CN103033622A

CN103033622A - 猪圆环病毒2型elisa抗原检测试剂盒及其制备方法和其应用

Info

Publication number: CN103033622A
Application number: CN2012103565527A
Authority: CN
Inventors: 廖园园; 漆世华; 朱薇; 李建; 秦伟; 王威; 熊媛媛; 张萍; 秦红刚; 李伟; 谢红玲; 温文生; 王桢桢; 靖志强; 吴玉石; 韩兴; 刘洁
Original assignee: WUHAN CHOPPER BIOLOGY CO Ltd
Current assignee: WUHAN CHOPPER BIOLOGY CO Ltd
Priority date: 2011-12-26
Filing date: 2012-09-21
Publication date: 2013-04-10
Anticipated expiration: 2032-09-21
Also published as: CN103033622B

Abstract

本发明涉及一种猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒及其制备方法和其应用。其中，所述检测试剂盒含有：包被抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、抗原标准品、HRP标记的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体的二抗、浓缩洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和终止液，其中，所述抗原标准品为纯化的重组猪圆环病毒2型核衣壳蛋白（PCV2-Cap蛋白）。本发明试剂盒的特异性达100%，灵敏度高达4ng/ml，可用于猪群PCV2抗原检测和PCV2疫苗产品的定量检测。

Description

猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒及其制备方法和其应用

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒及其制备方法和其应用。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是引发断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原。除了引发PMWS外，PCV2还与仔猪先天性震颤、猪皮炎肾炎综合征、猪呼吸道综合征(PDNS)、母猪繁殖障碍等疾病相关。自1996年在加拿大首次发现PMWS以来，PCV2感染引起的相关疾病已经在全世界广泛存在。截止目前，我国养猪业受到PCV2感染的危害日益突出。因此，研制PCV2抗原检测试剂盒的临床需求日益迫切。

目前，国内外采用的PCV2检测方法主要包括病毒分离培养、间接免疫荧光、免疫酶单层实验（IMPA）、原位杂交（ISH）、聚合酶链式反应（PCR）等。尽管这些方法可以检测PCV2，但存在使用不便，操作繁琐，耗时长，不易普及等缺陷。

CN102183650A公开了一种猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒采用双单抗结合技术检测PCV2抗体。

CN1584597A公开了一种猪圆环病毒2型抗原或抗体ELISA检测试剂盒，其中，所述的抗原检测试剂盒使用双单抗夹心法，包被的抗体为原核表达的蛋白制备所得，并仅能依靠检测孔的深浅来判断强阳性、阳性、弱阳性和阴性等定性检测结果。该文献公开的试剂盒至今还没有市场化，分析原因可能是试剂盒的特异性或敏感性不能满足市场检测的需要。为此，急需研究一种能够高效、定量检测PCV2的方法。

CN201110440750.7公开了一种猪圆环病毒2型亚单位疫苗及其制备方法和其应用，该申请公开的内容全文作为本申请的参考。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述检测试剂盒含有：包被抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、抗原标准品、HRP标记的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体的二抗、浓缩洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和终止液，其中，所述抗原标准品为纯化的重组杆状病毒表达的形成病毒样颗粒（VLPs）的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白（PCV2-Cap蛋白）,所述酶底物A溶液为3,3’-5,5’-四甲基联苯胺溶液，所述的酶底物B溶液为含有双氧水的乙酸钠缓冲溶液。

本发明的优选技术方案中，所述的包被抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体的酶标板孔包被的抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体为由纯化的重组杆状病毒表达的形成病毒样颗粒（VLPs）的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap蛋白)作为抗原免疫实验兔后纯化血清所得，所述抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体的包被量为0.1μg-5μg/孔，包被稀释液为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，其中，所述碳酸盐缓冲液的pH9.6。

本发明的优选技术方案中，所述碳酸盐缓冲液的组成为，每升碳酸盐缓冲溶液中含有1.59g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃。

本发明的优选技术方案中，所述封闭液选自质量浓度为1-10%的BSA、质量浓度为1-10%的脱脂牛奶的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述样品稀释液由质量浓度为0.1-10%牛血清白蛋白（BSA）和含有0.01-0.05%NaN₃的磷酸盐缓冲液（PBS）组成，其中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/L，pH7.2-7.4。

本发明的优选技术方案中，所述浓缩洗涤液为含有0.5v/v％吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，其中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH7.2-7.4。

本发明的优选技术方案中，所述的酶底物A溶液为10mg/ml的3,3’-5,5’-四甲基联苯胺（TMB）溶液；所述的酶底物B溶液为含有0.012%（质量浓度）双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为10mg/ml，pH5.0。

本发明的优选技术方案中，所述终止液为1mol/L H₂SO₄溶液。

本发明的优选技术方案中，所述样品稀释液的配制为：配制pH7.2-7.4、浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液,再加入BSA和NaN₃，使其浓度分别为0.1-10%BSA和0.01-0.05%NaN₃，即得。

本发明的优选技术方案中，所述浓缩洗涤液的配制为：在0.1mol/L PBS溶液中加入吐温-20(Tween-20)，使得吐温-20的浓度为0.5v/v%。

本发明的优选技术方案中，所述的酶底物A溶液为10mg/ml的3,3’-5,5’-四甲基联苯胺（TMB）溶液，其配制为：称取100mg TMB，将其加入到10ml二甲基亚砜（DMSO）中，完全溶解后，即得。

本发明的优选技术方案中，所述的酶底物B溶液为0.012%双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为10mg/ml，pH5.0，其配制为：称取10g乙酸钠，溶于1L纯化水，用乙酸调pH5.0，再加入400μl浓度为30%H₂O₂，即得。

本发明的优选技术方案中，所述显色液用酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得。

本发明的优选技术方案中，所述的试剂盒中还含有抗原标准品和阴性对照液，其中抗原标准品的配制为用样品稀释液稀释重组PCV2-Cap蛋白，将其配制至1ug/ml而得；所述的阴性对照液用样品稀释液100倍稀释不含PCV2抗原的猪阴性血清配制而成。

本发明的优选技术方案中，所述重组PCV2-Cap蛋白的制备方法包括如下步骤：

（1）获得本发明所述的重组杆状病毒转移载体pFastBac Dual-2ORF2；

（2）同源重组，产生重组杆状病毒DNA；

（3）包装，产生表达PCV2衣壳蛋白的重组杆状病毒；

（4）获得本发明制备的重组杆状病毒；

（5）培养宿主细胞，接种步骤（4）的重组杆状病毒；

（6）灭活病毒；

（7）分离纯化重组PCV2Cap蛋白。

在本发明的一个优选技术方案中，所述重组杆状病毒转移载体是分别在pFastBacDual转移载体的P10启动子和Ppolh启动子(多角体蛋白启动子)之后各插入一个拷贝的PCV2Cap蛋白编码基因ORF2。

在本发明的一个优选技术方案中，所述的PCV2Cap蛋白编码基因ORF2是完整的、未经修饰的PCV2b ORF2。

在本发明的一个优选技术方案中，所述的PCV2Cap蛋白编码基因ORF2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在本发明的一个优选技术方案中，所述PCV2Cap蛋白编码基因ORF2分别通过BamHI/Hind III和Kpn I/Xho I双酶切插入pFastBac Dual转移载体中。

在本发明的一个优选技术方案中，所述重组杆状病毒转移载体为pFastBacDual-2ORF2。

在本发明的一个优选技术方案中，所述的同源重组是将步骤(1)所述的重组杆状病毒转移载体转化进含穿梭载体Bacmid的大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中，产生重组杆状病毒DNA。

在本发明的一个优选技术方案中，所述的包装是将步骤(2)产生的重组杆状病毒DNA感染sf9细胞，包装出重组杆状病毒。

在本发明的一个优选技术方案中，所述重组杆状病毒为rBac-2ORF2。

在本发明的一个优选技术方案中，所述的步骤（5）包括利用生物反应器无血清培养基悬浮培养sf9细胞作为宿主细胞，按感染复数（MOI）为0.001-10的量接种步骤（4）所述的重组杆状病毒后，继续培养，使PCV2Cap蛋白在sf9细胞中高效表达。

在本发明的一个优选技术方案中，所述生物反应器的培养参数设定为：pH 6.0-6.5，温度25-30℃，溶氧30-80%，搅拌速度50-250rpm，优选所述生物反应器的培养参数设定为pH 6.2，温度27℃，溶氧50%，搅拌速度100-180rpm。

在本发明的一个优选技术方案中，所述步骤（5）包括将细胞经过5L-50L培养体积逐级放大培养后，于50L生物反应器培养并接种所述重组杆状病毒；或者，将细胞经过5L-50L-500L培养体积逐级放大培养后，于500L生物反应器培养并接种所述重组杆状病毒。

在本发明的一个优选技术方案中，所述步骤（5）的培养方法选自批式培养方法、分批补料培养方法、半连续灌注培养方法或连续灌注培养方法的任一种或其组合，优选为分批补料培养方法。

在本发明的一个优选技术方案中，所述步骤（6）包括向细胞培养液中加入灭活剂二乙烯亚胺（BEI）灭活所述的重组杆状病毒，并可选的，在灭活结束后使用硫代硫酸钠中和过量的BEI。

在本发明的一个优选技术方案中，所述步骤（7）包括收集步骤（6）灭活后的细胞培养物，通过离心或中空纤维过滤除去细胞碎片，得到含有PCV2Cap蛋白的细胞培养上清，再通过超速离心和CsCl密度梯度离心，获得纯化的形成病毒样颗粒的Cap蛋白。

本发明的另一目的在于提供一种利用猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒的检测方法，包括下述步骤：

1）将待检试样用样品稀释液1:100稀释，将其加入均匀包被抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体的酶标板孔中，每孔加100μl，同时设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组加入1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512 系列稀释的抗原标准品各100μl，阴性对照组加入100μl阴性对照液，空白对照组加入100μl样品稀释液，每个试样和对照平行加样2-6个孔；

2）加样完成后，将酶标板置37℃孵育1小时后，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加水稀释10倍制得；

3）每孔加入100μlHRP标记的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体的二抗，37℃孵育1小时，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加水稀释10倍制得；

4）每孔加入100μl显色液，避光显色5-10分钟后，每孔再加入50μl终止液，其中，所述的显色液由酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得；

5）将酶标板置于酶标仪中，在450nm测定其光吸收值O_D450nm；

6）结果计算与判定：

其中，定性结果的判定：Cut off（CO值）=阴性对照光吸收值OD_450nm×2.1倍，样品值=样品光吸收值OD_450nm/CO值，其中，样品值>1为阳性；样品值≤1为阴性；或者，

定量结果的判定：以2为底OD值的对数为X轴，以2为底标准品的稀释倍数为Y轴，利用“EXCEL”软件获得线性曲线及方程式，将以2为底样品OD值的对数带入曲线方程式计算出样品的浓度。

本发明的另一目的在于提供本发明的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒用于检测猪群PCV2抗原或PCV2疫苗产品的应用。

本发明的优选技术方案中，所述的PCV2抗原选自猪群PCV2感染、PCV2疫苗抗原的任一种。

本发明的抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体的制备方法，包括下述步骤：

1）将前述纯化的PCV2-Cap蛋白常规免疫实验兔，当兔血清ELISA效价达到1:1000以上时，采集兔血清；

2）将步骤1）制得的兔血清经硫酸铵沉淀，纯化，制得纯化的抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体；

3）在步骤2）制得的抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体中加入0.1-10％牛血清白蛋白、0.1-10%酪蛋白和50％的中性甘油，测定工作浓度后，-20℃保存备用。

本发明的辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体的二抗可以商购，或按照本领域的常规方法制备，如参照文献（曹雪涛，精编免疫学实验指南[M].北京:科学出版社,2009；酶标记抗体－HRP标记抗体原理及方法，戊二醛二步法和过碘酸钠法，[EB/OL]http://www.seekbio.com/biotech/Immunity/2007/2007831543528. html2007-8-3.）公开的方法制备。作为示例，本发明的辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体的二抗的制备方法，包括下述步骤：

1）将前述纯化的PCV2-Cap蛋白常规免疫Balb/c小鼠，当小鼠血清ELISA效价达到1:10000以上时，取脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）以5×10⁷：1×10⁷的比例进行融合；用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞；用ELISA方法和间接免疫荧光（IFA）方法进行阳性杂交瘤细胞的筛选；将筛选到的阳性杂交瘤细胞经三次有限稀释得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株及抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体；

2）将步骤1）制得的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体经硫酸铵沉淀，纯化，制得纯化的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体；

3）用改良的过碘酸钠氧化法对步骤2）制得的纯化的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体进行HRP标记，制得辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体的二抗；

4）在辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体的二抗中加入0.1-10％牛血清白蛋白、0.1-10%酪蛋白和50％的中性甘油，测定工作浓度后，-20℃保存备用。

本发明的浓缩洗涤液为10倍洗涤液，检测时需加水稀释10倍，制得洗涤液。

本发明的显色液用酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得，其中，酶底物A溶液为10mg/ml的3,3’-5,5’-四甲基联苯胺（TMB）溶液；酶底物B溶液为0.012%（质量浓度）双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为10mg/ml，pH5.0。

本发明所述的抗原标准品的配制为用样品稀释液稀释重组PCV2-Cap蛋白至1ug/ml制成。

本发明所述的阴性对照液用样品稀释液100倍稀释不含PCV2抗原的猪阴性血清配制而成。

本发明所述的空白对照液为样品稀释液。

除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。

与现有技术相比，本发明的试剂盒具有下述有益技术效果：

1、经试验验证，本发明采用了中国流行的PCV2b亚型的编码Cap蛋白的基因序列，针对性地用于检测和预防中国流行的猪圆环病毒病；

2、本发明所述重组杆状病毒含有双启动子（多角体蛋白启动子和P10启动子），可表达双拷贝的Cap蛋白编码基因，显著提高了蛋白的表达效率；并且，插入的外源基因所表达的Cap蛋白不含多余序列，能有效形成病毒样颗粒（VLPs），保持了病毒抗原的空间构象结构，提高了表达蛋白的免疫原性，且生产的抗原含量高；

3、本发明的猪圆环病毒2型（PCV2）ELISA抗原检测试剂盒采用由形成病毒样颗粒（VLPs）的PCV2-Cap蛋白研制的多克隆抗体制备反应板，抗PCV2-Cap蛋白的单抗进行HRP酶标记后制备二抗，进而组成用双抗夹心法酶联免疫吸附实验检测猪圆环病毒2型抗原的试剂盒。本发明的试剂盒除具有ELISA试剂盒的优点外，还克服了抗原空间构象问题所致的特异性低和二抗问题所致的灵敏度低等缺陷，显著提高了检测的特异性和灵敏度。

4、本发明的试剂盒里还配备了抗原标准品，可以检测到样品中PCV2-Cap蛋白的准确含量，特别适合用于PCV2基因亚单位疫苗的定量检测，最高检测到抗原标准品的浓度为4ng/ml。

5、本发明试剂盒可以定性何定量检测PCV2，其检测特异性达100%，灵敏度高达4ng/ml，可用于猪群PCV2抗原检测和PCV2疫苗产品的定量检测。

附图说明

图1本发明的重组杆状病毒转移载体构建流程图。

图2本发明的重组杆状病毒构建流程图。

图3单拷贝、双拷贝重组bacmid PCR鉴定图。其中，图3A是双拷贝重组bacmid鉴定结果图，1是阴性对照，2和3是marker，4是PUC M13F/R引物。图3B是单拷贝重组bacmid鉴定结果图，1是阴性对照，2和3是marker，4是PUC M13F/R引物。

图4本发明表达的Cap蛋白形成病毒样颗粒（VLPs）电镜图片。

图5本发明试剂盒的制备工艺流程图。

图6实施例3制得的PCV2-Cap蛋白SDS-PAGE分析图，其中，M是Marker，1是纯化的PCV2-Cap蛋白。

图7实施例8中由标准品绘制的标准曲线图。

具体实施方式

以下将结合实施例具体说明本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。

实施例1 重组杆状病毒的构建

使用Bac-to-Bac系统构建重组杆状病毒，根据GENBANK公布的基因序列（NCBI登陆号EU340257.1）设计以下引物：

P1：TCTGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGCG

P2：GCGAAGCTTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC

P3：TCTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGCG

P4：GCGGGTACCTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC

以PCV2b株病毒ORF2序列为模板（该模板根据已公布的PCV2b ORF2序列：登陆号EU340257.1合成获得），P1，P2扩增PCV2ORF2基因，并将该基因克隆入pMD-19T载体中，获得重组载体pMD-19T-ORF2-1，以PCV2b株病毒ORF2序列为模板，P3，P4扩增PCV2ORF2基因，并将该基因克隆入pMD-19T载体中，获得重组载体pMD-19T-ORF2-2。

通过BamH I和Hind III双酶切pMD-19T-ORF2-1，将ORF2基因克隆入转移载体pFastBac Dual中，构建载体pFastBac Dual-ORF2；通过Kpn I和Xho I双酶切pMD-19T-ORF2-2，将ORF2基因克隆入转移载体pFastBac Dual-ORF2中，构建包含双拷贝ORF2基因的重组转移载体pFastBac Dual-2ORF2，将该重组转移载体转化大肠杆菌DH10Bac，获得插入双拷贝ORF2基因的重组质粒bacmid-2ORF2（PUC M13 F/R引物鉴定bacmid结果见图3A），将该重组质粒bacmid-2ORF2转染入昆虫细胞Sf9中，获得重组杆状病毒rBac-2ORF2（ORF2序列如SEQ ID NO：1所述），扩增重组杆状病毒rBac-2ORF2作为种毒备用。将重组转移载体pFastBac Dual-ORF2转化大肠杆菌DH10Bac，获得插入单拷贝ORF2基因的重组质粒bacmid-ORF2，将该重组质粒bacmid-ORF2转染入昆虫细胞Sf9中，获得重组杆状病毒rBac-ORF2（ORF2序列如SEQ ID NO：1所述），扩增重组杆状病毒rBac-ORF2备用（PUC M13F/R引物鉴定bacmid结果见图3B）。

实施例2 昆虫细胞的生物反应器无血清悬浮培养及Cap蛋白的表达定量

在1000ml摇瓶中无菌培养Sf9昆虫细胞3-4天，待浓度长到3-5×10⁶cells/ml，活力大于95%时，将细胞接种到5L的生物反应器中，接种浓度为3-8×10⁵cells/ml。当细胞浓度达到3-5×10⁶cells/ml时，将细胞接种到50L生物反应器中，待细胞长至浓度为3-5×10⁶cells/ml，接种到500L生物反应器中，待细胞浓度达到2-8×10⁶cells/ml时，接种重组病毒rBac-2ORF2或rBac-ORF2，感染复数（MOI）为0.001-10，反应器培养条件为pH 6.0-6.5、温度25-27℃、溶氧30-80%、搅拌速度100-180rpm。考虑到细胞培养的最适条件，优选的pH 6.2、细胞培养阶段温度设定27℃、溶氧50%、搅拌速度100-180rpm。在感染之后继续培养5-9天后，加入终浓度为5mmol/L的BEI，37℃作用24h后，加1mol/L Na₂S₂O₃至终浓度5mmol/L终止灭活。通过离心或中空纤维过滤的方法收获细胞培养上清，置2-8℃保存疫苗原液。

制备的疫苗抗原中所含的Cap蛋白通过ELISA定量检测。用包被缓冲液稀释纯化的捕获抗体兔抗PCV2-Cap蛋白多抗至合适浓度，每孔100μl，4℃过夜，PBST洗涤三次，1%BSA封闭1小时。加入不同浓度的抗原标准品（通过CsCl密度梯度离心纯化的形成病毒样颗粒VLPs的Cap蛋白）和梯度稀释待检样品，37℃孵育1小时，PBST洗三次。每孔加入检测抗体-抗PCV2Cap蛋白的单克隆抗体，37℃孵育1小时，PBST洗三次。每孔加入二抗-HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1小时，PBST洗三次。TMB显色10分钟，2MH₂SO₄终止反应。酶标仪读数，通过标准曲线计算待检样品中Cap蛋白的量。

使用三种不同MOI（0.01、0.1、1）接种两种不同的病毒，分别于接种后7-11天取样定量分析培养上清中的目的蛋白含量，结果见表1。

表1不同感染复数接种两种病毒蛋白表达量（μg/ml）分析

由Cap蛋白定量结果表明，使用生物反应器无血清悬浮培养表达Cap蛋白，在最适MOI（MOI=0.1）下，其表达量可达180μg/ml，相同条件下使用单拷贝目的基因的重组杆状病毒表达Cap蛋白（仅含多角体蛋白启动子），其表达量仅为70μg/ml。由此可见，本发明所述构建策略可以大幅提高Cap蛋白的表达水平。

实施例3 VLP颗粒的纯化及电镜观察

收获表达细胞培养物，将细胞培养物10000g，4℃离心30min，去细胞碎片，取上清，将上清31000rpm离心3h（Beckman SW70转子），将沉淀用少量PBS重悬，待沉淀完全溶解后，按2.1g/4.5ml溶液加入CsCl，混合均匀后，分装到5ml超速离心管中，补加PBS，到距管口2-3mm处，精确配平后，149000g，10℃离心24h。离心后，可见两条淡黄色透明带。将目的带（下层带）吸出收集，即为纯化的病毒样颗粒，即为PCV2-Cap蛋白，检测结果见图6。

取同等条件下，培养等量的rBac-ORF2和rBac-2ORF2表达的细胞培养物，按上述方法处理，将吸出的目的带稀释到相同体积，取样进行磷钨酸负染，电镜观察。结果如图4所示，其中，图4A为rBac-ORF2单拷贝表达样品纯化后电镜观察图片，图4B为rBac-2ORF2双拷贝表达样品纯化后电镜观察图片。可见，rBac-2ORF2能表达出更多的病毒样颗粒，并保持了病毒抗原的空间构象结构，具有良好的免疫原性。

实施例4 昆虫细胞的生物反应器无血清悬浮培养条件优化

本实施例采用批式培养方法和分批补料培养方法对悬浮培养条件进行优化，其中，Cap蛋白表达定量方法同实施例2。

批式培养中，于10L生物反应器中，按照5×10⁵cells/ml接种sf9细胞，当细胞密度达到2×10⁶cells/ml时，接种重组病毒rBac-2ORF2，培养7天，收获细胞培养物，测定Cap蛋白的表达量。

分批补料培养中，于10L生物反应器中，按照5×10⁵cells/ml接种sf9细胞，当细胞密度达到8×10⁶cells/ml时，接种重组病毒rBac-2ORF2，同时按照每天1/1000培养体积的量进行补料，培养7天，收获细胞培养上清，置2-8℃保存疫苗原液。测定Cap蛋白的表达量。

Cap蛋白定量结果表明：批式培养表达量为150μg/ml，而分批补料培养表达量达221μg/ml。可见，使用分批补料培养方法能大幅提高细胞培养密度及Cap蛋白的表达水平。

实施例5 猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒的制备

A.本实施例的抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体的制备方法，包括下述步骤：

1）将实施例3纯化的PCV2-Cap蛋白常规免疫实验兔，当兔血清ELISA效价达到1:1000以上时，采集兔血清；

3）在步骤2）制得的抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体中加入0.1-10％牛血清白蛋白、0.1-10%酪蛋白和50％的中性甘油，测定工作浓度后，-20℃保存备用；

B.辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体的二抗的制备方法，包括下述步骤：

1）将实施例3纯化的PCV2-Cap蛋白常规免疫Balb/c小鼠，当小鼠血清ELISA效价达到1:10000以上时，取脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）以5×10⁷：1×10⁷的比例进行融合；用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞；用ELISA方法和间接免疫荧光（IFA）方法进行阳性杂交瘤细胞的筛选；将筛选到的阳性杂交瘤细胞经三次有限稀释得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株及抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体；

4）在辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体的二抗中加入0.1-10％牛血清白蛋白、0.1-10%酪蛋白和50％的中性甘油，测定工作浓度后，-20℃保存备用；

C.酶标板孔均匀包被抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体，包被量为0.1μg-5μg/孔，包被缓冲液为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，pH9.6，即1升溶液中含1.59g Na₂CO₃和2.93gNaHCO₃；

D、封闭液为质量浓度为1-10%的BSA或脱脂牛奶的任一种或其组合；

E、试剂盒中其他溶液的配制：①样品稀释液：配制pH7.2-7.4、浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，再加入BSA和NaN₃，使其浓度分别为0.1-10%BSA和0.01-0.05%NaN₃，即得；②浓缩洗涤液：在0.1mol/LPBS溶液中加入吐温-20(Tween-20)，使得吐温-20的浓度为0.5v/v%，即得；③酶底物A溶液为10mg/ml的3,3’-5,5’-四甲基联苯胺溶液，其配制为：称取100mg TMB，加入到10ml二甲基亚砜（DMSO）中，完全溶解后，即得；④酶底物B溶液为0.012%双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为10mg/ml，pH5.0，其配制为：称取10g乙酸钠，溶于1L纯化水，用乙酸调pH5.0，加入400μl浓度为30%H2O2，即得；⑤显色液，用酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得；⑥终止液：取54.3ml浓度为95％浓硫酸，加蒸馏水至1000ml，即得；⑦抗原标准品：用样品稀释液稀释重组PCV2-Cap蛋白至1ug/ml而成；⑧阴性对照液，样品稀释液100倍稀释不含PCV2抗原的猪阴性血清配制而成。

实施例6 猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒的制备

1）商购获得抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体，该抗体购自美国RTI公司，商品克隆号为PCV2；

2）用改良的过碘酸钠氧化法对步骤1）获得的纯化的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体进行HRP标记，制得辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体的二抗；

3）在辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体的二抗中加入0.1-10％牛血清白蛋白、0.1-10%酪蛋白和50％的中性甘油，测定工作浓度后，-20℃保存备用；

E、试剂盒中其他溶液的配制：①样品稀释液：配制pH7.2-7.4、浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，再加入BSA和NaN₃，使其浓度分别为0.1-10%BSA和0.01-0.05%NaN₃，即得；②浓缩洗涤液：在0.1mol/LPBS溶液中加入吐温-20(Tween-20)，使得吐温-20的浓度为0.5v/v%，即得；③酶底物A溶液为10mg/ml的3,3’-5,5’-四甲基联苯胺溶液，其配制为：称取100mg TMB，加入到10ml二甲基亚砜（DMSO）中，完全溶解后，即得；④酶底物B溶液为0.012%双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为10mg/ml，pH5.0，其配制为：称取10g乙酸钠，溶于1L纯化水，用乙酸调pH5.0，加入400μl浓度为30%H₂O₂，即得；⑤显色液，用酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得；⑥终止液：取54.3ml浓度为95％浓硫酸，加蒸馏水至1000ml，即得；⑦抗原标准品：用样品稀释液稀释重组PCV2-Cap蛋白至1ug/ml而成；⑧阴性对照液，样品稀释液100倍稀释不含PCV2抗原的猪阴性血清配制而成。

实施例7 猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒的检测方法

利用本发明猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒的检测方法，包括下述步骤：

1）将待检试样用样品稀释液1:100稀释，将其加入均匀包被抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体的酶标板孔中，每孔加100μl，同时设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组加入1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512系列稀释的抗原标准品各100μl，阴性对照组加入100μl阴性对照液，空白对照组加入100μl样品稀释液，每个试样和对照平行加样3个孔；

2）加样完成后，将酶标板置37℃孵育1小时后，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；

3）每孔加入100μl HRP标记的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体的二抗，37℃孵育1小时，洗涤液洗板3-5次，甩干，其中，所述洗涤液由浓缩洗涤液加纯净水稀释10倍制得；

4）每孔加入100μl显色液，避光显色5-10分钟，每孔加入50μl终止液，其中，所述的显色液由酶底物B溶液100倍稀释酶底物A溶液制得；

5）将酶标板置于酶标仪中，在450nm测定其光吸收值OD_450nm；

6）结果计算与判定：

实施例8 本发明试剂盒的特异性和灵敏度测试

1.特异性检测

按照实施例7所述的检测方法，利用实施例5制得的试剂盒分别检测猪PCV2感染的血清、猪蓝耳病毒感染的血清、猪伪狂犬病毒感染的血清、猪瘟病毒感染的血清、PCV2疫苗（厂家1）、PCV2疫苗（厂家2）、PCV2疫苗（厂家3）和猪PCV2阴性血清。

将待检试样用样品稀释液1:100稀释，将其加入均匀包被抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体的酶标板孔中，每孔加100μl，同时设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组加入1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512系列稀释的抗原标准品各100μl，阴性对照组加入100μl阴性对照液，空白对照组加入100μl样品稀释液，每个试样和对照平行加样3个孔；

表2本发明试剂盒的特异性测试

由表2可见，猪PCV2感染的血清和PCV2疫苗检测为阳性，其他样品检测为阴性，本发明试剂盒的检测特异性为100%。

2.灵敏度检测

按照实施例7所述的检测方法，利用实施例5制得的试剂盒检测不同稀释度的抗原标准品。

将抗原标准品用样品稀释液1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512系列稀释，将其加入均匀包被抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体的酶标板孔中，每孔加100μl，设阴性对照组和空白对照组，阴性对照组加入100μl阴性对照液，空白对照组加入100μl样品稀释液，每个试样和对照平行加样3个孔；

表3本发明试剂盒检测不同浓度的抗原标准品的结果

由表3可见，本发明的试剂盒的最高检测到抗原标准品的浓度为4ng/ml。

实施例9 猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒的比较研究

按照实施例7所述的检测方法，分别利用实施例5与实施例6制得的试剂盒检测猪PCV2感染的血清、猪蓝耳病毒感染的血清、猪伪狂犬病毒感染的血清、猪瘟病毒感染的血清、PCV2疫苗（厂家1）、PCV2疫苗（厂家2）、PCV2疫苗（厂家3）和猪PCV2阴性血清。

表4猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒的比较试验结果

由表4可见，实施例5和实施例6制备的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒检测效果无明显差异。

实施例10 猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒的不同制备方法的比较

1、猪圆环病毒2型ELISA双单抗检测试剂盒的制备：

1）酶标板孔均匀包被实施例5中的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体（与HRP标记的PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体克隆号不同），包被量为0.1μg-5μg/孔，包被缓冲液为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，pH9.6，即1升溶液中含1.59g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃；

2）二抗及试剂盒其它试剂同实施例5中的2、4、5。

2、猪圆环病毒2型ELISA双单抗检测试剂盒的检测方法同实施例7。

3、本发明试剂盒与双单抗检测试剂盒的比较实验

按照实施例7所述的检测方法，利用实施例5制得的试剂盒与双单抗检测试剂盒分别检测猪PCV2感染的血清、猪蓝耳病毒感染的血清、猪伪狂犬病毒感染的血清、猪瘟病毒感染的血清、PCV2疫苗（厂家1）、PCV2疫苗（厂家2）、PCV2疫苗（厂家3）和猪PCV2阴性血清。

表5本发明试剂盒与双单抗检测试剂盒的比较实验结果

由表5可见，双单抗检测试剂盒的样品检测OD450nm值很低，部分阳性样品检测为阴性。本发明试剂盒的灵敏度高于双单抗检测方法。

Claims

1.一种猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述检测试剂盒含有：包被抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、抗原标准品、HRP标记的抗PCV2-Cap蛋白的单克隆抗体的二抗、浓缩洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和终止液，其中，所述抗原标准品为纯化的重组杆状病毒表达的形成病毒样颗粒（VLPs）的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白（PCV2-Cap蛋白），所述酶底物A溶液为3,3’-5,5’-四甲基联苯胺溶液；所述的酶底物B溶液为含有双氧水的乙酸钠缓冲溶液。

2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体为由纯化的重组杆状病毒表达的形成病毒样颗粒（VLPs）的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白(PCV2-Cap蛋白)作为抗原免疫实验兔后纯化血清所得，所述抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体的包被量为0.1μg-5μg/孔，包被稀释液为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，其中，所述碳酸盐缓冲液的pH为9.6。

3.根据权利要求2所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述碳酸盐缓冲液的组成为，每升碳酸盐缓冲溶液中含有1.59g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃。

4.根据权利要求1-3任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述封闭液选自质量浓度为1-10%的牛血清白蛋白（BSA）或质量浓度为1-10%的脱脂牛奶的任一或其组合。

5.根据权利要求1-4任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述样品稀释液由质量浓度为0.1-10%牛血清白蛋白和含有0.01-0.05%叠氮化钠（NaN₃）的磷酸盐缓冲液组成，其中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/L，pH7.2-7.4。

6.根据权利要求1-5任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述浓缩洗涤液为含有0.5％（v/v）吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，其中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH7.2-7.4。

7.根据权利要求1-6任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述的酶底物A溶液选自浓度为10mg/ml的3,3’-5,5’-四甲基联苯胺溶液；所述的酶底物B溶液含有质量浓度为0.012%双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为10mg/ml，pH为5.0。

8.根据权利要求1-7任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述终止液为1mol/L的H₂SO₄溶液。

9.根据权利要求1-8任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，其中，抗原标准品的配制为用样品稀释液稀释重组PCV2-Cap蛋白至1ug/ml制成。

10.根据权利要求1-9任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述的试剂盒中还含有阴性对照液，所述的阴性对照液为用样品稀释液100倍稀释不含PCV2抗原的猪阴性血清配制而成。

11.根据权利要求1-10任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，所述重组PCV2-Cap蛋白的制备方法包括如下步骤：

（1）获得重组杆状病毒转移载体pFastBac Dual-2ORF2，其中，所述载体是分别在pFastBac Dual转移载体的P10启动子和Ppolh启动子(多角体蛋白启动子)之后各插入一个拷贝的PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2，优选所述的PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2是完整的、未经修饰的PCV2b ORF2，更优选所述PCV 2Cap蛋白编码基因ORF2分别通过BamHI/Hind III和Kpn I/Xho I双酶切插入pFastBac Dual转移载体中;

（2）同源重组，产生重组杆状病毒DNA；

（3）包装，产生表达PCV2衣壳蛋白的重组杆状病毒；

（4）获得重组杆状病毒rBac-2ORF2；

（5）培养宿主细胞，接种步骤（4）的重组杆状病毒，使其表达Cap蛋白，并自我组装形成病毒样颗粒（VLPs）；

（6）灭活病毒；

（7）分离纯化重组PCV2 Cap蛋白。

12.根据权利要求11所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒，其中，所述的PCV2 Cap蛋白编码基因ORF2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

13.一种利用权利要求1-12任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒的检测方法，包括下述步骤：

1）将待检试样用样品稀释液1:100稀释，将其加入均匀包被抗PCV2-Cap蛋白的多克隆抗体的酶标板孔中，每孔加100μl，同时设置阳性对照组、阴性对照组和空白对照组，其中，阳性对照组加入1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512系列稀释的抗原标准品各100μl，阴性对照组加入100μl阴性对照液，空白对照组加入100μl样品稀释液，每个试样和对照平行加样2-6个孔；

5）将酶标板置于酶标仪中，在450nm测定其光吸收值OD_450nm；

6）结果计算与判定：

14.权利要求1-12任一项所述的猪圆环病毒2型ELISA抗原检测试剂盒用于检测PCV2抗原或PCV2疫苗产品的应用，优选所述的PCV2抗原选自猪群PCV2感染、PCV2疫苗抗原的任一种。