CN103757137B

CN103757137B - 同步检测三种猪病毒的共有引物核酸扩增方法与试剂盒

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Publication number: CN103757137B
Application number: CN201410029934.8A
Authority: CN
Inventors: 陈茹; 高小博; 宋长绪; 薛春宜; 于晓璐; 段燕喻; 李艳; 刘志玲; 陈芳
Original assignee: Inspection and Quarantine Technology Center of Guangdong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Inspection and Quarantine Technology Center of Guangdong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2014-01-22
Filing date: 2014-01-22
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2034-01-22
Also published as: CN103757137A

Abstract

本发明提供一种通过锁核酸（LNA）修饰碱基共有引物引导的同步快速检测猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒三种重要猪病原的新型核酸扩增检测方法及其检测试剂盒，设计筛选了一对含有LNA修饰碱基的共有引物和三对5＇端带有共有引物碱基序列的病毒特异引物，通过优化的反应体系和两步PCR扩增反应条件，使得反应过程中主要由LNA修饰碱基共有引物引导特异PCR扩增反应，实现简便、高效地同步检测猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒。本发明验证了LNA修饰碱基共有引物能够高效引导多重PCR扩增，为研究发明适合其他用途多重PCR体系的修饰碱基共有引物提供研究和实验基础。

Description

同步检测三种猪病毒的共有引物核酸扩增方法与试剂盒

技术领域

本发明属生物技术领域，具体而言，提供一种同步检测猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒三种猪病毒的新型核酸扩增检测方法及其检测试剂盒。

背景技术

（一）猪病原体同步快速检测技术现状

猪可感染多种病原，并且猪发生多种疫病后呈现相似甚至临床难于鉴别的病症，给疾病的准确诊断带来困难。各国科学家均努力研究开发能同步检测鉴别多种疾病病原体的方法，分子生物学技术的飞速发展为实现多种猪疫病同步鉴别检测提供了技术基础。

在猪疫病检测方面，国内外已公开发表的多重检测方法主要为二重和三重PCR方法。目前多重常规PCR或多重实时荧光PCR遇到的主要问题是多重反应带来的检测灵敏度和特异性下降，这主要是由于在多重体系中多条引物、探针相互之间竞争模板、dNTP、酶等资源以及交叉反应问题；在多重实时荧光PCR方面，仪器分辨力以及可选荧光基团的组合是制约多重荧光PCR检测通量的关键因素，现有的设备平台和可供选用的荧光染料不能很好解决不同检测通道荧光信号交叉干扰以及仪器对不同荧光基团分辨敏感性差异问题。上述因素限制了多重PCR技术的发展。现有常规多重PCR技术是将多对引物混合在一起，然后进行多重核酸扩增，存在检测灵敏度下降、检测效果不理想、临床检验中应用效果不佳等不足。

近10年来，国外研究人员积极探索共有引物扩增技术研究，目前国外已发表采用共有引物的多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probeamplification，MLPA），该技术的原理是设计连接探针先进行连接反应，其中每对探针上都携带有一对共有引物序列，然后采用连接探针上的共有引物对连接产物进行PCR扩增，最多可以对45个目标模板分子进行定量鉴别。国外有研究采用MLPA技术可以同时检测7种性传播疾病、15种呼吸道疾病病原体（MuvunyiCM，2011；BruijnesteijnvanCoppenraetLE，2010）。国内也有1篇采用类似MLPA技术同步检测3种猪源性病毒的报道（郑鸣等，2011）。但该技术目前还不成熟，其反应体系较复杂、反应步骤较多，目前检测效果不理想，还不适合实际应用。TEM-PCR技术是QIAgen公司的多重PCR专利技术,其技术原理也是采用特异性引物加共有引物的模式，整个反应体系需要加入3对引物，同时检测25种不同类型的人乳头瘤病毒（JianHan，2006）。但该方法在实际应用中仍存在很大问题，主要是灵敏度不够。上述两种已发表方法中采用的共有引物由常规碱基组成。

国外的研究发现，在寡核苷酸中加入锁核酸（LNA）修饰碱基可显著增强寡核苷酸与DNA模板的结合能力；含有LNA修饰碱基的寡核苷酸探针已广泛应用于荧光PCR反应体系。国外研究人员已发表采用含有LNA碱基的引物进行PCR扩增的对比试验。研究证实，在PCR扩增引物中引入LNA修饰碱基可提高常规PCR和荧光PCR扩增的效率，包括特异性和灵敏度，含有LNA修饰碱基的PCR引物其Tm值提高，PCR反应可耐受70℃以上的退火温度。

迄今国内外均没有发表采用含LNA修饰碱基的共有引物PCR方法检测猪病原体的研究或应用报道。

（二）、相关猪病毒病及危害

猪圆环病毒2型(PCV-2)。猪圆环病毒（Porcinecircovirus，PCV）是迄今发现的一种最小的动物病毒。PCV有PCV-1和PCV-2两个血清型，其中PCV-1为非致病性病毒，PCV-2具有致病性。PCV-2是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PostweaningMultisystemicWastingSyndrome，PMWS）的主要病原，PCV-2所引起的疾病是当今养猪业密切关注的重大传染病之一。它能造成猪的生长缓慢，饲料报酬降低，同时侵害猪的免疫系统，导致机体的免疫力下降，引起其他疾病的大爆发，给世界各国养猪业的发展造成了严重威胁和巨大的经济损失。PCV最早发现于加拿大（1991），很快在欧美及亚洲一些国家包括我国发生和流行，目前已经在世界范围内广泛存在，现已被公认为是继猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）之后新发现的引起猪免疫障碍的重要传染病。已证实PCV-2可在猪群中垂直传播，在自然感染和人工感染猪的精液中均已检测到PCV-2病毒，在自然感染猪群中，能从精液中分离到PCV-2病毒的比例达50%（Guérin B et al，2005），感染后5-47天可从精液中分离到PCV-2病毒，精液带毒持续时间较长，甚至在猪体产生抗体后仍可从精液中分离到病毒。感染公猪可长期间歇性排放PCV-2，而猪精液是传播PCV-2的重要途径（Kim J et al，2001）。

猪伪狂犬病病毒（Aujeszky’sdiseasevirus，PRV）。猪伪狂犬病病毒(PRV)属疱疹病毒科(Herpesviridae)、猪疱疹病毒属。PRV在全世界广泛分布。猪是PRV的贮存宿主，PRV主要通过已感染猪排毒而传给健康猪，猪群中PRV主要通过鼻分泌物传播，也可通过乳汁和精液传播方式。感染PRV对15日龄以内的仔猪发病死亡率可达100％，断奶仔猪发病率可达40％，死亡率20％左右；对成年肥猪可引起种猪不育症、生长停滞、增重缓慢等。PRV属疱疹病毒，在自然环境中很稳定，在动物体内可形成潜伏感染，病毒在猪体内终生潜伏，在应激条件下可阶段性复苏并排毒，导致伪狂犬病难于根除。从人工感染和自然感染的猪体精液中可不定期分离到PRV，猪精液中PRV病毒滴度可高达10^3.7-10⁹TCID₅₀/mL（Maes D et al，2008）。PRV病毒可在公猪生殖器官中复制从而导致精液带毒，PRV感染猪在病毒血症期间可排放感染白细胞到精液中。接受人工授精的母猪被PRV带毒精液感染后发生血清阳转和子宫病症。

猪细小病毒（Porcineparvovirus，PPV）。猪细小病毒病是由猪细小病毒(PPV)引起的一种繁殖机能障碍性疾病，引起母猪繁殖障碍，全球均有发生。PPV对热稳定性强。各年龄段的家猪和野猪均易感。传染源主要来自感染母猪和带毒公猪，病毒能通过胎盘垂直传播，感染母猪所产的死胎、仔猪及子宫内的排泄物中均含有很高滴度的病毒，带毒猪所产的活猪可能带毒排毒时间很长甚至终生。感染种公猪也是该病最危险的传染源，可在公猪的精液、精索、附睾、性腺中分离到病毒（Gradil C et al，1990；Thacker B J et al，1987）。种公猪通过配种传染给易感母猪，并使该病传播扩散。怀孕母猪出现繁殖障碍，如流产、死胎、产木乃伊、产后久配不孕等。

上述三种猪病毒是引起猪繁殖障碍疾病的重要病原，所引起的疫病在养猪业常见多发、防治难度大，临床已发现2种甚至3种猪病毒混合感染的情况，在养猪业已造成严重危害。

研究开发同步检测上述多种猪病原体的方法，不但有助于生猪养殖过程中的疫病防控，对于猪精液等遗传物质的安全质量把关也具有重要的实用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一组用于同步检测鉴别猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)的新型核酸扩增方法中使用的引物及其核酸；本发明的另一目的在于提供了一种基于修饰碱基共有引物的新型核酸扩增同步检测PCV-2、PRV和PPV三种猪病毒的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一组用于同步检测鉴别猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)的新型核酸扩增方法使用的引物，其组成为：

含修饰碱基的共有引物对，其共有引物对的核苷酸序列分别如序列表SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示，其中引物SEQ ID No.1距5＇端第4、8、11位的碱基为锁核酸修饰碱基、引物SEQ ID No.2距5＇端第4、7、10位的碱基为锁核酸修饰碱基；

检测PCV-2病毒特异的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；

检测PRV病毒特异的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQID No.6和SEQ ID No.7所示；

检测PPV病毒特异的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQID No.9和SEQ ID No.10所示。

一组用于检测及鉴别PCV-2、PRV和PPV的新型核酸扩增方法中使用的核酸，该组核酸包括：

核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的共有引物序列；

核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示检测PCV-2病毒的序列和作为阳性对照含有PCV-2病毒阳性扩增产物如SEQ ID No.5所示的序列；

核苷酸序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示检测PRV病毒的序列和作为阳性对照含有PRV病毒阳性扩增产物如SEQ ID No.8所示的序列；

核苷酸序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示检测PPV病毒的序列和作为阳性对照含有PPV病毒阳性扩增产物如SEQ ID No.11所示的序列。

一种同步检测PCV-2、PRV和PPV三种猪病毒的新型核酸扩增非诊断性方法，该方法包括以下步骤：

（1）从样品中提取病毒核酸；

（2）对提取的核酸进行PCR扩增，其中

PCR扩增反应体系采用40μL体系：

共有引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，其中引物SEQ ID No.1距5＇端第4、8、11位的碱基为锁核酸修饰碱基、引物SEQ ID No.2距5＇端第4、7、10位的碱基为锁核酸修饰碱基，终浓度各为250nmol/L；

检测猪圆环病毒2型的特异性引物，上下游序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，其终浓度各为12.5nmol/L；

检测猪伪狂犬病病毒的特异性引物，上下游序列如SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6所示，其终浓度各为2.5nmol/L；

检测猪细小病毒的特异性引物，上下游序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示，其引物终浓度各为2.5nmol/L；

Mg²⁺终浓度1.5mmol/L；

dNTP终浓度200μmol/L；

PCR缓冲液；

Taq聚合酶用量1-2unit；

模板1-5μL，用灭菌双蒸水补足总体积为40μL；

PCR扩增反应条件：

94℃预变性2分钟；第一步循环反应：94℃变性20秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行10个循环；接着进行第二步循环反应：94℃变性20秒，70℃退火10秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环；最后72℃延伸1分钟；

（3）对扩增产物进行电泳：阴性对照为灭菌生理盐水；阳性对照为分别携带有如序列表SEQ ID No.5、SEQ ID No.8、SEQ ID No.11所示序列的DNA；

（4）分析、判定结果：样品的扩增条带与阳性对照的扩增条带位置一致，且阴性对照无相应的扩增条带，则样品为阳性。

本发明方法结果的具体判定：本发明方法PCV-2扩增产物分子量382bp，PRV扩增产物分子量235bp，PPV扩增产物分子量529bp；扩增反应结束后，取反应产物按常规进行电泳，若电泳出现上述1到3条分子量符合的电泳条带，则判定为相应1到3种病毒检测阳性（详列如下），若未出现分子量符合的电泳条带，则判定为上述三种病毒检测阴性。

电泳出现382bp条带，判为PCV-2核酸检测阳性；

电泳出现235bp条带，判为PRV核酸检测阳性；

电泳出现529bp条带，判为PPV核酸检测阳性；

电泳同时出现382bp、235bp条带，判为PCV-2和PRV核酸检测阳性，显示两种病毒混合感染；

电泳同时出现382bp、529bp条带，判为PCV-2和PPV核酸检测阳性，显示两种病毒混合感染；

电泳同时出现235bp、529bp条带，判为PRV和PPV核酸检测阳性，显示两种病毒混合感染；

电泳同时出现382bp、235bp和529bp条带，判为PCV-2、PRV和PPV核酸检测阳性，显示三种病毒混合感染。

为进一步确证检测结果，可对扩增产物进行核酸序列测定，将测得的核酸序列与已知病毒核酸序列进行同源性比对，序列吻合的确证为相应病毒核酸检测阳性。

本发明的另一方面还提供一种基于修饰碱基共有引物的同步检测鉴别PCV-2、PRV和PPV三种猪病毒的非诊断性试剂盒，所述试剂盒包括：

PCR缓冲液；

共有引物对，核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，引物SEQ IDNo.1距5＇端第4、8、11位的碱基为锁核酸修饰碱基、引物SEQ ID No.2距5＇端第4、7、10位的碱基为锁核酸修饰碱基；

检测PCV-2病毒的引物，核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；

检测PRV病毒的引物，核苷酸序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示；

检测PPV病毒的引物，核苷酸序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示；

dNTP；

MgCl₂；

Taq DNA聚合酶；

灭菌双蒸水；

阴性对照：灭菌生理盐水；

阳性对照：携带有扩增产物序列的DNA，所述扩增产物的核苷酸序列如SEQID No.5、SEQ ID No.8和SEQ ID No.11所示。

本发明通过在反应体系中引入锁核酸（LNA）修饰碱基共有引物，提供了一种同步检测PCV-2、PRV和PPV三种猪病毒的新型三重核酸扩增检测方法及试剂盒。本发明设计了共有引物与5＇端加有共有引物常规碱基序列的特异引物，共有引物为与NCBI网络数据库中各种已知动植物及微生物核酸序列无同源性的引物，共有引物合成时采用LNA修饰碱基；加有共有引物常规碱基序列的特异引物为病毒特异引物5＇端加共有引物常规碱基序列作为特异性扩增的特异引物。在反应体系中，加入微量的病毒特异引物和常规用量的LNA修饰碱基共有引物，采用两个阶段（两步）的循环扩增反应策略，在扩增反应第一阶段（第一步），采用较低的退火温度和较少的循环数，使特异引物能够参与扩增反应引导产生少量5＇端含共有引物序列的特异扩增产物模板；在扩增反应第二阶段（第二步），引物浓度优势和提高的退火温度确保LNA修饰碱基共有引物发挥主导作用，由LNA修饰碱基共有引物引导病毒特异扩增产物的生成。

本发明成功研究了能够引导多重扩增的一对LNA修饰碱基共有引物。采用本发明方法及检测试剂盒，能够从含三种病毒的混合样品中成功检测到三种特异扩增产物。本发明由于大大减少了多条病毒特异引物的用量（比常规用量减少20-100倍），还达到降低检测成本的目的。采用共有引物可有效降低甚至避免多重PCR反应体系中多条特异扩增引物相互竞争干扰造成的非特异性反应和灵敏度下降问题。本发明的方法检测PCV-2的最低检出限可达225fg，检测PRV的最低检出限可达255fg，检测PPV的最低检出限可达87fg，检测灵敏度高；对17种非PCV-2、PRV、PPV的样本检测均无特异性扩增，特异性强。本发明方法的又一个特点是，操作简便，除在反应体系中加入LNA修饰碱基共有引物这点差别外，其实验操作与常规PCR完全相同，可采用市售的各种常规PCR基础试剂组成反应体系，扩增反应可在常规PCR扩增仪上进行，检测结果通过常规电泳检测进行判断，还可通过核酸序列分析进行确证。

本发明首次研究成功适用于常规多重核酸扩增的LNA修饰碱基共有引物，证实可通过采用一对LNA修饰碱基共有引物实现多重核酸扩增，为进一步改进当前普遍采用的完全依赖多条特异引物的多重PCR技术提供了一种新方法、新思路，具有重要的实用价值，并具体体现在提供了一种高效的同步检测鉴别PCV-2、PRV和PPV三种猪病毒的新型核酸扩增方法及试剂盒。

本发明的有益效果在于：本发明提供一种通过LNA修饰碱基共有引物引导的同步快速检测三种重要猪病原的新型核酸扩增检测方法和检测试剂盒，适合应用于临床，实现简便、高效和快速检测猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒。本发明的检测方法和试剂盒具有较强的特异性和高灵敏度。本发明的试剂盒不仅可以实现同步检测三种猪病毒，也可用于单独检测一种病毒或用于两种病毒的同时检测，检测试剂盒可针对不同的检测项目灵活应用，从而有效节约试剂。

附图说明

图1为本发明LNA共有引物扩增反应检测结果。

图2为本发明特异性检测结果。

图3为本发明对三种病毒核酸混合模板的敏感性试验检测结果。

图4为本发明对人工添加病毒的猪精液样品的检测结果。

具体实施方式

本发明采用修饰碱基共有引物多重核酸扩增技术，其原理与共有引物的多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）和TEM-PCR均不同：本发明建立的锁核酸（LNA）修饰碱基共有引物多重PCR反应体系中包括1对含有修饰碱基的共有引物和三对病原体特异性引物，病原体特异引物5＇端人工加上共有引物序列。反应体系中加入的特异性引物的浓度比共有引物浓度低，并且共有引物含有修饰碱基使得Tm值提高，使PCR反应可耐受70℃以上的退火温度；在PCR的早期，特异性引物参与引导扩增，随着PCR循环的进行，特异性引物由于浓度和Tm值较低处于竞争劣势，扩增反应主要由共有引物引导进行，通过提高退火温度可进一步保障共有引物的主导作用，从而有效减少甚至避免常规多重PCR扩增体系中多对特异性引物竞争引起的灵敏度和特异性下降问题，达到改善检测效果的目的。

（一）引物的设计

本发明根据如下原理对共有引物进行设计：引物的长度在20-25bp之间；引物退火温度的Tm值一般控制在58-65℃，上下游引物的Tm值基本一致；引物中的G+C含量控制在50%-60%；引物中四种碱基最好是随机分布的，不存在多聚嘌呤或多聚嘧啶，尤其在引物的3＇端不应超过2个连续的G或C；引物自身不存在连续4个碱基以上的互补序列；上下游引物之间尽量不存在互补序列；上下游引物与已知的各种动植物及微生物序列无同源性。根据以上设计原则，采用软件自动生成多段DNA序列，然后利用DNAMAN V6.0软件对引物的Tm值、引物自身及引物之间的互补性进行分析，然后根据上述引物设定原则选出最适的引物对，然后再将引物对通过NCBI网站进行BLAST分析，为了避免在检测临床样品时产生非特异性，筛选出与NCBI网络数据库中各种已知动植物及微生物核酸序列无同源性的引物对作为最适引物对。在筛选出的最适引物对的基础上，对引物5＇端的其中三个碱基G或C采用LNA修饰碱基，合成的引物采用HPLC纯化。筛选出的共有引物序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，引物SEQ ID No.1距5＇端第4、8、11位的碱基采用LNA修饰碱基、引物SEQ ID No.2距5＇端第4、7、10位的碱基采用LNA修饰碱基（序列见下表，表中带方框碱基为LNA修饰）。

根据猪圆环病毒2型（PCV-2）基因CAP的核酸序列，选择参考序列（GeneBankNo.JQ181589.1）；根据猪伪狂犬病病毒（PRV）基因gD的核酸序列，选择参考序列（GeneBankNo.KC981239.1）；根据猪细小病毒（PPV）基因NS1的核酸序列，选择参考序列（GeneBankNo.KF742500.1）；根据引物的退火温度在59℃左右，采用DNAMAN V6.0软件，分别设计出PCV-2、PRV、PPV特异的多条引物序列，然后分别进行实验室检测试验，根据检测试验结果筛选确定以下序列：如SEQIDNo.3、SEQIDNo.4所示的PCV-2特异的引物对，PCR产物SEQIDNo.5长度为382bp；序列如SEQIDNo.6、SEQIDNo.7所示的PRV特异的引物对，PCR产物SEQIDN o.8长度为235bp；序列如SEQIDNo.9、SEQIDNo.10所示的PPV特异的引物对，PCR产物SEQIDNo.11长度为529bp，本发明中的扩增产物通过采用特异性引物对病毒基因组核酸进行扩增，对扩增产物进行测序，然后与理论推导出来的序列进行比较，根据病毒特异序列加上两端共有引物序列后可推导出本发明中的扩增产物序列，与测序的结果一致。

引物委托英潍捷基北京有限公司合成，PAGE纯化。

序列如下表：

（二）本发明检测方法的建立和优化

1、基础反应试剂

本发明方法可采用常规的商品化PCR反应预混液（含dNTP、Mg²⁺、Taq聚合酶），通过加入适量引物形成反应体系；也可采用商品化的不含Taq聚合酶、dNTP、Mg²⁺的反应缓冲液，通过加入适量引物、dNTP、Mg²⁺和Taq聚合酶形成反应体系。

2、反应体系中引物浓度的优化

实验中将LNA修饰碱基共有引物配成10μmol/L，在40μL反应体系中以0.5μL的幅度递增，直至加入量达3μL，将三对病毒特异引物均配成10μmol/L、5μmol/L、2μmol/L、1μmol/L、0.5μmol/L、0.2μmol/L和0.1μmol/L等不同浓度工作液，在40μL反应体系将各引物的加入量从0.5μL开始，以0.5μL的幅度递增，直至加入量达3μL。采用矩阵法进行不同浓度引物组合的对比实验，对比实验的其它条件完全一致。

3、反应体系中Mg²⁺浓度的优化

在固定其它反应成分不变的情况下，试验采用不同Mg²⁺浓度梯度，Mg²⁺浓度从1.5mmol/L（指Mg²⁺在反应体系中的终浓度）开始，以0.5mmol/L的幅度递增，直至反应体系中Mg²⁺终浓度达3mmol/L。

4、扩增反应条件的优化

通过优化扩增反应中采用的引物退火温度、时间和扩增循环次数对扩增反应条件进行优化。根据共有引物和特异引物的Tm值，进行退火温度从58℃开始，以1℃的幅度递增，直至72℃，并在同一退火温度下试验不同退火时间1min、40s、30s、20s、10s、5s；实验中对仅含一步扩增循环反应和采用两步扩增循环的反应条件进行比较。

5、经过优化后建立的反应体系

（1）引物浓度

根据矩阵比对实验结果，确定LNA修饰碱基共有引物最佳反应浓度为250nmol/L，PRV、PPV特异引物最佳反应浓度为2.5nmol/L，PCV-2特异引物最佳反应浓度为12.5nmol/L。

（2）Mg²⁺浓度的优化

Mg²⁺会影响PCR反应的特异性和扩增效率。根据上述对不同浓度Mg²⁺试验结果，提高Mg²⁺浓度，扩增效率有所提高，但也产生非特异扩增，反应特异性受到影响。本发明最终选定的Mg²⁺浓度为1.5mmol/L。

（3）扩增反应条件的优化

采用上述优化的反应体系，对仅含一个阶段扩增循环反应和采用二个阶段扩增循环反应条件下的检测结果进行比较，结果确定采用含二个阶段扩增循环反应条件：即，在预变性后，先采用59℃、30s退火的反应条件进行第一阶段10个循环扩增，然后采用70℃、10s退火的反应条件进行第二阶段30个循环扩增的反应条件。

实验还进行在反应体系中去掉LNA共有引物的结果比对，结果如图1所示，显示在其他条件完全一致的情况下，缺失LNA共有引物则导致扩增产物量很少或电泳检测不到，说明在上述优化的反应体系和扩增反应条件下，多重扩增反应主要由LNA修饰碱基共有引物引导。

（4）确定的反应体系和扩增反应条件

如上所述，本发明所确定的反应体系和反应条件如下：

反应体系：40μL反应体系中各引物的终浓度：LNA修饰碱基上、下游引物各250nmol/L，PRV、PPV病毒特异性引物每条各25nmol/L、PCV-2病毒特异性引物每条各12.5nmol/L，Mg²⁺浓度1.5mmol/L，dNTP200μmol/L，Taq聚合酶用量1-2unit；模板1-5μL（根据模板核酸浓度进行调整）。

扩增反应条件：94℃预变性2分钟；第一步扩增循环反应：94℃变性20秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行10个循环；接着进行第二步扩增循环反应：94℃变性20秒，70℃退火10秒，72℃延伸30秒，共进行30个循环；最后72℃延伸1分钟。

在同样扩增条件、反应体系其它组份完全一样的情况下，反应体系中含LNA共有引物和不含LNA共有引物得到的扩增产物电泳结果，如图1所示，其中图中M：核酸标准分子量marker；1～4：采用含LNA共有引物的反应体系进行的扩增反应；5～8：采用不含LNA共有引物的反应体系进行的扩增反应；1、5：PCV-2、PRV和PPV三种病毒核酸混合模板，2、6：PCV-2、PPV二种病毒核酸混合模板，3、7：PPV、PRV二种病毒核酸混合模板，4、8：PCV-2、PRV二种病毒核酸混合模板；从电泳图可看出，对分别含二种病毒核酸和三种病毒核酸的混合模板进行扩增反应，含LNA共有引物的扩增反应能得到预期的二条或三条扩增产物，而不含LNA共有引物的扩增反应仅能得到极少量的个别扩增产物（电泳显示仅有微弱的个别条带），不能同时获得多条扩增产物。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对本发明的限定，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围，本发明中所用的方法和试剂，如无特殊说明，均为常规方法和试剂。

实施例1同步检测三种猪病毒的共有引物核酸扩增新方法

一种同步检测PCV-2、PRV和PPV三种猪病毒的新型核酸扩增非诊断性方法，该方法包括：

（1）从样品中提取病毒核酸；

（2）对提取的核酸进行PCR扩增，其中

PCR扩增反应体系采用40μL反应体系：

共有引物如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列，其中引物SEQ ID No.1距5＇端第4、8、11位的碱基采用锁核酸（LNA）修饰碱基、引物SEQ ID No.2距5＇端第4、7、10位的碱基采用锁核酸（LNA）修饰碱基，终浓度为250nmol/L；检测PRV的特异性引物，序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6，其引物终浓度各为2.5nmol/L；检测PPV病毒的特异性引物，序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示，其引物终浓度各为2.5nmol/L；检测PCV-2病毒的特异性引物，序列如SEQID No.3和SEQ ID No.4所示，其引物终浓度各为12.5nmol/L；Mg²⁺终浓度1.5mmol/L；dNTP终浓度为200μmol/L；PCR缓冲液；Taq聚合酶用量1-2unit，模板1-5μL；

PCR扩增反应条件为：

结果的具体判定：本发明方法PCV-2扩增产物分子量382bp，PRV扩增产物分子量235bp，PPV扩增产物分子量529bp；扩增反应结束后，取反应产物按常规进行电泳，若电泳出现上述1到3条分子量符合的电泳条带，则判定为相应1到3种病毒检测阳性（详列如下），若未出现分子量符合的电泳条带，则判定为上述三种病毒检测阴性。

电泳出现382bp条带，判为PCV-2核酸检测阳性；

电泳出现235bp条带，判为PRV核酸检测阳性；

电泳出现529bp条带，判为PPV核酸检测阳性；

上述引物委托英潍捷基北京有限公司合成，PAGE纯化。

实施例2本发明方法特异性、敏感性检测

1、特异性试验

采用PCV-2、PRV、PPV细胞增殖病毒株和病毒疫苗，提取纯化病毒核酸后，采用实施例1中确定的反应体系和扩增反应条件，对单一病毒核酸模板和三种病毒核酸混合的模板进行检测试验，结果如图2显示，图2中M：核酸标准分子量marker；1：PCV-2、PPV和PRV三种病毒的细胞毒核酸等量混合样品的检测结果；2：从三种病毒的商品化疫苗产品中提取的病毒核酸等量混合样品的检测结果；3：PPV细胞毒核酸样品的检测结果；4：PCV-2细胞毒核酸样品的检测结果；5：PRV细胞毒核酸样品的检测结果；6：阴性对照。由图2结果表明：对病毒单一模板和混合模板均能检测到与预期分子量相符的病毒特异阳性扩增产物，核酸序列并经测序核实。

采用实施例1的方法对上述三种目标病毒的各种毒株和疫苗样品以及各种其他常见猪病原体样品、猪组织全基因组核酸、常用的传代细胞全基因组核酸样品进行检测试验，结果显示仅PCV-2、PRV、PPV三种病毒或疫苗样品呈现阳性反应，其他各种样品均呈现阴性反应。说明本发明方法特异可靠，与各种常见猪病原体和猪组织等无非特异性交叉反应。检测结果详见表1。

表1特异性试验样品列表

注：“+”表示检测阳性；“—”表示检测阴性

2、敏感性试验

（1）核酸模板准备：从上述PCV-2、PRV和PPV病毒样品中提取纯化病毒核酸，采用NanoDrop核酸蛋白分析仪对纯化的PCV-2、PRV和PPV病毒核酸样品分别测定A₂₆₀吸光度值并换算成核酸浓度。将单一已知浓度病毒核酸样品进行10倍梯度系列稀释，将上述三种已知浓度病毒核酸样品两两等量混合或三种病毒核酸等量混合后的样品分别进行10倍梯度系列稀释。

（2）敏感性检测试验

采用实施例1的方法，对上述不同稀释度单一种病毒核酸、两两混合病毒核酸样品以及三种病毒核酸混合样品进行检测试验，每个稀释度均进行两管平行试验，得到检测终点稀释度，根据原始核酸样品的浓度换算为检测终点对应的模板用量。

检测试验结果显示，采用本发明方法对PCV-2、PRV和PPV单一病毒核酸模板的最低检测限（LOD）为每个反应（反应体积40μL）87fg～255fg，对三重模板混合样品中不同病毒的最低检测限（LOD）为每个反应（反应体积40μL）203fg～2.80pg，详见表2。

表2本发明方法敏感性试验数据

采用本发明方法对三种病毒核酸混合模板（三重模板）不同稀释度样品进行检测敏感性试验的电泳检测结果，如图3所示，图中：M为核酸标准分子量marker；从1至7分别为三重模板等体积混合样品原液、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵倍稀释样品、阴性对照。

实施例3临床样品和人工制备带毒猪精液的检测

1、从样品中提取纯化病毒核酸

本发明方法可用于检测动物血清、精液和组织等临床样品中的病毒以及细胞培养液中的病毒。样品经过研磨、离心等前处理后，可采用TRIzol提取法或商品化硅胶柱提取法提取纯化病毒核酸。

（1）样品前处理

1）猪组织样品前处理：猪内脏、肌肉等组织样品取适量，剪碎并研磨后，按1：5(W/V)比例加入灭菌PBS缓冲液，移入离心管，振荡混匀后，冻融3次，5000g离心1min，取上清进行后续核酸提取纯化。

2）猪精液样品前处理：取适量猪精液样品分装入离心管，振荡混匀后，冻融3次，5000g离心1min，取上清液进行后续核酸提取纯化。

3）动物血清和细胞培养病毒液可不需前处理，直接用于核酸提取；也可取适量样品进行5000g离心1min后，取上清液进行后续核酸提取纯化。

（2）TRIzol提取法：

1）取经适当前处理的待检样品200ul，加入1.5ml离心管，每管加入600ulTRIzol试剂，上下颠倒几次混匀后室温静置5min。

2）每管加入120ul氯仿，盖紧管盖，涡旋剧烈震荡15s后立即冰上静置5min。

3）10000g室温离心15min。

4）小心取出离心管，倾斜管壁用微量移液器小心吸取并弃掉上层水相，留中间蛋白层和下层有机相。

5）每管中加入250ul无水乙醇，反复颠倒混匀至溶液呈完全透明状，室温静置3min。

6）2000g室温离心5min。

7）倾斜离心管小心倒掉上层酚-醇有机相，加入750ul柠檬酸钠溶液（10%乙醇配制），涡旋震荡10s后室温静置20min，期间涡旋震荡数次。

8）2000g室温离心5min，倾斜离心管弃掉上层液体。

9）向管中加入1.5ml75%乙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min，期间轻微摇晃数次。

10）2000g室温离心5min，倾斜离心管弃掉上层液体。

11）打开管盖，室温自然干燥，待管壁上没有液滴时，向管底加入50ul ddH₂O悬浮DNA，室温放置5min后，用于进行检测试验或置4℃暂存、-20℃长期保存。

（3）硅胶柱提取法(商品化试剂盒)

1）吸取ProteinaseK溶液加入微量离心管，每管加入20ul。

2）每管加入200ul上述经前处理的样品上清液，并做好标记。

3）每管加入200ulcarrierRNA工作液，盖上管盖，涡旋震荡15s充分混匀。

4）置水浴锅，56℃水浴15min。

5）简短离心以收集管壁上液体，小心打开管盖，向其中加入250ul预冷无水乙醇（此时可能出现絮状沉淀），盖上管盖涡旋振荡30s，室温放置5min。

6）简短离心以收集管壁及管盖上的液体。

7）将硅胶柱放入收集管中，仔细将离心管中的液体和絮状沉淀全部转移至吸附柱上，盖上管盖做好标记。

8）6000g室温离心1min，弃掉废液。

9）向硅胶柱中加入500ul洗涤工作液，盖上管盖静置2min,6000g室温离心1min，弃废液。

10）重复步骤1.3.9一次。

11）小心打开盖子，加入500ul无水乙醇，盖上管盖，6000g室温离心1min。

12）弃废液，13000g室温离心3min使柱膜完全变干。

13）取出硅胶柱并放入1.5mlRNase-free离心管，向柱膜中央加入50ulRNase-freeddH₂O，盖上盖子室温放置5min。

14）13000g离心1min，在确定离心管底部有50ul液体后，弃掉硅胶柱，得到的纯化核酸液体可直接用于后续检测，或贮存于低温备用（-20℃以下）。

2、对猪临床样品的检测

从国内发生疑似疫情的养猪场采集临床样品共84份（包括猪血样43份、淋巴组织7份、猪精液34份）等，采用本发明方法进行检测，结果检出7份样品（其中血样5份、淋巴样品1份、猪精液1份）PCV-2阳性、另8份样品（其中血样2份、淋巴组织5份、猪精液2份）PRV阳性。

3、对人工制备带毒猪精液样品的检测

人工带毒猪精液样品的制备：将采用传代细胞增殖的三种猪病毒液等体积混合后，用PBS缓冲液进行10倍系列稀释，把不同稀释度混合病毒液按1:20比例（V:V）添加到商品化猪精液中，制备成不同带毒量猪精液样品。

对上述添加了不同病毒量的猪精液，采用本发明方法进行样品处理、病毒核酸提取纯化以及核酸扩增检测，结果如图4所示，图4中M为核酸标准分子量marker；从1至4分别对应添加了10¹、10²、10³、10⁴倍稀释混合病毒液的猪精液样品，结果表明采用本发明方法可检出猪精液中100-1000倍稀释的添加病毒液。根据纯化病毒核酸模板浓度，换算出本发明方法对带毒猪精液中PCV-2、PRV和PPV病毒核酸的检测低限（LOD）分别达到34.84pg、2.24pg和1.63pg。

Claims

1.一组用于同步检测鉴别猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)的核酸扩增方法使用的引物，其特征在于，其组成为：

含修饰碱基的共有引物对，共有引物对的核苷酸序列分别如序列表SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示，其中引物SEQ ID No.1距5′端第4、8、11位的碱基为锁核酸修饰碱基、引物SEQ ID No.2距5′端第4、7、10位的碱基为锁核酸修饰碱基；

检测猪圆环病毒2型特异的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；

检测猪伪狂犬病病毒特异的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示；

检测猪细小病毒特异的引物对，上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示。

2.一组用于检测及鉴别猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的核酸扩增方法中使用的核酸，其特征在于，该组核酸包括：

核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的共有引物序列；

核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示检测猪圆环病毒2型的序列和作为阳性对照含有猪圆环病毒2型阳性扩增产物如SEQ ID No.5所示的序列；

核苷酸序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示检测猪伪狂犬病病毒的序列和作为阳性对照含有猪伪狂犬病病毒阳性扩增产物如SEQ ID No.8所示的序列；

核苷酸序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示检测猪细小病毒的序列和作为阳性对照含有猪细小病毒阳性扩增产物如SEQ ID No.11所示的序列。

3.一种同步检测猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒三种猪病毒的核酸扩增非诊断性方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)从样品中提取病毒核酸；

(2)对提取的核酸进行PCR扩增，其中

PCR扩增反应体系采用40μL体系：

共有引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，其中引物SEQ ID No.1距5′端第4、8、11位的碱基为锁核酸修饰碱基、引物SEQ ID No.2距5′端第4、7、10位的碱基为锁核酸修饰碱基，终浓度各为250nmol/L；

Mg²⁺终浓度1.5mmol/L；

dNTP终浓度200μmol/L；

PCR缓冲液；

Taq聚合酶用量1-2unit；

模板1-5μL，用灭菌双蒸水补足总体积为40μL；

PCR扩增反应条件：

(3)对扩增产物进行电泳：阴性对照为灭菌生理盐水；阳性对照为分别携带有如序列表SEQ ID No.5、SEQ ID No.8、SEQ ID No.11所示序列的DNA；

(4)分析、判定结果：样品的扩增条带与阳性对照的扩增条带位置一致，且阴性对照无相应的扩增条带，则样品为阳性。

4.一种同步检测及鉴别猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒三种猪病毒的核酸扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

PCR缓冲液；

共有引物对，核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，引物SEQ IDNo.1距5′端第4、8、11位的碱基为锁核酸修饰碱基，引物SEQ ID No.2距5′端第4、7、10位的碱基为锁核酸修饰碱基；

检测猪圆环病毒2型的引物，核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；

检测猪伪狂犬病病毒的引物，核苷酸序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示；

检测猪细小病毒的引物，核苷酸序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示；

dNTP；

MgCl₂；

Taq DNA聚合酶；

灭菌双蒸水；

阴性对照：灭菌生理盐水；