CN117363798A - 一种同时检测三种毒株的试剂盒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种同时检测三种毒株的试剂盒和应用，用于同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒北美型毒株、HP‑PRRSV毒株和NADC30‑1ike毒株，包括三个引物对和探针；检测猪繁殖与呼吸综合征病毒北美型毒株的引物对为SEQ ID NO.1、4，探针为SEQ ID NO.7；检测HP‑PRRSV毒株的引物对为SEQ ID NO.2、5，探针为SEQ ID NO.8；检测NADC30‑1ike毒株的引物对和探针，包括SEQ ID NO.18、22和SEQ ID NO.26以及SEQ ID NO.19、23和SEQ ID NO.27；本发明同时鉴别三种毒株，其灵敏度高，特异性好，重复性好。

Description

一种同时检测三种毒株的试剂盒和应用

技术领域

本发明属于病毒分子生物学检测技术领域，具体涉及一种同时检测三种毒株的试剂盒和应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍、仔猪和育成猪呼吸道症状及高死亡率为主要特征的一种传染病。PRRSV可分为基因1型和基因2型，我国的流行毒株主要为基因2型。对分离到的PRRSV进行遗传进化分析发现，该病毒与美国分离的以NADC30为代表的2型PRRSV毒株有高度的核苷酸同源性。因此，该病毒在中国被命名为类NADC30-PRRSV。与上述经典PRRSV和HP-PRRSV相比，类NADC30-PRRSV的毒力相对较弱，但与其他病毒株重组导致高致病性PRRSV(如JL150)将严重危及当地养猪业。另外在接种过疫苗的猪群中爆发类NADC30 PRRSV表明，目前的疫苗不能对类NADC30感染提供的完全保护，并不能对变异毒株产生交叉保护，所以需要进行鉴别诊断，做出不同应对策略。

临床上，PRRSV的检测方法主要有细胞传代法、RT-PCR技术、荧光抗体检测法、酶联免疫吸附试验、微量血清中和试验等。常规检测方法普遍存在费时费力、灵敏度低或者检测成本高等缺点。而且大部分检测方法并不能有效地鉴别不同毒株。

CN110885900A公开了一种用于鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株和NADC30样株的冻干微芯片、试剂盒及其方法，但是其制作工艺复杂，成本较高。

CN109762932A提供一种用于鉴别HP-PRRSV和NADC30-like毒株的检测引物和探针，提供HP-PRRSV和NADC30-like毒株的检测试剂盒及检测方法，其只能鉴别HP-PRRSV和NADC30-like毒株，不能同时诊断待测样本是否为蓝耳经典株，增加额外的检测成本。

CN108611439A根据经典型毒株、高致病型毒株与NADC30-like型毒株NSP2基因组差异，设计了鉴别检测用引物，建立了区分PRRSV三种毒株的PCR鉴别检测用方法并组装了试剂盒，其需要利用PCR扩增产物进行跑胶，根据条带大小鉴别三种毒株。该方法操作繁琐、检测时间长、有非特异性扩增并且存在污染的风险。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种同时检测三种毒株的试剂盒和应用，同时鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒北美型毒株、HP-PRRSV毒株和NADC30-1ike毒株，其灵敏度高，特异性好，重复性好。

本发明实施例提供一种同时检测三种毒株的试剂盒，用于同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒北美型毒株、HP-PRRSV毒株和NADC30-1ike毒株，包括三个引物对和探针；

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒北美型毒株的引物对为SEQ ID NO.1、4，探针为SEQID NO.7；

检测HP-PRRSV毒株的引物对为SEQ ID NO.2、5，探针为SEQ ID NO.8；

检测NADC30-1ike毒株的引物对和探针，包括引物对和探针1，即SEQ ID NO.18、22和SEQ ID NO.26，引物对和探针2，即SEQ ID NO.19、23和SEQ ID NO.27。

优选的，还包括PCR反应液。

优选的，检测猪繁殖与呼吸综合征病毒北美型毒株的探针的5’端标记有FAM报告荧光基团，3’端标记有BQ1淬灭荧光基团。

优选的，检测HP-PRRSV毒株的探针的5’端标记有HEX报告荧光基团，3’端标记有SQ1淬灭荧光基团。

优选的，检测NADC30-1ike毒株的探针的5’端标记有ROX报告荧光基团，3’端标记有SQ1淬灭荧光基团。

优选的，所述PCR反应液包括Mg²⁺和dNTP。

本发明提供一种所述的同时检测三种毒株的试剂盒的应用，所述试剂盒用于制备检测同时检测三种毒株的试剂盒。

本发明的有益效果是，本发明根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株、HP-PRRSV毒株和NADC30-1ike毒株的基因序列设计了4对特异性引物，通过对荧光定量RT-PCR反应条件进行相应的优化，具有较好的重复性、灵敏性和特异性，可以分别用于猪繁殖与呼吸综合征病毒HP-PRRSV毒株和NADC30-1ike毒株的检测,特别是对PRRSV感染的早期快速检测及其对猪源原材料等是否污染HP-PRRSV毒株和NADC30-1ike毒株的快速监测。

本发明采用探针法荧光定量RT-PCR方法，其假阳性率低于SVBR Green染料法，检测结果更加准确，与普通荧光定量RT-PCR检测方法相比，本发明具有特异性高、灵敏性高、重复性好等优点，扩增与检测一步完成，操作省时简单。

附图说明

图1为蓝耳北美型引物和探针筛选。

图2为蓝耳高致病性引物和探针筛选。

图3为蓝耳类NADC30引物和探针筛选。

图4为PCR反应液优化前后对比。

具体实施方式

实施例1

1.材料

仪器和试剂：荧光定量PCR仪，上海宏石公司；台式高速离心机，上海生工公司；全自动核酸提取仪，武汉济凡公司；磁珠法病毒核酸提取试剂盒，湖南国测公司。

2.方法

(1)引物探针设计与筛选

在NCBI网站上通过Blast分析查找PRRSV北美经典毒株、HP-PRRSV毒株和NADC30-1ike毒株的基因组序列，经过DNAman和MEGA7等软件序列比对，利用01igo7软件在PRRSVnsp2的高变区设计多组引物和探针，引物探针详细信息见表1，由上海通用生物技术有限公司合成。

分别对所述多组引物和探针进行扩增，筛选扩增效率、探针信噪比以及扩增曲线形态为最佳的组合，作为所述反应液的引物与探针。最终选取了一对扩增NA-PRRSV N基因高保守区域的特异性引物和探针(NA-PRRSV-F1、NA-PRRSV-R1、NA-PRRSV-P1)，扩增HP-PRRSV nsp2高变区的特异性引物和探针(HP-PRRSV-F2、HP-PRRSV-R1和HP-PRRSV-P2)，2对扩增NADC30-1ike毒株nsp2缺失区域的特异性引物和探针(NADC30-F1、NADC30-R1、NADC30-P1和NADC30-F2、NADC30-R2、NADC30-P2)。

表1引物与探针

(2)样本的制备

取本实验室猪病检测室所提供的各猪场送检感染猪蓝耳病样本，送检样本包括肺部组织块与血清，所有样本均保证冷链运输。样本送到后妥善保管，针对肺脏组织，裁剪后放入2mL EP管中，加入3粒研磨专用钢珠，使用液氮冷冻研磨机进行研磨后离心收上清。所有血清及组织液使用湖南国测生物技术有限公司的全自动核酸提取仪提取总RNA，确定RNA纯度浓度是否合格之后，使用北京康润诚业生物科技有限公司的StarScript II First-strand cDNA Synthesis Mix试剂盒进行反转录实验，得到cDNA后使用检测蓝耳病通用基因的引物进行PCR扩增后测序，通过反馈基因序列与NCBI数据库进行比对，以区分PRRSV经典毒株、HP-PRRSV毒株和NADC30-1ike毒株样本，保存样本毒株以备用。

(3)pMD18-T-nsp2标准品的制备

将含有PRRSV经典毒株、HP-PRRSV毒株的nsp2HV区和NADC30-1ike的nsp2缺区域的阳性扩增产物依次克隆入pMD18-T载体中，筛选阳性重组质粒pMD18-T-N和pMD18-T-nsp2送上海生工生物科技有限公司，采用T7引物进行测序。应用分光光度计对测序正确的pMD18-T-N和pMD18-T-nsp2质粒测定其OD260，重复5次，参考质粒DNA拷贝数计算方法，计算质粒的浓度为8.61×10⁸拷贝/μL，并定量稀释至5.0×10¹～5.0×10⁸拷贝/μL，-20℃保存备用。

(4)鉴别猪繁殖与呼吸综合征病寿HP-PRRSV毒株和NADC30-1ike毒株的荧光定量RT-PCR反应条件的优化

选择步骤(3)中终浓度为5.0×10⁶～5.0×10²拷贝/μL的重组质粒作为检测模板，引物探针稀释用TE缓冲液，将探针干粉溶解，并按照每管OD值稀释至10μmol/L，备用；用TE缓冲液液将引物干粉溶解，并按照每管OD值稀释至20μmol/L，备用。应用荧光定量PCR仪(上海宏石公司)采用矩阵法(表2)筛选不同浓度的引物和探针组合，筛选出针对PRRSV经典毒株、HP-PRRSV和NADC30-1ike毒株最佳引物浓度、探针浓度和最佳反应条件。

表2引物与探针添加量分组

按照实时荧光PCR方法，体系中dNTP与Mg²⁺浓度配比添加量按照表3设置“棋盘”试验。扩增时加入10μl待检模板，用DEPC处理水补足体系至50μl，比较不同dNTP与Mg²⁺浓度配比PCR扩增的Ct值。

表3体系中dNTP与Mg2+浓度配比分组

(5)结果判定

FAM通道Ct值≤35且扩增曲线为典型的S型，判定为蓝耳经典株阳性；当FAM通道判定为阳性时，HEX通道Ct值≤35且具有典型扩增曲线，则判定为高致病性变异株核酸阳性；当FAM通道判定为阳性时，ROX通道Ct值≤35且具有典型扩增曲线，则判定为类NADC30毒株核酸阳性；当35＜Ct值≤40或没有呈典型的S型时，需复检，若复测35＜Ct值≤40，相应的判定为阳性；若复测Ct值＞40或无Ct值，判定为阴性。

3.结果

(1)引物和探针组合筛选结果

选择步骤(3)中终浓度为5.0×10⁶～5.0×10²拷贝/μL的重组质粒作为检测模板，分别对多组引物探针进行扩增比较试验，从引物扩增效率、探针信噪比与扩增曲线形态等指标等方面进行验证。

蓝耳北美型引物和探针筛选结果：将正向引物与反向引物和探针进行正交试验，选出三种引物探针组合，通过比较三种组合扩增样本的ct值和荧光背景值，优选出NA-PRRSV-F1、NA-PRRSV-R1、NA-PRRSV-P1，结果见图1。

蓝耳高致病性引物和探针筛选结果：将正向引物与反向引物和探针进行正交试验，选出三种引物探针组合，通过比较三种组合扩增样本的ct值和荧光背景值，优选出HP-PRRSV-F2、HP-PRRSV-R1和HP-PRRSV-P2，结果见图2。

蓝耳类NADC30引物和探针筛选结果：将正向引物与反向引物和探针进行正交试验，选出三种引物探针组合，通过比较三种组合扩增样本的ct值和荧光背景值，优选出NADC30-F1、NADC30-R1、NADC30-P1和NADC30-F2、NADC30-R2、NADC30-P2，结果见图3。

最终选取了一对扩增NA-PRRSV N基因高保守区域的特异性引物和探针(NA-PRRSV-F1、NA-PRRSV-R1、NA-PRRSV-P1)，扩增HP-PRRSV nsp2高变区的特异性引物和探针(HP-PRRSV-F2、HP-PRRSV-R1和HP-PRRSV-P2)，2对扩增NADC30-1ike毒株nsp2缺失区域的特异性引物和探针(NADC30-F1、NADC30-R1、NADC30-P1和NADC30-F2、NADC30-R2、NADC30-P2)。将筛出的4对引物探针组合，进行三联检测试。

(2)PCR反应液主要成份工作浓度的优化

反应体系中PCR反应液配制主要包括目标引物(如上)、目标荧光探针(如上)、Mg²⁺、dNTP等。通过对反应液目标引物和探针组合不同浓度配比、Mg²⁺与dNTP不同浓度配比，比较对PCR的Ct值以及曲线形态的影响，确定各组分的最佳浓度配比为：体系中上下游引物(20μmol/L)各添加0.75～1.0μl，终浓度为300～400nmol/L，荧光探针(10μmol/L)添加0.25～0.5μl，终浓度为50～100nmol/L，整个反应体系扩增较好，曲线典型；Mg²⁺终浓度为4mmol/L，dNTP终浓度为0.3mmol/L。同时，以最佳浓度配比的各组分组合PCR反应液，最佳反应条件：1个循环反转录50℃，15min；1个循环CDNA预变性95℃，1min；45个循环95℃，15sec；60℃，30sec，于60℃进行荧光信号采集。探针检测模式设置为：所有检测孔均设置为FAM、HEV和ROX荧光三通道模式。并进行无模板检验、敏感性检验、特异性检验，结果PCR反应液无模板检验无扩增信号，敏感性高，特异性好，结果见图4。

(1)灵敏度试验

将步骤(3)获得的5×10¹～5×10⁴拷贝/μL的倍比稀释质粒为模板，应用优化后的反应体系和条件进行检测，蓝耳经典株引物对检测的灵敏度实验见表4，HP-PRRSV毒株引物对检测的灵敏度实验见表5，NADC30-1ike毒株引物对检测的灵敏度实验见表6。结果证实本试剂盒检测灵敏度为：10拷贝/μL。

表4蓝耳经典株敏感性测试结果

表5 HP-PRRSV毒株敏感性测试结果

表6 HP-PRRSV毒株敏感性测试结果

(2)特异性试验

将NA-PRRSV、HP-PRRSV、NADC30-1ike、PCV2、PRV、PEDV、TGEV和CSFV样本提取的病毒核酸进行荧光定量RT-PCR反应，同时设立阴性对照，利用上述的最佳反应体系及其程序进行反应。检测结果如表7所示，FAM荧光通道显示只有NA-PRRSV具有相应的Ct值，其他病毒毒株均为阴性；而HEX荧光通道显示只有HP-PRRSV具有相应的Ct值，其他病毒毒株均为阴性；ROX荧光通道显示只有NADC30-1ike具有相应的Ct值。因此，此结果证明建立的鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒NA-PRRSV、HP-PRRSV毒株和NADC30-1ike毒株的荧光定量RT-PCR检测方法特异性较好。

表7特异性测试结果

(3)重复性试验

根据己经优化好的反应条件，对同一样品提取病毒RNA进行荧光定量RT-PCR反应。结果如表8所示，选取同一模板重复进行4次荧光定量RT-PCR反应，结果表明NA-PRRSV毒株的所有样品的Ct值介于23.85～23.95之间，最大Ct值相差0.15；HP-PRRSV毒株的所有样品的Ct值介于26.36～26.51之间，最大Ct值相差0.15；NADC30-1ike毒株的所有样品的Ct值介于27.51～27.80之间，最大Ct值相差0.29，表明检测样品结果的重复性好。

表8试剂盒重复性

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本申请的保护范围限于这些例子；在本申请的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本申请中一个或多个实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本申请中一个或多个实施例旨在涵盖落入本申请的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本申请中一个或多个实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种同时检测三种毒株的试剂盒，其特征是，用于同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒北美型毒株、HP-PRRSV毒株和NADC30-1ike毒株，包括三个引物对和探针；

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒北美型毒株的引物对为SEQ ID NO.1、4，探针为SEQ IDNO.7；

检测HP-PRRSV毒株的引物对为SEQ ID NO.2、5，探针为SEQ ID NO.8；

检测NADC30-1ike毒株的引物对和探针，包括引物对和探针1，即SEQ ID NO.18、22和SEQ ID NO.26，引物对和探针2，即SEQ ID NO.19、23和SEQ ID NO.27。

2.如权利要求1所述的同时检测三种毒株的试剂盒，其特征是，还包括PCR反应液。

3.如权利要求1所述的同时检测三种毒株的试剂盒，其特征是，检测猪繁殖与呼吸综合征病毒北美型毒株的探针的5’端标记有FAM报告荧光基团，3’端标记有BQ1淬灭荧光基团。

4.如权利要求1所述的同时检测三种毒株的试剂盒，其特征是，检测HP-PRRSV毒株的探针的5’端标记有HEX报告荧光基团，3’端标记有SQ1淬灭荧光基团。

5.如权利要求1所述的同时检测三种毒株的试剂盒，其特征是，检测NADC30-1ike毒株的探针的5’端标记有ROX报告荧光基团，3’端标记有SQ1淬灭荧光基团。

6.如权利要求2所述的同时检测三种毒株的试剂盒，其特征是，所述PCR反应液包括Mg²⁺和dNTP。

7.一种如权利要求1-6任一项所述的同时检测三种毒株的试剂盒的应用，其特征是，所述试剂盒用于制备检测同时检测三种毒株的试剂盒。