CN111154915A - 一种猪圆环病毒4型与3型pcr鉴别诊断试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一种猪圆环病毒4型与3型pcr鉴别诊断试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于动物医学动物疫病分子生物学诊断领域，公开了猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法，根据设计的PCV4、PCV3病毒基因组序列所得的试剂盒和相应的检测方法具有灵敏度高、特异性好、稳定性高，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，能彻底解决PCV4、PCV3引起的类似症状但病原不同的诊断问题，适合猪场快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及动物医学动物疫病分子生物学诊断领域，具体涉及一种猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法。
背景技术
猪圆环病毒4型(Porcine circovirus type 2,PCV4)是一种由湖南大学的研究人员发现一种新型的猪圆环病毒，研究人员对187个样品的患病率调查表明，PCV4的患病率约为12.8％。病毒基因组的大小为1770个核苷酸。PCV4与水貂圆环病毒的基因组一致性最高(66.9％)，与其他PCV基因组的一致性为43.2％-51.5％。
猪圆环病毒3型(PCV3)由Palinski等2016年首次鉴定并命名。同年3月，在中国辽宁、江西、重庆的3个猪场检测出了PCV3病原。研究认为，PCV3是一种与母猪皮炎肾病综合征和繁殖障碍相关的病原，但目前尚未清楚其起源，是否早已存在于猪体中只是未被发现，还是通过跨物种传播或通过PCV间的重组而形成，仍有待进一步探究。自2016年以来，我国部分省(市)相继出现以母猪流产和死亡、断奶仔猪呼吸衰竭和死亡为临床特征的PCV3感染报道。国内有研究从广西腹泻病死仔猪的病料样品中检测出PCV3，表明PCV3不但引起母猪皮炎肾病综合征与繁殖障碍，还能引起仔猪腹泻。咸阳职业技术学院畜牧兽医研究所从96个猪场样本中进行PCV3检测，将阳性样品进行序列测定分析，同时对PCV3阳性样本进行6种常见猪群病毒病检测。结果检测出了PCV3阳性样品8份，阳性率为8.33％。其中7份样品与其他6种常见猪群病毒病存在不同程度的混合感染现象，混合感染率87.5％。序列分析表明，陕甘地区猪场8株PCV3基因片段核苷酸同源性在98.3％～100％之间，与不同地域参考毒株同源性在97.6％～100％之间。结果显示，陕甘地区2015年样本中即存在PCV3感染，不同地区的PCV3基因同源性高，PCV3遗传稳定，基因进化树显示不同地域PCV3毒株交叉分布，没有显著的地域特征。
由于PCV4是一种新型的猪圆环病毒，目前未见快速检测PCV4病原的公开报道，因此，发明一种快速鉴别PCV4和PCV3感染的诊断试剂盒，为临床快速确诊相应疾病，具有重要的现实意义。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法，该猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒灵敏度高、特异性好、稳定性高、结果直观，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，为临床确诊PCV4和PCV3感染提供有力的技术手段。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。
(一)一种猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒，包括裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、PCV4-F上游引物、PCV4-R下游引物、PCV3-F上游引物、PCV3-R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为PCV4和PCV3阳性质粒混合物。
优选的，PCV4-F上游引物的序列为：5’-GGAAGGAGGTCGGAGAAA-3’；
PCV4-R下游引物的序列为：5’-GCAACCAGCCATAATAGTCAT-3’；
PCV3-F上游引物的序列为：5’-CAGCTCGGTGAAGCGCTTAC-3’；
PCV3-R下游引物的序列为：5’-TACTGCAGGCATCTTCTCC-3’。
优选的，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent，20个反应共计20mL，装成1瓶；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5mmol·L-1dNTP、25μmol·L-1PCV4-F上游引物、25μmol·L-1PCV4-R下游引物、25μmol·L-1PCV3-F上游引物、25μmol·L-1PCV3-R下游引物和5U/μL rTaq DNA聚合酶，每个反应体积比为15.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰1.0︰1.0︰0.5，共计23μL，20个反应共计460μL，装成1管；所述阴性对照为灭菌三蒸水，20个反应共计2.0mL，装成1瓶；所述阳性对照为PCV4和PCV3阳性质粒混合物，20个反应共计40.0μL，装成1管。
(二)一种猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的检测方法，包括以下检测步骤：
步骤1，DNA提取
子步骤1.1，待检样品DNA提取：吸取待检样品置入无菌离心管(EP管)，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得待检样品DNA提取液；
子步骤1.2，阴性对照样品提取：吸取灭菌三蒸水置入无菌离心管，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得阴性对照样品提取液；
步骤2，PCR扩增反应
子步骤2.1，待检样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入所述待检样品DNA提取液，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应40s，55℃反应40s，72℃反应40s，共进行多个循环，最后在72℃反应10min，得待检样品PCR扩增产物；
子步骤2.2，阴性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入所述阴性对照样品提取液，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应40s，55℃反应40s，72℃反应40s，共进行多个循环，最后在72℃反应10min，得阴性对照样品PCR扩增产物；
子步骤2.3，阳性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入PCV4和PCV3阳性质粒混合物，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应40s，55℃反应40s，72℃反应40s，共进行多个循环，最后在72℃反应10min，得阳性对照样品PCR扩增产物；
步骤3，电泳检测
通过琼脂糖凝胶电泳分别对所述待检样品PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物和阳性对照样品PCR扩增产物进行电泳检测，并进行判断。
优选的，子步骤1.1中，所述待检样品为组织病料样品、血清样品或全血样品。
进一步优选的，所述组织病料样品为肺脏、肝脏或脾脏。
优选的，步骤2中，所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、PCV4-F上游引物、PCV4-R下游引物、PCV3-F上游引物、PCV3-R下游引物和rTaq DNA聚合酶。
进一步优选的，
所述PCV4-F上游引物的序列为：5’-GGAAGGAGGTCGGAGAAA-3’；所述PCV4-R下游引物的序列为：5’-GCAACCAGCCATAATAGTCAT-3’；所述PCV3-F上游引物的序列为：5’-CAGCTCGGTGAAGCGCTTAC-3’；所述PCV3-R下游引物的序列为：5’-TACTGCAGGCATCTTCTCC-3’。
优选的，步骤2中，所述多个循环为35个循环。
优选的，步骤3中，所述判断的标准为：阴性对照不出条带，阳性对照出519bp、220bp两个条带，说明对照成立；待检样品PCR扩增产物中出现519bp单条带，即为单一PCV4感染；待检样品PCR扩增产物出现220bp单条带，即为单一PCV3感染；待检样品PCR扩增产物出现519bp和220bp两个条带，即为PCV4和PCV3二重混合感染；待检样品PCR扩增产物为无条带者，即为阴性。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)本发明提供的猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒采用二重PCR扩增，两种病变相似且同为DNA病毒的病毒一次检测，检测总时间控制在2小时左右，其检测方法易于操作、方便快捷，能达到快速检测的目的。本发明能彻底解决PCV4、PCV3引起的类似症状但病原不同的诊断问题，适合猪场和基层实验室快速检测，亦适用于流行病学调查。
2)本发明的提供了两对针对PCV4和PCV3的特异性引物，PCV4-F/PCV4-R为PCV4特异性扩增引物组，PCV3-F/PCV3-R为PCV3特异性扩增引物组，利用其制成的二重试剂盒能快速、特异的检测出PCV4和PCV3中的单一病毒以及二者的混合病毒，PCV4出现519bp一个条带，PCV3出现220bp一个条带，PCV4、PCV3两种病毒混合样品出现519bp、220bp两个条带。
3)本发明的猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒能检测的极限为10拷贝·μL-1，表明本发明的猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒在检测PCV4、PCV3时具有很高的灵敏度，既能缩短诊断时间、节约诊断试剂，又能降低使用成本。
4)本发明提供的猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒在6个月内检测结果一致，表明本发明猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒具有很高的稳定性。田间试验证明本发明所得的猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒实用性和适用性良好。
附图说明
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为本发明猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法特异性试验电泳图；
图中M为DL2000 DNA分子质量标准，1为PCV4、PCV3混合阳性质粒，2为PCV4单阳性质粒，3为PCV3单阳性质粒，4为猪伪狂犬病病毒，5为猪细小病毒，6为猪瘟病毒；
图2为本发明猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法灵敏度试验电泳图；
图中M为DL2000 DNA分子质量标准，1～10分别为PCV4、PCV3混合病毒DNA梯度稀释，浓度范围为1×108拷贝·μL-1～1×10-1拷贝·μL-1；
图3为本发明猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒对部分临床样品电泳检测结果；
图中M为DL2000 DNA分子质量标准，1-6为部分组织病料和血清的电泳检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域的技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
实施例1
一种猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒，包括裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照，具体如下：
1)裂解液：成分为DNAiso Reagent，20个反应共计20mL，装成1瓶；
2)扩增反应混合液：由灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5mmol·L-1dNTP、25μmol·L-1PCV4-F上游引物、25μmol·L-1PCV4-R下游引物、25μmol·L-1PCV3-F上游引物、25μmol·L-1PCV3-R下游引物、5U/μL rTaq DNA聚合酶组成，每个反应体积比为15.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰1.0︰1.0︰0.5，共计23μL，20个反应共计460μL，装成1管；其中引物的设计与制备如下：
参考GenBank上公布的PCV4、PCV3病毒基因组序列，经过综合分析比对，针对以上两种病毒基因设计了4条引物，引物的序列如下：
PCV4-F：5’-GGAAGGAGGTCGGAGAAA-3’
PCV4-R：5’-GCAACCAGCCATAATAGTCAT-3’
PCV3-F：5’-CAGCTCGGTGAAGCGCTTAC-3’
PCV3-R：5’-TACTGCAGGCATCTTCTCC-3’。
上述引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；
3)阴性对照：为灭菌三蒸水，20个反应共计2.0mL，装成1瓶；
4)阳性对照：为PCV4和PCV3阳性质粒混合物，20个反应共计40.0μL，装成1管。
本发明的猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒中裂解液为常温保存，扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照保存条件为-20℃。
上述猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的检测方法，包括以下检测步骤：
步骤1，DNA提取
子步骤1.1，待检样品DNA提取：吸取100μL待检样品置入1.5mL无菌EP管，加入800μL裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μL冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用75％乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置EP管，在空气中自然干燥，用40μL8mmol·L-1NaOH溶解，得待检样品DNA提取液；
子步骤1.2，阴性对照样品提取：吸取100μL灭菌三蒸水置入无菌离心管，加入800μL裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μL冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用75％乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置EP管，在空气中自然干燥，用40μL 8mmol·L-1NaOH溶解，得阴性对照样品提取液；
步骤2，PCR扩增反应
子步骤2.1，待检样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液23μL，加入待检样品DNA提取液2μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应40s，55℃反应40s，72℃反应40s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得待检样品PCR扩增产物；
子步骤2.2，阴性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液23μL，加入阴性对照样品提取液2μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应40s，55℃反应40s，72℃反应40s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得阴性对照样品PCR扩增产物；
子步骤2.3，阳性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液23μL，加入PCV4和PCV3阳性质粒混合物2μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应40s，55℃反应40s，72℃反应40s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得阳性对照样品PCR扩增产物；
步骤3，电泳检测
通过经10g·L-1琼脂糖凝胶电泳分别对所述待检样品PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物和阳性对照样品PCR扩增产物进行电泳检测，并进行判断；判断标准为：阴性对照样品PCR扩增产物不出条带，阳性对照样品PCR扩增产物出519bp、220bp两个条带，说明对照成立；待检样品PCR扩增产物中出现519bp单条带，即为单一PCV4感染；待检样品PCR扩增产物出现220bp单条带，即为单一PCV3感染；待检样品PCR扩增产物出现519bp和220bp两个条带，即为PCV4和PCV3二重混合感染；待检样品PCR扩增产物为无条带者，即为阴性。
对实施例1所得的一种猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法的特异性、稳定性、灵敏性进行试验，并通过田间试验对本发明所得猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的实用性和适用性进行验证，具体如下：
(1)特异性试验
采用实施例1所得的一种猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的检测方法提取猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒等DNA病毒的DNA作为模板，同时以PCV4、PCV3两种阳性质粒分别作为模板，并将两者混合作为1个模板，用试剂盒的扩增混合液进行二重PCR，扩增完毕后电泳观察。按照RNAiso Reagent试剂说明提取猪瘟病毒总RNA，反转录获得第一链cDNA，用本发明所得的诊断试剂盒扩增混合液进行二重PCR，扩增完毕后电泳观察，试验结果如图1所示。
由图1可知，PCV4阳性质粒出现519bp一个条带，PCV3阳性质粒出现220bp一个条带，PCV4、PCV3两种阳性质粒混合样品出现519bp、220bp两个条带，猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒均没有出现条带。
回收各阳性样本的条带，纯化后连接pMD18-T载体，转化DH5ɑ感受态细胞，取PCR鉴定为阳性得菌液，提取质粒进行测序，将测得的序列与所用毒株基因序列进行比较，发现序列完全一致。结果证实本发明所得猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法具有很高的特异性，能准确扩增PCV4、PCV3基因片段，并能直观鉴别诊断PCV4、PCV3的感染情况。
(2)灵敏度试验
采用实施例1所得的一种猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的检测方法检测PCV4、PCV3阳性质粒，紫外分光光度计测定各自浓度后计算拷贝数，稀释调整PCV4、PCV3阳性质粒浓度分别为1×108拷贝·μL-1，混合两种质粒作为模板，按照10倍浓度梯度稀释至10-10，用试剂盒提供的扩增混合液进行二重PCR，扩增完毕后电泳观察，试验结果如图2所示。
由图2可知，本发明的猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒能检测的极限为10拷贝·μL-1，表明本发明的猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的检测方法有很高的灵敏度。
(3)稳定性试验
将实施例1所得的猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒保存在-20℃，每月1次用PCV4、PCV3及对照进行检测试验，连续检测6个月，检测试剂盒存放的稳定性。
结果显示，6个月内猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的检测结果完全一致，说明猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒有良好的稳定性。
(4)田间试验
采集了2018-2019年间猪场出现母猪有繁殖障碍现象、皮炎肾炎综合征表现以及仔猪腹泻现象的组织病料和血清共270份，采用实施例1所得的猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒及其检测方法进行检测诊断，发现临床样品中单一PCV3阳性31份，阳性率11.5％；单一PCV4阳性13份，阳性率4.8％；PCV4、PCV3双阳性4份，双阳性率1.5％；具体如下：
实施例2
1、组织病料样品的处理
取疑似病例组织病料如肺脏、肝脏或脾脏3～5g，剪碎成糊状，加5倍无菌PBS缓冲液，用组织研磨器充分研磨，收集悬液，4℃、12000r/min离心10min，吸取上清液，备用；
2、DNA提取
2.1组织病料样品DNA提取：吸取100μL所得上清液置入1.5mL无菌EP管，加入800μL裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μL冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用75％乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置EP管，在空气中自然干燥，用40μL 8mmol·L-1NaOH溶解，得组织病料DNA提取液；
2.2阴性对照样品提取：吸取100μL灭菌三蒸水置入无菌离心管，加入800μL裂解液，颠倒混匀，静置裂解10min，加入600μL冰冷的无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用75％乙醇洗涤1次，弃去乙醇，倒置EP管，在空气中自然干燥，用40μL 8mmol·L-1NaOH溶解，得阴性对照样品提取液；
3、PCR扩增反应
3.1组织病料样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液23μL，加入组织病料DNA提取液2μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应40s，55℃反应40s，72℃反应40s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得组织病料样品PCR扩增产物；
3.2阴性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液23μL，加入阴性对照样品提取液2μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应40s，55℃反应40s，72℃反应40s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得阴性对照样品PCR扩增产物；
3.3阳性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液23μL，加入PCV4和PCV3阳性质粒混合物2μL，混合均匀，进行PCR扩增反应，PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应40s，55℃反应40s，72℃反应40s，共进行35个循环，最后在72℃反应10min，得阳性对照样品PCR扩增产物；
4、电泳检测
将所得的组织病料样品PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物、阳性对照样品PCR扩增产物通过10g·L-1琼脂糖凝胶电泳进行检查诊断，具体如下：
4.1称取1.0g琼脂糖，加入100mL 1×TAE缓冲液中，微波炉中加热融化，加入5μL(100mg/mL)溴化乙锭，混匀，倒入水平放置的凝胶盘中，胶板厚度为5mm，待冷却凝固后拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入1×TAE缓冲液淹没胶面；
4.2分别取5μL组织病料样品PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物、阳性对照样品PCR扩增产物和上样缓冲液混匀，加入加样孔中，同时加5μL DL2000 DNA分子量标准；
4.3电压80V～100V，或电流40mA～50mA，电泳30min；
4.4取出凝胶，置入紫外分析仪中观察，或置入凝胶成像系统中观察照相；
4.5以DL2000 DNA分子质量标准作为参照，阴性对照不出条带，阳性对照出519bp、220bp两个条带，说明对照成立；待检样品PCR扩增产物中出现519bp单条带，即为单一PCV4感染；待检样品PCR扩增产物出现220bp单条带，即为单一PCV3感染；待检样品PCR扩增产物出现519bp和220bp两个条带，即为PCV4和PCV3二重混合感染；待检样品PCR扩增产物为无条带者，即为阴性。
实施例3
1、血清样品的处理
对疑似病例猪只进行前腔静脉采血，自然凝固，待血清析出后分离出血清，备用；
2、DNA提取、PCR扩增反应和电泳检测
具体检测方法同实施例2，区别在于将实施例2中的组织病料样品替换为血清样品。
实施例4
1、全血样品的处理
注射器中加入肝素钠抗凝剂，对疑似病例猪只进行前腔静脉采血，混匀后即得抗凝血，备用；
2、DNA提取、PCR扩增反应和电泳检测
具体检测方法同实施例2，区别在于将实施例2中的组织病料样品替换为全血样品。
图3为部分组织病料和血清检测结果。由图3可知，1/4为PCV4、PCV3病毒混合感染阳性结果；2/3/5/6为PCV4阳性结果。田间试验证明本发明所得的猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒实用性和适用性良好。
虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，包括裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、PCV4-F上游引物、PCV4-R下游引物、PCV3-F上游引物、PCV3-R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为PCV4和PCV3阳性质粒混合物。
2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，PCV4-F上游引物的序列为：5’-GGAAGGAGGTCGGAGAAA-3’；
PCV4-R下游引物的序列为：5’-GCAACCAGCCATAATAGTCAT-3’；
PCV3-F上游引物的序列为：5’-CAGCTCGGTGAAGCGCTTAC-3’；
PCV3-R下游引物的序列为：5’-TACTGCAGGCATCTTCTCC-3’。
3.根据权利要求2所述的猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent，20个反应共计20mL，装成1瓶；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5mmol·L-1dNTP、25μmol·L-1PCV4-F上游引物、25μmol·L-1PCV4-R下游引物、25μmol·L-1PCV3-F上游引物、25μmol·L-1PCV3-R下游引物和5U/μLrTaq DNA聚合酶，每个反应体积比为15.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰1.0︰1.0︰0.5，共计23μL，20个反应共计460μL，装成1管；所述阴性对照为灭菌三蒸水，20个反应共计2.0mL，装成1瓶；所述阳性对照为PCV4和PCV3阳性质粒混合物，20个反应共计40.0μL，装成1管。
4.一种猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下检测步骤：
步骤1，DNA提取
子步骤1.1，待检样品DNA提取：吸取待检样品置入无菌离心管，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得待检样品DNA提取液；
子步骤1.2，阴性对照样品提取：吸取灭菌三蒸水置入无菌离心管，加入裂解液，颠倒混匀，静置裂解，加入无水乙醇，颠倒混匀，静置沉淀，离心，弃去上清液，洗涤，弃去洗涤液，倒置无菌离心管，在空气中自然干燥，用NaOH溶解，得阴性对照样品提取液；
步骤2，PCR扩增反应
子步骤2.1，待检样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入所述待检样品DNA提取液，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应40s，55℃反应40s，72℃反应40s，共进行多个循环，最后在72℃反应10min，得待检样品PCR扩增产物；
子步骤2.2，阴性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入所述阴性对照样品提取液，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应40s，55℃反应40s，72℃反应40s，共进行多个循环，最后在72℃反应10min，得阴性对照样品PCR扩增产物；
子步骤2.3，阳性对照样品PCR扩增反应：取扩增反应混合液，加入PCV4和PCV3阳性质粒混合物，混合均匀，进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的条件依次为95℃预变性反应5min，94℃反应40s，55℃反应40s，72℃反应40s，共进行多个循环，最后在72℃反应10min，得阳性对照样品PCR扩增产物；
所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、PCV4-F上游引物、PCV4-R下游引物、PCV3-F上游引物、PCV3-R下游引物和rTaq DNA聚合酶；
步骤3，电泳检测
通过琼脂糖凝胶电泳分别对所述待检样品PCR扩增产物、阴性对照样品PCR扩增产物和阳性对照样品PCR扩增产物进行电泳检测，并进行判断。
5.根据权利要求4所述的猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的检测方法，其特征在于，
PCV4-F上游引物的序列为：5’-GGAAGGAGGTCGGAGAAA-3’；
PCV4-R下游引物的序列为：5’-GCAACCAGCCATAATAGTCAT-3’；
PCV3-F上游引物的序列为：5’-CAGCTCGGTGAAGCGCTTAC-3’；
PCV3-R下游引物的序列为：5’-TACTGCAGGCATCTTCTCC-3’。
6.根据权利要求5所述的猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的检测方法，其特征在于，子步骤1.1中，所述待检样品为组织病料样品、血清样品或全血样品。
7.根据权利要求6所述的猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的检测方法，其特征在于，所述组织病料样品为肺脏、肝脏或脾脏。
8.根据权利要求5所述的猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤2中，所述多个循环为35个循环。
9.根据权利要求5所述的猪圆环病毒4型与3型PCR鉴别诊断试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤3中，所述判断的标准为：阴性对照不出条带，阳性对照出519bp、220bp两个条带，说明对照成立；待检样品PCR扩增产物中出现519bp单条带，即为单一PCV4感染；待检样品PCR扩增产物出现220bp单条带，即为单一PCV3感染；待检样品PCR扩增产物出现519bp和220bp两个条带，即为PCV4和PCV3二重混合感染；待检样品PCR扩增产物为无条带者，即为阴性。
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| HUI-HUI ZHANG 等: "Novel circovirus species identified in farmed pigs designated as Porcine circovirus 4, Hunan province, China", 《TRANSBOUND EMERG DIS》, vol. 67, 24 December 2019 (2019-12-24), pages 1 - 2 * |
| HUI-HUI ZHANG 等: "Novel circovirus species identified in farmed pigs designated as Porcine circovirus 4, Hunan province, China", TRANSBOUND EMERG DIS, vol. 67, pages 1057 * |
| KELI YANG 等: "Development of a multiplex PCR to detect and discriminate porcine circoviruses in clinical specimens", BMC INFECTIOUS DISEASES, vol. 19, no. 778, pages 1 - 10 * |
| 朱小甫: "陕甘地区猪PCV3流行毒株的检测", 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 * |
| 朱小甫: "陕甘地区猪PCV3流行毒株的检测", 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》, vol. 46, no. 11, 30 November 2018 (2018-11-30), pages 11 - 17 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112014561A (zh) * | 2020-09-03 | 2020-12-01 | 扬州大学 | 猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用及试剂盒 |
| CN112014561B (zh) * | 2020-09-03 | 2022-04-19 | 扬州大学 | 猪圆环病毒4型特异的抗原在制备检测猪圆环病毒4型抗体的试剂盒中的应用及试剂盒 |
| CN112345767A (zh) * | 2020-10-23 | 2021-02-09 | 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 | 猪圆环病毒4型elisa抗体检测试剂盒、应用及检测猪圆环病毒4型抗体的方法 |
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