CN112345767A - 猪圆环病毒4型elisa抗体检测试剂盒、应用及检测猪圆环病毒4型抗体的方法 - Google Patents

猪圆环病毒4型elisa抗体检测试剂盒、应用及检测猪圆环病毒4型抗体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种猪圆环病毒4型ELISA抗体检测试剂盒、应用及检测猪圆环病毒4型抗体的方法，涉及生物技术领域，本发明提供的猪圆环病毒4型ELISA抗原检测试剂盒，包括包被有猪圆环病毒4型Cap蛋白的酶标板，本发明使用圆环病毒4型Cap蛋白作为抗原建立ELISA抗体检测试剂盒，Cap蛋白作为圆环病毒保守蛋白具有良好的抗原性，其能够特异地结合血清样品中的圆环病毒4型抗体，从而保证本发明提供的试剂盒对圆环病毒4型具有很强的特异性及灵敏度。

Description

猪圆环病毒4型ELISA抗体检测试剂盒、应用及检测猪圆环病 毒4型抗体的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种猪圆环病毒4型ELISA抗体检测试剂盒、应用及检测猪圆环病毒4型抗体的方法。
背景技术
在猪中已经鉴定的圆环病毒包括猪圆环病毒1型(PCV1)、圆环病毒2型(PCV2)、圆环病毒3型(PCV3)。然而2019年4月，在我国湖南省几头临床病情严重的猪中发现了圆环病毒4型(PCV4)。另外，还有研究报道在我国的宁夏省、河南省和山西省的某猪场也发现了PCV4。该病毒基因组的大小为1770个核苷酸(nt)，它与水貂圆环病毒的基因型同源性最高(66.9％)，与其他PCV基因组的同源性为43.2％-51.5％。它包含两个主要的基因，分别是Rep基因(891nt)和Cap基因(687nt)。目前，在我国多个省份PCV4已经被发现，它被报道可能涉及严重的临床呼吸、肠道疾病和猪皮炎肾病综合征。随着猪圆环病毒4型的流行强度及流行区域的不断加强和扩大，这很可能会给养猪业带来巨大的威胁并且会给该病的防控工作带来巨大的挑战。
因此，当前急需建立一种快速、特异的血清学检测方法，及时掌握PCV4的流行情况及对该病的防控具有积极意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种猪圆环病毒4型ELISA抗体检测试剂盒，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供上述猪圆环病毒4型ELISA抗体检测试剂盒的应用。
本发明的第三个目的在于提供一种非疾病的诊断和治疗目的的检测和/或鉴定猪圆环病毒4型抗体的方法。
本发明提供了一种猪圆环病毒4型ELISA抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括包被有猪圆环病毒4型Cap蛋白的酶标板。
进一步地，所述酶标板中猪圆环病毒4型Cap蛋白的包被浓度为0.5-1μg/mL，优选为0.625μg/mL。
进一步的，所述猪圆环病毒4型Cap蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
优选地，编码所述猪圆环病毒4型Cap蛋白的核酸具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
进一步的，所述猪圆环病毒4型Cap蛋白的制备方法包括在宿主中表达编码所述猪圆环病毒4型Cap蛋白的基因；
优选地，将表达所述猪圆环病毒4型Cap蛋白的载体导入受体菌，得到表达猪圆环病毒4型Cap蛋白的宿主菌；
优选地，所述载体包括pET-28a；
优选地，所述受体菌包括BL21(DE3)。
进一步的，还包括对表达得到的猪圆环病毒4型Cap蛋白进行纯化的步骤；
优选地，使用Ni柱纯化。
进一步地，所述试剂盒还包括封闭液、辣根过氧化物酶标记的二抗、底物液、洗涤液、终止液、阳性对照和阴性对照；
优选地，所述封闭液包括含0.25％wt-0.5％wt明胶的PBST，优选为含0.25％明胶的PBST；
优选地，所述辣根过氧化物酶标记的二抗的稀释浓度为10000-20000倍稀释；优选为10000倍稀释。
优选地，所述洗涤液包括PBST；
优选地，所述终止液包括2M硫酸。
本发明还提供了上述的猪圆环病毒4型ELISA抗体检测试剂盒在制备检测和/或鉴定猪圆环病毒4型抗体的产品中的应用。
此外，本发明还提供了一种非疾病的诊断和治疗目的的检测和/或鉴定猪圆环病毒4型抗体的方法，所述方法依次包括抗原包被、封闭、一抗孵育、辣根过氧化物酶标记的二抗孵育、显色、终止及检测；
其中，抗原为猪圆环病毒4型Cap蛋白。
进一步的，所述抗原包被包括将浓度为0.625μg/mL的猪圆环病毒4型Cap蛋白加入酶标板中，加入量为100μL/孔，4℃包被过夜；
优选地，所述封闭包括加入含0.25％明胶的PBST的封闭液，加入量为150μL/孔，37℃封闭1h；
优选地，所述一抗孵育包括将待测样品稀释200倍后加入酶标板中，同时加入阴性对照和阳性对照，37℃孵育90min；
优选地，所述辣根过氧化物酶标记的二抗孵育包括将辣根过氧物化酶标记的抗体进行10000倍稀释后加入酶标板中，37℃孵育45min；
优选地，所述显色包括加入底物液，加入量为100μL/孔，37℃避光反应5min；
优选地，所述终止包括加入终止液，加入量为50μL/孔；
优选地，所述检测包括在加入终止液15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值；
优选地，所述结果判定为：若待检样品OD450值>0.494时，则判定为阳性；若待检样品OD450值<0.415时，则判定为阴性；若待检样品OD450值在两者之间的则判定为可疑。
进一步的，在抗原包被、封闭、一抗孵育、辣根过氧化物酶标记的二抗孵育和显色步骤之间，分别还包括洗涤的步骤；
优先地，所述洗涤包括：通过洗涤液洗涤酶标板至少3次并干燥，每次静置5min。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的猪圆环病毒4型ELISA抗原检测试剂盒，包括包被有猪圆环病毒4型Cap蛋白的酶标板，本发明使用圆环病毒4型Cap蛋白作为抗原建立ELISA抗体检测试剂盒，Cap蛋白作为圆环病毒保守蛋白具有良好的抗原性，其能够特异地结合血清样品中的圆环病毒4型抗体，从而保证本发明提供的试剂盒对圆环病毒4型具有很强的特异性及灵敏度。最低检测包被浓度达0.16μg/mL。
基于本发明提供的猪圆环病毒4型ELISA抗原检测试剂盒的有益效果，可将其应用于制备检测和/或鉴定猪圆环病毒4型抗体的产品，能够实现快速、准确地检测和/或鉴定猪圆环病毒4型抗体。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的重组载体pET-Cap4的酶切鉴定的结果图，其中1为重组载体pET-Cap4经EcoRI和XhoI双酶切产物，2为重组载体pET-Cap4，M为DNA MarkerDL15000；
图2为本发明实验例提供的SDS-PAGE鉴定猪圆环病毒4型Cap蛋白的纯化的结果图，其中，1为诱导的重组菌超声上清液，2为结合Ni后的流穿液，3-4为洗涤液，5-7为洗脱液，M为蛋白质分子量Marker；
图3为本发明实验例提供的Western blotting鉴定猪圆环病毒4型Cap蛋白的纯化的结果图，其中，1为诱导的重组菌超声上清液，2为结合Ni后的流穿液，3-4为洗涤液，5-7为洗脱液，M为蛋白质分子量Marker。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，提供了一种猪圆环病毒4型ELISA抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括包被有猪圆环病毒4型Cap蛋白的酶标板。
本发明使用圆环病毒4型Cap蛋白作为抗原建立ELISA抗体检测试剂盒，Cap蛋白作为圆环病毒保守蛋白具有良好的抗原性，其能够特异地结合血清样品中的圆环病毒4型抗体，从而保证本发明提供的试剂盒对圆环病毒4型具有很强的特异性及灵敏度。
需要说明的是，在本发明中，利用猪圆环病毒4型全长Cap蛋白来检测猪圆环病毒4型抗体，其中所述猪圆环病毒4型Cap蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
在一些优选的实施方式中，本发明通过对密码子进行优化，能够使得减少宿主低偏好性的密码子，增加目的蛋白的表达，具体的编码所述猪圆环病毒4型Cap蛋白的核酸具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明的发明人通过实验发现，抗原包被浓度对ELISA抗体检测试剂盒的检测结果特异性存在一定影响，当所述酶标板中猪圆环病毒4型Cap蛋白的包被浓度为0.5-1μg/mL，例如可以为，但不限于0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL、0.8μg/mL、0.9μg/mL或1μg/mL，当包被浓度为0.625μg/mL时，P/N比值最大。因此优选浓度为0.625μg/mL的猪圆环病毒4型Cap蛋白包被酶标板。
在一些优选的实施方式中，所述猪圆环病毒4型Cap蛋白的制备方法包括在宿主中表达编码所述猪圆环病毒4型Cap蛋白的基因。该方法操作简单，常规实验条件下即可实现，适合大规模生产猪圆环病毒4型Cap蛋白。
优选地，将表达所述猪圆环病毒4型Cap蛋白的载体导入受体菌，得到表达猪圆环病毒4型Cap蛋白的宿主菌。其中载体例如可以为，但不限于pET-28a；受体菌例如可以为，但不限于BL21(DE3)。
在一些优选的实施方式中，还包括对表达得到的猪圆环病毒4型Cap蛋白进行纯化的步骤。
需要说明的是，本发明对蛋白纯化的方式不做限定，凡是本领域能够实现对蛋白进行纯化的常规方法均可用于本发明中对猪圆环病毒4型Cap蛋白进行纯化。
作为优选，可以使用Ni柱纯化。
当使用Ni柱纯化猪圆环病毒4型Cap蛋白时，其配套的洗涤液可以为pH为8.0的300mM氯化钠，50mM磷酸二氢钠，10～20mM咪唑的水溶液；洗脱液可以为pH为8.0的300mM氯化钠，50mM磷酸二氢钠，250～500mM咪唑的水溶液。
在一些优选的实施方式中，所述试剂盒还包括封闭液、辣根过氧化物酶标记的二抗、底物液、洗涤液、终止液、阳性对照和阴性对照。
作为优选，典型的封闭液可以为含0.25％wt-0.5％wt明胶的PBST，例如可以为，但不限于含0.25％wt明胶的PBST、0.3％wt明胶的PBST、0.35％wt明胶的PBST、0.4％wt明胶的PBST、0.45％wt明胶的PBST或0.5％wt明胶的PBST，优选为0.25％明胶的PBST，典型的辣根过氧化物酶标记的二抗的稀释浓度为10000-20000倍稀释，例如可以为，但不限于10000倍稀释、12000倍稀释、14000倍稀释、16000倍稀释、18000倍稀释或20000倍稀释，当选择含0.25％明胶的PBST作为封闭液和/或选择10000倍的稀释倍数稀释辣根过氧化物酶标记的二抗时，P/N比值最大。
基于本发明提供的猪圆环病毒4型ELISA抗原检测试剂盒的有益效果，可将其应用于制备检测和/或鉴定猪圆环病毒4型抗体的产品，能够实现快速、准确地检测和/或鉴定猪圆环病毒4型抗体。
此外，本发明还提供了一种非疾病的诊断和治疗目的的检测和/或鉴定猪圆环病毒4型抗体的方法，所述方法依次包括抗体包被、封闭、一抗孵育、辣根过氧化物酶标记的二抗孵育、显色、终止及检测；
其中，抗体为猪圆环病毒4型Cap蛋白。
基于Cap蛋白作为圆环病毒保守蛋白具有良好的抗原性，其能够特异地结合血清样品中的圆环病毒4型抗体，因此本发明选用猪圆环病毒4型Cap蛋白作为包被抗体，能够使得该检测和/或鉴定猪圆环病毒4型抗体的方法具有更高的特异性和更强的灵敏度。
需要说明的是，本发明提供的检测和/或鉴定猪圆环病毒4型抗体的方法为非疾病的诊断和治疗目的，其可以用于实验室样本的检测和/或鉴定、或单纯科学研究等。
具体地，本发明提供的非疾病的诊断和治疗目的的检测和/或鉴定猪圆环病毒4型抗体的方法可以包括如下步骤：
S1.抗原包被：将纯化的重组蛋白通过包被液稀释至终浓度为0.625μg/mL加入酶标板中，100μL/孔，4℃包被过夜；
S2.洗涤：通过PBST洗涤酶标板3次，每次静置5min，最后一次用吸水纸上拍干；
S3.封闭：加入含0.25％明胶PBST的封闭液，150μL/孔，37℃封闭1h；
S4.洗涤：通过PBST洗涤酶标板3次，吸水纸上拍干，每次静置5min；
S5.一抗孵育：将血清样品进行200倍稀释后加入酶标板中，同时加入阴阳性对照，37℃孵育90min；
S6.洗涤：通过PBST洗涤酶标板3次，吸水纸上拍干，每次静置5min；
S7.酶标二抗孵育：将辣根过氧物化酶(HRP)标记的抗体进行10000倍稀释后加入酶标板中，37℃孵育45min；
S8.洗涤：通过PBST洗涤酶标板，每次静置5min，吸水纸上拍干，洗涤3次；
S9.显色：加入TMB底物液，100μL/孔，37℃避光反应5min；
S10.终止：加入终止液，50μL/孔；
S11.检测：在加入终止液15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值；
S12.结果判定：若待检样品OD450值>0.494时，则判定为阳性；若待检样品OD450值<0.415时，则判定为阴性；若待检样品OD450值在两者之间的则判定为可疑。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。试剂及药品的来源如下：
1.ELISA包被板购买于Corning公司；
2.ELISA包被液(50mM碳酸钠/碳酸氢钠，pH9.6)购买于Solarbio公司；
3.封闭液是来自于冷水鱼类皮肤的明胶购买于Sigma公司，用于稀释的1×PBS购买于Corning公司；
4.HRP标记的二抗购买于北京博奥森公司；
5.显色液是TMB底物液购买于Life technologies公司；
6.终止液是2M硫酸购买于RICCA公司；
7.His标签抗体购买于金斯瑞公司；
8.BCA蛋白定量试剂盒购买于康为世纪公司。
实施例1猪圆环病毒4型Cap蛋白的制备与纯化
本实施例提供了猪圆环病毒4型Cap蛋白的制备过程，包括以下步骤：
A1.经过密码子优化后，获得的猪圆环病毒4型Cap基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，并连入表达载体pET-28a上，得到重组载体并双酶切鉴定(图1)；
A2.将重组载体转化入受体菌BL21(DE3)，得到重组菌；
A3.挑取阳性的单菌落培养，液体培养基培养至OD600约0.8左右，加入IPTG使其终浓度为0.5mM，20℃低温诱导12～16h，离心取沉淀；
A4.加入含有蛋白酶抑制剂的1×PBS重悬沉淀，超声破碎，离心取上清；
A5.将重悬的上清液加入Ni柱中，混匀后，4℃缓慢涡旋60min；
A6.使用10～20mM咪唑pH 8.0的洗涤4～6次，再用250～500mM咪唑洗脱，收集洗脱液即可；
其中，洗涤液为pH为8.0的300mM氯化钠，50mM磷酸二氢钠，10～20mM咪唑的水溶液；
洗脱液为pH为8.0的300mM氯化钠，50mM磷酸二氢钠，250～500mM咪唑的水溶液。
将纯化后的Cap蛋白分别经SDS-PAGE鉴定及Western blotting鉴定，结果分别如图2和图3所示，从图2和图3均可看出，通过本实施例提供的方法能够有效得到纯度较高的猪圆环病毒4型Cap蛋白。
实施例2猪圆环病毒4型抗体的ELISA检测
本实施例提供了一种猪圆环病毒4型抗体的ELISA检测过程，包括以下步骤：
B1.抗原包被：将纯化的重组蛋白通过包被液稀释至终浓度为0.625μg/mL加入酶标板中，100μL/孔，4℃包被过夜；
B2.洗涤：通过PBST洗涤酶标板3次，每次静置5min，最后一次用吸水纸上拍干；
B3.封闭：加入含0.25％明胶PBST的封闭液，150μL/孔，37℃封闭1h；
B4.洗涤：通过PBST洗涤酶标板3次，吸水纸上拍干，每次静置5min；
B5.一抗孵育：将血清样品进行200倍稀释后加入酶标板中，同时加入阴阳性对照，37℃孵育90min；
B6.洗涤：通过PBST洗涤酶标板3次，吸水纸上拍干，每次静置5min；
B7.酶标二抗孵育：将辣根过氧物化酶(HRP)标记的抗体进行10000倍稀释后加入酶标板中，37℃孵育45min；
B8.洗涤：通过PBST洗涤酶标板，每次静置5min，吸水纸上拍干，洗涤3次；
B9.显色：加入TMB底物液，100μL/孔，37℃避光反应5min；
B10.终止：加入终止液，50μL/孔；
B11.检测：在加入终止液15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值；
B12.结果判定：若待检样品OD450值>0.494时，则判定为阳性；若待检样品OD450值<0.415时，则判定为阴性；若待检样品OD450值在两者之间的则判定为可疑。
实验例
为了验证本发明选择的不同ELISA条件的有益效果，进行如下实验：
1、抗原及一抗最佳稀释浓度的确定
将纯化的重组蛋白通过包被液稀释，以5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL进行包被，100μL/孔，4℃包被过夜；PBST洗涤3次，每次5min；加入封闭液，37℃封闭1h；洗涤后，将阴、阳性血清按照1：100、1：200、1：400、1：800稀释后，100μL/孔加入，37℃孵育90min；洗涤后，加入1:10000稀释的HRP-兔抗猪IgG，100μL/孔，37℃孵育45min；洗涤，拍干后每孔加入100μL TMB显色液，37℃避光作用6min；加入2M硫酸，50μL/孔，终止反应，酶标仪进行读数。根据表1所示，所纯化的蛋白包被浓度为0.625μg/mL，血清稀释倍数为1：200时，P/N比值最大(25.61)。
表1最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定
Figure BDA0002740696560000111
Figure BDA0002740696560000121
注：P表示PCV4阳性血清OD450nm值；N表示PCV4阴性血清OD450nm值；以下表格同样。
2、最佳包被条件的确定
将最佳包被抗原分别于4℃过夜、37℃孵育2h、37℃孵育1h后4℃包被过夜、37℃孵育2h后4℃包被过夜，其他条件同实施例2进行操作。根据表2所示，在抗原4℃包被过夜的条件下，P/N比值最大(24.31)。
表2包被条件的确定
Figure BDA0002740696560000122
3、最佳封闭液的确定
将最佳包被抗原4℃包被过夜，洗涤后，分别加入5％FBS、5％SMP、2.5％明胶、5％明胶、0.5％BSA和1％BSA于37℃封闭1h，其他条件同实施例2进行操作。根据表3所示，在含0.25％明胶的PBST作为封闭液时，P/N比值最大(15.02)。
表3封闭液的确定
Figure BDA0002740696560000123
注：FBS表示胎牛血清；SMP表示脱脂奶粉；BSA表示牛血清白蛋白；以下表格同样。
4、最佳封闭时间的确定
将最佳包被抗原4℃包被过夜，洗涤后，加入0.25％明胶分别封闭30min、45min、60min和90min，其他条件同实施例2进行操作。根据表4所示，在封闭时间为60min时，P/N比值最大(11.62)。
表4封闭液时间的确定
Figure BDA0002740696560000131
5、血清最佳反应时间的确定
将最佳包被抗原4℃包被过夜，洗涤后，加入0.25％明胶于37℃封闭1h，加入1：200倍稀释浓度的一抗，于37℃分别作用30min、45min、60min和90min，其他条件同实施例2进行操作。根据表5所示，当血清于37℃反应90min时，P/N比值最大(20.46)。
表5血清最佳反应时间的确定
Figure BDA0002740696560000132
6、酶标抗体最佳稀释浓度的确定
将最佳包被抗原4℃包被过夜，洗涤后，加入0.25％明胶于37℃封闭1h，加入1：200倍稀释浓度的一抗于37℃作用90min,洗涤后，将HRP-兔抗猪(二抗)酶标抗体分别以1：5000、1：10000、1：15000、1：20000稀释，其他条件同实施例2进行操作。根据表6所示，在HRP-兔抗猪酶标抗体为1：10000稀释时，P/N比值最大(21.92)。
表6酶标抗体稀释浓度的确定
Figure BDA0002740696560000133
Figure BDA0002740696560000141
7、酶标抗体最佳作用时间的确定
将最佳包被抗原4℃包被过夜，洗涤后，加入0.25％明胶于37℃封闭1h，加入1：200倍稀释浓度的一抗于37℃作用90min，洗涤后，将HRP-兔抗猪(二抗)酶标抗体按1：10000稀释于37℃分别作用30min、45min、60min和90min，其他条件同实施例2进行操作。根据表7所示，当酶标抗体在37℃反应45min时，P/N比值最大(23.49)。
表7酶标抗体作用时间的确定
Figure BDA0002740696560000142
8、底物最佳显色时间的确定
TMB底物于37℃避光分别作用3min、6min、10min、15min，其他条件同实施例2进行操作。根据表8所示，当底物在37℃作用6min时，P/N比值最大(15.09)。
表8底物作用时间的确定
Figure BDA0002740696560000143
9、阴阳性临界值的确定
用建立的间接ELISA检测方法检测84份阴性血清，算出这些阴性血清OD450nm值的平均值(AV)和标准偏差(SD)。根据表9所示，选取的84份PCV4阴性血清OD450nm值的平均值(AV)为0.257，标准偏差(SD)为0.079。根据统计学原理，当样品OD450nm值≥AV+3SD＝0.494时判定为阳性，当样品OD450nm值≤AV+2SD＝0.415时判定为阴性，而在阴阳性之间的数值则为可疑。
表9阴阳性临界值的确定
Figure BDA0002740696560000151
10、特异性试验
运用应该建立的间接ELISA方法分别对猪圆环病毒1(PCV1)、猪圆环病毒2(PCV2)、猪圆环病毒3(PCV3)、猪繁殖和呼吸障碍综合征(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)、戊型肝炎病毒(HEV)及乙型脑炎病毒(JEV)的阳性对照血清进行检测，同时设置阴阳性对照，从而验证所建该方法的特异性。根据表10所示，该ELISA方法检测其他病毒阳性血清均为阴性，表明此方法具有高度特异性。
表10特异性试验
Figure BDA0002740696560000152
Figure BDA0002740696560000161
注：PCV表示猪圆环病毒；PRRSV表示猪繁殖和呼吸障碍综合征；PRV表示伪狂犬病病毒；CSFV表示猪瘟病毒；ASFV表示非洲猪瘟病毒；HEV表示戊型肝炎病毒；JEV表示乙型脑炎病毒。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所
<120> 猪圆环病毒4型ELISA抗体检测试剂盒、应用及检测猪圆环病毒4型抗体的方
法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 228
<212> PRT
<213> 猪
<400> 1
Met Pro Ile Arg Ser Arg Tyr Ser Arg Arg Arg Arg Asn Arg Arg Asn
1 5 10 15
Gln Arg Arg Arg Gly Leu Trp Pro Arg Ala Asn Arg Arg Arg Tyr Arg
20 25 30
Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe His Ala Arg Phe Met Arg Glu Val
35 40 45
Thr Leu Ser Val Ser Ser Phe Ser Thr Pro Ser Trp Asn Val Gly His
50 55 60
Tyr Asp Phe Lys Leu Lys Asp Phe Ile Pro Lys Gly Pro Gly Thr Ile
65 70 75 80
Val Asn Leu Tyr Ser Leu Pro Phe Ala Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Ile
85 90 95
Lys Val Glu Phe Leu Pro Leu Asn Gly Ile Asn Ser Asn Arg Thr Tyr
100 105 110
Ser Ser Thr Ala Ile Gln Leu Asp Gly Asp Tyr Val Gly Glu Gly Lys
115 120 125
Asn Gln Thr Tyr Asp Val Leu Ala Asn His Ser Ser Arg His Gly Phe
130 135 140
Thr Asn Ile Ala Arg His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Gln Asp
145 150 155 160
Pro Ser Gly Glu Thr His Thr Leu His Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg
165 170 175
Asn Gln Trp Trp Ile Ser Met Ala Asp Gln Asp Leu Val His His Gly
180 185 190
Leu Gln Tyr Ser Ile Gln Asn Ser Asn Phe Val Gln Val Trp Thr Val
195 200 205
Arg Phe Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asp Leu Val Asn Tyr
210 215 220
Pro Lys Gln Gly
225
<210> 2
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgccgattc gcagtcgtta tagtcgtcgc cgtcgtaatc gtcgcaatca gcgtcgccgt 60
ggcctgtggc cgcgtgcaaa tcgtcgccgt tatcgttggc gtcgtaaaaa tggcattttt 120
catgcacgtt ttatgcgcga agtgaccctg agcgttagca gttttagtac cccgagttgg 180
aatgtgggtc attatgattt taaactgaag gatttcatcc cgaaaggtcc gggtaccatt 240
gttaatctgt atagcctgcc gtttgcatat tatcgcattc gtaaaattaa ggtggaattt 300
ctgccgctga atggcattaa tagcaatcgt acctatagta gcaccgccat tcagctggat 360
ggtgactatg ttggtgaagg taaaaatcag acctatgatg tgctggccaa tcatagtagt 420
cgccatggtt ttaccaatat tgcccgccat agccgttatt ttaccccgaa accgcaggat 480
ccgagcggtg aaacccatac cctgcatttt cagccgaata ataagcgcaa tcagtggtgg 540
attagcatgg cagatcagga tctggttcat catggtctgc agtatagcat tcagaatagc 600
aattttgttc aggtgtggac cgtgcgcttt accatgtatg tgcagtttcg cgaatttgat 660
ctggttaatt atccgaaaca gggttaa 687

Claims (10)

1.一种猪圆环病毒4型ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被有猪圆环病毒4型Cap蛋白的酶标板。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标板中猪圆环病毒4型Cap蛋白的包被浓度为0.5-1μg/mL，优选为0.625μg/mL。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述猪圆环病毒4型Cap蛋白具有如SEQID NO.1所示的氨基酸序列；
优选地，编码所述猪圆环病毒4型Cap蛋白的核酸具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述猪圆环病毒4型Cap蛋白的制备方法包括在宿主中表达编码所述猪圆环病毒4型Cap蛋白的基因；
优选地，将表达所述猪圆环病毒4型Cap蛋白的载体导入受体菌，得到表达猪圆环病毒4型Cap蛋白的宿主菌；
优选地，所述载体包括pET-28a；
优选地，所述受体菌包括BL21(DE3)。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括对表达得到的猪圆环病毒4型Cap蛋白进行纯化的步骤；
优选地，使用Ni柱纯化。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括封闭液、辣根过氧化物酶标记的二抗、底物液、洗涤液、终止液、阳性对照和阴性对照；
优选地，所述封闭液包括含0.25％wt-0.5％wt明胶的PBST，优选为含0.25％明胶的PBST；
优选地，所述辣根过氧化物酶标记的二抗的稀释浓度为10000-20000倍稀释；优选为10000倍稀释；
优选地，所述洗涤液包括PBST；
优选地，所述终止液包括2M硫酸。
7.权利要求1-6任一项所述的猪圆环病毒4型ELISA抗体检测试剂盒在制备检测和/或鉴定猪圆环病毒4型抗体的产品中的应用。
8.一种非疾病的诊断和治疗目的的检测和/或鉴定猪圆环病毒4型抗体的方法，其特征在于，所述方法依次包括抗体包被、封闭、一抗孵育、辣根过氧化物酶标记的二抗孵育、显色、终止及检测；
其中，抗体为猪圆环病毒4型Cap蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗体包被包括将浓度为0.625μg/mL的猪圆环病毒4型Cap蛋白加入酶标板中，加入量为100μL/孔，4℃包被过夜；
优选地，所述封闭包括加入含0.25％明胶的PBST的封闭液，加入量为150μL/孔，37℃封闭1h；
优选地，所述一抗孵育包括将待测样品稀释200倍后加入酶标板中，同时加入阴性对照和阳性对照，37℃孵育90min；
优选地，所述辣根过氧化物酶标记的二抗孵育包括将辣根过氧物化酶标记的抗体进行10000倍稀释后加入酶标板中，37℃孵育45min；
优选地，所述显色包括加入底物液，加入量为100μL/孔，37℃避光反应5min；
优选地，所述终止包括加入终止液，加入量为50μL/孔；
优选地，所述检测包括在加入终止液15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值；
优选地，所述结果判定为：若待检样品OD450值>0.494时，则判定为阳性；若待检样品OD450值<0.415时，则判定为阴性；若待检样品OD450值在两者之间的则判定为可疑。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，在抗原包被、封闭、一抗孵育、辣根过氧化物酶标记的二抗孵育和显色步骤之间，分别还包括洗涤的步骤；
优先地，所述洗涤包括：通过洗涤液洗涤酶标板至少3次并干燥，每次静置5min。
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