CN111621605A - 新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸恒温荧光检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型冠状病毒(2019‑nCoV)核酸恒温荧光检测试剂盒，包括特异性引物2019‑nCoV‑1ab‑F和2019‑nCoV‑1ab‑R，以及探针2019‑nCoV‑1ab‑P，用THF残基，[FAM‑dT]荧光团和[BHQ1‑dT]淬灭团取代靶标扩增子序列内的碱基，并在探针3’端标记[C3‑Spacer]作为阻断基团，试剂中的核酸外切酶可在THF位点裂解探针，从而分离荧光基团和淬灭基团并产生荧光信号。本发明提供的试剂盒可在20min内实现新型冠状病毒的检测，特异性为100％，检测敏感性为10copies/μl。因此，本发明的试剂盒具有操作简单、快速、灵敏的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型冠状病毒恒温荧光检测法，具体地说，涉及一种新型 冠状病毒(2019-nCoV)核酸恒温荧光检测试剂盒检测方法的建立及应用方法， 属于生物工程技术领域。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)是由冠状病毒2019-nCoV引起的人的一种传染病，主要症状为发热、乏力、咳嗽、呼吸不畅， 在较严重病例中，可导致严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。主要传播方 式为飞沫传播和接触传播，任何年龄段均易感。现已将该病纳入《中华人民共和 国传染病防治法》规定的乙类传染病，并采取甲类传染病的预防、控制措施。 自2019年12月中旬至2020年5月，新型冠状病毒肺炎疫情已波及200多个国 家和地区，全球累计确诊病例379万，累计死亡病例超26万，严重威胁全人类 的生命健康，给全球经济带来巨大影响。由于尚无有效的疫苗防治，所以建立一 种快速、准确的检测方法就显得尤为重要。
重组酶介导链替换核酸扩增技术(Recombinase-aid Amplification，RAA)，是 一种恒温核酸快速扩增技术，利用从细菌或真菌中获得的重组酶，在常温下，该 重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA 上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模 板DNA的双链结构，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，扩增 产物以指数级增长。反应可在37～42℃下连续进行反应，反应时间只需5～20分 钟，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术，非常适用于临床快速诊断。
实时荧光RAA技术是RAA基础反应体系与荧光探针结合起来的一种联用 技术，通过在反应体系中加入一个核酸外切酶Ⅲ和荧光探针对模板扩增实现实时 监测。与实时定量PCR比较，两者具有相同的灵敏度与特异性，而Real-time RAA 检测过程明显缩短，荧光强度信号实时检测可由荧光信号检测器或扫描仪完成， 是目前RAA技术应用最为广泛的检测方法。
作为一种新型核酸等温扩增技术，RAA技术在国内外已经有大量的研究和 报道，具有敏感性强、特异性高、检测时间短的显著特点。Boyle等应用Real-time RAA检测结核分枝杆菌复合群(MTC)的DNA，可在20min内检测到低至6.25 fg的DNA模板，其准确性也远远大于荧光显微镜检测；Wahed等将RT-RAA技 术应用于手足口病病毒的快速诊断，在埃及2013年的手足口病爆发中，该技术 被成功应用于现场FMDV的快速检测和疫情控制；哈登楚日亚等利用Real-time RAA用于非洲猪瘟病毒的定性检测，可在39℃、20min内最低检测10个拷贝的 DNA分子。
基于此，本发明依据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》选取2019-nCoV 保守的ORF1ab基因作为靶基因，设计特异性引物及探针建立2019-nCoV特异 的荧光型RAA检测方法。本发明的新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸恒温荧光 检测试剂盒在整个检测过程中，从DNA提取到出现检测结果，则只需25min， 大大减少手工操作和缩短时间。且本发明一次可检测多个样品，特别适合于大批 样品的检测。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸恒温荧光检 测试剂盒，实现2019-nCoV的快速检测。本发明在检测2019-nCoV的整个过程 中，从DNA提取到出现检测结果，只需25min，大大缩短检测时间，提高检测 效率。
为实现上述目的，本发明提供一种新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸恒温荧 光检测试剂盒，具体步骤如下：
(1)参考公布的2019-nCoV的77个基因型参考毒株序列，筛选ORF 1ab 基因保守区域，设计特异性引物2019-nCoV-1ab-F和2019-nCoV-1ab-R，以及探 针2019-nCoV-1ab-P，用四氢呋喃(THF残基)，[FAM-dT]荧光团和[BHQ1-dT] 淬灭团取代靶标扩增子序列内的碱基，并在探针3’端标记[C3-Spacer]作为阻断基 团，其中特异性引物和探针序列如下：
2019-nCoV-1ab-F:5′-TTGAGTATTGCCCTATTTTCTTCATAACTG-3′；
2019-nCoV-1ab-R:5′-AACTCCTGTGTAGAAACTAAGTAATCATAA-3′；
2019-nCoV-1ab-P:5-TTACTTTGGCCTCTTTTGTTTACTCAACCGC[FAM-dT]A[T HF][BHQ1-dT]TTAGACTGACTCTTG[C3-Spacer]-3′。
(2)经过大量实验，优化反应条件，试剂最佳引物探针浓度为20μmol/L 2019-nCoV-1ab-F/2019-nCoV-1ab-R各1.5μL，20μmol/L ASFV-P 1μL，引物、探 针与反应所需的酶冻干制成荧光型干粉反应管。在荧光型干粉反应管中加入42.5 μL水解缓冲液，5μL阳性对照/阴性对照/待检核酸，在反应管盖上加2.5μL醋 酸镁，盖上管盖，瞬时离心，上下颠倒混匀，离心10秒，立即检测。反应程序 为：39℃30秒，40个循环，此处采集FAM荧光信号。
本发明提供的试剂盒能够用于检测新型冠状病毒核酸(2019-nCoV)，可以 用于疑似感染人员的咽拭子、血液或血清等样本中新型冠状病毒(2019-nCoV) 核酸的检测。
(3)灵敏度验证：将阳性对照质粒倍比稀释为10-1～10-6，按(2)中方法 进行检测，验证本试剂盒的灵敏度。
(4)特异性验证：按(2)中方法对牛冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、传染 性胃肠炎病毒、禽传染性支气管炎病毒、犬呼吸道型冠状病毒核酸进行检测，验 证本试剂盒的特异性。
本发明提供的试剂盒是恒温扩增反应，在39℃条件下即可实现靶基因的有 效扩增，可在20min内实现型冠状病毒(2019-nCoV)的检测，特异性为100％， 检测敏感性为10copies/μl。因此，本发明的试剂盒具有操作简单、快速、灵敏 的特点，为型冠状病毒(2019-nCoV)的快速检测筛查提供有效的技术手段。
附图说明
图1为第一次引物筛选示意图。
图2为第二次引物筛选示意图。
图3为第三次引物筛选示意图。
具体实施方式
以下对本发明做进一步的详细描述，所举实例只用于解释本发明，并非用 于限定本发明的范围。
实施例1一种新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸恒温荧光检测试剂盒引物 及探针的设计：
(1)靶基因的筛选
通过GenBank/NMDC/Genome Warehouse/GISAID四个基因序列数据库，共 下载截止到2020年2月2日所公布的全部的77株新型冠状病毒基因组序列。(见 表1)，应用DNASTARLasergene软件进行ORF 1ab基因序列保守性分析，同时 筛选GC含量在40％～60％、没有正向/反向重复序列、回文序列的保守区域作为 靶基因的候选区域。通过比对分析，选择新型冠状病毒毒株(GenBank登录号： MN908947)ORF 1ab基因的保守区域作为引物的设计区域，靶区域位于第 11500～11780核苷酸。
表1新型冠状病毒(2019-nCoV)参考毒株
(2)引物、探针的设计和初筛
RAA核酸扩增技术对于引物设计与常规PCR引物设计有一定的区别，RAA 荧光扩增扩增子的通常长度为100～200bp，探针的长度为46～52bp，不与特异 性引物识别位点重叠，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基；共 有四个修饰位点，距离5’端的≥35nt的中部位置标记一个四氢呋喃(THF)，作 为核酸外切酶的识别位点；THF位点的上游标记一个[FAM-dT]荧光团，下游标 记一个[BHQ1-dT]淬灭基闭，两个基团的间距为2-4nt；THF距离3’末端≥l5nt， 并且3′末端标记一个阻断基团[C3-spacer]。引物长度在30-35核苷酸(nt)之间， Tm值不作为设计时主要考虑因素，引物的5′端避免出现重复“G”，而3′端最好有“G”和“C”，GC含量在70％～30％。引物、探针应符合该要求，从而 达到完美配合，保证较短的产物在较短的时间内生成，达到较高的灵敏度，因此 引物的设计和选择是本研究总体扩增效率的关键因素。
为了筛选出能够以单分子灵敏度检测模板DNA，在选择的靶区域筛选引物， 上、下游引物和选择5个引物，从而产生25种可能的引物组合，通过矩阵法评 估和比较其引物对的相对性能，确定最佳引物组合(见表2)。
引物筛选示意图见图1-3。
第一次筛选：以不同的引物组合测试靶标序列的侧翼引物。
第二次筛选：将第一次筛选所得的最佳引物向前和向后以1个碱基的速度 移动其在模板上的位置而得到一系列引物，并以不同的引物组合进行测试。
第三次筛选：将第二次筛选所得的最佳引物从3′末端逐一增减碱基而得到一 系列引物，并以不同的引物组合进行测试。
表2第一次引物探针筛选位置
(3)引物的第二次筛选
修整步骤(2)中确定的最佳引物，保持所选引物的长度不变，以1个碱基 的速度向前或向后移动其在模板上的位置，直至达到之前被否决的引物，上、下 游引物各选择6个引物，从而产生25种可能的引物组合，通过矩阵法评估和比 较其引物对的相对性能，确定最佳位置的引物组合。
表3第二次引物探针筛选位置
(4)引物的第三次筛选
根据第二次筛选的结果，通过将所选引物的3′末端添加和去掉碱基来作进 一步改进，上、下游引物各选择5个引物，从而产生25种可能的引物组合，以 通过再次筛选这些引物来提高扩增性能。
表4第三次引物探针筛选位置
最终确定上游引物序列为F6-3，下游引物序列为R6-5，引物及探针分别标 记为2019-nCoV-1ab-F、2019-nCoV-1ab-R、2019-nCoV-1ab-P，标记后的引物探 针序列如下：
2019-nCoV-1ab-F:5′-TTGAGTATTGCCCTATTTTCTTCATAACTG-3′；
2019-nCoV-1ab-R:5′-AACTCCTGTGTAGAAACTAAGTAATCATAA-3′；
2019-nCoV-1ab-P:5-TTACTTTGGCCTCTTTTGTTTACTCAACCGC[FAM-dT]A[T HF][BHQ1-dT]TTAGACTGACTCTTG[C3-Spacer]-3′。
实施例2一种新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸恒温荧光检测试剂盒重组载 体的构建
人工合成NMDC上登录的2019-nCoV参考基因(登录号：NMDC60013002-05) ORF1ab基因全长，克隆到pUC57载体上作为阳性对照。
实施例3一种新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸恒温荧光检测试剂反应体 系的建立
将实施例2中构建的含有新型冠状病毒(2019-nCoV)ORF1ab靶基因片段 的pUC57-ORF1ab重组质粒作为模板进行恒温扩增反应。筛选多组引物探针组 合，最终将实施例1中描述的引物探针组合作为最佳组合。试验阶段反应体系为： 在荧光型干粉反应管中加入38.5μL水解缓冲液，加入20μmol/L 2019-nCoV-1ab-F/2019-nCoV-1ab-R各1.5μl，20μmol/L2019-nCoV-1ab-P 1μL， 然后加入5μL pUC57-ORF1ab质粒DNA作为模板，在反应管盖上加2.5μL醋酸 镁(280mM)启动反应，盖上盖子离心，上下颠倒混匀，离心10秒，立即检测。 反应程序为：39℃30秒40个循环，此处采集FAM荧光信号。
实施例4一种新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸恒温荧光检测试剂盒检测方 法的建立
(1)在实施例2的基础上，将所选引物和探针与酶混合制成冻干粉组成荧 光型干粉反应管。试剂盒的检测方法为在荧光型干粉反应管中加入42.5μL水解 缓冲液，5μL阳性对照/阴性对照/待检核酸(也即三种试剂各5μL)，在反应管 盖上加2.5μL醋酸镁(280mM)，盖上盖子离心，上下颠倒混匀，离心10秒， 立即检测。反应程序为：39℃30秒40个循环，此处采集FAM荧光信号。
(2)结果判定
①阳性对照有典型的扩增曲线出现，出峰时间≤15min(Ct值≤30)，阴性对 照：无扩增曲线出现，或出峰时间≥200min(Ct值≥40)，为有效结果；均成立为 有效结果；
②被检样本：
a.阳性：被检样本出峰时间≤17.5min(Ct值≤35)，有明显指数增长，判断 为阳性。
b.可疑：若17.5min<出峰时间<20min(35<Ct值<40)，判为可疑，需重复检 测进行确认；再次检测结果仍然是若出峰时间≤20min(Ct值≤40)，则判断为 阳性，否则为阴性。
c.阴性：若出峰时间≥20min(Ct值≥40)，判断为阴性；
实施例5本试剂盒灵敏度的验证
用紫外吸收法测重组质粒pUC57-ORF1ab的浓度，调整浓度至106copies/μl， 用ddH2O对阳性质粒进行10倍倍比稀释，稀释范围为10-1～10-6，分别作为模 板进行检测。按试剂盒的反应体系配制试剂和设置反应程序。结果显示，本试剂 盒的最低检出限为10copies/μl。
实施例5本试剂盒特异性的验证
提取牛冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、禽传染性支气 管炎病毒、犬呼吸道型冠状病毒核酸分别为模板进行恒温扩增检测，按试剂盒体 系配制试剂和设置反应程序。结果显示，检测结果均为阴性，本试剂盒特异性良 好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的 精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保 护范围之内。
Claims (4)
1.一种新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸恒温荧光检测试剂盒，包括特异性引物2019-nCoV-1ab-F和2019-nCoV-1ab-R，以及探针2019-nCoV-1ab-P，探针标记的报告荧光染料为FAM，标记的荧光淬灭基团为BHQ-1；其中特异性引物和探针序列如下：
2019-nCoV-1ab-F:5′-TTGAGTATTGCCCTATTTTCTTCATAACTG-3′；
2019-nCoV-1ab-R:5′-AACTCCTGTGTAGAAACTAAGTAATCATAA-3′；
2019-nCoV-1ab-P:5′-TTACTTTGGCCTCTTTTGTTTACTCAACCGC[FAM-dT]A[THF][BHQ1-dT]TTAGACTGACTCTTG[C3-Spacer]-3′。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，还包括荧光型干粉反应管、Buffer A、Buffer B，阴性对照以及阳性对照；所述的荧光型干粉反应管含有重组酶、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶冻干粉；Buffer A为水解缓冲液；Buffer B为醋酸镁溶液；阳性对照为含有新型冠状病毒ORF1ab靶基因序列的质粒；阴性对照为空载体质粒。
3.根据权利要求2所述的一种新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸恒温荧光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)人工合成2019-nCoV新型冠状病毒基因组中开放读码框1a/b(open reading frame1ab，ORF1ab)靶基因序列克隆到pUC57载体上，经大肠杆菌工程菌纯培养后提取质粒作为阳性对照；
(2)引物组和探针制备：
根据ORF1ab基因靶序列，设计特异性引物2019-nCoV-1ab-F和2019-nCoV-1ab-R，以及探针2019-nCoV-1ab-P，用四氢呋喃(THF残基)，[FAM-dT]荧光团和[BHQ1-dT]淬灭团取代靶标扩增子序列内的碱基；[FAM-dT]与[BHQ1-dT]相差2～5个碱基，THF残基位于两者之间，并在探针3’端标记[C3-Spacer]作为阻断基团，试剂中的核酸外切酶可在THF位点裂解探针，从而分离荧光基团和淬灭基团并产生荧光信号；
(3)重组酶、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶冻干酶粉、水解缓冲液、醋酸镁溶液，为商品化制备。
4.利用权利要求2所述的新型冠状病毒试剂盒快速检测新型冠状病毒的方法，其特征在于包含，以下步骤：
1)在荧光型干粉反应管中加入42.5μL水解缓冲液，5μL阳性对照/阴性对照/待检核酸，在反应管盖上加2.5μL醋酸镁，盖上盖子离心，上下颠倒混匀，离心10秒，立即检测；反应程序为：39℃，30秒，40循环，收集荧光信号，荧光通道选择FAM通道，20min可完成检测；
2)结果判定
①阳性对照有典型的扩增曲线出现，出峰时间≤15min(Ct值≤30)，阴性对照：无扩增曲线出现，或出峰时间≥200min(Ct值≥40)，为有效结果；均成立为有效结果；
②被检样本：
a.阳性：被检样本出峰时间≤17.5min(Ct值≤35)，有明显指数增长，判断为阳性；
b.可疑：若17.5min<出峰时间<20min(35<Ct值<40)，判为可疑，需重复检测进行确认；再次检测结果仍然是若出峰时间≤20min(Ct值≤40)，则判断为阳性，否则为阴性；
c.阴性：若出峰时间≥20min(Ct值≥40)，判断为阴性。
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