタイプＡの検出を行い、 （b）第一のプライマーとして、GCAATAGAAAAATTCTCCTC
（配列番号５）のヌクレオチド配列を含むプライマー12
A、ACAGTAGAAAAATTCCCCTC（配列番号６）のヌクレオチ
ド配列を含むプライマー12B、CACAGTACAATGCACACATG
（配列番号８）のヌクレオチド配列を含むプライマー9A
EおよびCACAGTACAATGTACACATG（配列番号９）のヌクレ
オチド配列を含むプライマー9Bの混合物を用い、第二の
プライマー対として、CACAATTAAAACTGTGCATTAC（配列番
号２８）のヌクレオチド配列を含むプライマー11VBおよ
びCTGTTAAATGGCAGTCTAGC（配列番号２０）のヌクレオチ
ド配列を含むプライマー10Uを用いてサブタイプBの検出
を行い、 （c）第一のプライマーとして、GCAATAGAAAAATTCTCCTC
（配列番号５）のヌクレオチド配列を含むプライマー12
A、ACAGTAGAAAAATTCCCCTC（配列番号６）のヌクレオチ
ド配列を含むプライマー12B、CACAGTACAATGCACACATG
（配列番号８）のヌクレオチド配列を含むプライマー9A
EおよびCACAGTACAATGTACACATG（配列番号９）のヌクレ
オチド配列を含むプライマー9Bの混合物を用い、第二の
プライマー対として、TTGTTTTATTAGGGAAGTGTTC（配列番
号２９）のヌクレオチド配列を含むプライマー11XCおよ
びCTGTTAAATGGCAGTCTAGC（配列番号２０）のヌクレオチ
ド配列を含むプライマー10Uを用いてサブタイプCの検出
を行い、 （d）第一のプライマーとして、GCAATAGAAAAATTCTCCTC
（配列番号５）のヌクレオチド配列を含むプライマー12
A、ACAGTAGAAAAATTCCCCTC（配列番号６）のヌクレオチ
ド配列を含むプライマー12B、CACAGTACAATGCACACATG
（配列番号８）のヌクレオチド配列を含むプライマー9A
EおよびCACAGTACAATGTACACATG（配列番号９）のヌクレ
オチド配列を含むプライマー9Bの混合物を用い、第二の
プライマー対として、CTCTACAATTAAAATGATGCATTG（配列
番号３０）のヌクレオチド配列を含むプライマー11WEお
よびCTGTTAAATGGCAGTCTAGC（配列番号２０）のヌクレオ
チド配列を含むプライマー10Uを用いてサブタイプＥの
検出を行うことにより、サブタイプＡ、Ｂ、ＣおよびＥ
の鑑別を行うことができる。
env遺伝子のヌクレオチド配列の一部を標的配列とする
第一の増幅反応を行った後、第二のプライマー対を用い
て前記標的配列の内部のヌクレオチド配列を標的配列と
する第二の増幅反応を行い、第二の増幅反応による核酸
の増幅の有無によりサブタイプの検出を行う一連の操作
を第二のプライマー対を変えて少なくとも１回繰り返す
ことにより、少なくとも２つのサブタイプの鑑別を行う
ことができる。例えば、（a）第一のプライマーとし
て、GCAATAGAAAAATTCTCCTC（配列番号５）のヌクレオチ
ド配列を含むプライマー12A、ACAGTAGAAAAATTCCCCTC
（配列番号６）のヌクレオチド配列を含むプライマー12
B、CACAGTACAATGCACACATG（配列番号８）のヌクレオチ
ド配列を含むプライマー9AEおよびCACAGTACAATGTACACAT
G（配列番号９）のヌクレオチド配列を含むプライマー9
Bの混合物を用い、第二のプライマー対として、CTCCTGA
GGAGTTAGCAAAG（配列番号２７）のヌクレオチド配列を
含むプライマー11QA1およびCTGTTAAATGGCAGTCTAGC（配
列番号２０）のヌクレオチド配列を含むプライマー10U
を用いてサブタイプＡの検出を行い、 （b）第一のプライマーとして、GCAATAGAAAAATTCTCCTC
（配列番号５）のヌクレオチド配列を含むプライマー12
A、ACAGTAGAAAAATTCCCCTC（配列番号６）のヌクレオチ
ド配列を含むプライマー12B、CACAGTACAATGCACACATG
（配列番号８）のヌクレオチド配列を含むプライマー9A
EおよびCACAGTACAATGTACACATG（配列番号９）のヌクレ
オチド配列を含むプライマー9Bの混合物を用い、第二の
プライマー対として、CACAATTAAAACTGTGCATTAC（配列番
号２８）のヌクレオチド配列を含むプライマー11VBおよ
びCTGTTAAATGGCAGTCTAGC（配列番号２０）のヌクレオチ
ド配列を含むプライマー10Uを用いてサブタイプBの検出
を行い、 （c）第一のプライマーとして、GCAATAGAAAAATTCTCCTC
（配列番号５）のヌクレオチド配列を含むプライマー12
A、ACAGTAGAAAAATTCCCCTC（配列番号６）のヌクレオチ
ド配列を含むプライマー12B、CACAGTACAATGCACACATG
（配列番号８）のヌクレオチド配列を含むプライマー9A
EおよびCACAGTACAATGTACACATG（配列番号９）のヌクレ
オチド配列を含むプライマー9Bの混合物を用い、第二の
プライマー対として、TTGTTTTATTAGGGAAGTGTTC（配列番
号２９）のヌクレオチド配列を含むプライマー11XCおよ
びCTGTTAAATGGCAGTCTAGC（配列番号２０）のヌクレオチ
ド配列を含むプライマー10Uを用いてサブタイプCの検出
を行い、 （d）第一のプライマーとして、GCAATAGAAAAATTCTCCTC
（配列番号５）のヌクレオチド配列を含むプライマー12
A、ACAGTAGAAAAATTCCCCTC（配列番号６）のヌクレオチ
ド配列を含むプライマー12B、CACAGTACAATGCACACATG
（配列番号８）のヌクレオチド配列を含むプライマー9A
EおよびCACAGTACAATGTACACATG（配列番号９）のヌクレ
オチド配列を含むプライマー9Bの混合物を用い、第二の
プライマー対として、CTCTACAATTAAAATGATGCATTG（配列
番号３０）のヌクレオチド配列を含むプライマー11WEお
よびCTGTTAAATGGCAGTCTAGC（配列番号２０）のヌクレオ
チド配列を含むプライマー10Uを用いてサブタイプＥの
検出を行うことにより、サブタイプＡ、Ｂ、ＣおよびＥ
の鑑別を行うことができる。
【０００７】あるいはまた、第一のプライマー対を用い
てＨＩＶ−１のenv遺伝子のヌクレオチド配列の一部を
標的配列とする第一の増幅反応を行った後、第二のプラ
イマー対を用いて前記標的配列の内部のヌクレオチド配
列を標的配列とする第二の増幅反応を行い、第二の増幅
反応による核酸の増幅の有無によりサブタイプの検出を
行う一連の操作を第一のプライマー対および第二のプラ
イマー対を変えて少なくとも１回繰り返すことにより、
少なくとも２つのサブタイプの鑑別を行ってもよい。例
えば、(a) 第一のプライマー対として、GCAATAGAAAAATT
CTCCTC（配列番号５）のヌクレオチド配列を含むプライ
マー12AおよびCACAGTACAATGCACACATG（配列番号８）の
ヌクレオチド配列を含むプライマー9AEを用い、第二の
プライマー対として、CTCCTGAGGGGTTAGCAAAG（配列番号
１）のヌクレオチド配列を含むプライマー11QAおよびAA
ATGGCAGTCTAGCAGAAG（配列番号４）のヌクレオチド配列
を含むプライマー10を用いてサブタイプＡの検出を行
い、（b) 第一のプライマー対として、ACAGTAGAAAAATTC
CCCTC（配列番号６）のヌクレオチド配列を含むプライ
マー12BおよびCACAGTACAATGTACACATG（配列番号９）の
ヌクレオチド配列を含むプライマー9Bを用い、第二のプ
ライマー対として、CTGTGCATTACAATTTCTGG（配列番号
２）のヌクレオチド配列を含むプライマー11BBおよびAA
ATGGCAGTCTAGCAGAAG（配列番号４）のヌクレオチド配列
を含むプライマー10を用いてサブタイプＢの検出を行
い、また、(c) 第一のプライマー対として、GCAATAGAAA
AATTCCCCTC（配列番号７）のヌクレオチド配列を含むプ
ライマー12EおよびCACAGTACAATGCACACATG（配列番号
８）のヌクレオチド配列を含むプライマー9AEを用い、
第二のプライマー対として、CTCCTGAGGGTGGTTGAAAG（配
列番号３）のヌクレオチド配列を含むプライマー11QEお
よびAAATGGCAGTCTAGCAGAAG（配列番号４）のヌクレオチ
ド配列を含むプライマー10を用いてサブタイプＥの検出
を行うことにより、サブタイプＡ、ＢおよびＥの鑑別を
行うことができる。
てＨＩＶ−１のenv遺伝子のヌクレオチド配列の一部を
標的配列とする第一の増幅反応を行った後、第二のプラ
イマー対を用いて前記標的配列の内部のヌクレオチド配
列を標的配列とする第二の増幅反応を行い、第二の増幅
反応による核酸の増幅の有無によりサブタイプの検出を
行う一連の操作を第一のプライマー対および第二のプラ
イマー対を変えて少なくとも１回繰り返すことにより、
少なくとも２つのサブタイプの鑑別を行ってもよい。例
えば、(a) 第一のプライマー対として、GCAATAGAAAAATT
CTCCTC（配列番号５）のヌクレオチド配列を含むプライ
マー12AおよびCACAGTACAATGCACACATG（配列番号８）の
ヌクレオチド配列を含むプライマー9AEを用い、第二の
プライマー対として、CTCCTGAGGGGTTAGCAAAG（配列番号
１）のヌクレオチド配列を含むプライマー11QAおよびAA
ATGGCAGTCTAGCAGAAG（配列番号４）のヌクレオチド配列
を含むプライマー10を用いてサブタイプＡの検出を行
い、（b) 第一のプライマー対として、ACAGTAGAAAAATTC
CCCTC（配列番号６）のヌクレオチド配列を含むプライ
マー12BおよびCACAGTACAATGTACACATG（配列番号９）の
ヌクレオチド配列を含むプライマー9Bを用い、第二のプ
ライマー対として、CTGTGCATTACAATTTCTGG（配列番号
２）のヌクレオチド配列を含むプライマー11BBおよびAA
ATGGCAGTCTAGCAGAAG（配列番号４）のヌクレオチド配列
を含むプライマー10を用いてサブタイプＢの検出を行
い、また、(c) 第一のプライマー対として、GCAATAGAAA
AATTCCCCTC（配列番号７）のヌクレオチド配列を含むプ
ライマー12EおよびCACAGTACAATGCACACATG（配列番号
８）のヌクレオチド配列を含むプライマー9AEを用い、
第二のプライマー対として、CTCCTGAGGGTGGTTGAAAG（配
列番号３）のヌクレオチド配列を含むプライマー11QEお
よびAAATGGCAGTCTAGCAGAAG（配列番号４）のヌクレオチ
ド配列を含むプライマー10を用いてサブタイプＥの検出
を行うことにより、サブタイプＡ、ＢおよびＥの鑑別を
行うことができる。
【０００８】本発明の方法は、さらに、ＨＩＶ−１のゲ
ノムのヌクレオチド配列の一部であって、ヌクレオチド
配列がすべてのサブタイプの間で高度に保存されている
一部を標的配列とする核酸の増幅反応を行い、核酸の増
幅の有無によりＨＩＶ−１の存在または不存在を確認す
る工程を含んでもよい。ＨＩＶ−１の存在または不存在
を確認する工程は、第一のプライマー対を用いて、ＨＩ
Ｖ−１のゲノムのヌクレオチド配列の一部であって、ヌ
クレオチド配列がすべてのサブタイプの間で高度に保存
されている一部を標的配列とする核酸の増幅反応を行っ
た後、第二のプライマー対を用いて、前記標的配列の内
部のヌクレオチド配列を標的配列とする第二の増幅反応
を行い、核酸の増幅の有無によりＨＩＶ−１の存在また
は不存在を確認することからなるとよい。ここで、第一
のプライマーとして、GCAATAGAAAAATTCTCCTC（配列番号
５）のヌクレオチド配列を含むプライマー12A、ACAGTAG
AAAAATTCCCCTC（配列番号６）のヌクレオチド配列を含
むプライマー12B、CACAGTACAATGCACACATG（配列番号
８）のヌクレオチド配列を含むプライマー9AEおよびCAC
AGTACAATGTACACATG（配列番号９）のヌクレオチド配列
を含むプライマー9Bの混合物を用い、第二のプライマー
として、AATTTCTGGGTCCCCTCCTG（配列番号１８）のヌク
レオチド配列を含むプライマー11LB、AATTTCTAGATCCCCT
CCTG（配列番号２５）のヌクレオチド配列を含むプライ
マー11LAE、AATTTCTAGGTCCCCTCCTG（配列番号２６）の
ヌクレオチド配列を含むプライマー11LCおよびCTGTTAAA
TGGCAGTCTAGC（配列番号２０）のヌクレオチド配列を含
むプライマー10Uの混合物を用いることができる。
ノムのヌクレオチド配列の一部であって、ヌクレオチド
配列がすべてのサブタイプの間で高度に保存されている
一部を標的配列とする核酸の増幅反応を行い、核酸の増
幅の有無によりＨＩＶ−１の存在または不存在を確認す
る工程を含んでもよい。ＨＩＶ−１の存在または不存在
を確認する工程は、第一のプライマー対を用いて、ＨＩ
Ｖ−１のゲノムのヌクレオチド配列の一部であって、ヌ
クレオチド配列がすべてのサブタイプの間で高度に保存
されている一部を標的配列とする核酸の増幅反応を行っ
た後、第二のプライマー対を用いて、前記標的配列の内
部のヌクレオチド配列を標的配列とする第二の増幅反応
を行い、核酸の増幅の有無によりＨＩＶ−１の存在また
は不存在を確認することからなるとよい。ここで、第一
のプライマーとして、GCAATAGAAAAATTCTCCTC（配列番号
５）のヌクレオチド配列を含むプライマー12A、ACAGTAG
AAAAATTCCCCTC（配列番号６）のヌクレオチド配列を含
むプライマー12B、CACAGTACAATGCACACATG（配列番号
８）のヌクレオチド配列を含むプライマー9AEおよびCAC
AGTACAATGTACACATG（配列番号９）のヌクレオチド配列
を含むプライマー9Bの混合物を用い、第二のプライマー
として、AATTTCTGGGTCCCCTCCTG（配列番号１８）のヌク
レオチド配列を含むプライマー11LB、AATTTCTAGATCCCCT
CCTG（配列番号２５）のヌクレオチド配列を含むプライ
マー11LAE、AATTTCTAGGTCCCCTCCTG（配列番号２６）の
ヌクレオチド配列を含むプライマー11LCおよびCTGTTAAA
TGGCAGTCTAGC（配列番号２０）のヌクレオチド配列を含
むプライマー10Uの混合物を用いることができる。
【０００９】また、本発明は、ＨＩＶ−１のenv遺伝子
のヌクレオチド配列の一部であって、5'末端部および3'
末端部のうちの少なくとも片方のヌクレオチド配列がサ
ブタイプにより異なる一部を標的配列とするプライマー
対を含む、ＨＩＶ−１のサブタイプを決定するためのキ
ットを提供する。
のヌクレオチド配列の一部であって、5'末端部および3'
末端部のうちの少なくとも片方のヌクレオチド配列がサ
ブタイプにより異なる一部を標的配列とするプライマー
対を含む、ＨＩＶ−１のサブタイプを決定するためのキ
ットを提供する。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施態様を詳細に
説明する。ＨＩＶ−１感染が疑われている人、ＨＩＶ−
１感染が確認されている感染者もしくは患者、または抗
ＨＩＶ−１治療を受けている患者などの被験者から、血
液、リンパ液、髄液、精液、リンパ節などのサンプルを
採取する。採取したサンプルから、Pharmacia社のFicol
l-Paque密度勾配遠心を用いて単核球を分離した後か、
あるいは直接QIAGEN社のQIAamp Blood Kitを用いてDNA
を抽出する。あるいは、血漿からは、QIAGEN社のQIAamp
Viral RNA Kitを用いてRNAを抽出する。次いで、このD
NAまたはRNAの濃度を２６０ｎｍにおける吸光度から決
定する。
説明する。ＨＩＶ−１感染が疑われている人、ＨＩＶ−
１感染が確認されている感染者もしくは患者、または抗
ＨＩＶ−１治療を受けている患者などの被験者から、血
液、リンパ液、髄液、精液、リンパ節などのサンプルを
採取する。採取したサンプルから、Pharmacia社のFicol
l-Paque密度勾配遠心を用いて単核球を分離した後か、
あるいは直接QIAGEN社のQIAamp Blood Kitを用いてDNA
を抽出する。あるいは、血漿からは、QIAGEN社のQIAamp
Viral RNA Kitを用いてRNAを抽出する。次いで、このD
NAまたはRNAの濃度を２６０ｎｍにおける吸光度から決
定する。
【００１１】次に、この核酸をＰＣＲ 、好ましくは、n
ested PCRにかける。ここでは、nested PCRを利用する
場合について説明する。nested PCRとは、一組のプライ
マー対（第一のプライマー対）で増幅される標的配列の
内側に第二のプライマー対を設計し、一回目のＰＣＲを
行った後、その反応生成物を希釈して新たな鋳型として
二回目のＰＣＲを行うものである。一回目のＰＣＲでは
標的配列の他に、望まれない配列も増幅されることがあ
る。しかし、一回目のＰＣＲで増幅された望まれない断
片中に第二のプライマー対の各プライマーがアニールす
る配列が存在する確率は極めて低い。従って、このよう
な２回のＰＣＲを行うことにより、標的配列だけが選択
的に増幅されるのである。
ested PCRにかける。ここでは、nested PCRを利用する
場合について説明する。nested PCRとは、一組のプライ
マー対（第一のプライマー対）で増幅される標的配列の
内側に第二のプライマー対を設計し、一回目のＰＣＲを
行った後、その反応生成物を希釈して新たな鋳型として
二回目のＰＣＲを行うものである。一回目のＰＣＲでは
標的配列の他に、望まれない配列も増幅されることがあ
る。しかし、一回目のＰＣＲで増幅された望まれない断
片中に第二のプライマー対の各プライマーがアニールす
る配列が存在する確率は極めて低い。従って、このよう
な２回のＰＣＲを行うことにより、標的配列だけが選択
的に増幅されるのである。
【００１２】まず、鑑別すべきサブタイプ（例えば、サ
ブタイプＡ、サブタイプＢ、サブタイプＥ）にそれぞれ
特異的なプライマー対を用いて一回目のＰＣＲ（第一の
ＰＣＲ）を行う。あるいは、サブタイプに特異的なプラ
イマー対の代わりに、どのサブタイプでも増幅すること
ができる共通なプライマー対を用いてもよい。
ブタイプＡ、サブタイプＢ、サブタイプＥ）にそれぞれ
特異的なプライマー対を用いて一回目のＰＣＲ（第一の
ＰＣＲ）を行う。あるいは、サブタイプに特異的なプラ
イマー対の代わりに、どのサブタイプでも増幅すること
ができる共通なプライマー対を用いてもよい。
【００１３】サブタイプ特異的なプライマー対として
は、例えば、ＨＩＶ−１のenv遺伝子のC2領域の一部の
ヌクレオチド配列に相補的な配列を含むプライマー（プ
ライマー４'）とＨＩＶ−１のenv遺伝子のC3領域の一部
のサブタイプによって異なる（すなわち、サブタイプ特
異的である）ヌクレオチド配列に相補的な配列を含むプ
ライマー（プライマー３'）とからなるプライマー対を
挙げることができる。ＨＩＶ−１のenv遺伝子のC2領域
は図１のようにサブタイプによりヌクレオチド配列が異
なるので、この領域からヌクレオチド配列を選択して、
プライマー４'を設計するとよい。また、ＨＩＶ−１のe
nv遺伝子のC3領域は図２のようにサブタイプによる違い
があるので、この領域からヌクレオチド配列を選択し
て、プライマー３'を設計するとよい。一般に、プライ
マーの長さは、18〜30塩基対であるとよく、好ましくは
20〜25塩基対である。具体的には、以下のプライマー対
を用いることができる。
は、例えば、ＨＩＶ−１のenv遺伝子のC2領域の一部の
ヌクレオチド配列に相補的な配列を含むプライマー（プ
ライマー４'）とＨＩＶ−１のenv遺伝子のC3領域の一部
のサブタイプによって異なる（すなわち、サブタイプ特
異的である）ヌクレオチド配列に相補的な配列を含むプ
ライマー（プライマー３'）とからなるプライマー対を
挙げることができる。ＨＩＶ−１のenv遺伝子のC2領域
は図１のようにサブタイプによりヌクレオチド配列が異
なるので、この領域からヌクレオチド配列を選択して、
プライマー４'を設計するとよい。また、ＨＩＶ−１のe
nv遺伝子のC3領域は図２のようにサブタイプによる違い
があるので、この領域からヌクレオチド配列を選択し
て、プライマー３'を設計するとよい。一般に、プライ
マーの長さは、18〜30塩基対であるとよく、好ましくは
20〜25塩基対である。具体的には、以下のプライマー対
を用いることができる。
【００１４】サブタイプＡの検出のための第一のＰＣＲ
用プライマー対とそのヌクレオチド配列 ・9AE/12A プライマー9AE：CACAGTACAATGCACACATG （配列番号８） プライマー12A：GCAATAGAAAAATTCTCCTC（配列番号５） プライマー9AEは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’末
端（左端）から数えて、6943-6962番目の配列に相補的
な配列であり、サブタイプＡ、Ｅ、ＦおよびＨに特異的
なプライマーである。
用プライマー対とそのヌクレオチド配列 ・9AE/12A プライマー9AE：CACAGTACAATGCACACATG （配列番号８） プライマー12A：GCAATAGAAAAATTCTCCTC（配列番号５） プライマー9AEは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’末
端（左端）から数えて、6943-6962番目の配列に相補的
な配列であり、サブタイプＡ、Ｅ、ＦおよびＨに特異的
なプライマーである。
【００１５】プライマー12Aは、HIV-1(NL4-3株)の全塩
基配列の5’末端（左端）から数えて、7369-7350番目の
配列に相補的な配列であり、サブタイプＡ、Ｃ、Ｅ、
Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪに特異的なプライマーである。
基配列の5’末端（左端）から数えて、7369-7350番目の
配列に相補的な配列であり、サブタイプＡ、Ｃ、Ｅ、
Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪに特異的なプライマーである。
【００１６】サブタイプＢの検出のための第一のＰＣＲ
用プライマー対とそのヌクレオチド配列 ・9B/12B プライマー9B：CACAGTACAATGTACACATG（配列番号９） プライマー12B：ACAGTAGAAAAATTCCCCTC（配列番号６） プライマー9Bは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’末
端（左端）から数えて、6943-6962番目の配列に相補的
な配列であり、サブタイプＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ
およびＪに特異的なプライマーである。プライマー12B
は、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’末端（左端）か
ら数えて、7369-7350番目の配列に相補的な配列であ
り、サブタイプＢ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＩに特異的なプラ
イマーである。
用プライマー対とそのヌクレオチド配列 ・9B/12B プライマー9B：CACAGTACAATGTACACATG（配列番号９） プライマー12B：ACAGTAGAAAAATTCCCCTC（配列番号６） プライマー9Bは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’末
端（左端）から数えて、6943-6962番目の配列に相補的
な配列であり、サブタイプＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ
およびＪに特異的なプライマーである。プライマー12B
は、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’末端（左端）か
ら数えて、7369-7350番目の配列に相補的な配列であ
り、サブタイプＢ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＩに特異的なプラ
イマーである。
【００１７】サブタイプＥの検出のための第一のＰＣＲ
用プライマー対とそのヌクレオチド配列 ・9AE/12E プライマー9AE：CACAGTACAATGCACACATG （配列番号８） プライマー12E：GCAATAGAAAAATTCCCCTC（配列番号７） プライマー12Eは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5'末
端（左端）から数えて、7350-7369番目の配列に相補的
な配列であり、サブタイプＥにのみ特異的なプライマー
である。
用プライマー対とそのヌクレオチド配列 ・9AE/12E プライマー9AE：CACAGTACAATGCACACATG （配列番号８） プライマー12E：GCAATAGAAAAATTCCCCTC（配列番号７） プライマー12Eは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5'末
端（左端）から数えて、7350-7369番目の配列に相補的
な配列であり、サブタイプＥにのみ特異的なプライマー
である。
【００１８】サブタイプＣの検出のための第一のＰＣＲ
用プライマー対とそのヌクレオチド配列 ・9B/12A プライマー9B：CACAGTACAATGTACACATG（配列番号９） プライマー12A：GCAATAGAAAAATTCTCCTC（配列番号５） サブタイプＤの検出のための第一のＰＣＲ用プライマー
対とそのヌクレオチド配列 ・9B/12B プライマー9B：CACAGTACAATGTACACATG（配列番号９） プライマー12B：ACAGTAGAAAAATTCCCCTC（配列番号６） サブタイプＦの検出のための第一のＰＣＲ用プライマー
対とそのヌクレオチド配列 ・9B/12A プライマー9B：CACAGTACAATGTACACATG（配列番号９） プライマー12A：GCAATAGAAAAATTCTCCTC（配列番号５） サブタイプＧの検出のための第一のＰＣＲ用プライマー
対とそのヌクレオチド配列 ・9B/12A プライマー9B：CACAGTACAATGTACACATG（配列番号９） プライマー12A：GCAATAGAAAAATTCTCCTC（配列番号５） サブタイプＨの検出のための第一のＰＣＲ用プライマー
対とそのヌクレオチド配列 ・9B/12A プライマー9B：CACAGTACAATGTACACATG（配列番号９） プライマー12A：GCAATAGAAAAATTCTCCTC（配列番号５） あるいは、いくつかのサブタイプについて増幅産物を与
えることができるプライマーの混合物をプライマーに用
いて、第一のＰＣＲを行ってもよい。この目的のための
プライマーとしては、プライマー9AE、プライマー9B、
プライマー12Aおよびプライマー12Bの混合物を挙げるこ
とができる。
用プライマー対とそのヌクレオチド配列 ・9B/12A プライマー9B：CACAGTACAATGTACACATG（配列番号９） プライマー12A：GCAATAGAAAAATTCTCCTC（配列番号５） サブタイプＤの検出のための第一のＰＣＲ用プライマー
対とそのヌクレオチド配列 ・9B/12B プライマー9B：CACAGTACAATGTACACATG（配列番号９） プライマー12B：ACAGTAGAAAAATTCCCCTC（配列番号６） サブタイプＦの検出のための第一のＰＣＲ用プライマー
対とそのヌクレオチド配列 ・9B/12A プライマー9B：CACAGTACAATGTACACATG（配列番号９） プライマー12A：GCAATAGAAAAATTCTCCTC（配列番号５） サブタイプＧの検出のための第一のＰＣＲ用プライマー
対とそのヌクレオチド配列 ・9B/12A プライマー9B：CACAGTACAATGTACACATG（配列番号９） プライマー12A：GCAATAGAAAAATTCTCCTC（配列番号５） サブタイプＨの検出のための第一のＰＣＲ用プライマー
対とそのヌクレオチド配列 ・9B/12A プライマー9B：CACAGTACAATGTACACATG（配列番号９） プライマー12A：GCAATAGAAAAATTCTCCTC（配列番号５） あるいは、いくつかのサブタイプについて増幅産物を与
えることができるプライマーの混合物をプライマーに用
いて、第一のＰＣＲを行ってもよい。この目的のための
プライマーとしては、プライマー9AE、プライマー9B、
プライマー12Aおよびプライマー12Bの混合物を挙げるこ
とができる。
【００１９】このＰＣＲ産物の1/1000〜1/5量（例え
ば、１/５０量）を用いて各サブタイプに特異的なもう
一組のプライマー対を用いて二回目のＰＣＲ（第二のＰ
ＣＲ）を行う。この時、第一のＰＣＲで増幅される標的
配列の内側に第二のＰＣＲ用のプライマー対を設計す
る。例えば、第二のＰＣＲ用のサブタイプに特異的なプ
ライマー対を構成する少なくとも一方のプライマーは、
ＨＩＶ−１のenv遺伝子のC2領域の一部のサブタイプ特
異的なヌクレオチド配列に相補的な配列を含むプライマ
ー（プライマー1）を挙げることができる。ＨＩＶ−１
のenv遺伝子のC2領域は図１のようにサブタイプにより
ヌクレオチド配列に相違があるので、この領域からヌク
レオチド配列を選択して、プライマーを設計するとよ
い。ＨＩＶ−１の種々のサブタイプのenv遺伝子のV3領
域の3’隣接領域（C3領域）のヌクレオチド配列を図２
に示すが、サブタイプによりヌクレオチド配列に相違が
あるので適当な配列を選択して、プライマーを設計する
ことができる。サブタイプ特異的プライマーの設計にあ
たっては、系統樹解析法を用い、あるサブタイプのヌク
レオチド配列が他のサブタイプの対応するヌクレオチド
配列と最も遺伝的距離が大きいものを選び出す。例え
ば、もう一方のプライマーとしては、ＨＩＶ−１のenv
遺伝子のC3領域の一部のヌクレオチド配列に相補的な配
列を含むプライマー（プライマー２）を挙げることがで
きる。具体的には、以下のヌクレオチド配列を含むプラ
イマー対を用いることができる。
ば、１/５０量）を用いて各サブタイプに特異的なもう
一組のプライマー対を用いて二回目のＰＣＲ（第二のＰ
ＣＲ）を行う。この時、第一のＰＣＲで増幅される標的
配列の内側に第二のＰＣＲ用のプライマー対を設計す
る。例えば、第二のＰＣＲ用のサブタイプに特異的なプ
ライマー対を構成する少なくとも一方のプライマーは、
ＨＩＶ−１のenv遺伝子のC2領域の一部のサブタイプ特
異的なヌクレオチド配列に相補的な配列を含むプライマ
ー（プライマー1）を挙げることができる。ＨＩＶ−１
のenv遺伝子のC2領域は図１のようにサブタイプにより
ヌクレオチド配列に相違があるので、この領域からヌク
レオチド配列を選択して、プライマーを設計するとよ
い。ＨＩＶ−１の種々のサブタイプのenv遺伝子のV3領
域の3’隣接領域（C3領域）のヌクレオチド配列を図２
に示すが、サブタイプによりヌクレオチド配列に相違が
あるので適当な配列を選択して、プライマーを設計する
ことができる。サブタイプ特異的プライマーの設計にあ
たっては、系統樹解析法を用い、あるサブタイプのヌク
レオチド配列が他のサブタイプの対応するヌクレオチド
配列と最も遺伝的距離が大きいものを選び出す。例え
ば、もう一方のプライマーとしては、ＨＩＶ−１のenv
遺伝子のC3領域の一部のヌクレオチド配列に相補的な配
列を含むプライマー（プライマー２）を挙げることがで
きる。具体的には、以下のヌクレオチド配列を含むプラ
イマー対を用いることができる。
【００２０】サブタイプＡの検出のための第二のＰＣＲ
用プライマー対とそのヌクレオチド配列 ・10/11QA プライマー10：AAATGGCAGTCTAGCAGAAG（配列番号４） プライマー11QA：CTCCTGAGGGGTTAGCAAAG（配列番号１） プライマー10は、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’末
端（左端）から数えて、6997-7016番目の配列に相補的
な配列であり、サブタイプＡ、Ｂ、ＤおよびＥに特異的
なプライマーである。プライマー11QAは、HIV-1(NL4-3
株)の全塩基配列の5’末端（左端）から数えて、7313-7
294番目の配列に相補的な配列であり、サブタイプＡに
のみ特異的なプライマーである。
用プライマー対とそのヌクレオチド配列 ・10/11QA プライマー10：AAATGGCAGTCTAGCAGAAG（配列番号４） プライマー11QA：CTCCTGAGGGGTTAGCAAAG（配列番号１） プライマー10は、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’末
端（左端）から数えて、6997-7016番目の配列に相補的
な配列であり、サブタイプＡ、Ｂ、ＤおよびＥに特異的
なプライマーである。プライマー11QAは、HIV-1(NL4-3
株)の全塩基配列の5’末端（左端）から数えて、7313-7
294番目の配列に相補的な配列であり、サブタイプＡに
のみ特異的なプライマーである。
【００２１】・10U/11QA1 プライマー10U：CTGTTAAATGGCAGTCTAGC（配列番号２
０） プライマー11QA1:CTCCTGAGGAGTTAGCAAAG（配列番号２
７） プライマー10Uは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’末
端（左端）から数えて、6992-7011番目の配列に相補的
な配列であり、サブタイプＡ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＪに特
異的なプライマーである。プライマー11QA1は、HIV-1(N
L4-3株)の全塩基配列の5’末端（左端）から数えて、73
13-7294番目の配列に相補的な配列であり、サブタイプ
Ａにのみ特異的なプライマーである。
０） プライマー11QA1:CTCCTGAGGAGTTAGCAAAG（配列番号２
７） プライマー10Uは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’末
端（左端）から数えて、6992-7011番目の配列に相補的
な配列であり、サブタイプＡ、Ｂ、Ｄ、ＥおよびＪに特
異的なプライマーである。プライマー11QA1は、HIV-1(N
L4-3株)の全塩基配列の5’末端（左端）から数えて、73
13-7294番目の配列に相補的な配列であり、サブタイプ
Ａにのみ特異的なプライマーである。
【００２２】サブタイプＢの検出のための第二のＰＣＲ
用プライマー対とそのヌクレオチド配列 ・10/11BB プライマー10：AAATGGCAGTCTAGCAGAAG（配列番号４） プライマー11BB：CTGTGCATTACAATTTCTGG（配列番号２） プライマー11BBは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、7338-7319番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＢにのみ特異的なプライマ
ーである。 ・10U/11VB プライマー10U：CTGTTAAATGGCAGTCTAGC（配列番号２
０） プライマー11VB：CACAATTAAAACTGTGCATTAC（配列番号２
８） プライマー11VBは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、7349-7328番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＢにのみ特異的なプライマ
ーである。
用プライマー対とそのヌクレオチド配列 ・10/11BB プライマー10：AAATGGCAGTCTAGCAGAAG（配列番号４） プライマー11BB：CTGTGCATTACAATTTCTGG（配列番号２） プライマー11BBは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、7338-7319番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＢにのみ特異的なプライマ
ーである。 ・10U/11VB プライマー10U：CTGTTAAATGGCAGTCTAGC（配列番号２
０） プライマー11VB：CACAATTAAAACTGTGCATTAC（配列番号２
８） プライマー11VBは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、7349-7328番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＢにのみ特異的なプライマ
ーである。
【００２３】サブタイプＥの検出のための第二のＰＣＲ
用プライマー対とそのヌクレオチド配列 ・10/11QE プライマー10：AAATGGCAGTCTAGCAGAAG（配列番号４） プライマー11QE：CTCCTGAGGGTGGTTGAAAG（配列番号３） プライマー11QEは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、7313-7294番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＥにのみ特異的なプライマ
ーである。 ・10U/11WE プライマー10U：CTGTTAAATGGCAGTCTAGC（配列番号２
０） プライマー11WE：CTCTACAATTAAAATGATGCATTG（配列番号
３０） プライマー11WEは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、7352-7339番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＥにのみ特異的なプライマ
ーである。
用プライマー対とそのヌクレオチド配列 ・10/11QE プライマー10：AAATGGCAGTCTAGCAGAAG（配列番号４） プライマー11QE：CTCCTGAGGGTGGTTGAAAG（配列番号３） プライマー11QEは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、7313-7294番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＥにのみ特異的なプライマ
ーである。 ・10U/11WE プライマー10U：CTGTTAAATGGCAGTCTAGC（配列番号２
０） プライマー11WE：CTCTACAATTAAAATGATGCATTG（配列番号
３０） プライマー11WEは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、7352-7339番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＥにのみ特異的なプライマ
ーである。
【００２４】サブタイプＣの検出のための第二のＰＣＲ
用プライマー対とそのヌクレオチド配列 ・10C/11RC プライマー10C：AAATGGTAGCCTAGCAGAAG（配列番号１
０） プライマー11RC：CTCCTGAGGATGGTGCAAATTT（配列番号１
３） プライマー10Cは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’末
端（左端）から数えて、6997-7016番目の配列に相補的
な配列であり、サブタイプＣおよびＦに特異的なプライ
マーである。
用プライマー対とそのヌクレオチド配列 ・10C/11RC プライマー10C：AAATGGTAGCCTAGCAGAAG（配列番号１
０） プライマー11RC：CTCCTGAGGATGGTGCAAATTT（配列番号１
３） プライマー10Cは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’末
端（左端）から数えて、6997-7016番目の配列に相補的
な配列であり、サブタイプＣおよびＦに特異的なプライ
マーである。
【００２５】プライマー11RCは、HIV-1(NL4-3株)の全塩
基配列の5’末端（左端）から数えて、7313-7292番目の
配列に相補的な配列であり、サブタイプＣにのみ特異的
なプライマーである。 ・10U/11XC プライマー10U：CTGTTAAATGGCAGTCTAGC（配列番号２
０） プライマー11XC：TTGTTTTATTAGGGAAGTGTTC（配列番号２
９） プライマー11XCは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、7289-7268番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＣに特異的なプライマーで
ある。
基配列の5’末端（左端）から数えて、7313-7292番目の
配列に相補的な配列であり、サブタイプＣにのみ特異的
なプライマーである。 ・10U/11XC プライマー10U：CTGTTAAATGGCAGTCTAGC（配列番号２
０） プライマー11XC：TTGTTTTATTAGGGAAGTGTTC（配列番号２
９） プライマー11XCは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、7289-7268番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＣに特異的なプライマーで
ある。
【００２６】サブタイプＤの検出のための第二のＰＣＲ
用プライマー対とそのヌクレオチド配列 ・10/11RD プライマー10：AAATGGCAGTCTAGCAGAAG（配列番号４） プライマー11RD：CTCCTGAGGATGGTTTAAAAAT（配列番号１
４） プライマー11RDは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、7313-7292番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＤにのみ特異的なプライマ
ーである。
用プライマー対とそのヌクレオチド配列 ・10/11RD プライマー10：AAATGGCAGTCTAGCAGAAG（配列番号４） プライマー11RD：CTCCTGAGGATGGTTTAAAAAT（配列番号１
４） プライマー11RDは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、7313-7292番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＤにのみ特異的なプライマ
ーである。
【００２７】サブタイプＦの検出のための第二のＰＣＲ
用プライマー対とそのヌクレオチド配列 ・10C/11RF プライマー10C：AAATGGTAGCCTAGCAGAAG（配列番号１
０） プライマー11RF：CTCCTGAGGATGAGTTAAATTT（配列番号１
５） プライマー11RFは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、7313-7292番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＦにのみ特異的なプライマ
ーである。
用プライマー対とそのヌクレオチド配列 ・10C/11RF プライマー10C：AAATGGTAGCCTAGCAGAAG（配列番号１
０） プライマー11RF：CTCCTGAGGATGAGTTAAATTT（配列番号１
５） プライマー11RFは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、7313-7292番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＦにのみ特異的なプライマ
ーである。
【００２８】サブタイプＧの検出のための第二のＰＣＲ
用プライマー対とそのヌクレオチド配列 ・10G/11SG プライマー10G：GAATGGCAGTTTAGCAGAAG（配列番号１
１） プライマー11SG：TCCTGCAGATGAGTTAAAGG（配列番号１
６） プライマー10Gは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’末
端（左端）から数えて、6997-7016番目の配列に相補的
な配列であり、サブタイプＧにのみ特異的なプライマー
である。プライマー11SGは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配
列の5’末端（左端）から数えて、7312-7293番目の配列
に相補的な配列であり、サブタイプＧにのみ特異的なプ
ライマーである。
用プライマー対とそのヌクレオチド配列 ・10G/11SG プライマー10G：GAATGGCAGTTTAGCAGAAG（配列番号１
１） プライマー11SG：TCCTGCAGATGAGTTAAAGG（配列番号１
６） プライマー10Gは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’末
端（左端）から数えて、6997-7016番目の配列に相補的
な配列であり、サブタイプＧにのみ特異的なプライマー
である。プライマー11SGは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配
列の5’末端（左端）から数えて、7312-7293番目の配列
に相補的な配列であり、サブタイプＧにのみ特異的なプ
ライマーである。
【００２９】サブタイプＨの検出のための第二のＰＣＲ
用プライマー対とそのヌクレオチド配列 ・10H/11SH プライマー10H：GTCAAATGGCAGTTTAGCAG（配列番号１
２） プライマー11SH：TCCTGAGGATGGTTTAAAGG（配列番号１
７） プライマー10Hは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’末
端（左端）から数えて、6994-7013番目の配列に相補的
な配列であり、サブタイプＨにのみ特異的なプライマー
である。プライマー11SHは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配
列の5’末端（左端）から数えて、7312-7293番目の配列
に相補的な配列であり、サブタイプＨにのみ特異的なプ
ライマーである。
用プライマー対とそのヌクレオチド配列 ・10H/11SH プライマー10H：GTCAAATGGCAGTTTAGCAG（配列番号１
２） プライマー11SH：TCCTGAGGATGGTTTAAAGG（配列番号１
７） プライマー10Hは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’末
端（左端）から数えて、6994-7013番目の配列に相補的
な配列であり、サブタイプＨにのみ特異的なプライマー
である。プライマー11SHは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配
列の5’末端（左端）から数えて、7312-7293番目の配列
に相補的な配列であり、サブタイプＨにのみ特異的なプ
ライマーである。
【００３０】あるいは、どのサブタイプでも増幅できる
ようにするために、いくつかのサブタイプについて増幅
産物を与えることができるプライマーの混合物を用い
て、第二のＰＣＲを行ってもよい。この目的のためのプ
ライマーとしては、以下のプライマーの混合物を挙げる
ことができる。 プライマー10U：AAATGGCAGTCTAGCAGAAG（配列番号４） プライマー11LB：AATTTCTGGGTCCCCTCCTG（配列番号１
８） プライマー11LAE：AATTTCTAGATCCCCTCCTG（配列番号２
５） プライマー11LC：AATTTCTAGGTCCCCTCCTG（配列番号２
６）
ようにするために、いくつかのサブタイプについて増幅
産物を与えることができるプライマーの混合物を用い
て、第二のＰＣＲを行ってもよい。この目的のためのプ
ライマーとしては、以下のプライマーの混合物を挙げる
ことができる。 プライマー10U：AAATGGCAGTCTAGCAGAAG（配列番号４） プライマー11LB：AATTTCTGGGTCCCCTCCTG（配列番号１
８） プライマー11LAE：AATTTCTAGATCCCCTCCTG（配列番号２
５） プライマー11LC：AATTTCTAGGTCCCCTCCTG（配列番号２
６）
【００３１】プライマー11LBは、HIV-1(NL4-3株)の全塩
基配列の5'末端（左側）から数えて、7327-7308番目の
配列に相補的であり、サブタイプＢ、Ｄ、Ｆ、Ｇおよび
Ｉに特異的なプライマーである。プライマー11LAEは、H
IV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5'末端（左側）から数え
て、7327-7308番目の配列に相補的であり、サブタイプ
Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＩおよびＪに特異的なプライマーであ
る。プライマー11LCは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の
5'末端（左側）から数えて、7327-7308番目の配列に相
補的であり、サブタイプＣ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪに
特異的なプライマーである。
基配列の5'末端（左側）から数えて、7327-7308番目の
配列に相補的であり、サブタイプＢ、Ｄ、Ｆ、Ｇおよび
Ｉに特異的なプライマーである。プライマー11LAEは、H
IV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5'末端（左側）から数え
て、7327-7308番目の配列に相補的であり、サブタイプ
Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＩおよびＪに特異的なプライマーであ
る。プライマー11LCは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の
5'末端（左側）から数えて、7327-7308番目の配列に相
補的であり、サブタイプＣ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪに
特異的なプライマーである。
【００３２】その他に、以下のようなプライマーを利用
することができる。 プライマー10KC：CTCAACTACTGTTAAATGGTAG（配列番号２
１） プライマー10KCは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、6984-7005番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＣにのみ特異的なプライマ
ーである。
することができる。 プライマー10KC：CTCAACTACTGTTAAATGGTAG（配列番号２
１） プライマー10KCは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、6984-7005番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＣにのみ特異的なプライマ
ーである。
【００３３】プライマー10UF：CTGTTAAATGGCAGCCTAGC
（配列番号２２） プライマー10UFは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、6992-7011番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＡ、Ｅ、Ｆ、ＨおよびＩに
特異的なプライマーである。 プライマー10UG：CTGTTAAATGGCAGTTTAGC（配列番号２
３） プライマー10UGは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、6992-7011番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＡ、Ｅ、Ｇ、ＩおよびＪに
特異的なプライマーである。 プライマー10UC：CTGTTAAATGGTAGTCTAGC（配列番号２
４） プライマー10UCは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、6992-7011番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＣおよびＥに特異的なプラ
イマーである。
（配列番号２２） プライマー10UFは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、6992-7011番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＡ、Ｅ、Ｆ、ＨおよびＩに
特異的なプライマーである。 プライマー10UG：CTGTTAAATGGCAGTTTAGC（配列番号２
３） プライマー10UGは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、6992-7011番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＡ、Ｅ、Ｇ、ＩおよびＪに
特異的なプライマーである。 プライマー10UC：CTGTTAAATGGTAGTCTAGC（配列番号２
４） プライマー10UCは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、6992-7011番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＣおよびＥに特異的なプラ
イマーである。
【００３４】プライマー11LE：AATTTCTAGATCTCCTCCTG
（配列番号１９） プライマー11LEは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5'末
端（左側）から数えて、7327-7308番目の配列に相補的
であり、サブタイプＥ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＪに特異的
なプライマーである。 プライマー11LC：AATTTCTAGGTCCCCTCCTG（配列番号２
６） プライマー11LCは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、7327-7308番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＣ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉおよび
Ｊに特異的なプライマーである。 プライマー11TC：TTCTCCTCTACAATTAAAGC（配列番号３
１） プライマー11TCは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、7357-7338番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＣにのみ特異的なプライマ
ーである。
（配列番号１９） プライマー11LEは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5'末
端（左側）から数えて、7327-7308番目の配列に相補的
であり、サブタイプＥ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＪに特異的
なプライマーである。 プライマー11LC：AATTTCTAGGTCCCCTCCTG（配列番号２
６） プライマー11LCは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、7327-7308番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＣ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉおよび
Ｊに特異的なプライマーである。 プライマー11TC：TTCTCCTCTACAATTAAAGC（配列番号３
１） プライマー11TCは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、7357-7338番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＣにのみ特異的なプライマ
ーである。
【００３５】プライマー11RC1：TTATTGTTTTATTAGGGAAGT
G（配列番号３２） プライマー11RC1は、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、7292-7271番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＣにのみ特異的なプライマ
ーである。 プライマー11SE：TGCATTGTAATTTCTAGATCTC（配列番号３
３） プライマー11SEは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、7333-7314番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＥにのみ特異的なプライマ
ーである。 プライマー11BE：TGATGCATTGTAATTTCTAG（配列番号３
４） プライマー11BEは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、7338-7319番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＥにのみ特異的なプライマ
ーである。
G（配列番号３２） プライマー11RC1は、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、7292-7271番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＣにのみ特異的なプライマ
ーである。 プライマー11SE：TGCATTGTAATTTCTAGATCTC（配列番号３
３） プライマー11SEは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、7333-7314番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＥにのみ特異的なプライマ
ーである。 プライマー11BE：TGATGCATTGTAATTTCTAG（配列番号３
４） プライマー11BEは、HIV-1(NL4-3株)の全塩基配列の5’
末端（左端）から数えて、7338-7319番目の配列に相補
的な配列であり、サブタイプＥにのみ特異的なプライマ
ーである。
【００３６】ＰＣＲの手順および反応条件は、Bruisten
S. et al., AIDS Res Hum Retroviruses 1993, 9:259-
265 に従えばよいが、ホットスタート法を行うことが望
ましい。ホットスタート法とは、ＰＣＲ反応液がホット
プレートに置かれて、温度が高温（通常90℃以上）にな
って初めて働き始めるＰＣＲ法をいう。
S. et al., AIDS Res Hum Retroviruses 1993, 9:259-
265 に従えばよいが、ホットスタート法を行うことが望
ましい。ホットスタート法とは、ＰＣＲ反応液がホット
プレートに置かれて、温度が高温（通常90℃以上）にな
って初めて働き始めるＰＣＲ法をいう。
【００３７】ところで、上記のような方法でＨＩＶ−１
のサブタイプ決定を行った際に、どのサブタイプも検出
されないことがある。その原因として、ＨＩＶ−１ Ｄ
ＮＡ濃度が検出限界以下であったか、あるいはプライマ
ー結合部分に多数の変異が存在していた可能性が考えら
れる。前者の可能性に対しては、一般に、ＨＩＶ−１は
細胞中よりも血漿中の方が濃度が高いので、血漿からＲ
ＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに変換して
から上記の方法を行う。
のサブタイプ決定を行った際に、どのサブタイプも検出
されないことがある。その原因として、ＨＩＶ−１ Ｄ
ＮＡ濃度が検出限界以下であったか、あるいはプライマ
ー結合部分に多数の変異が存在していた可能性が考えら
れる。前者の可能性に対しては、一般に、ＨＩＶ−１は
細胞中よりも血漿中の方が濃度が高いので、血漿からＲ
ＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに変換して
から上記の方法を行う。
【００３８】後者の可能性に対しては、本法によるサブ
タイプ判定は保留とし、ＨＩＶ−１の他の遺伝子領域を
ＰＣＲで増幅してヌクレオチド配列を決定し、従来の方
法でサブタイプを決定する。（注：感染の有無は抗体検
査によって行う．本法はＨＩＶ−１感染を判定するもの
ではない。） ＰＣＲの反応生成物をアガロースゲル電気泳動により分
離し、エチジウムブロミド染色で検出する。試料ＤＮＡ
中のＨＩＶ−１のサブタイプに一致したプライマーを用
いたときは明瞭なバンドが観測されるが、一致しないと
きは微かなバンドが観測されるかあるいは全くバンドが
観測されない。これによってＨＩＶ−１のサブタイプを
決定する。
タイプ判定は保留とし、ＨＩＶ−１の他の遺伝子領域を
ＰＣＲで増幅してヌクレオチド配列を決定し、従来の方
法でサブタイプを決定する。（注：感染の有無は抗体検
査によって行う．本法はＨＩＶ−１感染を判定するもの
ではない。） ＰＣＲの反応生成物をアガロースゲル電気泳動により分
離し、エチジウムブロミド染色で検出する。試料ＤＮＡ
中のＨＩＶ−１のサブタイプに一致したプライマーを用
いたときは明瞭なバンドが観測されるが、一致しないと
きは微かなバンドが観測されるかあるいは全くバンドが
観測されない。これによってＨＩＶ−１のサブタイプを
決定する。
【００３９】本発明のＨＩＶ−１のサブタイプ決定法
は、さらに、ＨＩＶ−１のゲノムのヌクレオチド配列の
一部であって、ヌクレオチド配列がすべてのサブタイプ
の間で高度に保存されている一部を標的配列とする核酸
の増幅反応を行い、核酸の増幅の有無によりＨＩＶ−１
の存在または不存在を確認する工程を含んでもよい。Ｈ
ＩＶ−１の存在または不存在を確認する工程は、第一の
ＰＣＲ用のプライマーの混合物（例えば、9AE/9B/12A/1
2B）を用いて、ＨＩＶ−１のゲノムのヌクレオチド配列
の一部であって、ヌクレオチド配列がすべてのサブタイ
プの間で高度に保存されている一部を標的配列とする核
酸の増幅反応を行った後、第二のＰＣＲ用のプライマー
の混合物（例えば、10U/11LB/11LAE/11LC）を用いて、
前記標的配列の内部のヌクレオチド配列を標的配列とす
る第二の増幅反応を行い、核酸の増幅の有無によりＨＩ
Ｖ−１の存在または不存在を確認することからなるとよ
い。
は、さらに、ＨＩＶ−１のゲノムのヌクレオチド配列の
一部であって、ヌクレオチド配列がすべてのサブタイプ
の間で高度に保存されている一部を標的配列とする核酸
の増幅反応を行い、核酸の増幅の有無によりＨＩＶ−１
の存在または不存在を確認する工程を含んでもよい。Ｈ
ＩＶ−１の存在または不存在を確認する工程は、第一の
ＰＣＲ用のプライマーの混合物（例えば、9AE/9B/12A/1
2B）を用いて、ＨＩＶ−１のゲノムのヌクレオチド配列
の一部であって、ヌクレオチド配列がすべてのサブタイ
プの間で高度に保存されている一部を標的配列とする核
酸の増幅反応を行った後、第二のＰＣＲ用のプライマー
の混合物（例えば、10U/11LB/11LAE/11LC）を用いて、
前記標的配列の内部のヌクレオチド配列を標的配列とす
る第二の増幅反応を行い、核酸の増幅の有無によりＨＩ
Ｖ−１の存在または不存在を確認することからなるとよ
い。
【００４０】本発明は、ＨＩＶ−１のenv遺伝子のヌク
レオチド配列の一部であって、5'末端部および3'末端部
のうちの少なくとも片方のヌクレオチド配列がサブタイ
プにより異なる一部を標的配列とするプライマー対を含
む、ＨＩＶ−１のサブタイプを決定するためのキットも
包含する。プライマー対としては、上述したような、第
二のＰＣＲ用のプライマー対（inner primers)、あるい
は第一のＰＣＲ用のプライマー対（outer primers)と第
二のＰＣＲ用のプライマー対との組み合わせを挙げるこ
とができる。本発明のキットは、その他にも、dNTP混合
物、反応用バッファー、ＤＮＡポリメラーゼ、第一のＰ
ＣＲ用のサブタイプ共通プライマー対（例えば、9B/12
B）、第二のＰＣＲ用のサブタイプ共通プライマー対
（例えば、10U/11VB）などを含むとよい。また、プライ
マーと検体HIV-1 DNAの塩基対の不一致による影響を減
じるために、反応バッファー中のマグネシウムイオン濃
度を通常の1.5 ｍMを4 mM程度まで高めることが望まし
い。
レオチド配列の一部であって、5'末端部および3'末端部
のうちの少なくとも片方のヌクレオチド配列がサブタイ
プにより異なる一部を標的配列とするプライマー対を含
む、ＨＩＶ−１のサブタイプを決定するためのキットも
包含する。プライマー対としては、上述したような、第
二のＰＣＲ用のプライマー対（inner primers)、あるい
は第一のＰＣＲ用のプライマー対（outer primers)と第
二のＰＣＲ用のプライマー対との組み合わせを挙げるこ
とができる。本発明のキットは、その他にも、dNTP混合
物、反応用バッファー、ＤＮＡポリメラーゼ、第一のＰ
ＣＲ用のサブタイプ共通プライマー対（例えば、9B/12
B）、第二のＰＣＲ用のサブタイプ共通プライマー対
（例えば、10U/11VB）などを含むとよい。また、プライ
マーと検体HIV-1 DNAの塩基対の不一致による影響を減
じるために、反応バッファー中のマグネシウムイオン濃
度を通常の1.5 ｍMを4 mM程度まで高めることが望まし
い。
【００４１】この診断キットにおいて、キットを構成す
る要素は、各々あるいは組み合わせてあるいはひとまと
めにして、バイアル, チューブなどのような容器に包含
されていてもよく、さらに、それらの容器はひとまとめ
にして納めるための区画化された担持手段に納められて
いてもよい。
る要素は、各々あるいは組み合わせてあるいはひとまと
めにして、バイアル, チューブなどのような容器に包含
されていてもよく、さらに、それらの容器はひとまとめ
にして納めるための区画化された担持手段に納められて
いてもよい。
【００４２】
【実施例】以下に、本発明を実施例により具体的に説明
するが、本発明の範囲はこれらに何ら限定されることは
ない。 〔実施例１〕対象と方法 １）サブタイプ決定法の検討のためのサブタイプ別標準
検体 env遺伝子のシーケンシングと系統樹解析により、サブ
タイプＡと決定されたＨＩＶ感染者３名、サブタイプＢ
と決定されたＨＩＶ感染者８名、およびサブタイプＥと
決定されたＨＩＶ感染者３名の血液より、ＤＮＡを抽出
し、これを標準検体として用いた。 ２）サブタイプを決定した対象 東京都内の病院に通院または入院している８名のＨＩＶ
感染者を対象としてＨＩＶ−１のサブタイプを決定し
た。
するが、本発明の範囲はこれらに何ら限定されることは
ない。 〔実施例１〕対象と方法 １）サブタイプ決定法の検討のためのサブタイプ別標準
検体 env遺伝子のシーケンシングと系統樹解析により、サブ
タイプＡと決定されたＨＩＶ感染者３名、サブタイプＢ
と決定されたＨＩＶ感染者８名、およびサブタイプＥと
決定されたＨＩＶ感染者３名の血液より、ＤＮＡを抽出
し、これを標準検体として用いた。 ２）サブタイプを決定した対象 東京都内の病院に通院または入院している８名のＨＩＶ
感染者を対象としてＨＩＶ−１のサブタイプを決定し
た。
【００４３】３）ＨＩＶ患者の血液からのＤＮＡの調製 上記のHIV感染者から、10 mlの末梢血を採取した。抗凝
固剤としてクエン酸ナトリウムを用いた。末梢血からFi
coll-Paque（Pharmacia社）密度勾配遠心によって単核
球を分離した後、QIAamp Blood Kit（QIAGEN社）を用い
てDNAを調製した。DNAは純水あるいは1mM EDTAを含むバ
ッファーに溶解し、使用直前まで-20℃で保存した。こ
のDNAの0.5μgを用いて、ＰＣＲを行った。
固剤としてクエン酸ナトリウムを用いた。末梢血からFi
coll-Paque（Pharmacia社）密度勾配遠心によって単核
球を分離した後、QIAamp Blood Kit（QIAGEN社）を用い
てDNAを調製した。DNAは純水あるいは1mM EDTAを含むバ
ッファーに溶解し、使用直前まで-20℃で保存した。こ
のDNAの0.5μgを用いて、ＰＣＲを行った。
【００４４】４）ＰＣＲによるサブタイプＡ、Ｂおよび
Ｅの検出 ＰＣＲに使用したプライマーのヌクレオチド配列を図３
に示す。サブタイプＡの特異的検出のために、一回目の
ＰＣＲ用のプライマーとして、9AEと12Aを用い、二回目
のＰＣＲ用のプライマーとして、10と11QAを用いて、ne
sted PCRを行った。サブタイプＢの特異的検出のために
は、一回目のＰＣＲ用のプライマーとして、9Bと12Bを
用い、二回目のＰＣＲ用のプライマーとして、10と11BB
を用いて、nested PCRを行った。サブタイプＥの特異的
検出のためには、一回目のＰＣＲ用のプライマーとし
て、9AEと12Eを用い、二回目のＰＣＲ用のプライマーと
して、10と11QEを用いて、nested PCRを行った（図
３）。
Ｅの検出 ＰＣＲに使用したプライマーのヌクレオチド配列を図３
に示す。サブタイプＡの特異的検出のために、一回目の
ＰＣＲ用のプライマーとして、9AEと12Aを用い、二回目
のＰＣＲ用のプライマーとして、10と11QAを用いて、ne
sted PCRを行った。サブタイプＢの特異的検出のために
は、一回目のＰＣＲ用のプライマーとして、9Bと12Bを
用い、二回目のＰＣＲ用のプライマーとして、10と11BB
を用いて、nested PCRを行った。サブタイプＥの特異的
検出のためには、一回目のＰＣＲ用のプライマーとし
て、9AEと12Eを用い、二回目のＰＣＲ用のプライマーと
して、10と11QEを用いて、nested PCRを行った（図
３）。
【００４５】ＰＣＲは、ＨＩＶ感染者から調製したDNA
のうちの0.5μgを試料として用い、100μLの反応液（10
mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 4 mM MgCl2, 0.2 mM
dNTP, 1.0 μMのプライマー, 2.5単位のTaq polymeras
e）で、94℃ 15秒、56℃ 30秒、72℃ １分のサイクルを
30回行った。二回目のＰＣＲは、一回目のＰＣＲの反応
液２μLを試料として用い、同じ条件で25サイクル行っ
た。ただし、56℃ 30秒の代わりに60℃ 30秒とした。Ｐ
ＣＲ産物（サブタイプＡとＥは317 bp、サブタイプＢは
342 bp）の検出は、2％ァガロースゲルの電気泳動によ
る分離後、エチジウムブロミド染色を行うことにより行
った。
のうちの0.5μgを試料として用い、100μLの反応液（10
mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 4 mM MgCl2, 0.2 mM
dNTP, 1.0 μMのプライマー, 2.5単位のTaq polymeras
e）で、94℃ 15秒、56℃ 30秒、72℃ １分のサイクルを
30回行った。二回目のＰＣＲは、一回目のＰＣＲの反応
液２μLを試料として用い、同じ条件で25サイクル行っ
た。ただし、56℃ 30秒の代わりに60℃ 30秒とした。Ｐ
ＣＲ産物（サブタイプＡとＥは317 bp、サブタイプＢは
342 bp）の検出は、2％ァガロースゲルの電気泳動によ
る分離後、エチジウムブロミド染色を行うことにより行
った。
【００４６】結果 １）サブタイプ別標準検体のＰＣＲによるサブタイプ決
定の検討 ウイルスゲノムのシークエンシングによってサブタイプ
が決定されている検体については、以下のような結果と
なった。サブタイプＡ検出用プライマーを用いたＰＣＲ
ではサブタイプＡの検体のみ陽性で、サブタイプＢおよ
びＥの検体はすべて陰性であった。また、サブタイプＢ
検出用プライマーを用いたＰＣＲではサブタイプＢの検
体のみ陽性で、サブタイプＡおよびＥの検体はすべて陰
性であった。また、サブタイプＥ検出用プライマーを用
いたＰＣＲではサブタイプＥの検体のみ陽性で、サブタ
イプＡおよびＢの検体はすべて陰性であった（図４）。 ２）ＰＣＲによるＨＩＶ感染者のサブタイプ決定 東京都内の病院に通院または入院している８名のＨＩＶ
感染者についてＨＩＶ−１のサブタイプを決定した結果
を表１に示す。
定の検討 ウイルスゲノムのシークエンシングによってサブタイプ
が決定されている検体については、以下のような結果と
なった。サブタイプＡ検出用プライマーを用いたＰＣＲ
ではサブタイプＡの検体のみ陽性で、サブタイプＢおよ
びＥの検体はすべて陰性であった。また、サブタイプＢ
検出用プライマーを用いたＰＣＲではサブタイプＢの検
体のみ陽性で、サブタイプＡおよびＥの検体はすべて陰
性であった。また、サブタイプＥ検出用プライマーを用
いたＰＣＲではサブタイプＥの検体のみ陽性で、サブタ
イプＡおよびＢの検体はすべて陰性であった（図４）。 ２）ＰＣＲによるＨＩＶ感染者のサブタイプ決定 東京都内の病院に通院または入院している８名のＨＩＶ
感染者についてＨＩＶ−１のサブタイプを決定した結果
を表１に示す。
【００４７】
【表１】
【００４８】この結果から、症例P18、P19、P20、P24、
P25はサブタイプＢに感染し、症例P21とP23はサブタイ
プＥに感染していると診断される。症例P22では、サブ
タイプＢ用のプライマー対を用いたときのみＤＮＡバン
ドが検出されたが、その長さが予想よりも短かったので
判定保留とした。以上の診断結果が正しいことを確認す
るために、増幅されたＤＮＡをシーケンシングし、系統
樹解析を行ったが、その結果は表１の結果と一致してい
た。判定保留の症例P22はサブタイプＢであった。
P25はサブタイプＢに感染し、症例P21とP23はサブタイ
プＥに感染していると診断される。症例P22では、サブ
タイプＢ用のプライマー対を用いたときのみＤＮＡバン
ドが検出されたが、その長さが予想よりも短かったので
判定保留とした。以上の診断結果が正しいことを確認す
るために、増幅されたＤＮＡをシーケンシングし、系統
樹解析を行ったが、その結果は表１の結果と一致してい
た。判定保留の症例P22はサブタイプＢであった。
【００４９】１）と２）の結果を合わせると、本法は２
２症例中２１症例のサブタイプを正しく診断できた。残
りの１症例は判定保留であった。すなわち、本法は簡便
で正確なサブタイプ決定法であることが実証された。本
発明の方法によれば、１検体あたり約2,000円程度の費
用で、ＨＩＶ−１のサブタイプを決定することができ
る。また、サブタイプ決定に必要な時間は、８検体を一
度に扱うとして、ＤＮＡ分離に２時間、ＰＣＲに６時
間、電気泳動に１時間程度である。
２症例中２１症例のサブタイプを正しく診断できた。残
りの１症例は判定保留であった。すなわち、本法は簡便
で正確なサブタイプ決定法であることが実証された。本
発明の方法によれば、１検体あたり約2,000円程度の費
用で、ＨＩＶ−１のサブタイプを決定することができ
る。また、サブタイプ決定に必要な時間は、８検体を一
度に扱うとして、ＤＮＡ分離に２時間、ＰＣＲに６時
間、電気泳動に１時間程度である。
【００５０】〔実施例２〕対象と方法 １）サブタイプ決定法の検定のためのサブタイプ別標準
検体 実施例2で対象とした、サブタイプＡのＨＩＶ−１の感
染者3名、サブタイプＢのＨＩＶ−１の感染者3名、およ
びサブタイプＥのＨＩＶ−１の感染者3名に、env遺伝子
のシーケンシングと系統樹解析によりサブタイプＣと決
定されたＨＩＶ−１の感染者2名を加えた合計１１名の
血液よりＤＮＡを抽出し、これを標準検体として用い
た。
検体 実施例2で対象とした、サブタイプＡのＨＩＶ−１の感
染者3名、サブタイプＢのＨＩＶ−１の感染者3名、およ
びサブタイプＥのＨＩＶ−１の感染者3名に、env遺伝子
のシーケンシングと系統樹解析によりサブタイプＣと決
定されたＨＩＶ−１の感染者2名を加えた合計１１名の
血液よりＤＮＡを抽出し、これを標準検体として用い
た。
【００５１】２）サブタイプを決定した対象 東京都内の病院に通院または入院している３２名のＨＩ
Ｖ感染者を対象としてＨＩＶ−１のサブタイプを決定し
た。
Ｖ感染者を対象としてＨＩＶ−１のサブタイプを決定し
た。
【００５２】３）ＨＩＶ患者の血液からのＤＮＡの調製 上記のＨＩＶ感染者から、10 mlの末梢血を採取した。
抗凝固剤としてクエン酸ナトリウムを用いた。末梢血か
らFicoll-Paque（Pharmacia社）密度勾配遠視によって
単核球を分離した後、QIAamp Blood Kit（QIAGEN社）を
用いてＤＮＡを調製した。ＤＮＡは純水あるいは1 mM E
DTAを含むバッファーに溶解し、使用直前まで-20℃で保
存した。このＤＮＡの0.5μgを用いて、ＰＣＲを行っ
た。
抗凝固剤としてクエン酸ナトリウムを用いた。末梢血か
らFicoll-Paque（Pharmacia社）密度勾配遠視によって
単核球を分離した後、QIAamp Blood Kit（QIAGEN社）を
用いてＤＮＡを調製した。ＤＮＡは純水あるいは1 mM E
DTAを含むバッファーに溶解し、使用直前まで-20℃で保
存した。このＤＮＡの0.5μgを用いて、ＰＣＲを行っ
た。
【００５３】４）ＰＣＲによるサブタイプＡ，Ｂ，Ｃお
よびＥの検出 ＰＣＲに使用したプライマーのヌクレオチド配列を図５
に示す。一回目のＰＣＲ用のプライマーとして、9AE、9
B、12Aおよび12Bの混合物を用いた。二回目のＰＣＲ用
のプライマーとして、サブタイプＡの特異的検出のため
には10Uと11QA1を用い、サブタイプＢの特異的検出のた
めには10Uと11VBを用い、サブタイプＣの特異的検出の
ためには10Uと11XCを用い、サブタイプＥの特異的検出
のためには10Uと11WEを用いてnested PCRを行った。サ
ブタイプに関係なくＨＩＶ-1のＤＮＡを増幅するために
は、10U、11LB、11LAEおよび11LCの混合物を用いてnest
ed PCRを行った（図５）。
よびＥの検出 ＰＣＲに使用したプライマーのヌクレオチド配列を図５
に示す。一回目のＰＣＲ用のプライマーとして、9AE、9
B、12Aおよび12Bの混合物を用いた。二回目のＰＣＲ用
のプライマーとして、サブタイプＡの特異的検出のため
には10Uと11QA1を用い、サブタイプＢの特異的検出のた
めには10Uと11VBを用い、サブタイプＣの特異的検出の
ためには10Uと11XCを用い、サブタイプＥの特異的検出
のためには10Uと11WEを用いてnested PCRを行った。サ
ブタイプに関係なくＨＩＶ-1のＤＮＡを増幅するために
は、10U、11LB、11LAEおよび11LCの混合物を用いてnest
ed PCRを行った（図５）。
【００５４】ＰＣＲは、ＨＩＶ感染者から調製したＤＮ
Ａのうちの0.5μgを試料として用い、100 μLの反応液
（10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 4 mM MgCl2,
0.2 mMdNTP, 1.0μMプライマー, 2.5単位のTaq polymer
ase）で、94℃15秒、56℃30秒、72℃1分のサイクルを30
回行った。二回目のＰＣＲは、一回目のＰＣＲの反応液
2 μLを試料として用い、同じ条件で25サイクル行っ
た。ただし、56℃30秒の代わりに60℃30秒とした。ＰＣ
Ｒ産物（サブタイプＡは322 bp、サブタイプＢは358 b
p、サブタイプＣは298 bp、サブタイプＥは361 bp）の
検出は、2%アガロースゲルの電気泳動による分離後、エ
チジウムブロミド染色を行うことにより行った。
Ａのうちの0.5μgを試料として用い、100 μLの反応液
（10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 4 mM MgCl2,
0.2 mMdNTP, 1.0μMプライマー, 2.5単位のTaq polymer
ase）で、94℃15秒、56℃30秒、72℃1分のサイクルを30
回行った。二回目のＰＣＲは、一回目のＰＣＲの反応液
2 μLを試料として用い、同じ条件で25サイクル行っ
た。ただし、56℃30秒の代わりに60℃30秒とした。ＰＣ
Ｒ産物（サブタイプＡは322 bp、サブタイプＢは358 b
p、サブタイプＣは298 bp、サブタイプＥは361 bp）の
検出は、2%アガロースゲルの電気泳動による分離後、エ
チジウムブロミド染色を行うことにより行った。
【００５５】結果 １）サブタイプ別標準検体のＰＣＲによるサブタイプの
検討 ウイルスゲノムのシーケンシングによってサブタイプが
決定されている検体については、以下のような結果とな
った。サブタイプＡ検出用のプライマーを用いたＰＣＲ
ではサブタイプＡの検体のみ陽性で、サブタイプＢ、Ｃ
およびＥの検体はすべて陰性であった。また、サブタイ
プＢ検出用のプライマーを用いたＰＣＲではサブタイプ
Ｂの検体のみ陽性で、サブタイプＡ、ＣおよびＥの検体
はすべて陰性であった。また、サブタイプＣ検出用のプ
ライマーを用いたＰＣＲではサブタイプＣの検体のみ陽
性で、サブタイプＡ、ＢおよびＥの検体はすべて陰性で
あった。また、サブタイプＥ検出用のプライマーを用い
たＰＣＲではサブタイプＥの検体のみ陽性で、サブタイ
プＡ、ＢおよびＣの検体はすべて陰性であった（図
６）。また、サブタイプに関係なくＨＩＶ-１のＤＮＡ
を増幅するためのプライマーを用いたＰＣＲではすべて
の検体が陽性であった（図６）。
検討 ウイルスゲノムのシーケンシングによってサブタイプが
決定されている検体については、以下のような結果とな
った。サブタイプＡ検出用のプライマーを用いたＰＣＲ
ではサブタイプＡの検体のみ陽性で、サブタイプＢ、Ｃ
およびＥの検体はすべて陰性であった。また、サブタイ
プＢ検出用のプライマーを用いたＰＣＲではサブタイプ
Ｂの検体のみ陽性で、サブタイプＡ、ＣおよびＥの検体
はすべて陰性であった。また、サブタイプＣ検出用のプ
ライマーを用いたＰＣＲではサブタイプＣの検体のみ陽
性で、サブタイプＡ、ＢおよびＥの検体はすべて陰性で
あった。また、サブタイプＥ検出用のプライマーを用い
たＰＣＲではサブタイプＥの検体のみ陽性で、サブタイ
プＡ、ＢおよびＣの検体はすべて陰性であった（図
６）。また、サブタイプに関係なくＨＩＶ-１のＤＮＡ
を増幅するためのプライマーを用いたＰＣＲではすべて
の検体が陽性であった（図６）。
【００５６】２）ＰＣＲによるＨＩＶ感染者のサブタイ
プ決定。 東京都内の病院に通院または入院している３２名のＨＩ
Ｖ感染者を対象としてＨＩＶ−１のサブタイプを決定し
た。内訳は、１１例のサブタイプ別標準検体を合わせる
と、サブタイプＡが３例、サブタイプＢが３０例、サブ
タイプＣが２例、サブタイプＥが８例であった。以上の
診断結果が正しいことを確認するために、ＰＣＲによっ
てサブタイプが決定されたＨＩＶ感染者合計４３名のう
ちの２１名について、増幅されたＤＮＡをシーケンシン
グし、系統樹解析を行った結果を図７に示す。その結
果、これらのＨＩＶ-１について、ＰＣＲによって決定
されたサブタイプと系統樹分析によってサブタイプは完
全に一致していた。
プ決定。 東京都内の病院に通院または入院している３２名のＨＩ
Ｖ感染者を対象としてＨＩＶ−１のサブタイプを決定し
た。内訳は、１１例のサブタイプ別標準検体を合わせる
と、サブタイプＡが３例、サブタイプＢが３０例、サブ
タイプＣが２例、サブタイプＥが８例であった。以上の
診断結果が正しいことを確認するために、ＰＣＲによっ
てサブタイプが決定されたＨＩＶ感染者合計４３名のう
ちの２１名について、増幅されたＤＮＡをシーケンシン
グし、系統樹解析を行った結果を図７に示す。その結
果、これらのＨＩＶ-１について、ＰＣＲによって決定
されたサブタイプと系統樹分析によってサブタイプは完
全に一致していた。
【００５７】実施例２が実施例１と方法において大きく
異なる点は、一回目のＰＣＲではプライマーを共通に
し、二回目のＰＣＲでサブタイプ特異的プライマーを用
いたことである。その結果、ＰＣＲの反応数を８分の５
に軽減することができた。実施例１では判定保留例が１
例あったことを考え合わせると、実施例２の方法によっ
て、診断がより正確になるとともに、一層簡便なものに
することができた。
異なる点は、一回目のＰＣＲではプライマーを共通に
し、二回目のＰＣＲでサブタイプ特異的プライマーを用
いたことである。その結果、ＰＣＲの反応数を８分の５
に軽減することができた。実施例１では判定保留例が１
例あったことを考え合わせると、実施例２の方法によっ
て、診断がより正確になるとともに、一層簡便なものに
することができた。
【００５８】３）遺伝型による薬剤耐性検査に与えるサ
ブタイプの影響 遺伝型による薬剤耐性検査はサブタイプＢのデータをも
とに行われている。サブタイプＢ以外のＨＩＶ−１の薬
剤耐性をサブタイプＢのデータで判定できるかどうかを
調べるために、サブタイプＢ以外のＨＩＶ-１に感染
し、ＨＡＡＲＴ療法を受けている４名の感染者につい
て、ＨＡＡＲＴ療法開始前後におけるＨＩＶ-１のプロ
テアーゼのアミノ酸配列を決定した。図８にはプロテア
ーゼ阻害剤に対する耐性と関係があるアミノ酸のみを示
す。サブタイプＥに感染した症例Ｃ３の場合、ＨＡＡＲ
Ｔ療法開始後、アミノ酸番号１０がＬ（ロイシン）から
Ｆ（フェニルアラニン）に、またアミノ酸番号２０がＫ
（リシン）がＴ（スレオニン）に変異している。これら
はサブタイプＢにおいて薬剤耐性を示すアミノ酸変異と
して認められている。しかし、４名の患者すべてで、ア
ミノ酸番号３６がＨＡＡＲＴ療法開始前からＩ（イソロ
イシン）となっている。サブタイプＢのデータでは、ア
ミノ酸番号３６がＩのＨＩＶ−１は薬剤耐性であると判
定される。しかし、ＨＩＶ−１が薬剤投与前から薬剤耐
性を獲得していたとは考えにくい。したがって、この変
異はサブタイプＢ以外のＨＩＶ-１では薬剤耐性とは関
係ないと考えた方が自然である。この結果から、遺伝型
によって薬剤耐性を正しく判定するためには、サブタイ
プを事前に診断することが重要であると考えられる。
ブタイプの影響 遺伝型による薬剤耐性検査はサブタイプＢのデータをも
とに行われている。サブタイプＢ以外のＨＩＶ−１の薬
剤耐性をサブタイプＢのデータで判定できるかどうかを
調べるために、サブタイプＢ以外のＨＩＶ-１に感染
し、ＨＡＡＲＴ療法を受けている４名の感染者につい
て、ＨＡＡＲＴ療法開始前後におけるＨＩＶ-１のプロ
テアーゼのアミノ酸配列を決定した。図８にはプロテア
ーゼ阻害剤に対する耐性と関係があるアミノ酸のみを示
す。サブタイプＥに感染した症例Ｃ３の場合、ＨＡＡＲ
Ｔ療法開始後、アミノ酸番号１０がＬ（ロイシン）から
Ｆ（フェニルアラニン）に、またアミノ酸番号２０がＫ
（リシン）がＴ（スレオニン）に変異している。これら
はサブタイプＢにおいて薬剤耐性を示すアミノ酸変異と
して認められている。しかし、４名の患者すべてで、ア
ミノ酸番号３６がＨＡＡＲＴ療法開始前からＩ（イソロ
イシン）となっている。サブタイプＢのデータでは、ア
ミノ酸番号３６がＩのＨＩＶ−１は薬剤耐性であると判
定される。しかし、ＨＩＶ−１が薬剤投与前から薬剤耐
性を獲得していたとは考えにくい。したがって、この変
異はサブタイプＢ以外のＨＩＶ-１では薬剤耐性とは関
係ないと考えた方が自然である。この結果から、遺伝型
によって薬剤耐性を正しく判定するためには、サブタイ
プを事前に診断することが重要であると考えられる。
【００５９】４）サブタイプと性行動の関係 面接によって性的嗜好が推定できたＨＩＶ感染者２２名
について、サブタイプと性的行動との関係を図９にまと
めた。Heterosexualとは異性愛者、ＭＳＭとは男性同性
愛者のことである。異性愛者ではサブタイプＢとＥが同
数であるのに対して、男性同性愛者ではサブタイプＢが
圧倒的に多い。これは、東南アジア由来のＨＩＶが異性
愛者の中に浸透しているが、男性同性愛者の中にはあま
り浸透していないことを示唆していると考えられる。
について、サブタイプと性的行動との関係を図９にまと
めた。Heterosexualとは異性愛者、ＭＳＭとは男性同性
愛者のことである。異性愛者ではサブタイプＢとＥが同
数であるのに対して、男性同性愛者ではサブタイプＢが
圧倒的に多い。これは、東南アジア由来のＨＩＶが異性
愛者の中に浸透しているが、男性同性愛者の中にはあま
り浸透していないことを示唆していると考えられる。
【００６０】〔実施例３〕対象と方法 １）ウェスタンブロット法陰性、ＰＡ法陽性の血清検体 東京都内の病院における血液検査で、ウェスタンブロッ
ト法ではＨＩＶ-１陰性であったが、ＰＡ法ではＨＩＶ-
１陽性であった１５件の血清検体を対象とした。 ２）血漿からのＲＮＡからのＤＮＡの調製 上記の血清検体200 μLからRNAeasy Kit（QIAGEN社）を
用いてＲＮＡを調製した。ＲＮＡは純水に溶解し、使用
直前まで-20℃で保存した。
ト法ではＨＩＶ-１陰性であったが、ＰＡ法ではＨＩＶ-
１陽性であった１５件の血清検体を対象とした。 ２）血漿からのＲＮＡからのＤＮＡの調製 上記の血清検体200 μLからRNAeasy Kit（QIAGEN社）を
用いてＲＮＡを調製した。ＲＮＡは純水に溶解し、使用
直前まで-20℃で保存した。
【００６１】３）ＰＣＲによるＨＩＶ−１の検出 血清20 μL分に相当するＲＮＡを試料とし、プライマー
12Aと12Bの混合物を用い、20μLの反応液（10 mM Tris-
HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl2, 1 mMdNTP, 5
μMプライマー, 100単位の逆転写酵素）で、42℃30分反
応させｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを試料とし、
サブタイプに関係なくＨＩＶ-1のＤＮＡを増幅できるne
sted PCRを行った。一回目のＰＣＲ用のプライマーとし
て、9AE、9B、12Aおよび12Bの混合物を用いた。二回目
のＰＣＲ用のプライマーとして、10U、11LB、11LAEおよ
び11LCの混合物を用いた。
12Aと12Bの混合物を用い、20μLの反応液（10 mM Tris-
HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl2, 1 mMdNTP, 5
μMプライマー, 100単位の逆転写酵素）で、42℃30分反
応させｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを試料とし、
サブタイプに関係なくＨＩＶ-1のＤＮＡを増幅できるne
sted PCRを行った。一回目のＰＣＲ用のプライマーとし
て、9AE、9B、12Aおよび12Bの混合物を用いた。二回目
のＰＣＲ用のプライマーとして、10U、11LB、11LAEおよ
び11LCの混合物を用いた。
【００６２】一回目のＰＣＲは、100μLの反応液（10 m
M Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 4mM MgCl2, 0.2 mM d
NTP, 1.0μMプライマー, 2.5単位のTaq polymerase）
で、94℃ 15秒、56℃ 30秒、72℃ 1分のサイクルを30回
行った。二回目のＰＣＲは、一回目のＰＣＲの反応液2
μLを試料として用い、同じ条件で25サイクル行った。
ただし、56℃ 30秒の代わりに60℃ 30秒とした。ＰＣＲ
産物（サブタイプＡは322 bp、サブタイプＢは358 bp、
サブタイプＣは298 bp、サブタイプＥは361 bp）の検出
は、2%アガロースゲルの電気泳動による分離後、エチジ
ウムブロミド染色を行うことにより行った。
M Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 4mM MgCl2, 0.2 mM d
NTP, 1.0μMプライマー, 2.5単位のTaq polymerase）
で、94℃ 15秒、56℃ 30秒、72℃ 1分のサイクルを30回
行った。二回目のＰＣＲは、一回目のＰＣＲの反応液2
μLを試料として用い、同じ条件で25サイクル行った。
ただし、56℃ 30秒の代わりに60℃ 30秒とした。ＰＣＲ
産物（サブタイプＡは322 bp、サブタイプＢは358 bp、
サブタイプＣは298 bp、サブタイプＥは361 bp）の検出
は、2%アガロースゲルの電気泳動による分離後、エチジ
ウムブロミド染色を行うことにより行った。
【００６３】結果 ウェスタンブロット法ではＨＩＶ-１陰性であるが、Ｐ
Ａ法ではＨＩＶ−１陽性であった１５件の血清検体いず
れからもＰＣＲによってＨＩＶ-1が検出されなかった
（図１０）。今回用いたＰＣＲはすべてのサブタイプの
ＨＩＶ-1が検出できるように設計されたもので、少なく
とも、サブタイプＡ、Ｂ、ＣおよびＥのＨＩＶ−１は検
出できることが実証されている（図６）。したがって、
今回検査した血清検体のウェスタンブロット法とＰＡ法
の結果が一致しなかったのは、サブタイプの問題ではな
く、ＰＡ法による擬陽性の結果である可能性が高いと考
えられる。このように、サブタイプに関係なくＨＩＶ−
１が検出できるＰＣＲは、ＨＩＶ−１感染の確定診断と
して有効であると考えられる。
Ａ法ではＨＩＶ−１陽性であった１５件の血清検体いず
れからもＰＣＲによってＨＩＶ-1が検出されなかった
（図１０）。今回用いたＰＣＲはすべてのサブタイプの
ＨＩＶ-1が検出できるように設計されたもので、少なく
とも、サブタイプＡ、Ｂ、ＣおよびＥのＨＩＶ−１は検
出できることが実証されている（図６）。したがって、
今回検査した血清検体のウェスタンブロット法とＰＡ法
の結果が一致しなかったのは、サブタイプの問題ではな
く、ＰＡ法による擬陽性の結果である可能性が高いと考
えられる。このように、サブタイプに関係なくＨＩＶ−
１が検出できるＰＣＲは、ＨＩＶ−１感染の確定診断と
して有効であると考えられる。
【００６４】
【発明の効果】本発明により、ＨＩＶ−１のサブタイプ
を決定する簡便な方法が提供された。また、ＨＩＶ−１
のサブタイプを決定するのに有効な手段も提供された。
を決定する簡便な方法が提供された。また、ＨＩＶ−１
のサブタイプを決定するのに有効な手段も提供された。
【００６５】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KEIO UNIVERSITY <120> A METHOD FOR HIV-1 SUBTYPING <130> P99-0608 <140> <141> <150> JP P11-167736 <151> 1999-06-15 <160> 34 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 1 ctcctgaggg gttagcaaag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 2 ctgtgcatta caatttctgg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 3 ctcctgaggg tggttgaaag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 4 aaatggcagt ctagcagaag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 5 gcaatagaaa aattctcctc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 6 acagtagaaa aattcccctc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 7 gcaatagaaa aattcccctc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 8 cacagtacaa tgcacacatg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 9 cacagtacaa tgtacacatg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 10 aaatggtagc ctagcagaag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 11 gaatggcagt ttagcagaag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 12 gtcaaatggc agtttagcag 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 13 ctcctgagga tggtgcaaat tt 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 14 ctcctgagga tggtttaaaa at 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 15 ctcctgagga tgagttaaat tt 22 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 16 tcctgcagat gagttaaagg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 17 tcctgaggat ggtttaaagg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 18 aatttctggg tcccctcctg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 19 aatttctaga tctcctcctg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 20 ctgttaaatg gcagtctagc 20 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 21 ctcaactact gttaaatggt ag 22 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 22 ctgttaaatg gcagcctagc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 23 ctgttaaatg gcagtttagc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 24 ctgttaaatg gtagtctagc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 25 aatttctaga tcccctcctg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 26 aatttctagg tcccctcctg 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 27 ctcctgagga gttagcaaag 20 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 28 cacaattaaa actgtgcatt ac 22 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 29 ttgttttatt agggaagtgt tc 22 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 30 ctctacaatt aaaatgatgc attg 24 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 31 ttctcctcta caattaaagc 20 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 32 ttattgtttt attagggaag tg 22 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 33 tgcattgtaa tttctagatc tc 22 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 34 tgatgcattg taatttctag 20
【００６６】
【配列表フリーテキスト】配列番号１は、プライマー11
QAのヌクレオチド配列を示す。配列番号２は、プライマ
ー11BBのヌクレオチド配列を示す。配列番号３は、プラ
イマー11QEのヌクレオチド配列を示す。配列番号４は、
プライマー10のヌクレオチド配列を示す。配列番号５
は、プライマー12Aのヌクレオチド配列を示す。配列番
号６は、プライマー12Bのヌクレオチド配列を示す。配
列番号７は、プライマー12Eのヌクレオチド配列を示
す。配列番号８は、プライマー9AEのヌクレオチド配列
を示す。配列番号９は、プライマー9Bのヌクレオチド配
列を示す。配列番号１０は、プライマー10Cのヌクレオ
チド配列を示す。
QAのヌクレオチド配列を示す。配列番号２は、プライマ
ー11BBのヌクレオチド配列を示す。配列番号３は、プラ
イマー11QEのヌクレオチド配列を示す。配列番号４は、
プライマー10のヌクレオチド配列を示す。配列番号５
は、プライマー12Aのヌクレオチド配列を示す。配列番
号６は、プライマー12Bのヌクレオチド配列を示す。配
列番号７は、プライマー12Eのヌクレオチド配列を示
す。配列番号８は、プライマー9AEのヌクレオチド配列
を示す。配列番号９は、プライマー9Bのヌクレオチド配
列を示す。配列番号１０は、プライマー10Cのヌクレオ
チド配列を示す。
【００６７】配列番号１１は、プライマー10Gのヌクレ
オチド配列を示す。配列番号１２は、プライマー10Hの
ヌクレオチド配列を示す。配列番号１３は、プライマー
11RCのヌクレオチド配列を示す。配列番号１４は、プラ
イマー11RDのヌクレオチド配列を示す。配列番号１５
は、プライマー11RFのヌクレオチド配列を示す。配列番
号１６は、プライマー11SGのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１７は、プライマー11SHのヌクレオチド配列を
示す。配列番号１８は、プライマー11LBのヌクレオチド
配列を示す。配列番号１９は、プライマー11LEのヌクレ
オチド配列を示す。配列番号２０は、プライマー10Uの
ヌクレオチド配列を示す。
オチド配列を示す。配列番号１２は、プライマー10Hの
ヌクレオチド配列を示す。配列番号１３は、プライマー
11RCのヌクレオチド配列を示す。配列番号１４は、プラ
イマー11RDのヌクレオチド配列を示す。配列番号１５
は、プライマー11RFのヌクレオチド配列を示す。配列番
号１６は、プライマー11SGのヌクレオチド配列を示す。
配列番号１７は、プライマー11SHのヌクレオチド配列を
示す。配列番号１８は、プライマー11LBのヌクレオチド
配列を示す。配列番号１９は、プライマー11LEのヌクレ
オチド配列を示す。配列番号２０は、プライマー10Uの
ヌクレオチド配列を示す。
【００６８】配列番号２１は、プライマー10KCのヌクレ
オチド配列を示す。配列番号２２は、プライマー10UFの
ヌクレオチド配列を示す。配列番号２３は、プライマー
10UGのヌクレオチド配列を示す。配列番号２４は、プラ
イマー10UCのヌクレオチド配列を示す。配列番号２５
は、プライマー11LAEのヌクレオチド配列を示す。配列
番号２６は、プライマー11LCのヌクレオチド配列を示
す。配列番号２７は、プライマー11QA1のヌクレオチド
配列を示す。配列番号２８は、プライマー11VBのヌクレ
オチド配列を示す。配列番号２９は、プライマー11XCの
ヌクレオチド配列を示す。配列番号３０は、プライマー
11WEのヌクレオチド配列を示す。
オチド配列を示す。配列番号２２は、プライマー10UFの
ヌクレオチド配列を示す。配列番号２３は、プライマー
10UGのヌクレオチド配列を示す。配列番号２４は、プラ
イマー10UCのヌクレオチド配列を示す。配列番号２５
は、プライマー11LAEのヌクレオチド配列を示す。配列
番号２６は、プライマー11LCのヌクレオチド配列を示
す。配列番号２７は、プライマー11QA1のヌクレオチド
配列を示す。配列番号２８は、プライマー11VBのヌクレ
オチド配列を示す。配列番号２９は、プライマー11XCの
ヌクレオチド配列を示す。配列番号３０は、プライマー
11WEのヌクレオチド配列を示す。
【００６９】配列番号３１は、プライマー11TCのヌクレ
オチド配列を示す。配列番号３２は、プライマー11RC1
のヌクレオチド配列を示す。配列番号３３は、プライマ
ー11SEのヌクレオチド配列を示す。配列番号３４は、プ
ライマー11BEのヌクレオチド配列を示す。
オチド配列を示す。配列番号３２は、プライマー11RC1
のヌクレオチド配列を示す。配列番号３３は、プライマ
ー11SEのヌクレオチド配列を示す。配列番号３４は、プ
ライマー11BEのヌクレオチド配列を示す。
【図１】図１は、ＨＩＶ−１の種々のサブタイプのenv
遺伝子のV3領域の5'隣接領域（C2領域）のヌクレオチド
配列を示す。大文字は同じサブタイプ内でヌクレオチド
が完全に共通であることを、小文字は同じサブタイプ内
でヌクレオチドが異なる変異体が存在することを示す。
?は変異が多すぎてコンセンサスのヌクレオチドが決め
られないことを示す。-はサブタイプAと同じヌクレオチ
ドを示す。．は相当する部位にヌクレオチドが存在しな
いことを示す。
遺伝子のV3領域の5'隣接領域（C2領域）のヌクレオチド
配列を示す。大文字は同じサブタイプ内でヌクレオチド
が完全に共通であることを、小文字は同じサブタイプ内
でヌクレオチドが異なる変異体が存在することを示す。
?は変異が多すぎてコンセンサスのヌクレオチドが決め
られないことを示す。-はサブタイプAと同じヌクレオチ
ドを示す。．は相当する部位にヌクレオチドが存在しな
いことを示す。
【図２】図２は、ＨＩＶ−１の種々のサブタイプのenv
遺伝子のV3領域の3'隣接領域（C3領域）のヌクレオチド
配列を示す。大文字は同じサブタイプ内でヌクレオチド
が完全に共通であることを、小文字は同じサブタイプ内
でヌクレオチドが異なる変異体が存在することを示す。
?は変異が多すぎてコンセンサスのヌクレオチドが決め
られないことを示す。-はサブタイプAと同じヌクレオチ
ドを示す。．は相当する部位にヌクレオチドが存在しな
いことを示す。
遺伝子のV3領域の3'隣接領域（C3領域）のヌクレオチド
配列を示す。大文字は同じサブタイプ内でヌクレオチド
が完全に共通であることを、小文字は同じサブタイプ内
でヌクレオチドが異なる変異体が存在することを示す。
?は変異が多すぎてコンセンサスのヌクレオチドが決め
られないことを示す。-はサブタイプAと同じヌクレオチ
ドを示す。．は相当する部位にヌクレオチドが存在しな
いことを示す。
【図３】図３は、ＨＩＶ−１のサブタイプを決定するた
めのnested PCR（第一ＰＣＲも第二ＰＣＲもプライマー
が異なる）で用いたプライマーの位置、組み合わせおよ
び塩基配列を示す。
めのnested PCR（第一ＰＣＲも第二ＰＣＲもプライマー
が異なる）で用いたプライマーの位置、組み合わせおよ
び塩基配列を示す。
【図４】図４は、ウイルスゲノムのシーケンシングによ
ってサブタイプが決定されている検体について、図３に
示したプライマーを用いたnested PCRによりサブタイプ
の検出を行った結果を示す。
ってサブタイプが決定されている検体について、図３に
示したプライマーを用いたnested PCRによりサブタイプ
の検出を行った結果を示す。
【図５】図５は、ＨＩＶ−１のサブタイプを決定するた
めのnested PCR（第一ＰＣＲのプライマーは共通で第二
のＰＣＲのプライマーが異なる）で用いたプライマーの
位置、組み合わせおよび塩基配列を示す。9Mはプライマ
ー9AEおよび9Bの混合物、11Mはプライマー11LAE、11Bお
よび11LCの混合物、12Mはプライマー12Aと12Bの混合物
を示す。
めのnested PCR（第一ＰＣＲのプライマーは共通で第二
のＰＣＲのプライマーが異なる）で用いたプライマーの
位置、組み合わせおよび塩基配列を示す。9Mはプライマ
ー9AEおよび9Bの混合物、11Mはプライマー11LAE、11Bお
よび11LCの混合物、12Mはプライマー12Aと12Bの混合物
を示す。
【図６】図６は、図５に示したプライマーを用いたnest
ed PCRによりサブタイプの検出を行った結果を示す。
ed PCRによりサブタイプの検出を行った結果を示す。
【図７】図７は、シーケンシングによって得られた、en
v遺伝子V3領域の塩基配列をもとにHIV-1変異体の系統樹
解析を行い、サブタイプを決定した結果を示す。
v遺伝子V3領域の塩基配列をもとにHIV-1変異体の系統樹
解析を行い、サブタイプを決定した結果を示す。
【図８】図８は、HAART療法を受けている非サブタイプ
Ｂ HIV-1感染患者におけるプロテアーゼ阻害剤耐性に関
係するアミノ酸配列を示す。
Ｂ HIV-1感染患者におけるプロテアーゼ阻害剤耐性に関
係するアミノ酸配列を示す。
【図９】図９は、各種のサブタイプとHIV-1感染患者の
性行動の関係を示す表である。
性行動の関係を示す表である。
【図１０】図１０は、粒子吸着法により陽性(PA+)と診
断され、ウェスタンブロット法により陰性(WB-)と診断
された被験者からの血清検体について、サブタイプに関
係なくＨＩＶ−１を増幅できるプライマー対を用いたRT
-PCRを行った結果を示す。N1とN2は陰性対照、P1とP2は
陽性対照を示す。
断され、ウェスタンブロット法により陰性(WB-)と診断
された被験者からの血清検体について、サブタイプに関
係なくＨＩＶ−１を増幅できるプライマー対を用いたRT
-PCRを行った結果を示す。N1とN2は陰性対照、P1とP2は
陽性対照を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 杉田 哲佳 東京都中野区本町２−28−７−303 (56)参考文献 特開 平８−242898（ＪＰ，Ａ) 特開 平10−210990（ＪＰ，Ａ) 特開 平11−69987（ＪＰ，Ａ) 特表 平７−503135（ＪＰ，Ａ) ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯ ＧＹ，Ｖｏｌ．73，Ｎｏ．５，ｐ．3351 −3559 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯ ＧＹ，Ｖｏｌ．69，Ｎｏ．10，ｐ．6122 −6130 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯ ＧＹ，Ｖｏｌ．72，Ｎｏ．１，ｐ．512 −519 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯ ＧＹ，Ｖｏｌ．71，Ｎｏ．３，ｐ．1871 −1879 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12Q 1/70 G01N 33/50 G01N 33/569 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (18)
- 【請求項１】 配列番号１〜３４のいずれかのヌクレオ
チド配列中の連続した１８個のヌクレオチドを含む、１
８〜３０塩基の長さのプライマーを用いて、ＨＩＶ−１
の特定のサブタイプのenv遺伝子のヌクレオチド配列の
一部を標的配列として特異的に増幅することにより、サ
ブタイプの検出を行うことを特徴とする、ＨＩＶ−１の
サブタイプを決定する方法。 - 【請求項２】 標的配列が１００〜２５００ヌクレオチ
ドの長さである請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 標的配列の3'末端および／または5'末端
から１番目〜３０番目の塩基までの配列がサブタイプに
よって異なる請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 標的配列の3'末端がＨＩＶ−１のenv遺伝
子のC3領域にある請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 標的配列の5'末端がＨＩＶ−１のenv遺伝
子のC2領域にある請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 異なるプライマー対を用いる異なる増幅
反応を行い、異なるサブタイプの検出を行う請求項１〜
５のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７】 ＨＩＶ−１のenv遺伝子のC3領域の一部の
サブタイプによって異なるヌクレオチド配列（ヌクレオ
チド配列１）に相補的な配列を含むプライマー（プライ
マー１）とＨＩＶ−１のenv遺伝子のC2領域の一部のヌ
クレオチド配列（ヌクレオチド配列２）に相補的な配列
を含むプライマー（プライマー２）とからなるプライマ
ー対を用いる増幅反応を少なくとも２回プライマー対を
変えて行い、少なくとも２つのサブタイプの検出を行う
請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 第一のプライマー対を用いて、ＨＩＶ−
１のenv遺伝子のヌクレオチド配列の一部を標的配列と
する第一の増幅反応を行った後、第二のプライマー対を
用いて、前記標的配列の一部であって、5'末端部および
3'末端部のうちの少なくとも片方のヌクレオチド配列が
サブタイプにより異なる一部を標的配列とする第二の増
幅反応を行い、第二の増幅反応による核酸の増幅の有無
によりサブタイプの検出を行う請求項１〜７のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項９】 第二のプライマー対が、ＨＩＶ−１のenv
遺伝子のC3領域の一部のサブタイプによって異なるヌク
レオチド配列（ヌクレオチド配列１）に相補的な配列を
含むプライマー（プライマー１）とＨＩＶ−１のenv遺
伝子のC2領域の一部のヌクレオチド配列（ヌクレオチド
配列２）に相補的な配列を含むプライマー（プライマー
２）とからなり、第一のプライマー対が、ＨＩＶ−１の
env遺伝子のヌクレオチド配列１の3'末端の下流の領域
の一部のヌクレオチド配列（ヌクレオチド配列３）に相
補的な配列を含むプライマー（プライマー３）とＨＩＶ
−１のenv遺伝子のヌクレオチド配列２の5'末端の上流
の領域の一部のヌクレオチド配列（ヌクレオチド配列
４）に相補的な配列を含むプライマー（プライマー４）
とからなる請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 第一のプライマー対を用いてＨＩＶ−
１のenv遺伝子のヌクレオチド配列の一部を標的配列と
する第一の増幅反応を行った後、第二のプライマー対を
用いて前記標的配列の内部のヌクレオチド配列を標的配
列とする第二の増幅反応を行い、第二の増幅反応による
核酸の増幅の有無によりサブタイプの検出を行う一連の
操作を第二のプライマー対を変えて少なくとも１回繰り
返すことにより、少なくとも２つのサブタイプの鑑別を
行う請求項８または９に記載の方法。 - 【請求項１１】（a）第一のプライマー対として、GCAAT
AGAAAAATTCTCCTC（配列番号５）のヌクレオチド配列を
含むプライマー12AおよびACAGTAGAAAAATTCCCCTC（配列
番号６）のヌクレオチド配列を含むプライマー12Bの混
合物と、CACAGTACAATGCACACATG（配列番号８）のヌクレ
オチド配列を含むプライマー9AEおよびCACAGTACAATGTAC
ACATG（配列番号９）のヌクレオチド配列を含むプライ
マー9Bの混合物を用い、第二のプライマー対として、CT
CCTGAGGAGTTAGCAAAG（配列番号２７）のヌクレオチド配
列を含むプライマー11QA1およびCTGTTAAATGGCAGTCTAGC
（配列番号２０）のヌクレオチド配列を含むプライマー
10Uを用いサブタイプＡの検出を行い、 （b）第一のプライマー対として、GCAATAGAAAAATTCTCCT
C（配列番号５）のヌクレオチド配列を含むプライマー1
2AおよびACAGTAGAAAAATTCCCCTC（配列番号６）のヌクレ
オチド配列を含むプライマー12Bの混合物と、CACAGTACA
ATGCACACATG（配列番号８）のヌクレオチド配列を含む
プライマー9AEおよびCACAGTACAATGTACACATG（配列番号
９）のヌクレオチド配列を含むプライマー9Bの混合物を
用い、第二のプライマー対として、CACAATTAAAACTGTGCA
TTAC（配列番号２８）のヌクレオチド配列を含むプライ
マー11VBおよびCTGTTAAATGGCAGTCTAGC（配列番号２０）
のヌクレオチド配列を含むプライマー10Uを用いサブタ
イプＢの検出を行い、 （c）第一のプライマー対として、GCAATAGAAAAATTCTCCT
C（配列番号５）のヌクレオチド配列を含むプライマー1
2AおよびACAGTAGAAAAATTCCCCTC（配列番号６）のヌクレ
オチド配列を含むプライマー12Bの混合物と、CACAGTACA
ATGCACACATG（配列番号８）のヌクレオチド配列を含む
プライマー9AEおよびCACAGTACAATGTACACATG（配列番号
９）のヌクレオチド配列を含むプライマー9Bの混合物を
用い、第二のプライマー対として、TTGTTTTATTAGGGAAGT
GTTC（配列番号２９）のヌクレオチド配列を含むプライ
マー11XCおよびCTGTTAAATGGCAGTCTAGC（配列番号２０）
のヌクレオチド配列を含むプライマー10Uを用いサブタ
イプＣの検出を行い、 （d）第一のプライマー対として、GCAATAGAAAAATTCTCCT
C（配列番号５）のヌクレオチド配列を含むプライマー1
2AおよびACAGTAGAAAAATTCCCCTC（配列番号６）のヌクレ
オチド配列を含むプライマー12Bの混合物と、CACAGTACA
ATGCACACATG（配列番号８）のヌクレオチド配列を含む
プライマー9AEおよびCACAGTACAATGTACACATG（配列番号
９）のヌクレオチド配列を含むプライマー9Bの混合物を
用い、第二のプライマー対として、CTCTACAATTAAAATGAT
GCATTG（配列番号３０）のヌクレオチド配列を含むプラ
イマー11WEおよびCTGTTAAATGGCAGTCTAGC（配列番号２
０）のヌクレオチド配列を含むプライマー10Uを用いサ
ブタイプＥの検出を行うことにより、サブタイプＡ、
Ｂ、ＣおよびＥの鑑別を行う請求項１０記載の方法。 - 【請求項１２】 第一のプライマー対を用いてＨＩＶ−
１のenv遺伝子のヌクレオチド配列の一部を標的配列と
する第一の増幅反応を行った後、第二のプライマー対を
用いて前記標的配列の内部のヌクレオチド配列を標的配
列とする第二の増幅反応を行い、第二の増幅反応による
核酸の増幅の有無によりサブタイプの検出を行う一連の
操作を第一のプライマー対および第二のプライマー対を
変えて少なくとも１回繰り返すことにより、少なくとも
２つのサブタイプの鑑別を行う請求項８または９に記載
の方法。 - 【請求項１３】 (a) 第一のプライマー対として、GCAAT
AGAAAAATTCTCCTC（配列番号５）のヌクレオチド配列を
含むプライマー12AおよびCACAGTACAATGCACACATG（配列
番号８）のヌクレオチド配列を含むプライマー9AEを用
い、第二のプライマー対として、CTCCTGAGGGGTTAGCAAAG
（配列番号１）のヌクレオチド配列を含むプライマー11
QAおよびAAATGGCAGTCTAGCAGAAG（配列番号４）のヌクレ
オチド配列を含むプライマー10を用いてサブタイプＡの
検出を行い、（b) 第一のプライマー対として、ACAGTAG
AAAAATTCCCCTC（配列番号６）のヌクレオチド配列を含
むプライマー12BおよびCACAGTACAATGTACACATG（配列番
号９）のヌクレオチド配列を含むプライマー9Bを用い、
第二のプライマー対として、CTGTGCATTACAATTTCTGG（配
列番号２）のヌクレオチド配列を含むプライマー11BBお
よびAAATGGCAGTCTAGCAGAAG（配列番号４）のヌクレオチ
ド配列を含むプライマー10を用いてサブタイプＢの検出
を行い、また、(c) 第一のプライマー対として、GCAATA
GAAAAATTCCCCTC（配列番号７）のヌクレオチド配列を含
むプライマー12EおよびCACAGTACAATGCACACATG（配列番
号８）のヌクレオチド配列を含むプライマー9AEを用
い、第二のプライマー対として、CTCCTGAGGGTGGTTGAAAG
（配列番号３）のヌクレオチド配列を含むプライマー11
QEおよびAAATGGCAGTCTAGCAGAAG（配列番号４）のヌクレ
オチド配列を含むプライマー10を用いてサブタイプＥの
検出を行うことにより、サブタイプＡ、ＢおよびＥの鑑
別を行う請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 さらに、ＨＩＶ−１のゲノムのヌクレ
オチド配列の一部であって、ヌクレオチド配列がすべて
のサブタイプの間で高度に保存されている一部を標的配
列とする核酸の増幅反応を行い、核酸の増幅の有無によ
りＨＩＶ−１の存在または不存在を確認する工程を含む
請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１５】 ＨＩＶ−１の存在または不存在を確認
する工程が、第一のプライマー対を用いて、ＨＩＶ−１
のゲノムのヌクレオチド配列の一部であって、ヌクレオ
チド配列がすべてのサブタイプの間で高度に保存されて
いる一部を標的配列とする核酸の増幅反応を行った後、
第二のプライマー対を用いて、前記標的配列の内部のヌ
クレオチド配列を標的配列とする第二の増幅反応を行
い、核酸の増幅の有無によりＨＩＶ−１の存在または不
存在を確認することからなる請求項１４記載の方法。 - 【請求項１６】 ヌクレオチド配列が異なる複数の上流
プライマーおよびヌクレオチド配列が異なる複数の下流
プライマーの混合物をプライマーとして用いる請求項１
５記載の方法。 - 【請求項１７】第一のプライマー対として、GCAATAGAAA
AATTCTCCTC（配列番号５）のヌクレオチド配列を含むプ
ライマー12AおよびACAGTAGAAAAATTCCCCTC（配列番号
６）のヌクレオチド配列を含むプライマー12Bの混合物
と、CACAGTACAATGCACACATG（配列番号８）のヌクレオチ
ド配列を含むプライマー9AEおよびCACAGTACAATGTACACAT
G（配列番号９）のヌクレオチド配列を含むプライマー9
Bの混合物を用い、第二のプライマー対として、AATTTCT
GGGTCCCCTCCTG（配列番号１８）のヌクレオチド配列を
含むプライマー11LBおよびAATTTCTAGATCCCCTCCTG（配列
番号２５）のヌクレオチド配列を含むプライマー11LAE
の混合物と、AATTTCTAGGTCCCCTCCTG（配列番号２６）の
ヌクレオチド配列を含むプライマー11LCおよびCTGTTAAA
TGGCAGTCTAGC（配列番号２０）のヌクレオチド配列を含
むプライマー10Uの混合物を用いる請求項１６記載の方
法。 - 【請求項１８】配列番号１〜３４のいずれかのヌクレオ
チド配列中の連続した１８個のヌクレオチドを含む、１
８〜３０塩基の長さのプライマーを含んでなる、ＨＩＶ
−１のサブタイプを決定するためのキット。
Priority Applications (4)
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|---|---|---|---|
| JP2000023581A JP3351773B2 (ja) | 1999-06-15 | 2000-02-01 | Ｈｉｖ−１のサブタイプ決定法 |
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| ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．７２，Ｎｏ．１，ｐ．５１２−５１９ |
| ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．７３，Ｎｏ．５，ｐ．３３５１−３５５９ |
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