CN113584226A

CN113584226A - 鉴别诊断非洲猪瘟病毒P72/MGF/CD2v的多重荧光定量引物、探针及其应用

Info

Publication number: CN113584226A
Application number: CN202110863652.8A
Authority: CN
Inventors: 陈蕾; 王永强
Original assignee: Taizhou Leiling Baiao Biotechnology Co ltd
Current assignee: Taizhou Leiling Baiao Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-07-29
Filing date: 2021-07-29
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2041-07-29
Also published as: CN113584226B

Abstract

本发明提供了一种用于检测非洲猪瘟病毒的引物和探针组合，其中包括分别针对非洲猪瘟P72、MGF、CD2v基因的引物和探针；本发明还提供18S rRNA序列作为检测中内标的应用。进一步提供一种用于鉴别诊断非洲猪瘟P72/MGF/CD2v的多重荧光定量PCR试剂盒，其包括上述的试剂盒包装成的反应液。本发明通过引物和探针的设计，使得在一个反应里能同时检测非洲猪瘟P72、MGF、CD2v基因，针对这三个基因的扩增相互之间无干扰，特异性强、灵敏度高、重复性好，对于非洲猪瘟病毒的确诊，毒株类型的鉴定，具有较高的应用价值，产生巨大的经济效益。

Description

鉴别诊断非洲猪瘟病毒P72/MGF/CD2v的多重荧光定量引物、探针及其应用

背景技术

ASF的发病症状与其他多种猪病的症状相似，在临床上进行鉴别诊断难度较大，必须借助实验室诊断方法。非洲猪瘟病毒(ASFV)建立感染后，抗体在感染一定时期后才会生成，因此早期筛查最佳的选择还是进行抗原检测。目前检测ASFV抗原的常用方法有PCR、荧光定量PCR、直接免疫荧光技术(DIF)与红细胞吸附试验(HAD)四种，其中报道的PCR检测方法存在灵敏度与特异性较低的缺点；DIF具有较高的敏感性和特异性，但该方法需配备荧光显微镜、荧光标记抗体以及专业技术人员，无法得到推广；HAD无法鉴定不吸附红细胞的ASFV毒株，容易出现假阴性结果；因此，建立更加快速、灵敏、特异荧光定量PCR方法是目前防控ASFV的最优方案。

P72是ASFV病毒的保守结构蛋白，常被用于作为ASFV的鉴定基因，也是目前公认的诊断常用区域。在一项针对中国家猪2020年自然发生低毒非洲猪瘟的发生及流行研究中报道表明，以II 型ASFV为特征，与中国最早的ASFV毒株HLJ/2018(HLJ/18)相比，田间流行毒株的基因组变异及生物学和致病性表型进化已成趋势，在不同地区分离得到的22株分离株的23个ORF或区域中，有8个ORF或区域均发生突变、缺失、插入或短片段替换(Sun E,ZhangZ,Wang Z,et al. Emergence and prevalence of naturally occurring lowervirulent African swine fever viruses in domestic pigs in China in 2020.SciChina Life Sci.2021 May；64(5):752-765.)。低毒力自然突变体的出现给ASF 的早期诊断带来了较大困难，为ASFV的防控带来了新的挑战，因此仅检测P72已无法满足当前的疫情防控需求。

CD2v蛋白是病毒吸附红细胞活性所必须的重要蛋白，从功能上来说属于宿主免疫调控相关蛋白，CD2v蛋白由ASFV EP402R基因编码，相关研究表明，与野生病毒株相比，缺失EP402R的重组毒虽然不能降低猪群死亡率，但可以推迟病毒的扩散时间(Borca MV，Carrillo C，Zsak L，et al. Deletion of a CD2-like gene，8-DR，from African swinefever virus affects viral infection in domestic swine.J Virol. 1998 Apr；72(4):2881-9.)。MGF是ASFV病毒编码中另一个具有免疫抑制特性的蛋白成分，有关 ASFV的第一个减毒候选疫苗就是通过敲减MGF实现的(O'Donnell V,Holinka LG,Gladue DP，etal. African Swine Fever Virus Georgia Isolate Harboring Deletions of MGF360and MGF505 Genes Is Attenuated in Swine and Confers Protection againstChallenge with Virulent Parental Virus.J Virol.2015 Jun；89(11):6048-56.)。目前对于ASFV的减毒候选株研究大多集中于CD2v与MGF两个区域。目前，对于非洲猪瘟感染情况的检测，不仅需要确诊传染源，还需要精准确定毒株类型。

PCR等分子生物学技术因其快速、灵敏等优点，在疾病诊断中的作用越来越明显，尤其是多重荧光定量PCR能够同时检测多种靶基因，可在鉴别病毒毒株类型上发挥巨大作用。基于微流控技术的PCR即时检测(point-of-care testing,POCT)是目前国际基因检测的前沿技术之一(Vashist SK. Point-of-Care Diagnostics:Recent Advances andTrends.Biosensors(Basel).2017，7(4).pii:E62.)，将核酸提取与荧光定量基因检测通过微流控卡槽相结合，实现了样本到基因检测结果的全封闭自动输出，将整体检测时间控制在1小时左右，大大减少了工作量，并且最大程度上避免了因实验操作失误造成的结果误差。目前以美国Cepheid公司和罗氏公司为首的国际公司纷纷推出了分子POCT仪器和试剂卡槽的荧光定量PCR试剂盒，其快速、无污染、不需要专业人员操作等特性，使之在欧美等发达国家广泛应用。我国在该领域也在持续的研发与推进，但目前上市的产品较少。

目前针对非洲猪瘟病毒的检测，存在以下两点可优化之处：一是病毒DNA的提取与后续的分子扩增是分隔开来的。而且人工提取病毒DNA会增加人力成本、时间成本，且批量样本中存在样本间均一性不够的问题，会受人为操作因素的影响，降低结果的精准度。二是目前针对非洲猪瘟病毒的分子检测主要是靶向P72，鉴于国内毒株出现各种类型的变异，毒株类型复杂化的趋势，只是检测P72不能对具体的非洲猪瘟病毒毒株类型进行区分，已经无法满足现实需求。

发明内容

本发明通过对非洲猪瘟病毒P72/MGF/CD2v三个重要基因进行序列分析，设计了一整套非洲猪瘟病毒P72/MGF/CD2v扩增引物及探针，用于检测非洲猪瘟病毒，同时确定毒株类型。反应同时进行，能够确保目的基因的扩增起始样本量的一致性，避免了分多次操作而导致的实验结果误差，对于多种类型毒株的混合感染，能够得出更为精准的信息，同时大大提高了工作效率，也降低了人工成本。

因此，本发明申请一种用于鉴别诊断非洲猪瘟病毒的引物和探针的组合，其选自下述各项的组合：

(1)针对非洲猪瘟病毒P72的引物和探针，其引物对序列分别如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示，探针序列为SEQ ID NO.3所示；

(2)针对非洲猪瘟病毒MGF的引物和探针，其引物对序列分别如SEQ ID NO.4和SEQID NO.5所示，探针序列为SEQ ID NO.6所示；

(3)针对非洲猪瘟病毒CD2v的引物和探针，其引物对序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，探针序列为SEQ ID NO.9所示；

优选地，所述探针的两端荧光标记修饰；更优选地，SEQ ID NO.3的5’端用FAM修饰，3’端用BHQ1修饰；SEQ ID NO.6的5’端用CY5修饰，3’端用BHQ3修饰；SEQ ID NO.9的5’端用VIC 修饰，3’端用BHQ1修饰。

本发明由此提供一种鉴别诊断非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，其包括所述的引物和探针的组合。

进一步，所述试剂盒包括内标的引物和探针组合；优选地，以18S rRNA序列作为鉴别诊断非洲猪瘟病毒的内标。在具体实施方式中，内标的引物序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，内标的探针序列如SEQ ID NO.12所示，更优选地，对探针的两端进行荧光标记修饰，更优选地， 5’端用ROX修饰，3’端用BHQ2修饰。

在具体实施方式中，所述引物和探针组合单独包装或混和包装。优选地，所述引物和探针以预混液包装，优选地其包括Mn²⁺2.5mM；各引物和探针的浓度分别为：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2 所示引物各0.3μM，及SEQ ID NO.3所示探针0.2μM；SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5所示引物各0.3 μM，及SEQ ID NO.6所示探针0.2μM；SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示引物各0.3μM，及SEQ ID NO.9所示探针0.2μM；SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示引物各0.2μM，及SEQ ID NO.12所示探针0.15μM。

本发明的引物和探针在鉴别诊断非洲猪瘟病毒时，可以但不限于应用于本申请人此前申请的中国专利申请202010147432.0中所述的检测卡盒，以实现All-in-One一体化检测。所述的检测卡盒内设置多个分离腔体，相邻分离腔体之间使用柱塞阻断，分离腔体内分别罐装有裂解液、洗涤液和反应液；检测样本时，推动各个柱塞，使柱塞的柱塞孔对准分离腔体，进而导通各个分离腔体，然后利用电磁控制方式，控制试剂盒内的磁珠带动待测样本核酸依次经过各个分离腔体，裂解吸附核酸后依次进行清洗和反应，最后从外部对反应液中的基因进行光学检测。因此，本发明还提供一种用于一体化鉴别诊断非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求3至7任一项所述的试剂盒包装成的反应液。

本发明因而还提供所述的引物和探针的组合、所述的试剂盒在制备鉴别诊断非洲猪瘟病毒的试剂中的应用。

本发明的优点在于，可以在一个反应里实现ASFV不同毒株的鉴别诊断，不仅能够获知是否存在非洲猪瘟的感染，而且能够明确感染毒株的类型，省时高效。而目前未有报道一款专门针对鉴别 ASFV的多重荧光定量PCR试剂盒获批上市，基于本发明开发的试剂盒具有潜在巨大的经济效益。其中，本发明扩增靶标为P72、MGF、CD2v基因，针对三个靶标的扩增相互不干扰，且特异性强、灵敏度高、重复性好。因为对于多重荧光定量PCR来说，很难保证每个靶标的高灵敏度，有报道的多重荧光定量PCR往往会突出某个靶标，从而造成某些靶标灵敏度低的情况。在本发明中三个靶标的扩增均可以低至10个拷贝，充分保证了对每个靶标的扩增。其中本发明综合各种因素分别设计了针对这三个靶标的多套引物探针组合，并且根据反应的特异性、扩增的效率进行筛选与优化，最终选择出本发明的引物和探针组合，达到上述极其优异的效果。

进一步地，本发明的非洲猪瘟多重荧光定量PCR试剂盒可以应用于All-in-One一体化检测，实现“样本进”到“结果出”的全封闭、一体化反应。只需要人工加入样本，其余步骤均自动化完成，最大限度的降低了人力成本、时间成本、减少了人为因素的影响，杜绝了主观的结果判断。最大限度地降低了对环境的污染，同时也保护了检测操作人员。

附图说明

图1.ASFV P72基因引物探针序列比对图。

图2.ASFV MGF基因引物探针序列比对图。

图3.ASFV CD2v基因引物探针序列比对图。

图4.ASFV P72标准品扩增曲线。其中，1.1×10⁷pUC57-AS-P72质粒；2.1×10⁶pUC57-AS-P72 质粒；3.1×10⁵pUC57-AS-P72质粒；4.1×10⁴pUC57-AS-P72质粒；5.1×10³pUC57-AS-P72质粒；6.1 ×10²pUC57-AS-P72质粒；7.1×10¹pUC57-AS-P72质粒；8.1×10⁰pUC57-AS-P72质粒；9.H₂O。

图5.ASFV MGF标准品扩增曲线。其中，1.1×10⁷pUC57-AS-MGF质粒；2.1×10⁶pUC57-AS- MGF质粒；3.1×10⁵pUC57-AS-MGF质粒；4.1×10⁴pUC57-AS-MGF质粒；5.1×10³pUC57-AS-MGF 质粒；6.1×10²pUC57-AS-MGF质粒；7.1×10¹pUC57-AS-MGF质粒；8.1×10⁰pUC57-AS-MGF质粒； 9.H₂O。

图6.ASFV CD2v标准品扩增曲线。其中，1.1×10⁷pUC57-AS-CD2v质粒；2.1×10⁶pUC57-AS- CD2v质粒；3.1×10⁵pUC57-AS-CD2v质粒；4.1×10⁴pUC57-AS-CD2v质粒；5.1×10³pUC57-AS- CD2v质粒；6.1×10²pUC57-AS-CD2v质粒；7.1×10¹pUC57-AS-CD2v质粒；8.1×10⁰pUC57-AS- CD2v质粒；9.H₂O。

图7.ASFV多重荧光定量PCR特异性。其中，1.pUC57-AS-P72质粒；2.pUC57-AS-MGF质粒；3. pUC57-AS-CD2v质粒；4.pUC57-18S质粒；5.CSFV cDNA；6.PRRSV cDNA；7.PRV DNA；8.PCV DNA；9.PEDV cDNA；10.PPV DNA；11.H₂O。

图8.ASFV多重荧光定量PCR敏感性。其中，1-9.1×10²pUC57-AS-P72质粒；1×10²pUC57-AS- MGF质粒；1×10²pUC57-AS-CD2v质粒；10-18.1×10¹pUC57-AS-P72质粒；1×10¹pUC57-AS-MGF 质粒；1×10¹pUC57-AS-CD2v质粒；19.H₂O。

图9.ASFV多重荧光定量PCR的批内重复。其中，1-9.1×10⁴pUC57-AS-P72质粒；1×10⁴ pUC57-AS-MGF质粒；1×10⁴pUC57-AS-CD2v质粒；10-18.1×10²pUC57-AS-P72质粒；1×10² pUC57-AS-MGF质粒；1×10²pUC57-AS-CD2v质粒；19-27.1×10¹pUC57-AS-P72质粒；1×10¹ pUC57-AS-MGF质粒；1×10¹pUC57-AS-CD2v质粒；28-30.H2O。

图10.ASFV多重荧光定量PCR的批间重复一。其中，1-3.1×10⁴pUC57-AS-P72质粒；1×10⁴ pUC57-AS-MGF质粒；1×10⁴pUC57-AS-CD2v质粒；4-6.1×10²pUC57-AS-P72质粒；1×10²pUC57- AS-MGF质粒；1×10²pUC57-AS-CD2v质粒；7-9.1×10¹pUC57-AS-P72质粒；1×10¹pUC57-AS- MGF质粒；1×10¹pUC57-AS-CD2v质粒；10.H₂O。

图11.ASFV多重荧光定量PCR的批间重复二。其中，1-3.1×10⁴pUC57-AS-P72质粒；1×10⁴ pUC57-AS-MGF质粒；1×10⁴pUC57-AS-CD2v质粒；4-6.1×10²pUC57-AS-P72质粒；1×10²pUC57- AS-MGF质粒；1×10²pUC57-AS-CD2v质粒；7-9.1×10¹pUC57-AS-P72质粒；1×10¹pUC57-AS- MGF质粒；1×10¹pUC57-AS-CD2v质粒；10.H₂O。

图12.ASFV多重荧光定量PCR试剂盒应用于All-in-One一体化检测。其中，1.内标质粒；2. pUC57-AS-CD2v质粒；3.pUC57-AS-MGF质粒；4.pUC57-AS-P72质粒。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步的描述，但并不构成对本发明的限制。

实施例一、质粒标准品的制备

非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种在世界范围内流行的烈性病原，作为一种古老的病毒，在遗传演化的过程中，进化出了保守的基因和高变的基因。编码P72的基因就是高度保守基因中的典型代表，作为检测靶标的首选，也受到了OIE(国际兽医局)的推荐。而编码MGF和CD2v的基因出现了特定的变异，在中国出现了相应的变异株。而且，我国的一些研究机构，针对MGF和CD2v这两个区域进行了毒株的改造，研发了贮备毒株。靶向这三个区域的扩增，不仅能够确诊非洲猪瘟病毒的感染，而且能够明确猪只感染的毒株类型以及病毒流行的分子生物学特征。为更加精准的防控非洲猪瘟病毒打下基础。根据GenBank中ASFV中国株(MK333180.1)序列，分别合成ASFV部分基因序列P72(SEQ ID NO.13)、MGF(SEQ ID NO.14)、CD2v(SEQ ID NO.15)，克隆至pUC57载体，转化细菌感受态细胞DH5α，提取质粒，测序验证后作为多重荧光定量PCR的质粒标准品。对应的质粒标准品分别命名为pUC57-AS-P72、pUC57-AS-MGF、pUC57-AS-CD2v。用紫外分光光度计测OD₂₆₀值，按公式([X(g/μL)DNA/DNA长度(bp)×660]×6.02×10²³＝Y(copies/μL))换算成摩尔浓度后，稀释至10⁸拷贝/μL，-20℃保存，使用前稀释。

实施例二、引物探针的设计

通过比较GenBank中ASFV中国株的相关基因序列(序列号包括：MK128995.1、MK333180.1、 MK333181.1、MK645909.1、MK940252.1、MN172368.1、MN207061.1、MN393476.1、 MN393477.1、MT496893.1)，分别选取P72/MGF/CD2v相应基因的保守区段，并结合序列中高级结构的分布特点、序列退火温度的情况，选择引物的设计区域。分别设计针对这三个靶标的多套引物探针组合，并根据反应的特异性、扩增的效率进行筛选与优化，选择出以下的引物探针组合。分别针对P72基因设计引物和探针，如表1所示，探针5’端标记为FAM，3’端标记为BHQ1，其引物探针的序列比对如图1所示。针对MGF基因设计引物和探针，如表2所示，探针5’端标记为CY5，3’端标记为BHQ3，其引物探针的序列比对如图2所示。针对CD2v基因设计引物和探针，如表3所示，探针 5’端标记为VIC，3’端标记为BHQ1，其引物探针的序列比对如图3所示。

表1.ASFV P72引物和探针

引物/探针名称	引物序列	5’端修饰	3’端修饰
				SEQ ID NO.1	CTGAAAGCTTATCTCTGCG	/	/
SEQ ID NO.2	CCGAGATTGGYACAAGTTC	/	/
				SEQ ID NO.3	ACGCCATTATGCAGCCCACTC	FAM	BHQ1

表2.ASFV MGF引物和探针

表3.ASFV CD2v引物和探针

引物/探针名称	引物序列	5’端修饰	3’端修饰
				SEQ ID NO.7	CAATGTCAGCATGATGACAC	/	/
SEQ ID NO.8	GGCTTAGGAAGTAATGGTTC	/	/
				SEQ ID NO.9	CACTTCCATACATGAACCATCTCCC	5｀VIC	3｀BHQ1

实施例三、内标的设置

比对GenBank中人、猪、牛、羊、马、兔、鸡、鸭、鼠、豚鼠、猕猴、大猩猩、长臂猿、骆驼、鹿、蝙蝠、鲸等物种的全长18S rRNA序列，进行遗传演化分析，结果显示各物种之间18SrRNA序列的一致性为93.3％到99.9％(比对序列包括：EU823286.1；FM165414.1；NR_046261.1； NR_046271.1；NR_036642.1；NR_146166.1；NR_145820.1；NR_046237.1；XR_004135034.1； XR_003587981.1；XR_004038418.1；XR_002788481.1；XR_002778881.1；XR_004246958.1； XR_004069086.1；XR_003493879.1；X00640.1)，说明在哺乳动物及禽类中该序列高度保守，可设计作为理想的内标基因。进一步通过序列比对找出该序列的保守区域，排除序列中高级结构复杂的区域，选取出用于合适的引物设计区，并将此区域克隆至pUC57载体，转化细菌感受态细胞DH5α，制备工程菌pUC57-18S。设计并筛选出一组各个参数指标最为优良的引物组和探针，并根据极少数序列位点的差异，在探针和下游引物中分别引入一个简并碱基(如表4如示)。

表4.内标18S rRNA引物和探针

引物/探针名称	引物序列	5’端修饰	3’端修饰
				SEQ ID NO.10	TTGCCAAGAATGTTTTCATTA	/	/
SEQ ID NO.11	CATCGTTTRTGGTCGGAA	/	/
				SEQ ID NO.12	ATCTGATCGTCTTCRAACCTCCG	ROX	BHQ2

实施例四、最佳反应体系、最佳反应条件

分别针对引物探针的反应浓度、Mn²⁺的反应量、酶的反应量进行正交试验，引物的反应浓度筛选0.2-0.8uM，探针的反应浓度筛选0.1-0.4uM，增加的幅度均为0.1uM；Mn²⁺的反应浓度筛选0.5-5 mM，增加的幅度为0.5mM；酶的反应量筛选1-10U。经过多轮正交筛选，选择特异性好，扩增效率高的组合，确定最佳反应预混液为：Real-time PCR master mix(1×，东洋纺生物科技有限公司)，Mn²⁺2.5mM、引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8各0.3uM，引物SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11各0.2uM，探针SEQ ID NO.3、 SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9各0.2uM，探针SEQ ID NO.120.15uM。

比较传统三段式反应和将退火和延伸合并的两段式反应，并筛选退火温度，范围从53℃- 63℃，增加幅度为2℃，选择特异性好，扩增效率高的组合，最佳反应程序为：95℃30s,40循环 (95℃0s,60℃45s)。结果判断为：无Ct值判定为阴性；Ct值小于38判定为阳性；Ct值在38-40之间判定为可疑，并重复试验，若重复试验Ct小于40，扩增曲线有明显起峰，则判定为阳性，否则为阴性。

以最佳反应体系与最佳反应条件进行pUC57-AS-P72、pUC57-AS-MGF、pUC57-AS-CD2v质粒标准品的反应，均获得良好的扩增，其结果如图4-图6所示。

实施例五、特异性试验

取灭活后等体积的经典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪细小病毒(PPV)样品提取病毒RNA(或DNA)，反转录后，按实施例四所述最佳反应体系与最佳反应条件进行荧光定量PCR 检测。结果显示非洲猪瘟病毒P72/MGF/CD2v多重荧光定量PCR与猪源常见传染病不存在非特异反应，阳性标准品反应良好(如图7所示)。

实施例六、灵敏度试验

以10倍梯度稀释的质粒标准品pUC57-AS-P72质粒；pUC57-AS-MGF质粒；pUC57-AS-CD2v质粒为模板，按实施例四所述最佳反应体系与最佳反应条件进行ASFV多重荧光定量检测。结果显示靶向P72、靶向MGF、靶向CD2v的扩增反应的检测敏感性均为10个拷贝的质粒标准品(如图8所示)。有报道将非洲猪瘟、经典猪瘟和猪的非典型瘟病毒进行多重荧光定量的检测，非洲猪瘟的检测灵敏度为6.34×10²拷贝，经典猪瘟和猪的非典型瘟病毒的检测灵敏度为6.34×10¹拷贝(Liu H, Shi K,Sun W,et al.Development a multiplex RT-PCRassay for simultaneous detection of African swine fever virus，classical swinefever virus and atypical porcine pestivirus.J Virol Methods.2021 Jan；287:114006.)。本发明的多重荧光定量PCR的三个靶标的检测灵敏度均能低至10个拷贝，说明靶向P72/MGF/CD2v的多重荧光定量PCR灵敏度高。与报道的多重荧光定量PCR相比优势明显。

实施例七、重复性试验

批内重复性试验：以10倍梯度稀释的质粒标准品pUC57-AS-P72质粒；pUC57-AS-MGF质粒； pUC57-AS-CD2v质粒为模板，分别各取1×10⁴；1×10²；1×10¹三个梯度，每个梯度做3个重复，按实施例四所述最佳反应体系与最佳反应条件进行ASFV多重荧光定量检测。结果显示三个梯度的批内重复均十分良好，CV值均小于8％(如图9所示)。其批内重复优于相关申报标准。

批间重复性试验：以10倍梯度稀释的质粒标准品pUC57-AS-P72质粒；2.pUC57-AS-MGF质粒；3. pUC57-AS-CD2v质粒为模板，分别各取1×10⁴；1×10²；1×10¹三个梯度，按实施例四所述最佳反应体系与最佳反应条件进行ASFV多重荧光定量检测。在另外两个不同的时间点重复试验，结果显示三个梯度的批间重复均十分良好，CV值均小于8％(如图10、11所示)。其批间重复优于相关申报标准。

实施例八、应用于All-in-One全自动一体化反应

本发明所使用的一体化结构如本公司已申请的专利202010147432.0所述，具体如下：样本裂解提取液存贮于一体化检测试剂卡盒的第一个小室内(自上而下)，以实现样本的裂解与核酸的提取；样本洗涤液I存贮于一体化检测试剂卡盒的第二个小室内，以实现核酸的第一次洗涤；样本洗涤液II存贮于一体化检测试剂卡盒的第三个小室内，以实现核酸的第二次洗涤；针对非洲猪瘟 P72/MGF/CD2v的多重荧光定量引物、探针(SEQ ID NO.1-NO.9)、靶向内标的引物、探针(SEQ ID NO.10-NO.12)及整个反应预混液存贮于一体化检测试剂卡盒的第四个小室内，以实现多重荧光定量PCR反应。

本发明一体化整合样本核酸提取与基因定性定量检测两大功能，实现自动化的样本提取到基因检测结果的全封闭输出。采集样本600微升，加入一体化检测试剂卡盒中，封闭卡盒。在一体化检测试剂卡内逐步进行以下反应：(1)裂解样本，磁珠吸附非洲猪瘟病毒DNA、内标基因DNA及物种DNA等；(2)吸附核酸的磁珠在卡盒中进行定向移动，逐步洗涤除去磁珠上的蛋白与杂质等非核酸样本；(3)磁珠进入扩增反应区后，非洲猪瘟病毒DNA等从磁珠上进行解离，在反转录酶的作用下进行多重荧光定量PCR反应，其中ASFV P72的探针5’端用FAM标记，ASFV MGF的探针5’端用Cy5标记，ASFV CD2v的探针5’端用VIC标记，内标的探针5’端用ROX标记，扩增反应中，各类探针发生水解，5’端的荧光标记物释放，仪器对相应的荧光信号进行捕捉并记录。(4)记录的各荧光信号将相应的荧光曲线输出到可视屏幕上，实现荧光信号实时捕捉，荧光曲线实时反馈的智能化输出。从而对ASFV P72、MGF、CD2v、内标的扩增进行实时监控。一体化系统运行是否正常，需以内标为准，当内标荧光曲线出现对数增长的阳性扩增，即可证明该一体化系统的样本裂解、核酸提取、荧光定量的分子扩增等环节均正常工作。其扩增曲线如图12所示。

序列表

<110> 泰州蕾灵百奥生物科技有限公司

<120> 鉴别诊断非洲猪瘟病毒P72/MGF/CD2v的多重荧光定量引物、探针及其应用

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<170> Patent-In 3.3

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ctgaaagcttatctctgcg 19

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ttgtggtgtttcatgtctgcta 22

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<213>人工序列

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<212> DNA

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caatgtcagcatgatgacac 20

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ggcttaggaagtaatggttc 20

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cacttccatacatgaaccatctccc 25

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ttgccaagaatgttttcatta 21

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atctgatcgtcttcraacctccg 23

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<223>African swine fever virus

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<212> DNA

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<223> African swine fever virus

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atgttttcccttcaagacctttgccgaaagcatctttttattcttcccgatgtttttggcgagcatgtactacaacgattaggactgtattggagatgtcacggctcccttcaacgcataggagacgaccacatactcatacgacgggatctcatcctttccaccaacgaggccttaagaatggcgggagaggaaggaaacaatgaagtagtaaagctcttgttactgtggaagggaaatcttcattacgccgtcataggagccttgcagggtgatcaatatgacctgatccataagtatgaaaaccaaatcggcgactttcattttatcttaccattgattcaagacgcgaatacgtttgaaaaatgccacgctttagaacgtttttgtggtgtttcatgtctgctaaaacatgctacaaaatacaacatgctccctattctccaaaaataccaagaagagctgtctatgagagcgtatcttcacgaaaccctatttgaactagcatgcctatggcagaggtatgatgtccttaaatggatagagcaaaccatacatgtttacgacctaaagattatgtttaatattgccatctccaagagggatctgactatgtactccttaggatatattttcctttttgatagagggaacaccgaagctacgttgctaacgcaacatctcaagaagacagcggccaaagggctcctccactttgtgctagaaacgttaaaatacggcggcaacatagataccgtcctgacccaagccgtaaagtacaatcatagaaaacttttagattattttctgcgtcaactacctcgtaaacatattgaaaaacttttgttgctggccgtgcaggaaaaggcttctaaaaaaacattgaacttactgttgtcacatttaaactactccgtgaaacgcatcaaaaaactaccgcgctatgtgatagagtacgagtccaccttggtgataaagattttattaaaaaaaagagtgaacctgatagatgccatgttggaaaagatggtaagatatttttctgcgacgaaagtgaggacgatcatggatgagctttcgattagtccggaaagagtcattaagatggctatacagaaaatgagaacggatatcgtaatccatacttcttatgtttgggaggatgatctagaacgtcttactcgtcttaaaaatatggtatacaccataaagtacgaacatgggaaaaaaatgttaattaaagtcatgcacggcatatacaaaaacttattatacggcgaaagggaaaaagtcatgttttatttagccaagctctatgttgctcaaaacgcggccacccaattcagagacatttgtaaggactgttacaaactggatgtggcacggtttaaaccgcggtttaagcaactaatattagactgtttagaaattattactaaaaaatcttgctatagtatcctggaaatcttagaaaaacatattatttccctgtttactatgaaagttatgactgaagaagaaaaaaacctatgtttagaaatattatataaagtaattcattataaaacaatacaatgttaa 1581

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Claims

1.一种用于鉴别诊断非洲猪瘟病毒的引物和探针的组合，其选自下述各项的组合：

(1)针对非洲猪瘟病毒P72的引物和探针，其引物对序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，探针序列为SEQ ID NO.3所示；

(2)针对非洲猪瘟病毒MGF的引物和探针，其引物对序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示，探针序列为SEQ ID NO.6所示；

(3)针对非洲猪瘟病毒CD2v的引物和探针，其引物对序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示，探针序列为SEQ ID NO.9所示。

2.如权利要求1所述的用于鉴别诊断非洲猪瘟病毒的引物和探针的组合，其特征在于，所述探针的两端荧光标记修饰；更优选地，SEQ ID NO.3的5’端用FAM修饰，3’端用BHQ1修饰；SEQ ID NO.6的5’端用CY5修饰，3’端用BHQ3修饰；SEQ ID NO.9的5’端用VIC修饰，3’端用BHQ1修饰。

3.一种鉴别诊断非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1或2所述的引物和探针的组合。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括内标的引物和探针组合；优选地，以18S rRNA序列作为鉴别诊断非洲猪瘟病毒的内标。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，内标的引物序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，内标的探针序列如SEQ ID NO.12所示，更优选地，对探针的两端进行荧光标记修饰，更优选地，5’端用ROX修饰，3’端用BHQ2修饰。

6.如权利要求3至5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述引物和探针组合单独包装或混和包装。

7.如权利要求3至5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述引物和探针以预混液包装，优选地其包括Mn²⁺2.5mM；各引物和探针的浓度分别为：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示引物各0.3μM，及SEQ ID NO.3所示探针0.2μM；SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示引物各0.3μM，及SEQ ID NO.6所示探针0.2μM；SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示引物各0.3μM，及SEQ ID NO.9所示探针0.2μM；SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示引物各0.2μM，及SEQ ID NO.12所示探针0.15μM。

8.一种用于一体化鉴别诊断非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求3至7任一项所述的试剂盒包装成的反应液。

9.如权利要求1或2所述的引物和探针的组合、如权利要求3至9任一项所述的试剂盒在制备鉴别诊断非洲猪瘟病毒的试剂中的应用。