CN113832260B

CN113832260B - 鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米pcr检测引物对、试剂盒及应用方法

Info

Publication number: CN113832260B
Application number: CN202110998757.4A
Authority: CN
Inventors: 张帆帆; 李海琴; 韦启鹏; 杨群; 康昭风; 谭美芳; 曾艳兵; 谭佳
Original assignee: Institute Of Animal Husbandry Veterinary Jiangxi Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute Of Animal Husbandry Veterinary Jiangxi Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-08-28
Filing date: 2021-08-28
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2041-08-28
Also published as: CN113832260A

Abstract

本发明涉及一种鹅星状病毒（GoAstV）、鹅细小病毒（GPV）与鹅嵌杯病毒（GoCV）多重纳米PCR检测引物对、试剂盒及其应用方法，所述试剂盒包括反转录混合液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照，本发明建立了鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒纳米PCR检测应用方法，并对该多重纳米PCR反应体系进行了优化，确定了引物浓度、退火温度、rTaq DNA聚合酶浓度、纳米粒子直径、纳米粒子浓度，使得GoAstV、GPV、GoCV三种病毒的扩增效果更佳；该方法具有灵敏度高、特异性好、稳定性高，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间﹐能彻底解决GoAstV、GPV、GoCV混合感染的诊断问题，适合临床实验室的快速检测。

Description

鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR检测引物对、试剂盒及应用方法

技术领域

本发明涉及动物疫病分子生物学诊断领域，具体涉及一种鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR检测引物对、试剂盒及其应用方法。

背景技术

近年来，全球新的水禽疫病不断出现，是导致水禽业损失惨重的一个重要原因。因此，建立一种快速检测水禽新发和再现变异病毒疾病的防控具有十分重要的意义。自2017年以来，在中国的许多省份，如安徽、山东、江苏、广东、辽宁、黑龙江、江西和河南等省份发现了越来越多的与星状病毒相关的鹅痛风疾病病例，死亡率高达50％，而新型鹅星状病毒(goose astroviruses,GoAstV)可以通过垂直传播，给预防和控制该疾病带来了更大的挑战。GoAstVs的基因组约为 7.0kb，包括一个5'非翻译区、三个开放阅读框(ORF1a、ORF1b和ORF2)、一个3'非翻译区和一个poly(A)尾部。ORF1a和ORF1b编码非结构蛋白，对病毒的转录和复制很重要；ORF2编码病毒的衣壳蛋白，为病毒的结构蛋白，与病毒的趋向性、中和表位和血清型的区分密切相关，对病毒生物学功能至关重要。ORF1b 为鹅星状病毒最保守基因，因此可以作为该病毒诊断的候选基因。

2008年，中国首次发现由新型鹅细小病毒(Novel goose parvovirus-relatedvirus,N-GPV)引起，以鹅软脚、嘴短和生长障碍为特征的临床症状。该病自2014 年在我国江苏、安徽、山东等地陆续报道过。被N-GPV感染的鸭群10％以上会受到生长影响，但病死率相对较低，不超过3％，而受病毒感染的鸭其淘汰率却在80％以上，给鸭业造成巨大的经济损失。N-GPV属于细小病毒，细小病毒亚科依赖病毒属，单链DNA病毒，无囊膜，二十面体对称,衣壳由32个管状壳粒组成。基因组大小约为5.1kb，两端存在可形成发夹结构的末端倒置重复序列 (ITR)，主要包含左右两个开放阅读框(ORF)，分别编码非结构蛋白(NS)和衣壳蛋白(VP)，其中非结构蛋白区域相对保守稳定，常被用做病原检测的基因。

嵌杯病毒科的成员是一类无囊膜的单链正链RNA病毒。该科中的一些成员是危害人类和动物健康的重要病原，如诺如病毒和札幌病毒可引发人的急性胃肠炎，猫嵌杯病毒能引发猫呼吸系统疾病，兔出血热病毒能引发兔的致死性疾病。在家禽业，嵌杯病毒可感染鸡、火鸡、金翅雀、雉鸡和白鸥等家禽，并可导致雉鸡肠炎。2016年张大丙等利用宏基因组测序的方法从肠炎患鹅的肠道病料样品中检测到一种新基因型水禽嵌杯病毒，与Nacovirus属成员NS蛋白的同源性仅为31％～34％。2018年至今，研究者从患有痛风的鹅中相继检测出一种新的GoCV 株，该病毒株与鹅肠炎型GoCV H146株同源性很高，而国内对GoCV鹅群的发病特点、传播途径及流行趋势等方面的研究还处于起步阶段。因此，采用合适的检测方法加强对GoCV的流行病学监控，对鹅病毒性肠炎与痛风的早期防治具有重要意义。

考虑到这三种新发病毒均能引起鹅群发生疾病，最近越来越多的研究表明，这三种病毒在临床上常呈混合感染，为疾病的诊断带来巨大的挑战。目前，三种病毒的检测方法主要包括：病原分离、血清抗体检测及病毒核酸检测等方法。其中病原分离存在工作量大、耗时长、分离困难等缺点，不便于病原的快速检测和开展大规模流行病学调查；抗体检测方法包括经典的病毒中和试验、琼脂免疫扩散试验、竞争ELISA等，虽然以上血清抗体检测方法可同时进行大量样品的检测，但是血清抗体的产生相对于病毒感染存在一定的滞后性，因此不利于疫病的早期诊断和防控，例如中国发明专利申请CN108802382B公开了一种鹅星状病毒抗体的ELISA试剂盒及制备方法。而单重检测技术已不能满足临床大批量检测的需求，而多重PCR技术能够在一个反应体系中同时检测多个临床样品，短时间内高效率鉴别检测几种病原，特别适合混合感染样品中多个病原的检测，综上考虑本研究建立了可同时检测这三种病毒的多重PCR检测技术，并用于临床样本检测。由于GoAstV、GPV和GoCV引起猪群发病的症状类似，因此，发明一种快速鉴别GoAstV、GPV和GoCV感染的诊断试剂盒，为临床快速确诊相应疾病，具有重要的现实意义。

随着人和动物新发疾病的发展越来越复杂，临床实践中各种疾病的早期诊断对体外诊断技术的灵敏度、检测限、检测速度等性能指标提出了越来越高的要求，这使得许多传统的、常规的体外诊断技术逐渐不能满足疾病诊断的需要。同时，随着我国建设的展开和对外开放的进一步加深，我国防控输入性疾病和对外医疗援助的难度与需求也空前增高，不同的应用环境也对实验诊断技术的分析速度、检测成本、操作难度等提出了各种各样的要求。而目前，并没有出现同时具备良好敏感性、特异性和稳定性的多重纳米PCR方法能同时检测鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒的技术应用。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR检测引物对、试剂盒及其应用方法，该鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR诊断试剂盒灵敏度高、特异性好、稳定性高、其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，为临床控制GoAstV、GPV和GoCV感染提供有力的技术手段。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。

本发明提供了一种鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR检测引物对，所述引物对包括GoAstV-F上游引物、GoAstV-R下游引物、GPV-F 上游引物、GPV-R下游引物、GoCV-F上游引物、GoCV-R下游引物，并且所述GoAstV-F上游引物的序列为：5'-GTTTGAGCAGGACCAGAATGA-3'：所述GoAstV-R下游引物的序列为：5'-GCCATAGCAAATCATGGTGAC-3'：所述GPV-F上游引物的序列为：5'-GCCTTTATTTACTGCTGCTGCT-3'：所述GPV-R下游引物的序列为：5'-CCCACCAAATCAGCATCTTATCA-3'；所述GoCV-F上游引物的序列为：5'-TGCATCTGGGACGAATTTGACAC-3'：所述GoCV-R下游引物的序列为：5'-CAGTGAGAGCACAAGGTGTGA-3'。

本发明还提供了一种含有权利要求1所述的鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR检测引物对的试剂盒，所述试剂盒用于诊断GoAstV、GPV、 GoCV的单一感染或混合感染。

进一步，本发明所述试剂盒含有反转录混合液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述反转录混合液包含PrimeScript IV Rtase、RNase Inhibitor、 Random6mers、dNTP Mixture、反转录PrimeScript IV Buffer(Mg⁺²plus)及ddH₂O；扩增反应混合液包含PCR Buffer(Mg⁺²plus)、dNTP Mixture，本发明所述的 GoAstV-F上游引物、GoAstV-R下游引物、GPV-F上游引物、GPV-R下游引物、 GoCV-F上游引物和GoCV-R下游引物，ddH2O，rTaqDNA聚合酶，金纳米粒子和ddH₂O；阴性对照为ddH2O；阳性对照为GoAstV、GPV和GoCV阳性质粒混合物。

进一步，所述反转录混合液包含5×PrimeScript IV Buffer(Mg⁺²plus)、RNaseInhibitor(40U/μl)、Random 6mers(10μM)、dNTP Mixture(10mM)，PrimeScript IV RTase反转录酶(200U/μl)和ddH2O；每个反应体积比为8：1：4：2：2：19；共计18μL，50个反应共计900μL，装成1管；

所述扩增反应混合液包含10×PCR Buffer(Mg⁺²plus)、dNTP Mixture(2.5mM)、GoAstV-F上游引物(10μM)、GoAstV-R下游引物(10μM)、GPV-F上游引物(10μM)、 GPV-R下游引物(10μM)、GoCV-F上游引物(10μM)、GoCV-R下游引物(10μM)、 rTaq DNA聚合酶(5U/μL)、金纳米粒子和ddH₂O，每个反应体积比为5：2：2：2： 2：2：2：2：0.5：4：21.5，共计22.5μL，50个反应共计1125μL，装成1管；

所述阴性对照为ddH₂O，50个反应共计2mL，装成1管；

所述阳性对照为GoAstV、GPV和GoCV阳性质粒混合物﹐50个反应共计 125μL，装成1管。

本发明还提供了一种利用本发明所述多重纳米PCR诊断试剂盒的应用方法，所述方法包括以下步骤：

1)提取待检测样品组织中的病毒RNA/DNA；

2)将所述RNA反转录为cDNA；

3)利用所述多重纳米PCR诊断试剂盒对所述病毒cDNA和DNA进行扩增；

4)判断临床样品是否为GoAstV、GPV、GoCV的单一感染或混合感染。

进一步，所述步骤2)的反转录反应条件为：用反转录混合液对所述RNA进行反转录：取反转录混合液18μL，加入所述待检测样品的RNA提取液2μL，混合均匀，置于PCR仪中进行cDNA的合成，以42℃15min，95℃5min反应程序进行。

进一步，所述步骤3)的扩增反应条件为：取扩增反应混合液22.5μL，加入所述待检测样品组织中的病毒cDNA/DNA 2.5μL；反应条件为：95℃预变性5min， 95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环，72℃总延伸5min。

进一步，所述步骤1)的提取方法为：

对于内脏组织样品，采集发病鹅群的内脏组织作为待检测样品，内脏组织经液氮速冻后，迅速转移至液氮预冷的研钵中，直至研磨成粉末状，按内脏组织与生理盐水1：3的质量比例进行研磨离心，使用离心柱型病毒DNA/RNA提取试剂盒提取组织中的病毒DNA和RNA，得待检样品RNA/DNA提取液；

对于粪便组织，对发病鹅群进行粪便收集，取约0.5g粪便加入1mL PBS稀释后充分涡旋，冻融1次，离心后使用离心柱型病毒DNA/RNA提取试剂盒提取组织中的病毒DNA和RNA，得待检样品RNA/DNA提取液；

对于血清样品，取发病鹅群血清样品，使用离心柱型病毒DNA/RNA提取试剂盒提取组织中的病毒DNA和RNA，得待检样品RNA/DNA提取液。

进一步，所述步骤1)的提取方法为：

对于内脏组织样品，采集发病鹅群的内脏组织作为待检测样品，内脏组织经液氮速冻后，迅速转移至液氮预冷的研钵中，直至研磨成粉末状，取大约25mg 组织加入500μLRNA-easy Isolation Reagent，剧烈振荡或移液枪吹打，使样品充分裂解，离心、取上清加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，离心，弃去上清液，加入75％乙醇洗涤，弃去洗涤液，在空气中自然干燥，加30μL ddH₂O溶解，得待检样品RNA提取液；

对于粪便组织，对发病鹅群进行粪便收集，取约0.5g粪便加入1mL PBS稀释后充分涡旋，冻融1次；4℃8000r/min离心5min，取200μL上清加入500μL RNA-easy IsolationReagent，剧烈振荡或移液枪吹打，使样品充分裂解，离心、取上清加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，离心，弃去上清液，加入75％乙醇洗涤，弃去洗涤液，在空气中自然干燥，加30μLddH₂O溶解，得待检样品RNA提取液；

对于血清样品的处理：取发病鹅群血清样品50μL，加入500μL RNA-easyIsolation Reagent，剧烈振荡或移液枪吹打，使样品充分裂解，离心、取上清加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，离心，弃去上清液，加入75％乙醇洗涤，弃去洗涤液，在空气中自然干燥，加30μL ddH₂O溶解，得待检样品RNA提取液；

进一步，所述步骤4)的判断是指测试步骤3)得到的扩增产物的电泳图，通过观察扩增产物电泳图是否包含相应病毒对应的预期条带，来判断临床样品是否为GoAstV、GPV、GoCV的单一感染或混合感染，其中鹅星状病毒对应的预期条带为484bp，鹅细小病毒对应的预期条带为607bp，鹅嵌杯病毒对应的预期条带为324bp。

从以上技术方案可以看出，本发明的优点是：

1、本发明建立的多重纳米PCR检测引物对、试剂盒及其应用方法，可准确检测鹅星状病毒、鹅细小病毒、鹅嵌杯病毒三种病变相似且同为RNA病毒的病毒一次检测，并对该多重纳米PCR反应体系及反应条件进行了优化，确定了最佳的引物比例、引物浓度、rTaq DNA聚合酶浓度、纳米粒子直径、纳米粒子浓度等，使得GoAstV、GPV、GoCV 3种病毒的RNA扩增效果更好，检测精度更高，在病毒鉴别领域具有重要优势。本发明的检测方法易于操作、方便快捷，能达到快速检测的目的。本发明能彻底解决GoAstV、GPV、GoCV流行病学监控，对鹅病毒性肠炎、痛风、生长障碍的早期防治具有重要意义。

2、本发明的提供了三对针对GoAstV、GPV和GoCV的特异性引物， GoAstV-F/GoAstV-R为GoAstV特异性扩增引物组，GPV-F/GPV-R为GPV特异性扩增引物组，GoCV-F/GoCV-R为GoCV特异性扩增引物组，利用其制成的多重试剂盒能快速、特异的检测出GoAstV、GPV和GoCV中的单一病毒以及二者以上的混合病毒，GoAstV出现484bp一个条带，GPV出现607bp一个条带， GoAstV、GPV两种病毒混合样品出现484bp、607bp两个条带；GoAstV、GoCV两种病毒混合样品出现484bp、324bp两个条带；GPV、GoCV两种病毒混合样品出现607bp、324bp两个条带；GoAstV、GPV、GoCV三种病毒混合样品出现484bp、607bp、324bp三个条带。

3、本发明在多重纳米PCR体系中加入了18～20nm的金纳米粒子，对扩增反应具有明显的优化效果，且针对鹅星状病毒、鹅细小病毒、鹅嵌杯病毒的扩增反应，比银纳米粒子、碳纳米粒子具有更加优良的优化效果。

4、本发明提供的鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR诊断试剂盒在12个月内检测结果一致，表明本发明鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR诊断试剂盒具有很高的稳定性。田间试验证明本发明所得的鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR诊断试剂盒实用性和适用性良好。

附图说明

图1为初始反应条件下和优化后最佳反应条件下PCR反应后的电泳图，图中M 为DL2000 DNA分子质量标准，1-5为初始反应条件下鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒混合物PCR电泳图，6-10为优化后最佳反应条件下鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒混合物PCR电泳图；

图2为鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR检测引物对、试剂盒及其应用方法特异性试验电泳图，图中M为DL2000 DNA分子质量标准，1 为鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒混合物，2为坦布苏病毒，3为鸭瘟病毒，4为鹅副黏病毒，5为鹅病毒性肝炎病毒，6为呼肠孤病毒，7为H9亚型禽流感病毒，8为H7亚型禽流感病毒，9为H7亚型禽流感病毒；

图3为鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR检测引物对、试剂盒及其应用方法敏感性试验电泳图，图中M为DL2000 DNA分子质量标准，1 为鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒分别为1×10⁷拷贝/μL，2为鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒分别为1×10⁶拷贝/μL，3为鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒分别为1×10⁵拷贝/μL，4为鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒分别为1×10⁴拷贝/μL，5为鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒分别为1×10³拷贝/μL，6为鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒分别为1×10²拷贝/μL，7为鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒分别为1×10¹拷贝/μL，8为鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒分别为1×10⁰拷贝/μL；

图4为鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR检测引物对、试剂盒及其应用方法稳定性试验电泳图，图中M为DL2000 DNA分子质量标准，1～6 分别为第1～6个月鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒混合物PCR反应电泳图；

图5为鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR检测引物对、试剂盒及其应用方法对部分临床样品电泳检测结果：图中M为DL2000 DNA分子质量标准，1为阴性对照，2为阳性对照，1～24为部分内脏组织病料、粪便和血清的电泳检测结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领城的技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。

若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；

若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

1材料与方法

1.1病毒毒株鹅星状病毒(GoAstV)、鹅细小病毒(GPV)、鹅嵌杯病毒(GoCV)，坦布苏病毒(TMUV)，鸭瘟病毒(DVE)，鹅副黏病毒(GPMV)，鹅病毒性肝炎病毒(DVH)，呼肠孤病毒(DRV)，灭活的H9亚型禽流感灭活病毒(H9 AIV)，灭活的H7亚型禽流感病毒(H7 AIV)、灭活的H5亚型禽流感病毒(H7 AIV)；

1.2主要试剂离心柱型病毒RNA/DNA提取试剂盒PrimeScript IV RTase、 5×PrimeScript IV Buffer、RNase Inhibitor、dNTP Mixture、rTaq DNA聚合酶均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；DL2000 DNA Marker购自北京擎科新业生物技术有限公司。

1.3实验方法

1.3.1引物的设计与合成本实施参考GenBank上公布的GoAstV、GPV、GoCV 病毒全基因组序列，经MEGA 6.0软件综合分析比对，选择其保守序列用 Primer3.0在线软件设计了3对分别扩增GoAstV、GPV、GoCV基因组片段的特异性引物，引物的序列如下：

GoAstV-F：5'-GTTTGAGCAGGACCAGAATGA-3'：

GoAstV-R：5'-GCCATAGCAAATCATGGTGAC-3'：

GPV-F：5'-GCCTTTATTTACTGCTGCTGCT-3'：

GPV-R：5'-CCCACCAAATCAGCATCTTATCA-3'；

GoCV-F：5'-TGCATCTGGGACGAATTTGACAC-3'：

GoCV-R：5'-CAGTGAGAGCACAAGGTGTGA-3'，上述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.2 RNA提取

对于内脏组织样品，采集发病鹅只的内脏组织作为待检测临床样品，内脏组织经液氮速冻后，迅速转移至液氮预冷的研钵中，直至研磨成粉末状，按内脏组织与生理盐水1：3的质量比例进行研磨离心，使用离心柱型病毒DNA/RNA提取试剂盒提取组织中的病毒DNA和RNA，得待检样品RNA/DNA提取液；

对于粪便组织，对发病鹅只进行粪便收集，取约0.5g粪便加入1mL PBS稀释后充分涡旋，冻融1次，离心后使用离心柱型病毒DNA/RNA提取试剂盒提取组织中的病毒DNA和RNA,得待检样品RNA/DNA提取液；

对于血清样品，取发病鹅只血清样品，使用离心柱型病毒DNA/RNA提取试剂盒提取组织中的病毒DNA和RNA，得待检样品RNA/DNA提取液；

1.3.3逆转录反应

取反转录混合液18μL，反转录混合液包含5×PrimeScript IV Buffer、RNaseInhibitor(40U/μl)、Random 6mers(10μM)、dNTP Mixture(10mM each)、PrimeScript IVRTase(200U/μl)反转录酶和ddH₂O；每个反应体积比为8：1：4： 2：2：19；加入阳性样品RNA提取液2μL，混合均匀，置于PCR仪中，42℃反转录反应15min，95℃反应5min，使酶失活后，冰上冷却，得待检样品cDNA 产物：

1.3.4 PCR扩增反应

多重纳米PCR反应在25μL体系中进行。先以初始的反应条件进行多重PCR 反应，反应后进行电泳观察如图1所示，其中，初始条件为10×PCR Buffer 5μL、 dNTP Mixture(2.5mM each)1μL、GoAstV-F上游引物(10μM)1μL、GoAstV-R 下游引物(10μM)1μL、GPV-F上游引物(10μM)1μL、GPV-R下游引物(10 μM)1μL、GoCV-F上游引物(10μM)1μL、GoCV-R下游引物(10μM)1μL、 rTaq DNA聚合酶(5U/μL)0.3μL、金纳米粒子2μL，cDNA模板2.5μL，加 ddH₂O至总体积为25μL。置于PCR仪中，以反应条件为：95℃预变性5min， 95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环，72℃总延伸5min。 1.3.5PCR扩增反应条件优化

为了获得最佳的反应条件，分别对反应的各组分的比例进行优化，金纳米粒子直径分别为18～20nm、20～23nm、20nm、20～40nm、40～60nm的纳米粒子进行PCR扩增；金纳米粒子体积以0.4μL依次递增0.4μL至2.8μL；rTaq DNA 聚合酶以0.1μL依次递增0.05μL至0.4μL；各引物浓度为0.5μL、1.0μL、1.5μL、 2μL。优化后，最佳的PCR反应的各组分比例为10×PCR Buffer、dNTP Mixture (2.5mM each)、GoAstV-F上游引物(10μM)、GoAstV-R下游引物(10μM)、 GPV-F上游引物(10μM)、GPV-R下游引物(10μM)、GoCV-F上游引物(10μM)、GoCV-R下游引物(10μM)、rTaq DNA聚合酶(5U/μL)、金纳米粒子和ddH₂O，每个反应体积比为5：2：2：2：2：2：2：2：0.5：4：21.5，共计22.5μL。以此为最佳反应组分比例，以退火温度为49℃、51℃、53℃、55℃、57℃进行PCR 反应，获得最佳反应温度为53℃。为此，该方法的最佳扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环，72℃总延伸5min。结果显示，优化后的反应条件，GoAstV、GPV、GoCV的目的条带与预期相符，分别为484bp、607bp、324bp，且条带更亮，更为清晰。如图1所示。

实施例2

对实施例1优化后所得的一种鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR检测引物对、试剂盒及其方法应用进行特异性、稳定性、灵敏性试验，通过田间试验对本发明所得鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR 诊断试剂盒的实用性和适用性进行验证，具体如下：

(1)特异性试验

采用实施例1优化后所得的一种鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR诊断试剂盒的检测方法提取GoAstV、GPV、GoCV、坦布苏病毒 (TMUV)、鸭瘟病毒(DVE)、鹅副黏病毒(GPMV)、鹅病毒性肝炎病毒(DVH)、呼肠孤病毒(DRV)、灭活的H9亚型禽流感灭活病毒(H9 AIV)、灭活的H7亚型禽流感病毒(H7 AIV)、灭活的H5亚型禽流感病毒(H7 AIV)；使用离心柱型病毒DNA/RNA提取试剂盒提取组织中的病毒DNA和RNA，得待检样品 RNA/DNA提取液；用本发明所得的诊断试剂盒扩增混合液进行多重纳米PCR，扩增完毕后电泳观察，试验结果如图2所示。

由图2可知，GoAstV出现484bp一个条带，GPV出现607bp一个条带， GoCV出现324bp一个条带、GoAstV、GPV二种病毒混合样品出现484bp、607 bp两个条带，GoAstV、GoCV二种病毒混合样品出现484bp、324bp两个条带， GPV、GoCV二种病毒混合样品出现607bp、324bp两个条带，GoAstV、GPV、 GoCV三种病毒混合样品出现484bp、607bp、324bp三个条带，坦布苏病毒 (TMUV)、鸭瘟病毒(DVE)、鹅副黏病毒(GPMV)、鹅病毒性肝炎病毒(DVH)、呼肠孤病毒(DRV)、灭活的H9亚型禽流感灭活病毒(H9 AIV)、灭活的H7亚型禽流感病毒(H7 AIV)、灭活的H5亚型禽流感病毒(H7 AIV)均没有出现条带。

回收各阳性样本的条带，纯化后连接pMD19-T载体，转化Top10感受态细胞，取PCR鉴定为阳性的菌液，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测得的序列与所用毒株基因序列进行比较，发现序列完全一致。结果证实本发明所得鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR检测引物对、试剂盒及其方法应用具有很高的特异性，能准确扩增GoAstV、GPV、GoCV基因片段，并能直观鉴别诊断GoAstV、GPV、GoCV的感染情况。

(2)敏感性试验

采用实施例1优化后所得的一种鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR诊断试剂盒的检测方法对获得的阳性菌液进行质粒提取，紫外分光光度计测定浓度后稀释调整各病毒阳性质粒DNA浓度为1.0×10⁶拷贝/μL，混合三种病毒DNA作为模板，按照10倍浓度梯度稀释至1.0×10¹拷贝/μL，用试剂盒提供的扩增混合液进行多重纳米PCR，扩增完毕后电泳观察，试验结果如图3 所示。

由图3可知，本发明的鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR 诊断试剂盒能检测的极限为1.0×10²拷贝/μL，表明本发明的鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR诊断试剂盒的检测方法有很高的敏感性。

(3)稳定性试验

将实施例1优化后所得的鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米 PCR诊断试剂盒保存在-20℃，每月1次用GoAstV、GPV、GoCV阳性样品及阴阳性对照进行检测试验，连续检测6个月，检测试剂盒存放的稳定性，试验结果如图4所示。

由图4可知，6个月内鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR 诊断试剂盒的检测结果完全一致，说明鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR诊断试剂盒有良好的稳定性。

(4)田间试验

采集了2020-2021年间鹅场发病鹅只的内脏组织样品、粪便样品和血清样品共312份，采用实施例1优化后所得的鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR检测引物对、试剂盒及其方法应用对其病毒感染情况进行检测诊断，具体如下：

实施例3

1内脏组织样品的处理

将内脏组织经液氮速冻后，迅速转移至液氮预冷的研钵中，直至研磨成粉末状。按内脏组织与生理盐水1：3的质量比例进行研磨离心，使用离心柱型病毒 DNA/RNA提取试剂盒提取组织中的病毒DNA和RNA，得待检样品RNA/DNA 提取液；

2逆转录反应

2.1内脏组织样品逆转录反应：取逆转录反应混合液18μL，加入内脏组织样品 RNA提取液2μL，混合均匀，进行逆转录反应，逆转录反应的条件依次为30℃引物与模板预结合10min，42℃反应15min，95℃反应5min，使酶失活后，冰上冷却，得内脏组织样品cDNA产物：

3 PCR扩增反应

3.1内脏组织样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液22.5μL，加入待检样品 cDNA2.5μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，95℃反应30s，53℃反应30s，72℃反应40s，共进行35个循环，最后在72℃反应5min，得待检样品PCR扩增产物：

4电泳检测

将所得的组织病料样品PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物、阳性对照样品PCR扩增产物通过1.5％琼脂糖凝胶电泳进行判定，具体如下：

4.1称取1.5g琼脂糖，加入100mL 1×TAE缓冲液中，微波炉中加热至融化，待凝胶温度降至55℃左右时，加入1μL GeneGreen核酸染料(10000×)，混匀，再将移胶板放入胶室中，并将梳子垂直安插在移胶板上方，将熔化的琼脂糖倒入放有移胶板的胶室中。等凝胶完全冷却凝固后变成乳白色不透明状，将梳子轻轻地垂直拔出，用拇指和指示轻持移胶板两侧，将凝胶体放入加有1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，并加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液浸没胶面，高出胶面。

4.2分别取5μL内脏组织样品的PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物、阳性对照样品PCR扩增产物和上样缓冲液混匀，加入加样孔中，同时加5μL DL2000 DNA Marker；

4.3盖好电泳槽盖子，选择适当的电泳电压，以及电泳方向，打开电源开关，开始电泳，DNA样品从负极向正极移动。

4.4切断电流，停止电泳，打开槽盖，取出凝胶，置入凝胶成像系统中观察拍照。4.5以DL2000 DNA Marker作为参照，阴性对照不出条带，阳性对照出484bp、 607bp、324bp三个条带，说明对照成立：待检样品PCR扩增产物中出现484bp 单条带，即为单一GoAstV感染：待检样品PCR扩增产物出现607bp单条带，即为单一GPV感染：待检样品PCR扩增产物出现324bp单条带，即为单一GoCV 感染：待检样品PCR扩增产物出现484bp和607bp两个条带，即为GoAstV和 GPV二重混合感染：待检样品PCR扩增产物出现484bp和324bp两个条带，即为GoAstV和GoCV二重混合感染：待检样品PCR扩增产物出现607bp和324 bp两个条带，即为GPV和GoCV二重混合感染：待检样品PCR扩增产物出现 484bp、607bp和324bp三个条带，即为GoAstV、GPV和GoCV三重混合感染。

实施例4

1、粪便样品的处理

对发病鹅只进行粪便收集，取约0.5g粪便加入1mL PBS稀释后充分涡旋，冻融1次；4℃8000r/min离心5min，取上清备用：

2、RNA提取、反转录反应、PCR扩增反应和电泳检测

具体检测方法同实施例2，区别在于将实施例2中的内脏组织样品替换为粪便样品。

实施例5

1、血清样品的处理

对发病鹅只翅静脉真空管采血，室温静置2h分离出血清备用：

2、DNA提取、PCR扩增反应和电泳检测

具体检测方法同实施例2，区别在于将实施例2中的内脏组织样品替换为血清样品。

电泳检测结果发现312份临床样品中存在单一的GoAstV感染、单一GPV 感染、单一GoCV感染、GoAstV、GPV两者混合感染、GoAstV、GoCV两者混合感染、GPV、GoCV两者混合感染和GoAstV、GPV、GoCV三者混合感染现象。其中，临床样品中，单一的GoAstV阳性102份，阳性率32.7％；单一GPV 阳性27份，阳性率8.7％；单一GoCV阳性5份，阳性率1.6％；GoAstV和GPV双阳性59份，阳性率18.9％；GoAstV和GoCV双阳性9份，阳性率2.9％；GPV 和GoCV双阳性2份，阳性率0.6％；GoAstV、GPV和GoCV三者均为阳性1 份，阳性率0.3％。如表1所示。

图5为部分内脏组织病料、粪便及血清检测结果。

由图5可知，2/5/7为GoAstV病毒阳性结果；11/12/13/16为GPV病毒阳性结果； 1/20/22为GoCV病毒阳性结果；3/4/6/10/18/23/24为GoAstV和GPV病毒混合感染阳性结果；21为GoAstV和GoCV病毒混合感染阳性结果；14/15/17/19为 GPV和GoCV病毒混合感染阳性结果；8为GoAstV、GPV和GoCV三种病毒混合感染阳性结果：9为阴性结果。田间试验证明本发明所得的鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR检测引物对、试剂盒及其应用方法实用性和适用性良好。

表1 GoAstV、GPV、GoCV多重纳米PCR诊断试剂盒对2020-2021年江西发病鹅群临床样品检测结果

对比实施例1

采用常规的鹅星状病毒PCR检测试剂盒及检测方法，对2020-2021年从江西养鹅场采集来的312份发病鹅群组织、粪便及血清样品进行GoAstV检测。结果表明，鹅星状病毒PCR检测试剂盒及检测方法仅检测出158份GoAstV阳性结果，其中内脏组织检出81份GoAstV阳性，粪便样品75份GoAstV阳性，血清2份GoAstV阳性；而本发明所得的鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR诊断试剂盒检测出171份GoAstV阳性结果，其中内脏组织检出84 份GoAstV阳性，粪便样品81份GoAstV阳性，血清6份GoAstV阳性，检出率远高于常规PCR检测试剂盒，特别是在粪便样品和血清样品中的结果表现更为出众，如表2所示。

表2常规的鹅星状病毒PCR检测试剂盒与GoAstV、GPV、GoCV多重纳米PCR 诊断试剂盒对临床样品检测GoAstV结果对比

对比实施例2

采用常规的鹅细小病毒PCR检测试剂盒及检测方法，对2020-2021年从江西养鹅场采集来的312份内脏组织、粪便及血清样品进行GPV检测。结果表明，鹅细小病毒PCR检测试剂盒及检测方法仅检测出80份GPV阳性结果，其中内脏组织检出50份GPV阳性，粪便样品29份GPV阳性，血清1份GPV阳性；而本发明所得的鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR诊断试剂盒检测出88份GPV阳性结果，其中内脏组织检出52份GPV阳性，粪便样品33份GPV阳性，血清3份GPV阳性，检出率远高于常规PCR检测试剂盒，特别是在粪便样品和血清样品中的结果表现更为出众，如表3所示。

表3常规的鹅细小病毒PCR检测试剂盒与GoAstV、GPV、GoCV多重纳米PCR 诊断试剂盒对临床样品检测GPV结果对比

对比实施例3

采用常规的鹅嵌杯病毒PCR检测试剂盒及检测方法，对2020-2021年从江西各养鹅场采集来的312份发病鹅内脏组织、粪便及血清样品进行GoCV检测。结果表明，鹅嵌杯病毒PCR检测试剂盒及检测方法仅检测出15份GoCV阳性结果，其中内脏组织检出10份GoCV阳性，粪便样品5份GPV阳性，血清0份 GoCV阳性；而本发明所得的鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米 PCR诊断试剂盒检测出17份GoCV阳性结果，其中内脏组织检出11份GoCV阳性，粪便样品6份GoCV阳性，血清0份GoCV阳性，检出率远高于常规PCR 检测试剂盒，如表4所示。

表4常规的鹅嵌杯病毒PCR检测试剂盒与GoAstV、GPV、GoCV多重纳米PCR 诊断试剂盒对临床样品检测GoAstV结果对比

综上所述，在对同样的312份养鹅场发病的鹅只的内脏组织、粪便及血清样品进行检测时，本发明所得的鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米 PCR诊断试剂盒检测出GoAstV阳性171份，阳性率54.8％；GPV阳性88份，阳性率28.2％；GoCV阳性17份，阳性率5.4％；而常规的鹅星状病毒PCR检测试剂盒仅检测出158份GoAstV阳性，阳性率为50.6％；而常规的鹅细小病毒PCR 检测试剂盒仅检测出80份GPV阳性，阳性率为25.6％；而常规的鹅嵌杯病毒 PCR检测试剂盒仅检测出15份GoAstV阳性，阳性率为4.8％；

由此可知，本发明所得的鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米 PCR诊断试剂盒的检出率远远优于常规的鹅星状病毒PCR检测试剂盒、常规的鹅细小病毒PCR检测试剂盒及常规的鹅嵌杯病毒PCR检测试剂盒的检出率，其实用性和适用性良好。此外，本发明所得的鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR诊断试剂盒不仅能检测出单一的GoAstV、单一的GPV、单一的GoCV，还能检测出GoAstV和GPV，GoAstV和GoCV，GPV和GoCV，GoAstV、 GPV和GoCV的混合病毒，检测范围更广，检测灵敏度也更高。

虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 江西省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR检测引物对、试剂盒及应用方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

gtttgagcag gaccagaatg a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

gccatagcaa atcatggtga c 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

gcctttattt actgctgctg ct 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

cccaccaaat cagcatctta tca 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

tgcatctggg acgaatttga cac 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 6

cagtgagagc acaaggtgtg a 21

Claims

1.一种鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR检测引物对，其特征在于，所述引物对包括GoAstV-F上游引物、GoAstV-R下游引物、GPV-F上游引物、GPV-R下游引物、GoCV-F上游引物、GoCV-R下游引物，并且

所述GoAstV-F上游引物的序列为：5'-GTTTGAGCAGGACCAGAATGA-3'：

所述GoAstV-R下游引物的序列为：5'-GCCATAGCAAATCATGGTGAC-3'：

所述GPV-F上游引物的序列为：5'-GCCTTTATTTACTGCTGCTGCT-3'：

所述GPV-R下游引物的序列为：5'-CCCACCAAATCAGCATCTTATCA-3'；

所述GoCV-F上游引物的序列为：5'-TGCATCTGGGACGAATTTGACAC-3'：

所述GoCV-R下游引物的序列为：5'-CAGTGAGAGCACAAGGTGTGA-3'。

2.一种含有权利要求1所述的鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒多重纳米PCR检测引物对的多重纳米PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于诊断GoAstV、GPV、GoCV的单一感染或混合感染。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，所述试剂盒含有反转录混合液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述反转录混合液包含PrimeScript IV Rtase，RNaseInhibitor，Random 6mers，dNTP Mixture，反转录PrimeScript IV Buffer Mg⁺²plus及ddH2O；扩增反应混合液包含PCR Buffer Mg⁺²plus，dNTP Mixture，权利要求1所述的GoAstV-F上游引物、GoAstV-R下游引物、GPV-F上游引物、GPV-R下游引物、GoCV-F上游引物和GoCV-R下游引物，ddH2O，rTaq DNA聚合酶，金纳米粒子和ddH₂O；阴性对照为ddH₂O；阳性对照为GoAstV、GPV和GoCV阳性质粒混合物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，所述反转录混合液包含5×PrimeScript IV Buffer

Mg+2plus、RNase Inhibitor 40U/μl、Random 6mers 10μM、dNTP Mixture 10mM、PrimeScript IV RTase反转录酶200U/μl和ddH₂O；每个反应体积比为8：1：4：2：2：19；共计18μL，50个反应共计900μL，装成1管；所述扩增反应混合液包含10×PCR Buffer Mg⁺²plus、dNTP Mixture 2.5mM、GoAstV-F上游引物10μM、GoAstV-R下游引物10μM、GPV-F上游引物10μM、GPV-R下游引物10μM、GoCV-F上游引物10μM、GoCV-R下游引物10μM、rTaq DNA聚合酶5U/μL、金纳米粒子和ddH₂O，每个反应体积比为5：2：2：2：2：2：2：2：0.5：4：21.5，共计22.5μL，50个反应共计1125μL，装成1管；所述阴性对照为ddH₂O，50个反应共计2mL，装成1管；所述阳性对照为GoAstV、GPV和GoCV阳性质粒混合物﹐50个反应共计125μL，装成1管。

5.一种利用如权利要求2～4任一项所述的多重纳米PCR检测试剂盒在检测鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒的非疾病诊断的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

1)提取待检测样品组织中的病毒RNA/DNA；

2)将所述RNA反转录为cDNA；

3)利用所述多重纳米PCR检测试剂盒对所述病毒cDNA和DNA进行扩增；

4)观察扩增产物电泳图是否包含鹅星状病毒、鹅细小病毒与鹅嵌杯病毒病毒对应的预期条带。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤2)的反转录反应条件为：用反转录混合液对所述RNA进行反转录：取反转录混合液18μL，加入所述待检测样品的RNA提取液2μL，混合均匀，置于PCR仪中进行cDNA的合成，以42℃15min，95℃5min反应程序进行。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤3)的扩增反应条件为：取扩增反应混合液22.5μL，加入所述待检测样品组织中的病毒cDNA/DNA2.5μL；反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环，72℃总延伸5min。

8.根据权利要求5所述的应用方法，其特征在于，所述步骤1)的提取方法为：对于内脏组织样品，采集发病鹅群的内脏组织作为待检测样品，内脏组织经液氮速冻后，迅速转移至液氮预冷的研钵中，直至研磨成粉末状，按内脏组织与生理盐水1：3的质量比例进行研磨离心，使用离心柱型病毒DNA/RNA提取试剂盒提取组织中的病毒DNA和RNA，得待检样品RNA/DNA提取液；对于粪便组织，对发病鹅群进行粪便收集，取约0.5g粪便加入1mL PBS稀释后充分涡旋，冻融1次，离心后使用离心柱型病毒DNA/RNA提取试剂盒提取组织中的病毒DNA和RNA，得待检样品RNA/DNA提取液；对于血清样品，取发病鹅群血清样品，使用离心柱型病毒DNA/RNA提取试剂盒提取组织中的病毒DNA和RNA，得待检样品RNA/DNA提取液。

9.根据权利要求5所述的应用方法，其特征在于，所述步骤4)鹅星状病毒对应的预期条带为484bp，鹅细小病毒对应的预期条带为607bp，鹅嵌杯病毒对应的预期条带为324bp。