CN110878377A - 非洲猪瘟病毒强弱毒荧光定量pcr鉴别诊断试剂盒 - Google Patents

非洲猪瘟病毒强弱毒荧光定量pcr鉴别诊断试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明基于ASFV的P72基因、MGF基因和CD2V基因序列，设计合成了针对该三个基因的特异性引物与探针，建立了ASFV强弱毒的鉴别诊断方法并进行了临床和实验样品的检测，因而本发明提供含有所述引物和探针的非洲猪瘟病毒强弱毒荧光定量PCR鉴别诊断试剂盒。采用该试剂盒适应于ASFV强弱毒的鉴别诊断。

Description

非洲猪瘟病毒强弱毒荧光定量PCR鉴别诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及兽医领域，具体为动物疾病诊断和病原检测，更具体涉及非洲猪瘟及其病原病毒的检测和诊断，尤其是非洲猪瘟强弱毒的鉴别。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由双股线性DNA的非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)感染猪引致的一种急性、热性、高度接触性传染病(
Figure BDA0002262421410000011
-VIZCAíNO J.M.&ARIAS M..African swine fever.In:Diseases of Swine,tenth Edition,Straw B.,D’Allaire S.,Mengeling W.,Taylor D.,eds.Iowa StateUniversity,USA,2012,pp:396–404；D.Zhao,R.Liu,X.Zhang,et al.Replication andvirulence in pigs of the first African swine fever virus isolated in China[J].Emerging Microbes&Infections，2019,8:438-447)。病程短、病死率家猪可达100％，其临床症状和病理变化与急性猪瘟相类似，表现为高热、皮肤充血、流产、水肿及脏器出血。该病为世界动物卫生组织[World Organization for Animal Health(英)，OfficeIntentional des Epizootic(法)，OIE]必须报告的动物疫病和我国动物疫病名录的一类动物疫病。病毒在鲜肉和腌肉中能存活数月，但高温、消毒剂都能对它进行有效杀灭。
家猪和野猪是ASFV的易感动物，且不同品种、性别和年龄猪均易感。软蜱是该病毒的自然宿主和传播媒介。传播途径多以口、鼻直接接触为主。
该病于1921年在肯尼亚首先发现，1957年传入欧洲，1971年传入美洲(
Figure BDA0002262421410000012
-VIZCAíNO J.M.&ARIAS M..African swine fever.In:Diseases of Swine,tenthEdition,Straw B.,D’Allaire S.,Mengeling W.,Taylor D.,eds.Iowa StateUniversity,USA,2012,pp:396–404)。上世纪90年代在欧洲已被消除，但2007年再次由东非传入欧亚接壤的格鲁吉亚，由此造成了该病在东欧的广泛传播，并于2017年传播到俄罗斯伊尔库斯克地区(Sh.Ge,J.Li,X.Fan,et al.Molecular Characterization of AfricanSwine Fever Virus,China,2018[J].Emerging Infectious Diseases，2018,24(11)：2131-2133；张艳艳、周鑫韬、齐宇等，非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗构建和免疫保护特性研究[J].中国兽医学报，2019,39(8)：1245-1249)。目前世界上有50多个国家存在ASF散发或暴发，给当地养猪业造成了毁灭性打击。我国国家外来动物疫病研究中心自对2018年8月1日发生在辽宁沈阳的疑似ASF病例进行了确诊以来，截至目前中国大陆各省市区都已发生过非洲猪瘟疫情，严重危害着我国养殖产业的健康发展，造成了不可估量的经济损失(X.Wen,X.He,X.Zhang,et al.Genome sequences derived from pig and dried blood pig feedsamples provide important insights into the transmission of African swinefever virus in China in 2018[J].Emerging Microbes&Infections，2019,8:303-306；Sh.Ge,J.Li,X.Fan,et al.Molecular Characterization of African Swine FeverVirus,China,2018[J].Emerging Infectious Diseases，2018,24(11)：2131-2133)。
ASF还与某些猪病毒病(高致病性猪蓝耳病、圆环病毒病、伪狂犬病)、某些细菌病或细菌感染(猪丹毒、沙门氏菌、巴氏杆菌、猪链球菌、副嗜血杆菌)、中毒及败血症等(香豆素抗凝血剂中毒、华法林中毒、重金属中毒、血小板减少性紫癜等)在临床和病变上相类似，因此需要进行鉴别诊断。
ASF实验室诊断方法有病原检测和抗体检测两种。前者包括病毒分离(红细胞吸附试验，HA)、病毒抗原检测(直接免疫荧光试验，DIF)和基因组DNA检测(PCR、qPCR)；后者为唾液、血液等中的抗体检测(IFA、ELISA、IB、IPT等)。方法的选择可依据各国或当地疾病情况而定。
基于高温、消毒剂能有效杀灭ASFV和ASF为高度接触性传染病的特点，ASF防控的关键是要搞好养殖场的生物安全防护。在没有商品化的疫苗用于预防ASF之前，一旦发生疫情，国际通行做法就是采取扑杀措施，并有许多成功案例(
Figure BDA0002262421410000021
-VIZCAíNO J.M.&ARIASM.African swine fever.In:Diseases of Swine,tenth Edition,Straw B.,D’AllaireS.,Mengeling W.,Taylor D.,eds.Iowa State University,USA,2012,pp:396–404)。
ASF无疑是养猪业的头号杀手，加上各国生猪饲养模式和管理水平(生物安全防护)差异造成了ASF在当地的传播、发生与流行存在不同的特点。如果不分时空、地域及疫情发生发展阶段，一律采取扑杀措施，不仅代价高昂、而且事倍功半。因此，ASF疫苗研究从未间断过，也取得了积极进展，其中利用分子生物技术构建的ASF基因缺失疫苗有望在ASF防控中发挥至关重要的作用。
ASF一年间能在我国迅速传播，很大程度与我们的现实国情密切相关。相关因素包括：饲养密度高，饲养总量大，饲养管理水平参差不齐，生物安全防护意识差造成的防控措施不力，各地猪肉供需不均衡和百姓消费习惯造成的活猪长距离调运，动物防疫法律法规的宣贯没落到实处等。基于我国目前非洲猪瘟传染源污染面广、易感猪群体量大(我国生猪养殖量占世界50％以上)、传播途径难以切断造成的生物安全防控措施难以完全奏效的现实，以及周边国家疫情国家逐年增多、存在自然疫病病源地的非洲猪瘟在全球范围内流行发展特点，预判疫情恐将在我国进一步扩大并会长期存在。因此，加快开展非洲猪瘟流行病学、致病机制、快速诊断检测技术和防治疫苗(根据我国国情和已有病毒病防控经验，疫苗是防控非洲猪瘟疫情最为有效和经济的方法，因此，目前研制安全有效的非洲猪瘟疫苗是阻止ASF在我国进一步传播蔓延的唯一现实选择)的研究，做好长期应对复杂非洲猪瘟疫情下的防控技术准备和政策部署，既是保障我国生猪产业健康持续发展的需要，更是刻不容缓并亟需解决的国计民生问题(步志高、陈伟业、赵东明等，基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的应用，申请号：201910348878.7；张艳艳、周鑫韬、齐宇等，非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗构建和免疫保护特性研究.中国兽医学报，2019,39(8)：1245-1249)。
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所依托所在的国家动物疫病高级别生物安全实验室(P3和P4)，并作为中国农业农村部批准的第一个和目前唯一可以从事非洲猪瘟病毒动物试验的单位，勇挑国家重任，发挥自身优势，立即投入巨大的人才和技术资源，开展了非洲猪瘟基因缺失减毒疫苗的研发并取得了阶段性成果，即步志高等利用分离到的黑龙江非洲猪瘟流行毒株(Pig/CN/HLJ/2018)为亲本，构建了MGF360-505R基因缺失和CD2V与MGF360-505R双基因联合缺失的减毒活疫苗，分别命名为rASFV△360-eGFP、rASFV△CD2V/360-eGFP-mCherry，其中rASFV△CD2V/360-eGFP-mCherry已进入临床中试阶段。另外张艳艳等以我国首例非洲猪瘟疫情中分离的流行毒株(SY18)为亲本株，构建了MGF基因和CD2V基因缺失的非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗候选株，并对其安全性和免疫保护效果进行了研究(张艳艳、周鑫韬、齐宇等，非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗构建和免疫保护特性研究.中国兽医学报，2019,39(8)：1245-1249)。
上述研究结果都表明，双基因缺失候选疫苗株对猪安全，接种猪能对基因型相同的流行株提供100％的保护。这将为非洲猪瘟基因缺失疫苗最终用于非洲猪瘟的防控带来了曙光。为此，建立ASFV强弱毒的鉴别诊断方法并组装成试剂盒在临床上推广应用，显得十分必要和具有现实意义。
发明内容
本发明针对上述目的，研发了非洲猪瘟病毒强弱毒荧光定量PCR鉴别方法所用的诊断试剂盒。其适用于样品中的非洲猪瘟强毒(野毒)核酸的检测，以及非洲猪瘟强毒与MGF基因缺失株，和CD2V与MGF基因联合缺失株的鉴别诊断。
本发明提供一种非洲猪瘟病毒MGF基因缺失弱毒荧光定量PCR鉴别诊断试剂盒，其包括下述检测用引物对：
正向引物MGF-F：5`cctagctctcgacagaggtccc 3`，
反向引物MGF-R：5`aaggctcataaaatcagcaggtatt 3`，
探针MGF-probe：5`ctccgtgttgacagataccagcccg 3`。
更具体地，所述MGF基因缺失是指非洲猪瘟病毒的MGF360-505R基因缺失病毒，所述非洲猪瘟病毒是基因II型的非洲猪瘟病毒，更具体是全长基因组序列如GenBank:MK333180.1中所述的中国流行株Pig/CN/HLJ/2018。
更具体的，所述MGF360-505R基因缺失病毒相对于原始毒株全长序列缺失了第27942-35500位核苷酸。一个具体实施方式中，所述MGF360-505R基因缺失病毒，保藏号为CCTCC NO:V201925。
另一方面，本发明还提供一种非洲猪瘟病毒CD2V与MGF基因联合缺失株弱毒荧光定量PCR鉴别诊断试剂盒，其包括下述检测用引物对：
正向引物MGF-F：5`cctagctctcgacagaggtccc 3`，
反向引物MGF-R：5`aaggctcataaaatcagcaggtatt 3`，
探针MGF-probe：5`ctccgtgttgacagataccagcccg 3`；
以及，
正向引物CD2V-F：5`agaaatagaaagtccaccacctga，
反向引物CD2V-R：5`tttaggtaagggaaatgggttg，
探针CD2V-probe：5`agtggttgtgttgagggacgcatgtagtaaa。
另一方面，所述CD2V与MGF基因联合缺失病毒是指缺失CD2V与MGF360-505R基因联合缺失，相对于原始毒株全长序列缺失了第27942-35500位和第73394-74476位核苷酸。一个具体实施方式中，所述CD2V与MGF360-505R基因联合缺失病毒，保藏号为，CCTCC NO:V201924。
进一步，上述两种诊断试剂盒，还包括用于检测阳性对照的强毒株的引物对：
正向引物ASFV-F：5`ctgctcatggtatcaatcttatcga 3`，
反向引物ASFV-R：5`acggcygatcttgtggtatc 3`，
探针ASFV-P：5`ccacgggaggaataccaacccagtg 3`。
其中上述各种探针用荧光标记进行修饰，例如FITC，FAM，HEX，Cy3，Cy5，Cy5.5，或Cy7，RB200。需要注意的，如果试剂盒中有两种或三种探针的情况下，各种探针分别用不同的荧光标记进行修饰。
更进一步地，上述两诊断试剂盒还包括其他用于检测的相关试剂，如缓冲液，核酸提取液，扩增用试剂(如扩增酶等)，以及ddH2O等。
在进行检测时可以采用猪的全血、血清、血浆、淋巴结、脾脏、肾脏、扁桃体、肌肉、肉骨粉、血粉、唾液、尿液、粪便、运输工具及环境取样等样品。其中核酸提取试剂可以采用已知的试剂。利用商品化的病毒核酸提取试剂盒进行核酸提取，因提取的核酸纯度好且DNA模板量得到富集，适应于病毒含毒量低的上述所有样品的实验室检测。但为了更快捷，可以采用用于核酸免提的直扩法核酸提取溶液1(500mM NaCl，10％TritonX-100，0.01％SDS,pH8.0)和核酸提取溶液2(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)，适用于全血、血清、血浆、淋巴结、脾脏、肾脏、扁桃体等病毒含量较高的样品和全血、血清、血浆和唾液等容易采集样品的现地/基层/猪场的快速检测。
进行检测中的PCR扩增的参数如下：
Figure BDA0002262421410000051
而检测方式可以采用荧光检测通道，如FITC，FAM，HEX，Cy3，Cy5，Cy5.5，或Cy7，RB200。具体检测通道设置可参照所使用的仪器使用说明。
检测结果判定，ASFV-阳性对照有明显指数扩增曲线且三个通道Ct值≤35，阴性对照检测结果为无Ct值显示或Ct值＞35，二者均成立才可判定试验成立，否则试验无效。
在一个具体实施方式中，结果判定标准如下：
Figure BDA0002262421410000052
本发明利用ASFV强毒株(Pig/CN/HLJ/2018)和基因缺失弱毒株(rASFV△360-eGFP、rASFV△CD2V/360-eGFP-mCherry)为实验材料，参考ASFV的P72基因、MGF基因和CD2V基因序列，设计合成了针对该三个基因的特异性引物与探针，建立了ASFV强弱毒的鉴别诊断方法并进行了临床和实验样品的检测。针对CD2V、MGF二个基因的引物探针设计上相对于常规设计而言需要克服更多的困难或需要更多的考虑因素才能获得效果好的引物和探针，即本发明充分考虑扩增效率一致性问题，即在判定标准的制定中，CD2V、MGF、P72三个基因的Ct值的离散度越小越好，因为一旦它们的扩增效率不一致时，各自的Ct值会差异较大，那么当受检样品模板浓度较低时，会出现错误的检测结果，达不到鉴别诊断的目的。
本发明的方法(试剂盒)的引物探针是基于非洲猪瘟病毒P72基因、MGF360-505R基因和CD2V基因中高度保守的核苷酸序列(基因片段)设计合成，也可以适用对其它非洲猪瘟病毒的MGF基因缺失株和CD2V基因基因缺失株的鉴别诊断，只要这些基因缺失株所缺失基因片段的核苷酸序列与该方法的引物探针能够完全匹配，即这些基因缺失株的亲本株能为这些引物探针提供正确的DNA扩增模板。因此，该方法适应于ASFV强弱毒的鉴别诊断。
附图说明
图1显示ASFV强毒株(Pig/CN/HLJ/2018)样品的P72-FAM、CD2V-HEX和MGF-Cy5三个荧光通道的Ct值(分别为26.07、26.94和25.12)。
图2显示阴性对照样品的P72-FAM、CD2V-HEX和MGF-Cy5三个荧光通道的Ct值(均为NoCt)。
图3显示rASFV△360-eGFP样品的P72-FAM、CD2V-HEX和MGF-Cy5三个荧光通道的Ct值(分别为28.81、31.52和NoCt)。
图4显示rASFV△CD2V/360-eGFP-mCherry样品的P72-FAM、CD2V-HEX和MGF-Cy5三个荧光通道的Ct值(分别为24.75、NoCt和NoCt)。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明做进一步的阐述，但仅仅是示例，其并不是对本发明产生任何限制。
1.材料方法
1.1细胞与病毒 猪肺泡巨噬细胞(PAM)、非洲猪瘟强毒株(Pig/CN/HLJ/2018)、非洲猪瘟单基因缺失株(rASFV△360-eGFP)、双基因缺失株(rASFV△CD2V/360-eGFP-mCherry)(申请号：201910348878.7)，均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所鉴定与保存。
1.2DNA制备 利用含有某种病毒的组织脏器匀浆液、细胞培养物或血液，按照DNA核酸提取试剂盒说明书提取病毒基因组DNA，并将收获纯化的DNA进行浓度测定。
1.2.1阳性对照
(1)P72阳性质粒拷贝数为108/μl的P72阳性质粒由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所构建、鉴定和保存。用于敏感性试验。
(2)ASFV基因组DNA用ASFV强毒株(Pig/CN/HLJ/2018)感染猪肺泡巨噬细胞，其培养物的病毒滴度达到106HAD50以上，用核酸提取试剂盒提取制备而成。用于鉴别诊断方法的建立和敏感性试验中的阳性对照。
(3)单基因缺失株基因组DNA用rASFV△360-eGFP感染猪肺泡巨噬细胞，其培养物的病毒滴度达到107TCID50以上，用核酸提取试剂盒提取制备而成。用于鉴别诊断方法的建立。
(4)双基因缺失株基因组DNA用rASFV△CD2V/360-eGFP-mCherry感染猪肺泡巨噬细胞，其培养物的病毒滴度达到107TCID50以上，用核酸提取试剂盒提取制备而成。用于鉴别诊断方法的建立。
1.2.2阴性与空白对照以健康猪肾或脾组织经核酸提取试剂盒提取的基因组DNA作为阴性对照，空白对照为去离子双蒸水(ddH2O)，用于鉴别诊断方法的建立和敏感性试验中的阴性与空白对照。
1.2.3特异性验证样品PCV-2和PrV的DNA、PEDV、FMDV、HCV和PRRSV的cDNA由各自病毒的细胞培养物，其毒价TCID50均达到106以上，分别用核酸提取试剂盒提取制备而成。阴性对照样品是健康猪组织的基因组DNA。
1.2.4受检样品以感染剂量1×102.5HAD50的ASFV强毒株(Pig/CN/HLJ/2018)感染30日龄的SPF猪，7天濒死时采集血液1份，取脾脏、淋巴结各1份；以免疫剂量107TCID50的rASFV△360-eGFP免疫30日龄的SPF猪，10天后剖杀采集淋巴结2份；以免疫剂量107TCID50的rASFV△CD2V/360-eGFP-mCherry免疫30日龄的SPF猪，10天后剖杀采集淋巴结2份；现地猪血液样品18份。
上述非洲猪瘟病毒强弱毒的肺泡巨噬细胞感染试验、SPF猪的感染和免疫试验，均在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所P3和P4实验室进行。
1.3引物探针设计与合成 根据黑龙江流行株Pig/CN/HLJ/2018中CD2V、MGF、P72三个基因序列，设计非洲猪瘟病毒强弱鉴别诊断的引物探针。引物设计过程中，考虑引物与探针的长度(nt)、退火温度(Tm℃)、CG含量(CG％)和荧光探针修饰物的选择等影响因素。我们通过Genebank数据比较已有非洲猪瘟病毒的目的基因序列结果的基础上，选取目的基因中最保守的一段核苷酸序列(基因片段)作为DNA扩增模板，利用引物探针设计软件筛选候选的引物与探针，再在Genebank数据库中进行序列比对，以确保引物与探针的特异性和扩增效率。在针对CD2V、MGF二个基因的引物探针设计上，必须充分考虑扩增效率一致性问题，即在判定标准的制定中，CD2V、MGF、P72三个基因的Ct值的离散度越小越好。因为一旦它们的扩增效率不一致时，各自的Ct值会差异较大，那么当受检样品模板浓度较低时，会出现错误的检测结果，达不到鉴别诊断的目的。通过筛选和验证，最终得到非洲猪瘟病毒强弱鉴别诊断的引物探针信息如下表1，由吉林省库美生物科技有限公司合成。
表1：引物探针信息
引物 序列5'-3' Tm℃ CG％ nt 分子量(g/mol) 修饰
CD2V-F agaaatagaaagtccaccacctga 59.10 41.70 24 7347.9
CD2V-R tttaggtaagggaaatgggttg 58.00 40.90 22 6909.6
CD2V-probe agtggttgtgttgagggacgcatgtagtaaa 69.00 45.20 31 9710.4 5'HEX-3'TRMRA
MGF-F cctagctctcgacagaggtccc 62.80 63.60 22 6656.4
MGF-R aaggctcataaaatcagcaggtatt 59.10 36.00 25 7698.1
MGF-probe ctccgtgttgacagataccagcccg 70.00 60.00 25 7603 5'Cy5-3'BHQ2
ASFV-F ctgctcatggtatcaatcttatcga 60.30 40.00 25 7607
ASFV-R acggcygatcttgtggtatc 59.20 52.50 20 6103
ASFV-P ccacgggaggaataccaacccagtg 70.30 60.00 25 7670 5'FAM-3'BHQ1
1.4非洲猪瘟病毒强弱毒荧光定量PCR鉴别诊断方法的建立
(1)样品处理脾脏/淋巴结、猪肺泡巨噬细胞病毒培养物、血液，在P3实验室内按DNA核酸提取试剂盒说明书提取基因组DNA。提取得到的核酸取2μl作为PCR模板用。
(2)反应体系反应体系按25μl/管的量进行配制，其中含引物探针的ASMC-PCR反应液和ASFV-PCR酶的扩增试剂23μl，模板量2μl。扩增试剂根据“待检样本数+阳性对照+阴性对照+1＝应测试数N”，按照表2的比例进行配制
表2：试剂配制
试剂组分 扩增试剂配制方法
ASMC-PCR反应液 22.5μl×N
ASFV-PCR酶 0.5μl×N
按照每管23μl分装扩增试剂后，然后加入提取好的样本模板(DNA模板)2μl，同时设定阴性、阳性对照，加完样品后盖上盖子再瞬时离心，上机检测。
(3)反应条件与程序设定在定量PCR仪(BIO-RAD:CFX96)上按照表3进行程序设定；荧光检测通道选择：FAM，HEX和Cy5。具体检测通道设置可参照各仪器使用说明书进行。
表3：程序设定参数
Figure BDA0002262421410000091
(4)结果判定
(a)试验结果成立的条件ASFV阳性对照有明显指数扩增曲线且三个通道Ct值≤35，阴性对照检测结果为无Ct值显示或Ct值＞35，二者均成立才可判定试验成立，否则试验无效。
(b)结果判定标准：在试验结果成立的条件下，按表4判定标准进行结果判定。
表4：判定标准
Figure BDA0002262421410000092
1.5敏感性试验
用P72阳性质粒(拷贝数108/μl)按照1:10、1:102、1:103、1:104、1:105、1:106和1:107进行梯度稀释，每个稀释度设置3个重复，同时设置阴性、阳性和空白对照。按照建立方法的反应条件在PCR仪设置程序并进行PCR扩增。
1.6特异性试验
将纯化好的PCV-2和PrV的DNA，以及PEDV、FMDV、HCV和PRRSV的cDNA作为特异性验证用样品。同样根据反应体系中每个样品需要扩增试剂23μl进行配制，分装后再分别加入各2μl模板，同时设置阴性、阳性对照。最后按照反应条件在PCR仪设置程序并进行PCR扩增。
2.结果
2.1鉴别诊断方法的建立
通过对非洲猪瘟强毒株(Pig/CN/HLJ/2018)、基因缺失弱毒株(rASFV△360-eGFP、rASFV△CD2V/360-eGFP-mCherry)感染猪肺泡巨噬细胞后提取的DNA以及阴性对照样品进行了荧光定量PCR检测，结果表明，ASFV强毒株(Pig/CN/HLJ/2018)样品的P72-FAM、CD2V-HEX和MGF-Cy5三个荧光通道的Ct值分别为26.07、26.94和25.12(图1)，阴性对照样品的P72-FAM、CD2V-HEX和MGF-Cy5三个荧光通道的Ct值均为NoCt(图2)，rASFV△360-eGFP样品的P72-FAM、CD2V-HEX和MGF-Cy5三个荧光通道的Ct值分别为28.81、31.52和NoCt(图3)，rASFV△CD2V/360-eGFP-mCherry样品的P72-FAM、CD2V-HEX和MGF-Cy5三个荧光通道的Ct值分别为24.75、NoCt和NoCt(图4)。由此可知：对于强毒株样品：P72-FAM的Ct值≤35、CD2V-HEX的Ct值≤35和MGF-Cy5的Ct值≤35；阴性对照样品：P72-FAM的Ct值>35、CD2V-HEX的Ct值>35和MGF-Cy5的Ct值>35；单基因缺失株样品：P72-FAM的Ct值≤35、CD2V-HEX的Ct值≤35和MGF-Cy5的Ct值>35；双基因缺失株样品：P72-FAM的Ct值≤35、CD2V-HEX的Ct值>35和MGF-Cy5的Ct值>35。
这满足了ASFV强弱毒鉴别诊断的判定标准，完全能够将ASFV强毒株(Pig/CN/HLJ/2018)与基因缺失弱毒株(rASFV△360-eGFP、rASFV△CD2V/360-eGFP-mCherry)加以区分。
2.2敏感性试验结果
用P72阳性质粒(拷贝数108/μl)按照1:10、1:102、1:103、1:104、1:105、1:106和1:107进行梯度稀释，每管拷贝数分别为2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102和2×10。结果详见下表5。其中前5个稀释度各样品的Ct值均＜35，结果均为阳性，而1:106的稀释度(200个拷贝/管)的Ct值在35～37之间，同是具有典型的S型扩增曲线。因此，其敏感性试验结果为200个拷贝/管。
表5：敏感性试验结果
Figure BDA0002262421410000111
注：P为阳性对照，N为阴性对照，ddH2O为空白对照。
2.3特异性试验结果
对PCV-2和PrV的DNA，以及PEDV、FMDV、HCV和PRRSV的cDNA作为特异性验证用样品进行检测，在试验结果成立的条件下，各样品P72-FAM、CD2V-HEX和MGF-Cy5的Ct值均＞35，结果均为阴性。
2.4受检样品检测结果
对ASFV强毒株(Pig/CN/HLJ/2018)感染猪的血液、脾脏和淋巴结样品各1份，rASFV△360-eGFP免疫猪的淋巴结样品2份；rASFV△CD2V/360-eGFP-mCherry免疫猪的淋巴结样品2份和收集的现地猪血液样品18份进行检测，结果见表6。
其中，样品1-3号为ASFV强毒株(Pig/CN/HLJ/2018)人工感染猪的血液和组织样品，样品4-8号为ASFV现地流行株自然感染猪的血液样品，样品9-10号为rASFV△360-eGFP免疫猪的淋巴结；样品11-12号为rASFV△CD2V/360-eGFP-mCherry免疫猪的淋巴结；样品13-25号为ASFV阴性猪的血液样品；样品26-28号分别为空白对照、阴性对照和P72阳性对照。
由表6可知，样品1-8号的P72-FAM、CD2V-HEX和MGF-Cy5三个荧光通道的Ct值均＜35；样品9-10号的P72-FAM和CD2V-HEX二个荧光通道的Ct值均＜35，而其MGF-Cy5荧光通道的Ct值均为NoCt；样品11-12号的P72-FAM荧光通道的Ct值均＜35，而其CD2V-HEX和MGF-Cy5二个荧光通道的Ct值均为NoCt；样品13-25号的P72-FAM荧光通道的Ct值均≥36.57或NoCt，而其CD2V-HEX和MGF-Cy5二个荧光通道的Ct值均为NoCt。上述检测结果，完全符合ASF强弱毒荧光定量PCR鉴别诊断的判定标准与条件，因此该方法能够用于ASFV强弱毒的鉴别诊断。
表6：受检样品检测结果
Figure BDA0002262421410000121
Figure BDA0002262421410000131
序列表
<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)
<120>非洲猪瘟病毒强弱毒荧光定量PCR鉴别诊断试剂盒
<160>9
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400> 1
agaaatagaa agtccaccac ctga 24
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tttaggtaag ggaaatgggt tg 22
<210>3
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
agtggttgtg ttgagggacg catgtagtaa a 31
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
cctagctctc gacagaggtc cc 22
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
aaggctcata aaatcagcag gtatt 25
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
ctccgtgttg acagatacca gcccg 25
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
ctgctcatgg tatcaatctt atcga 25
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
acggcygatc ttgtggtatc 20
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
ccacgggagg aataccaacc cagtg 25

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟病毒MGF基因缺失弱毒荧光定量PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于包括下述检测用引物对和探针：
正向引物MGF-F：5` cctagctctcgacagaggtccc 3`，
反向引物MGF-R：5` aaggctcataaaatcagcaggtatt 3`，
探针MGF-probe：5` ctccgtgttgacagataccagcccg 3`。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述MGF基因缺失是指非洲猪瘟病毒的MGF360-505R基因缺失病毒，所述非洲猪瘟病毒是基因I I型的非洲猪瘟病毒，更具体是全长基因组序列如GenBank:MK333180.1中所述的中国流行株Pig/CN/HLJ/2018。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述MGF360-505R基因缺失病毒相对于原始毒株全长序列缺失了第27942-35500位核苷酸，特别优选地所述MGF360-505R基因缺失病毒，其保藏号为CCTCC NO:V201925。
4.一种非洲猪瘟病毒CD2V与MGF基因联合缺失株弱毒荧光定量PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，包括下述检测用引物对和探针：
正向引物MGF-F：5` cctagctctcgacagaggtccc 3`，
反向引物MGF-R：5` aaggctcataaaatcagcaggtatt 3`，
探针MGF-probe：5` ctccgtgttgacagataccagcccg 3`；
以及，
正向引物CD2V-F：5` agaaatagaaagtccaccacctga，
反向引物CD2V-R：5` tttaggtaagggaaatgggttg，
探针CD2V-probe：5` agtggttgtgttgagggacgcatgtagtaaa。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述CD2V与MGF基因联合缺失病毒是指缺失CD2V与MGF360-505R基因联合缺失。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，相对于原始毒株全长序列缺失了第27942-35500位和第73394-74476位核苷酸，特别优选地，所述CD2V与MGF360-505R基因联合缺失病毒，其保藏号为CCTCC NO:V201924。
7.如权利要求1至6任一项所述的试剂盒，还包括用于检测阳性对照的强毒株的引物对和探针：
正向引物ASFV-F：5` ctgctcatggtatcaatcttatcga 3`，
反向引物ASFV-R：5` acggcygatcttgtggtatc 3`，
探针ASFV-P：5` ccacgggaggaataccaacccagtg 3`。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其中所述各种探针用荧光标记进行修饰，例如FITC，FAM，HEX，Cy3，Cy5，Cy5.5，或Cy7，RB200，任选地，在试剂盒中有两种或三种探针的情况下，各种探针分别用不同的荧光标记进行修饰。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括其他用于检测的相关试剂。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸提取液，缓冲液，或/和ddH2O。
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