CN116790823B - 同步检测htlv-1和htlv-2的双重定量rt-pcr检测组合物、试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及病毒检测领域，为解决现有技术对HTLV‑1、HTLV‑2两型人类T细胞白血病病毒的检测方法检测结果不确定、漏检等问题，公开了一种用于同步检测HTLV‑1与HTLV‑2的双重定量RT‑PCR的核酸组合物、一种同步检测HTLV‑1与HTLV‑2的双重定量RT‑PCR试剂盒和检测方法。本申请建立了一种同步检测HTLV‑1与HTLV‑2的方法，该检测方法灵敏度高、特异性好、可重复、试剂成本低，并且使用方便、操作简单、检测结果可靠，为患者的诊断和治疗争取了宝贵的时间。
Description
技术领域
本申请涉及病毒检测领域，尤其涉及一种同步检测HTLV-1与HTLV-2的双重定量RT-PCR的核酸组合物、试剂盒及方法。
背景技术
人类T细胞白血病病毒(human T-cell lymphotropic virus, human T-cellleukemia virus，HTLV)，是一种单正链RNA病毒，属于逆转录病毒科。HTLV流行呈世界性广泛分布，主要传播方式包括母婴传播、性传播和经血传播。HTLV有4个亚型，HTLV-1和HTLV-2是两个主要亚型，HTLV感染人体后可引起多种疾病，包括成人T淋巴细胞白血病(adult T-cell leukemia，ATL)、HTLV-1相关性脊髓病/热带痉挛性瘫痪(HTLV-1 associatedmyelopathy/ tropical spastic paraparesis，HAM/TSP)、炎症性疾病(尤其是葡萄膜炎、关节炎和皮炎)以及免疫缺陷相关疾病(如T细胞免疫缺陷、支气管扩张等)[1]。这些疾病治疗手段有限、疗效欠佳，疾病预后较差，严重影响患者生存质量。
目前HTLV实验室诊断大多采用蛋白免疫印迹(WB)作为确认实验，但在某些情况下可能会出现不确定的结果。此外，当宿主免疫缺陷时，常规抗体检测试剂难以检测到HTLV抗体。因此，血清学检测方法有一定的局限性，会造成一部分HTLV感染者漏检。随着核酸检测技术的普及，PCR检测常作为不确定样本的补充试验。然而现有技术中尚没有对HTLV-1和HTLV-2高效、灵敏、成本低、使用方便、检测结果可靠的检测方法。
发明内容
为了克服上述问题，本申请拟通过对HTLV-1和HTLV-2基因区域设计两组特异性引物探针，建立一种高灵敏的双重定量RT-PCR检测方法，以期同时检测HTLV-1和HTLV-2病毒感染，为我国献血者及临床患者HTLV-1和/或HTLV-2病毒载量监测提供技术支持。本申请所述检测HTLV-1和/或HTLV-2的核酸组合物、试剂盒和检测方法灵敏度高、特异性好、可重复、试剂成本低，并且使用方便、操作简单、检测结果可靠，为患者的诊断和治疗争取了宝贵的时间。
为了实现上述目的，本申请采用以下技术方案：
1.一组用于同步检测HTLV-1与HTLV-2的双重定量RT-PCR的核酸组合物，其特征是，所述核酸组合物包括HTLV-1引物对、HTLV-2引物对、HTLV-1探针和HTLV-2探针；
所述HTLV-1引物对包括HTLV-1正向引物和HTLV-1反向引物，HTLV-1正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，HTLV-1反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述HTLV-2引物对中包括HTLV-2正向引物和HTLV-2反向引物，HTLV-2正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，HTLV-2反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述HTLV-1探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述HTLV-2探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
2.一种包括如项1所述核酸组合物的同步检测HTLV-1与HTLV-2的双重定量RT-PCR试剂盒。
3.根据项2所述的同步检测HTLV-1与HTLV-2的双重定量RT-PCR试剂盒，其特征是，所述试剂盒还包括2X RT-PCR试剂、Taq酶、逆转录酶、阳性对照和无DNase和RNase的水。
4.根据项2或3所述的同步检测HTLV-1与HTLV-2的双重定量RT-PCR试剂盒，其特征是，所述引物的浓度分别为20μM。
5. 根据项4所述的同步检测HTLV-1与HTLV-2的双重定量RT-PCR试剂盒，其特征是，所述引物的浓度分别为10μM。
6.根据项2或3所述的同步检测HTLV-1与HTLV-2的双重定量RT-PCR试剂盒，其特征是，所述探针的浓度分别为10μM。
7. 根据项6所述的同步检测HTLV-1与HTLV-2的双重定量RT-PCR试剂盒，其特征是，所述探针的浓度分别为5μM。
8.根据项3所述的定量同步检测HTLV-1与HTLV-2的双重定量RT-PCR试剂盒，其特征是，所述阳性对照为含有如SEQ ID NO:9所示的多核苷酸序列的质粒。
9.一种使用如项2所述试剂盒的同步检测HTLV-1与HTLV-2双重定量RT-PCR方法，其特征是，包括以下步骤：
A、提取待检样品的RNA；
B、使用试剂盒中试剂将待检样品的RNA进行逆转录和荧光PCR扩增反应；
C、设立阳性对照和阴性对照，将阳性对照和阴性对照分别进行荧光PCR扩增反应；
D、根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集待检样品RNA的荧光曲线形态和Ct值判定结果。
10.根据项9所述的同步检测HTLV-1与HTLV-2双重定量RT-PCR方法，其特征是，所述步骤B中，荧光PCR的反应参数为42℃ 5min；95℃ 10s，1个循环；95℃ 5s，60℃ 34s，40个循环。
因此，本申请具有如下有益效果：(1)建立了一种同步检测HTLV-1与HTLV-2的方法，检测速度快，为患者的诊断和治疗争取了宝贵的时间，并且一次性检测两种病毒省时省力，试剂成本低；(2)该检测方法灵敏度高、特异性好、可重复，能有效排除其他病毒的干扰；(3)试剂盒使用方便，操作简单，检测结果可靠。
附图说明
图1是HTLV1引物+探针(HTLV1-P，FAM标记)与HTLV2引物+探针(HTLV2-P2，HEX标记)双通道检测实验结果。结果显示各靶点基线不平，意味着两个探针(HTLV1-P和HTLV2-P2)之间相互干扰。
图2是HTLV1和HTLV2的两组效果较好的引物和探针的反应性能检测结果图。其中HTLV1-P探针的5’端标记有FAM荧光报告基团，HTLV2-P2探针的5’端标记有ROX荧光报告基团。
图3是假病毒中残留质粒DNA的检测反应。使用表达载体上假病毒成熟蛋白片段上的引物，采用SYBR Green I方法检测；采用的扩增引物为M-F和M-R；以假病毒表达载体质粒DNA作为标准品。扩增曲线，自左至右：(1)、(2)、(3)、(4)，依次对应样品模板为：假病毒RNA(gDNA Eraser+, RT+)、假病毒中残留质粒DNA(gDNA Eraser-, RT-)、pSE380-HTLV1+HTLV2质粒、水。
图4是假病毒原液滴度测定反应。采用SYBR Green I方法检测；采用的扩增引物为M-F和M-R。扩增模板为构建的质粒标准品pSE380_STD(被梯度稀释的)及假病毒原液RNA逆转录所得的cDNA。标准品各梯度及假病毒原液样品各设置两个平行。扩增曲线，自左至右：红(1)、黄(2)、紫(3)、浅绿(4)、绿(5)、蓝(6)，依次对应假病毒滴度为1*107拷贝/μl、1*106拷贝/μl、假病毒原液、1*105拷贝/μl、1*104拷贝/μl、1*103拷贝/μl。
图5是双重扩增体系中，HTLV1对应的FAM通道检测结果。扩增曲线，自左向右：红(1)、绿(2)、蓝(3)、紫(4)，依次对应病毒滴度为100000、10000、1000、100拷贝/ul。
图6是双重扩增体系中，HTLV2对应的ROX通道检测结果。扩增曲线，自左向右：黄(1)、绿(2)、蓝(3)、粉(4)，依次对应病毒滴度为100000、10000、1000、100拷贝/ul。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本申请做进一步详细的描述，但本申请的实施方式不限于此。
对一些概念的解释：
基线：实时PCR反应的基线是指在PCR的初始循环期间的信号水平，通常是3至15的循环之间，此时荧光信号几乎没有变化。此时低信号可以认为是背景或反应的“噪音”。基线应该设置应考虑，在消除早期扩增循环中背景的同时，不覆盖掉明显非背景的扩增信号。当比较不同的qPCR反应或实验时，应定义同一基线。
阈值：qPCR的阈值代表的是明显超出基线的扩增信号水平，用以区分明确的扩增信号和背景。通常，qPCR仪器自带软件会自动将阈值设置为基线荧光值标准偏差的10倍。
Ct：Ct是指荧光信号超过阈值时对应的循环数。Ct值与目的基因的起始量成反比，可用于计算DNA初始拷贝数。随着模板量减少，检测到显着扩增时的循环数会增加。
本申请中设计的核酸序列如表1所示
表1：本申请中设计的核酸序列
表1中的“-F”表示正向引物、“-R”表示反向引物、“-P”表示探针。其中的“M-F”表示SYBR Green染料法定量PCR中使用的假病毒成熟蛋白的正向引物、“M-R”表示SYBR Green染料法定量PCR中使用的假病毒成熟蛋白的反向引物。
本申请中，针对HTLV1或HTLV2的探针5’端有荧光报告基团，所述荧光报告基团可选自FAM、ROX、VIC、Cy5或HEX；其3’端有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团可选自BHQ1、BHQ2、BHQ3或MGB。优选所述HTLV1探针的5’端标记有FAM荧光报告基团，其3’端标记有MGB荧光淬灭基团；优选所述HTLV2探针的5’端标记有ROX荧光报告基团，其3’端标记有BHQ荧光淬灭基团；更优选所述HTLV1探针的5’端标记有FAM荧光报告基团、其3’端标记有MGB荧光淬灭基团，所述HTLV2探针的5’端标记有ROX荧光报告基团、其3’端标记有BHQ荧光淬灭基团。
实施例
实施例1：pSE380-HTLV1+HTLV2标准品质粒的构建
1.1 合成基因获得pSE380-HTLV1质粒
合成HTLV1基因片段序列如SEQ ID NO:7所示：
SEQ ID NO:7 CTGCAGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAATTGGCGCAGTATGCTGCCCAGAACAGACGAGGCCTTGATCTCCTGTTCTGGGAGCAAGGAGGATTATGCAAAGCATTACAAGAACAGTGCCGTTTTCCGAAGCTT
将上述合成的HTLV1基因片段序列经过限制性内切酶的酶切和连接酶的连接插入到pSE380质粒的Pst I/Hind III位点之间，获得pSE380-HTLV1质粒。
1.2 合成HTLV2基因，获得pSE380-HTLV1+HTLV2标准品质粒
合成HTLV2基因片段序列如SEQ ID NO:8所示：
SEQ ID NO:8
GTGCCGTTTTCCGAAGCTAGCCTTCTCTTCGAGGTTGACAAAGATATCTCCCACCTTACCCAGGCCATAGTCAAAAATCATCAAAACATCCTCCGGGTTGCAAGCTTGGCTGTTTTGGC
将上述合成的HTLV2基因片段经过限制性内切酶的酶切和连接酶的连接插入到pSE380-HTLV1质粒的Hind III位点之间获得pSE380-HTLV1+ HTLV2标准品质粒。在所述pSE380-HTLV1+ HTLV2标准品质粒中插入的片段序列如SEQ ID NO:9所示：
SEQ ID NO:9
CTGCAGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAATTGGCGCAGTATGCTGCCCAGAACAGACGAGGCCTTGATCTCCTGTTCTGGGAGCAAGGAGGATTATGCAAAGCATTACAAGAACAGTGCCGTTTTCCGAAGCTAGCCTTCTCTTCGAGGTTGACAAAGATATCTCCCACCTTACCCAGGCCATAGTCAAAAATCATCAAAACATCCTCCGGGTTGCAAGCTT
1.3 制备含有pSE380-HTLV1+ HTLV2质粒的DH5α转化菌株
用pSE380-HTLV1+ HTLV2质粒转化DH5α菌株, 转化液涂布LB Amp抗性平板，37℃培养16小时以上，获得含质粒的菌株。挑几个单菌落，制作甘油菌保，-80℃保存。
1.4 重组质粒的菌液进行测序验证插入序列的正确性。
实施例2：HTLV-1和HTLV-2双重检测引物探针的合成及反应性能检测
2.1 引物探针的合成
比对分析HTLV1、HTLV2基因以及pSE380质粒载体的序列，利用引物设计工具(http://primerexplorer.jp/e/)设计合成几组引物，使用Blast对引物对比对分析并经实验验证后，最终选取具有较高种属特异性且能使扩增产物被有效区分的引物对：它们分别是HTLV1引物对和HTLV2引物对，其序列分别如SEQ ID NO:1-2、4-5所示；此外为确定假病毒的滴度，还针对表达载体上的假病毒成熟蛋白片段设计了扩增所述假病毒成熟蛋白片段的引物对，分别是M-F和M-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:10和11所示。在所选的引物上下游之间按照探针设计原则分别设计了三条探针，其序列分别如SEQ ID NO:3、6和12所示。本申请所用到的引物和探针的具体序列见表1。
本申请的引物和探针均由上海英骏公司合成。用无RNA酶的水稀释成10μmol/L, -20℃保存。
2.2 引物探针反应性能检测以pSE380+标准品质粒为模板，分别加入引物对+探针，验证HTLV-1与HTLV-2引物与探针的双重反应性能。其中使用的质粒模板的粒子浓度分别为106、105、104、103、102拷贝/µl；2µl/体系。使用的扩增引物分别如表1中的SEQ ID NO:1-2和SEQ ID NO:4-5所示，使用的检测探针分别如表1中的SEQ ID NO:3和12所示。使用试剂Premix Ex Taq (Probe qPCR) (Takara Code RR390)，配制PCR反应体系如表2所示：
表2
。
PCR扩增程序为：95℃、30秒；95℃、5秒，60℃、34秒，40个循环。
图1中，第四个分别为2x1000拷贝pSE380标准品质粒。其中编号为“(1)、(2)、(3)、(4)、(5)”的一组曲线为用FAM标记的HTLV1扩增结果；编号为“1、2、3、4、5”的一组曲线为用HEX标记的HTLV2扩增结果。
由图1中的实验结果可知，利用FAM(HTLV1-P)/HEX(HTLV2-P2)双探针混合同时检测HTLV1和HTLV2时，各靶点基线不平。判断：两个探针之间相互干扰。
于是重新设计针对HTLV2的探针，得HTLV2-P1，其序列如表1中的SEQ ID NO:6所示，其5’端采用ROX荧光标记。将pSE380-HTLV1+ HTLV2标准品质粒稀释至1000拷贝/μl作为模板，分别加入引物对+探针，采用双重混合检测引物探针的性能，同样使用试剂Premix ExTaq (Probe qPCR) (Takara Code RR390)，配置PCR反应体系如表3所示：
表3
。
PCR扩增程序为：95℃、30秒；95℃、5秒，60℃、34秒，40个循环。按照表3反应体系的双重混合检测实验结果如图2所示。
图2结果显示表3中的两组引物探针的扩增曲线光滑、检出Ct值可接受，两种标记扩增曲线无叠加，反应性能较好，可以使用。
实施例3：pSE380-HTLV1+HTLV2质粒包装获得MS2噬菌体假病毒，制备假病毒颗粒
菌株划线LB Amp抗性平板获得单菌落，挑单菌落在LB液体培养基中培养，并在对数生长期用IPTG诱导培养，从而表达出假病毒颗粒。
诱导培养后的菌液，离心收集后，做假病毒颗粒的回收纯化，得到相对纯净的假病毒。
实施例4：假病毒颗粒RNA的提取，定量检测假病毒颗粒的滴度、纯度
4.1 假病毒颗粒RNA的提取
假病毒颗粒原液，稀释100倍，取5μl，以无DNase无RNase的水补足体积至200μl，用takara病毒提取试剂盒TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0提取假病毒RNA，获得假病毒RNA的体积是50μl。
4.2 假病毒颗粒定量检测体系
假病毒粒子的定量，使用表达载体上假病毒成熟蛋白片段上的引物，采用SYBRGreen I方法检测；以假病毒表达载体质粒DNA作为标准品。
4.2.1 设计一对SYBR Green染料法定量PCR引物
序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示：
SEQ ID NO:10：M-F：TGTCGACTGGCTCCTACCTGTA
SEQ ID NO:11：M-R：CGTCAACGCTTATGATGGACTCAC
4.2.2 取2μl假病毒RNA做逆转录，并定量PCR检测，反应体系如下：
(1)RNA样品中gDNA去除反应(Takara Code RR047)，反应体系如表4所示。
表4
。
在42℃反应2分钟。
说明：DNA残留检测反应时，不做gDNA去除，即不加gDNAEraser，以水替代；也不做RT反应，即不加PrimeScript RT Enzyme Mix I，以水替代。 (2)RT反应(Takara CodeRR047)，反应体系如表5所示。
表5
。
表5中的反应体系在42℃反应15min，然后在95℃反应5秒。
(3)PCR反应(Takara Code RR820)，反应体系如表6所示。
表6
。
PCR扩增程序为：95℃、30秒；95℃、5秒，60℃、34秒，40个循环。
4.3 定量检测假病毒颗粒的滴度、纯度
4.3.1 假病毒颗粒的滴度检测以及假病毒中残留质粒DNA的检测
分别进行(1)假病毒RNA检测反应、(2)假病毒中残留质粒DNA检测反应、(3)对照质粒检测反应、及(4)阴性对照反应。残留质粒DNA检测反应，加入未经gDNA Eraser处理、且未进行逆转录反应的假病毒RNA做模板；DNA对照反应(即阳性对照)，加入pSE380-HTLV1+HTLV2质粒(1000拷贝/μl)做模板；阴性反应加水作为模板；每个反应均做平行双重复。具体反应体系如表7所示：
表7
注：gErasher是Takara试剂RR047中，用于去除DNA残留的试剂；具体请参考说明书。不添加gErasher、不添加反转录酶的体系，可以认为检测到的主要是残留DNA的污染。
处理完模板样品后，按照表6所示PCR反应体系准备PCR反应，扩增模板如表7所示方法进行处理；PCR扩增程序为：95℃、30秒；95℃、5秒，60℃、34秒，40个循环。
扩增结果如图3所示。扩增结果显示：
(1)号反应(红色扩增曲线)：为假病毒RNA检测反应，其模板为提取的假病毒RNA经gDNA Eraser+处理，并经逆转录反应后所得的DNA；Ct值约12；
(2)号反应(蓝色扩增曲线)，为假病毒中残留质粒DNA检测反应，其模板为直接提取的假病毒RNA；Ct值约26；
(3)号反应(紫色扩增曲线)，为对照质粒检测反应，其模板为pSE380-HTLV1+HTLV2质粒(1000拷贝/μl)；Ct值约26.5；
(4)号反应(粉色扩增曲线)，阴性对照，以无DNase和RNase的水为模板；无扩增。
1号反应与2号反应Ct差值约14圈，说明假病毒中质粒DNA残留约在1/10000。
1号反应与3号反应Ct差值约14.5圈，则说明1号反应模板拷贝数是3号反应的10000倍以上，3号反应(体系中)加入模板DNA拷贝数为2000拷贝。据此可大致计算假病毒原液的滴度。计算如下：
假病毒原液滴度 = 2000(拷贝/2μl)×20000(ct差值约14.5，模板拷贝数差值大于20000倍)
×10(2μl RNA逆转录获得20μl cDNA，取2μl cDNA做PCR模板。差值10倍)
×10(5μl稀释后假病毒提取RNA，获得50μl RNA。差值10倍)
×100(假病毒原液稀释100倍后，提取RNA。)
定量体系中，假病毒拷贝数为4x107拷贝数/2μl, 即2x107拷贝/μl；从病毒原液到定量体系，稀释了104倍；计算可得假病毒原液每µl滴度，约2x1011拷贝/µl。
4.3.2 假病毒颗粒的纯度定量检测结果
假病毒纯化过程，经过体系优化，最终检测数据表明，DNA污染水平在1.6万分之一。符合要求。
实施例5：假病毒颗粒的精确滴度测定
在实施例4对假病毒滴度有了初步估计数值的基础上，为了更准确地测定所制备的假病毒原液的滴度，特进行了下述精确滴度测定实验。
5.1 假病毒颗粒RNA的提取
假病毒颗粒原液，以SM缓冲液稀释至1/10000；取5μl，以无DNase无RNase的水补足体积至200μl；用takara病毒提取试剂盒TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA ExtractionKit Ver.5.0提取假病毒RNA，获得假病毒RNA的体积是50μl。
5.2 标准品制备及假病毒颗粒RNA的精确定量
5.2.1 标准品制备
以构建的质粒标准品pSE380_STD为模板，梯度稀释成107, 106, 105, 104, 103拷贝/μl。
5.2.2 假病毒颗粒RNA精确定量检测体系
假病毒粒子的定量，使用表达载体上假病毒成熟蛋白片段上的引物，采用SYBRGreen I方法检测。
5.2.2.1 采用前述设计的SYBR Green染料法定量PCR引物
序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示。
5.2.2.2 取2μl假病毒RNA做逆转录，并定量PCR检测，反应体系如下：
(1) RNA样品中gDNA去除反应(Takara Code RR047)，反应体系如表8所示。
表8
。
在42℃反应2分钟。
注：在质粒标准品实验中，用dH2O替代gDNA Eraser。 (2)RT反应(Takara CodeRR047)，反应体系如表9所示。
表9
。
表9中的反应体系在42℃反应15min，然后在95℃反应5秒。
(3)PCR反应(Takara Code RR820)，反应体系如表10所示。
表10
。
PCR扩增程序为：95℃、30秒；95℃、5秒，60℃、34秒，40个循环。
扩增结果如图4所示。图4中，采用的扩增引物为M-F和M-R。扩增模板为构建的质粒标准品pSE380_STD(被梯度稀释的)及假病毒原液RNA逆转录所得的cDNA。标准品各梯度及假病毒原液样品各设置两个平行。扩增曲线，自左至右：红(1)、黄(2)、紫(3)、浅绿(4)、绿(5)、蓝(6)，依次对应假病毒滴度为1*107拷贝/μl、1*106拷贝/μl、假病毒原液、1*105拷贝/μl、1*104拷贝/μl、1*103拷贝/μl。
因病毒稀释液(x10000)，经RNA提取(5 μl至50 μl，x10)，与RT-qPCR(2 μl至20μl,10x)后，病毒原液稀释了106倍；根据标准曲线，计算得假病毒原液病毒滴度约为2.58 x1011拷贝/μl(平均值)。
实施例6：HTLV-1/HTLV-2双重定量RT-PCR检测方法的灵敏度评价
假病毒颗粒原液起始滴度为2x1011拷贝/μl，稀释假病毒滴度至100000、10000、1000、100、10拷贝/μl。分别提取假病毒RNA，评估HTLV-1/HTLV-2双重定量RT-PCR检测方法的灵敏度。结果如图5和图6所示。图5是双重扩增体系中，HTLV1对应的FAM通道检测结果；图6是双重扩增体系中，HTLV2对应的ROX通道检测结果。
图5和图6的结果显示各梯度之间线性关系良好。假病毒颗粒浓度为10拷贝/μl时，无扩增曲线，故该方法的检测灵敏度在个位数拷贝。
实施例7：双探针定量PCR反应体系：RR064 (One Step PrimeScriptRT-PCR Kit )
表11
。
PCR扩增程序为：42℃、5min；95℃、10秒；95℃、5秒，60℃、34秒，40个循环。
HTLV在全世界广泛分布，我国HTLV感染流行主要集中于福建、广东、浙江3省，这与沿海地区人口与日本商人渔民之间有较多密切接触有关/>。近年来，中国经济飞速发展带来国内外人口大流动，HTLV在我国的流行趋势可因此发生变化。
核酸检测作为免疫学确证实验的补充方法，其检测快速、准确，可对病毒载量进行定量检测，对感染者的治疗和预后十分重要。相较于国内许多实验室建立的定量检测HTLV-1的实时荧光PCR检测体系，本研究成功设计了HTLV-1、HTLV-2两组探针引物，可进行双重定量检测HTLV-1、HTLV-2两种亚型，且该检测方法灵敏度较高，灵敏度在个位数拷贝，特异性好、可重复、试剂成本低，并且使用方便、操作简单、检测结果可靠，为患者的诊断和治疗争取了宝贵的时间，为我国HTLV筛查提供了技术支持。
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Claims (10)
1.一组用于同步检测HTLV-1与HTLV-2的双重定量RT-PCR的核酸组合物，其特征是，所述核酸组合物为HTLV-1引物对、HTLV-2引物对、HTLV-1探针和HTLV-2探针；
所述HTLV-1引物对为HTLV-1正向引物和HTLV-1反向引物，HTLV-1正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，HTLV-1反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述HTLV-2引物对为HTLV-2正向引物和HTLV-2反向引物，HTLV-2正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，HTLV-2反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述HTLV-1探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述HTLV-2探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
2.一种包括如权利要求1所述核酸组合物的同步检测HTLV-1与HTLV-2的双重定量RT-PCR试剂盒。
3.根据权利要求2所述的同步检测HTLV-1与HTLV-2的双重定量RT-PCR试剂盒，其特征是，所述试剂盒还包括2X RT-PCR试剂、Taq酶、逆转录酶、阳性对照和无DNase无RNase的水。
4.根据权利要求2或3所述的同步检测HTLV-1与HTLV-2的双重定量RT-PCR试剂盒，其特征是，所述引物的浓度分别为20μM。
5.根据权利要求4所述的同步检测HTLV-1与HTLV-2的双重定量RT-PCR试剂盒，其特征是，所述引物的浓度分别为10μM。
6.根据权利要求2或3所述的同步检测HTLV-1与HTLV-2的双重定量RT-PCR试剂盒，其特征是，所述探针的浓度分别为10μM。
7.根据权利要求6所述的同步检测HTLV-1与HTLV-2的双重定量RT-PCR试剂盒，其特征是，所述探针的浓度分别为5μM。
8.根据权利要求3所述的定量同步检测HTLV-1与HTLV-2的双重定量RT-PCR试剂盒，其特征是，所述阳性对照为含有如SEQ ID NO:9所示的多核苷酸序列的质粒。
9.一种使用如权利要求2所述试剂盒的同步检测HTLV-1与HTLV-2双重定量RT-PCR的非诊断目的的方法，其特征是，包括以下步骤：
A、提取待检样品的RNA；
B、使用试剂盒中试剂将待检样品的RNA进行逆转录和荧光PCR扩增反应；此步中的逆转录和PCR扩增反应在一个反应体系中进行；
C、设立阳性对照和阴性对照，将阳性对照和阴性对照分别进行荧光PCR扩增反应；
D、根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集待检样品RNA的荧光曲线形态和Ct值判定结果。
10.根据权利要求9所述的同步检测HTLV-1与HTLV-2双重定量RT-PCR的非诊断目的的方法，其特征是，所述步骤B中，荧光PCR的反应参数为42℃ 5min；95℃ 10s，1个循环；95℃5s，60℃ 34s，40个循环。
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| CN116790823A (zh) | 2023-09-22 |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Dong Lei Inventor after: Li Reyi Inventor after: Quan Shouzhen Inventor after: Ma Yueyun Inventor after: Liang Pei Inventor after: Huang Yue Inventor after: Li Ying Inventor after: Gong Bei Inventor after: Ping Xue Inventor before: Dong Lei Inventor before: Ma Yueyun Inventor before: Li Reyi Inventor before: Quan Shouzhen Inventor before: Liang Pei Inventor before: Huang Yue Inventor before: Li Ying Inventor before: Gong Bei Inventor before: Ping Xue |
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| CB03 | Change of inventor or designer information |