CN117821666A - 用于检测hiv-1的引物组及其应用和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测HIV‑1的引物组及其应用和检测方法，涉及生物技术领域，本发明的发明人通过检索NCBI核酸数据库获得完整(或近完整)HIV‑1基因组共计6485个，针对HIV‑1基因组相对保守的Gag‑pol区域不同的突变位点，设计了多套检测生物制品、细胞库等样品中HIV‑1的引物组合，比对不同HIV‑1基因组，覆盖M、N和O组所有亚型，约83％的HIV‑1变异毒株，检测重复性好，灵敏度可达到10拷贝/反应，具有检测特异性强、灵敏度高、覆盖率广的特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种用于检测HIV-1的引物组及其应用和检测方法。
背景技术
人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(Human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)属逆转录病毒科(Retroviridae)慢病毒属(Lentivirus)，其病毒颗粒大致呈球形，直径约100～200nm。1981年首次记载获得性免疫缺陷综合征(又称艾滋病)，1983年，法国巴斯德研究所首次从获得性免疫缺陷综合征患者身上分离出一种逆转录病毒，命名为淋巴腺病相关病毒(lymphadenopathy associated virus，LAV)。1984年美国国立癌肿研究所也分离到该病毒，命名为嗜人T淋巴细胞Ⅲ型病毒(human T-cell lymphotropic virus typeⅢ，HTLV-Ⅲ)。1986年，国际微生物学会及病毒分类学会将这些病毒统一命名为人类免疫缺陷病毒。
HIV-1基因组为两条相同的正链RNA，每条RNA长约9200～9800bp，含gag、pol、env3个结构基因，以及至少6个调控基因(tat、rev、nef、vif、vpu、vpr)。根据编码包膜蛋白的env基因和编码衣壳蛋白的gag基因序列的同源性又分为三个组：M、N和O组，其中M组是全球HIV流行的主要毒株，可进一步分为A～D、F～H、J和K共9个亚型和这些亚型的循环重组体(circulating recombinant forms,CRFs)。
HIV-1主要有三种传播方式：性接触传播、血液传播、母婴传播，HIV-1感染人CD4细胞，破坏人体免疫系统，使人体丧失免疫功能，易于感染各种疾病，并发生恶性肿瘤，病死率较高。临床实验室检测主要采取HIV-1抗体检测，但不能检测出处于HIV-1感染窗口期患者，在技术层面上，HIV-1核酸检测比免疫检测有更高的灵敏度，可检测更早的HIV-1感染窗口期。新发布的《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断WS293-2019》也提示使用核酸定量或定性检测HIV感染。
由于HIV-1基因组的高变异率和高重组率，仅采用一套引物探针较难扩增出所有的基因亚型。国内现有的HIV-1试剂盒多是检测最流行的几种基因亚型或重组型，并且没有明确的说明能检出HIV-1的覆盖率。国外的BioReliance公司检测细胞库产品的人源病毒污染的结果提示可检出82.7％的HIV-1病毒变异株，检测限为100拷贝/反应。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种用于检测HIV-1的引物组、相应产品及检测方法，具有检测特异性强、灵敏度高、覆盖率广的特点，以至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
根据本发明的一个方面，提供了一种用于检测HIV-1的引物组，包括如下(A)～(D)组中的至少一组：
(A)具有如SEQ ID NO.1所示的上游引物HIV-1F1和如SEQ ID NO.4所示的下游引物HIV-1R1；
(B)具有如SEQ ID NO.2所示的上游引物HIV-1F2和如SEQ ID NO.4所示的下游引物HIV-1R1；
(C)具有如SEQ ID NO.3所示的上游引物HIV-1F3和如SEQ ID NO.4所示的下游引物HIV-1R1；
(D)具有如SEQ ID NO.3所示的上游引物HIV-1F3和如SEQ ID NO.5所示的下游引物HIV-1R2。
本发明提供的引物组，比对不同HIV-1基因组，覆盖M、N和O组所有亚型，约83％的HIV-1变异毒株，检测重复性好，灵敏度可达到10拷贝/反应，具有检测特异性强、灵敏度高、覆盖率广的特点。以其中F3引物为例进行BLAST序列比对，选择所有核酸数据库进行比对，图18为比对结果，说明经BLAST比对与其他病原体无交叉反应。图19-21分别为与HIV-2序列、与HBV序列、与HCV序列比对结果。
需要说明的是，本发明提供的引物组可用于不同类型的PCR反应。典型的当被用于常规PCR检测时，可根据扩增产物条带的有无及扩增产物的片段大小来判定待测样本中是否含有HIV-1。典型的当被用于荧光定量PCR检测时，可以根据扩增产物中的荧光信号及扩增曲线，来判断待测样本中是否含有HIV-1，或含量多少。当使用荧光定量PCR作为检测手段时，对其具体表征方法不做限定，例如可以为本领域常用的染料法或探针法。其中探针法的特异性要优于染料法，因此优选使用探针法进行表征。
基于此，在一些优选的实施方式中，所述引物组还包括探针HIV-1P1～HIV-1P6中的任一个，所述HIV-1P1～HIV-1P6的序列依次如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.11所示。
可选地，所述HIV-1P1两端分别含有荧光淬灭基团MGB和荧光报告基团TAMRA；
所述HIV-1P2两端分别含有荧光淬灭基团MGB和荧光报告基团FAM；
所述HIV-1P3两端分别含有荧光淬灭基团MGB和荧光报告基团HEX；
所述HIV-1P4两端分别含有荧光淬灭基团MGB和荧光报告基团FAM；
所述HIV-1P5两端分别含有荧光淬灭基团MGB和荧光报告基团HEX；
所述HIV-1P6两端分别含有荧光淬灭基团BHQ1和荧光报告基团FAM。
需要说明的是，本发明对引物和探针的组合不做具体限定，任一探针均可与(A)～(D)中任一组的引物组合，形成引物探针组合。
具体地，可组合得到如下第一组～第六组中的引物组：
第一组包括HIV-1F1、HIV-1R1和HIV-1P1；
第二组包括HIV-1F2、HIV-1R1和HIV-1P2；
第三组包括HIV-1F2、HIV-1R1和HIV-1P3；
第四组包括HIV-1F3、HIV-1R1和HIV-1P4；
第五组包括HIV-1F3、HIV-1R2和HIV-1P5；
第六组包括HIV-1F3、HIV-1R2和HIV-1P6。
在一些优选的实施方式中，第一组～第六组的引物的工作浓度分别独立的为0.1～1.0μM，例如可以为但不限于为0.1、0.2、0.4、0.8或1.0μM，或上述任意两点之间的范围值，优选为0.4μM；
可选地，所述第一组～第六组的探针的工作浓度分别独立的为0.05～0.25μM，例如可以为但不限于为0.05、0.1、0.15、0.2或0.25μM，或上述任意两点之间的范围值，优选为0.2μM。
通过对引物和探针的工作浓度进行限定，避免工作浓度过低导致引物或探针降解，又避免浓度过高产生引物二聚体，同时，在优选工作浓度范围内也能够保证引物或探针的最大化利用，避免浪费。
基于与本发明提供的引物组相同的发明构思，本发明还提供了一种用于检测HIV-1的产品，包括上述的引物组。
在一些具体的实施方式中，所述产品包括试剂或试剂盒。
优选地，所述试剂盒还包括PCR反应液、阳性对照品或阴性对照品中的至少一种。
其中，PCR反应液包括进行PCR反应常用的试剂，具体的反应试剂的实例包括用于PCR反应的酶、盐、缓冲物质、缓冲液、dNTP和稳定剂等，本发明对这些试剂不作限制。优选地，在PCR反应液中还包含本发明提供的引物组，含有本发明提供的引物组的PCR反应液已预先分装，使用时只需加入提取好的基因组核酸即可，操作简单方便。优选的PCR反应液的总体积为每个反应25μL。
通过设置阳性对照品和阴性对照品，能够有效避免检测出现的假阴性或假阳性结果，进一步保证了检测的准确性。
根据本发明的第二个方面，还提供了上述的引物组或产品在非诊断和治疗目的的检测HIV-1中的应用。
根据本发明的第三个方面，本发明还提供了非诊断和治疗目的的检测HIV-1的方法，包括以待测样本的基因组核酸为模板，使用上述的引物组或产品，进行荧光定量PCR反应；收集所述荧光定量PCR反应的荧光信号，所述荧光信号用于结果分析。
本发明提供的用于检测HIV-1的方法，通过应用本发明提供的引物组或产品对待测样本进行PCR检测，根据不同检测结果，实现对HIV-1的精确分子鉴别，具有操作简便，结果特异性好、灵敏度高等特点，在病原体检测和流行病学调查等领域具有重要的应用价值。
所述结果分析包括但不限于定性、半定量或定量分析。可选的实施方式，根据待测样本是否出现扩增曲线，定性的判断待测样本中是否存在HIV-1；可选的实施方式，根据待测样本的Ct值，根据本领域已知的、常规的相对荧光定量的计算方法半定量待测样本中的HIV-1拷贝数；可选的实施方式，通过构建标准曲线，并根据所述荧光信号计算所述待测样本中所含有的HIV-1拷贝数。
在一些优选的实施方式中，考虑到具体实施过程的便捷性，该检测方法经优化合并为2个PCR反应进行，即将第一组、第二组和第三组混合作为引物组使用；或者，将第四组、第五组和第六组混合作为引物组使用。
此外，需要特别强调的是，本发明提供的用于检测HIV-1的方法为非疾病的诊断或治疗目的的方法，仅用于例如实验室样品的检测或鉴定。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的发明人通过检索NCBI核酸数据库获得完整(或近完整)HIV-1基因组共计6485个，针对HIV-1基因组相对保守的Gag-pol区域不同的突变位点，设计了多套适用于检测包括但不限于生物制品、细胞库等样品的HIV-1引物组合，比对不同HIV-1基因组，覆盖M、N和O组所有亚型，约83％的HIV-1变异毒株，检测重复性好，灵敏度可达到10拷贝/反应，具有检测特异性强、灵敏度高、覆盖率广的特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的HIV-1第一组的扩增结果图；
图2为本发明实施例提供的HIV-1第二组的扩增结果图；
图3为本发明实施例提供的HIV-1第三组的扩增结果图；
图4为本发明实施例提供的HIV-1第四组的扩增结果图；
图5为本发明实施例提供的HIV-1第五组的扩增结果图；
图6为本发明实施例提供的HIV-1第六组的扩增结果图；
图7为本发明实施例提供的HIV-1第一组的标准曲线；
图8为本发明实施例提供的HIV-1第二组的标准曲线；
图9为本发明实施例提供的HIV-1第三组的标准曲线；
图10为本发明实施例提供的HIV-1第四组的标准曲线；
图11为本发明实施例提供的HIV-1第五组的标准曲线；
图12为本发明实施例提供的HIV-1第六组的标准曲线；
图13为本发明实施例提供的HIV-1第一组～第三组引物组混合扩增结果图；
图14为本发明实施例提供的HIV-1第四组～第六组引物组混合扩增结果图；
图15为本发明实施例提供的HIV-1第一组～第三组引物组混合扩增的标准曲线；
图16为本发明实施例提供的HIV-1第四组～第六组引物组混合扩增的标准曲线；
图17为本发明实施例提供的HIV-1第一组的序列比对图；
图18为本发明提供的F3引物进行BLAST序列比对的结果图；
图19为本发明提供的F3引物与HIV-2序列比对的结果图；
图20为本发明提供的F3引物与HBV序列比对的结果图；
图21为本发明提供的F3引物与HCV序列比对的结果图。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
实施例1引物设计
本实施例通过检索NCBI核酸数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得完整(或近完整)HIV-1基因组共计6485个，以HIV-1参考基因组NC_001802.1序列(9181bp)为模板，选取相对保守的Gag-pol区域(336～4642)，针对Gag-pol区域不同的突变位点，设计了6套引物组合，如下表1所示。
表1HIV-1检测引物探针组
上述引物的理论扩增序列如SEQ ID No.12所示。
实施例2样本检测
主要检测样本：
①已知HIV-1阴性的细胞裂解液；
②HIV-1灭活病毒血清；
③含HIV-1扩增片段的质粒DNA(作为标曲和灵敏度样本)；
④0.9％生理盐水或PBS缓冲液作为阴性提取对照。
二、实验流程
1、6组引物检测
采用商品化病毒基因组提取试剂盒提取基因组RNA(天根，货号DP315)，参照试剂盒提供说明书对待测样本进行基因组提取；采用商品化反转录试剂盒(翌圣生物，货号11121ES60)，参照试剂盒提供说明书对提取的RNA进行反转录；采用商品化PCR酶混合液(诺唯赞，货号Q112-03)，用于检测的探针使用浓度为0.05～0.25μM，用于检测的上下游引物使用浓度为0.1～1.0μM，反应总体系为25μL。
使用ABI 7500进行qPCR，设置反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，56℃/60℃退火延伸1min(收集荧光信号)，40个循环。反应完成后，自动进行基线和阈值的设定，绘制标准曲线对待测样本进行定性/定量分析。对于结果的判定：有明显的扩增曲线且Ct≤39.99，判定为阳性，无扩增曲线无Ct或Ct≥39.99，判定为阴性。1～6引物组扩增结果见图1～图6，标曲见图7～图12。6组扩增曲线标曲各点浓度为2×103～2×107copies/μL，三复孔重复性较好，标曲拟合相关系数R2均大于0.99，扩增效率达到90％～110％。灵敏度浓度2copies/μL的十复孔稳定检出。
2、2组引物组合检测
进一步考虑到具体实施过程的便捷性，将1～3引物组、4～6引物组(见表1)分别进行混合检测，探针序列不变(SEQ ID No.6～11)，荧光基团由原来的TAMRA、FAM、HEX全部都换为FAM，重新合成探针。含HIV-1扩增片段的质粒DNA作为标曲和灵敏度样本，同时检测HIV-1灭活病毒血清，扩增结果见图13、图14，标曲见图15、图16。从结果可以看出1～3组引物混合和4～6组的引物混合后标曲拟合相关系数R2较好，扩增效率达到90％～110％。灵敏度浓度2copies/μL的十复孔稳定检出。
无论是6组引物分别检测还是1～3引物组、4～6引物组混合检测均能有效检测HIV-1，两者相比，混合检测可由单独检测的14小时降为6小时，大大降低实验时间，节约人力成本，提高检测效率。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种用于检测HIV-1的引物组，其特征在于，包括如下(A)～(D)组中的至少一组：
(A)具有如SEQ ID NO.1所示的上游引物HIV-1F1和如SEQ ID NO.4所示的下游引物HIV-1R1；
(B)具有如SEQ ID NO.2所示的上游引物HIV-1F2和如SEQ ID NO.4所示的下游引物HIV-1R1；
(C)具有如SEQ ID NO.3所示的上游引物HIV-1F3和如SEQ ID NO.4所示的下游引物HIV-1R1；
(D)具有如SEQ ID NO.3所示的上游引物HIV-1F3和如SEQ ID NO.5所示的下游引物HIV-1R2。
2.据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括探针HIV-1P1～HIV-1P6中的任一个，所述HIV-1P1～HIV-1P6的序列依次如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.11所示。
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述HIV-1P1两端分别含有荧光淬灭基团MGB和荧光报告基团TAMRA；
所述HIV-1P2两端分别含有荧光淬灭基团MGB和荧光报告基团FAM；
所述HIV-1P3两端分别含有荧光淬灭基团MGB和荧光报告基团HEX；
所述HIV-1P4两端分别含有荧光淬灭基团MGB和荧光报告基团FAM；
所述HIV-1P5两端分别含有荧光淬灭基团MGB和荧光报告基团HEX；
所述HIV-1P6两端分别含有荧光淬灭基团BHQ1和荧光报告基团FAM。
4.根据权利要求1-3任一项所述的引物组，其特征在于，所述引物组包括如下第一组～第六组中的至少一组：
第一组包括HIV-1F1、HIV-1R1和HIV-1P1；
第二组包括HIV-1F2、HIV-1R1和HIV-1P2；
第三组包括HIV-1F2、HIV-1R1和HIV-1P3；
第四组包括HIV-1F3、HIV-1R1和HIV-1P4；
第五组包括HIV-1F3、HIV-1R2和HIV-1P5；
第六组包括HIV-1F3、HIV-1R2和HIV-1P6。
5.根据权利要求4所述的引物组，其特征在于，所述第一组～第六组的引物的工作浓度分别独立的为0.1～1.0μM，优选为0.4μM；
所述第一组～第六组的探针的工作浓度分别独立的为0.05～0.25μM，优选为0.2μM。
6.一种用于检测HIV-1的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1-5任一项所述的引物组；
优选地，所述产品包括试剂或试剂盒。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应液、阳性对照品或阴性对照品中的至少一种。
8.权利要求1-5任一项所述的引物组、或权利要求6或7所述的产品在非诊断和治疗目的的检测HIV-1中的应用。
9.非诊断和治疗目的的检测HIV-1的方法，其特征在于，包括以待测样本的基因组核酸为模板，使用权利要求1-5任一项所述的引物组、或权利要求6或7所述的产品，进行荧光定量PCR反应；收集所述荧光定量PCR反应的荧光信号，所述荧光信号用于结果分析。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，将第一组、第二组和第三组混合作为引物组使用；或者，
将第四组、第五组和第六组混合作为引物组使用。
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