CN110133263A - 一种毛孢子菌的检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种毛孢子菌检测试剂盒及其制备方法，毛孢子菌检测试剂盒包含毛孢子菌捕获抗体包被的酶标板、毛孢子菌检测抗体、标准品、样本稀释缓冲液、包被缓冲液、封闭缓冲液、底物溶液及终止液。本发明利用多克隆毛孢子菌捕获抗体包被酶标板，使用高度特异性ELISA结合标准真菌培养方法证明了毛孢子菌特异性多抗(pAb)在混合培养物中区分T.asahii与其他酵母病原体的准确性，以及本发明中捕获抗体与可与毛孢子菌特异性结合。

Description

一种毛孢子菌的检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及临床医学免疫检测试技术领域，尤其是一种毛孢子菌的检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

原发毛孢子菌病是一种罕见病死率较高的侵袭性真菌病，早期诊断并及时治疗是抢救成功的关键。毛孢子菌病是一种致死性的机会性感染，多继发于免疫功能低下以及有糖尿病、恶性血液系统疾病等危险因素的患者，在免疫功能低下的患者中引起播散性疾病，尤其是那些因患有血液病或化疗而出现中性粒细胞减少的患者。在恶性血液病患者中，毛孢子菌属已成为除念珠菌属外致人类播散性感染第二位的酵母菌。吸入毛孢子菌孢子也是日本夏季型过敏性肺炎的最重要原因。此病临床表现多为发热、咳嗽，咯血，胸部平片及CT上可表现为渗出，楔形的实变，单侧或双侧结节样病变，孤立或多发肿块，空洞。

由于缺乏对毛孢子菌病的认识和对此病原体的诊断，毛孢子虫病常被误诊为念珠菌病或隐球菌病。据ARTEMIS DISK全球抗真菌监测研究报导，毛孢子菌是第三位常用的非念珠菌酵母。中国真菌监测网报导，目前毛孢子菌已经是第三位侵袭性真菌，仅次于念珠菌和隐球菌。血液恶性肿瘤患者的高死亡率与毛孢子菌病有关，文献报道高风险患者组有50％至80％的致死率。

入侵性毛孢子菌病的早期诊断对于迅速有效的治疗至关重要，但目前没有早期诊断的方法。毛孢子菌感染只有通过真菌病原学和组织病理学才能明确诊断。近年开展的真菌抗原检测如G试验、GM试验等在毛孢子菌感染时均为阴性；痰液、针吸液及支气管肺泡灌洗液培养阳性率小于5％，血培养的阳性率更低；确诊主要依靠组织病理学。以前因肺毛孢子菌病进展快、病死率高，确诊主要依靠尸体解剖。目前诊断肺毛孢子菌病最主要的方法是纤维支气管镜活检，但仅有约40％病例可见气管内病变。影像学表现无特异性。基于核酸的方法诊断方法并没有被标准化而应用于临床。某些免疫检测有交叉反应，例如，可与隐球菌抗原检测出现交叉反应。因而，也可导致错误鉴定和不当使用抗真菌药物。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种毛孢子菌的检测试剂盒，其能快速灵敏地检测血清中毛孢子菌的存在，明确患者是否被毛孢子菌感染。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种毛孢子菌检测试剂盒，包含毛孢子菌捕获抗体包被的酶标板、毛孢子菌检测抗体、标准品、样本稀释缓冲液、包被缓冲液、封闭缓冲液、底物溶液及终止液。其中，标准品包括标准阳性血清(阳性对照标准样本)、标准阴性血清(阴性对照标准样本)。

优选地，所述毛孢子菌捕获抗体为抗TA-Ag小鼠多克隆抗体。

优选地，所述毛孢子菌检测抗体为抗TA-Ag兔多克隆抗体。更优选地，抗TA-Ag兔多克隆抗体采用HRP标记。

优选地，所述抗TA-Ag兔多克隆抗体的效价比大于或等于1：5000。

优选地，所述样本稀释缓冲液为Tris-Cl缓冲液、磷酸缓冲液或柠檬酸缓冲液的一种或多种的组合，所述样本稀释缓冲液的浓度为10～100mM，含有1.0～5.0％的封闭剂、0.01～0.05％非离子型去污型、0.1～5.0％的蛋白稳定剂、50～200mM NaCl、0.01～0.05％防腐剂，pH值为7.0～8.0。更优选地，封闭试剂选自BSA、脱脂奶粉或酪蛋白，浓度为0.5～5％；非离子型去污剂选自Triton X-100或Tween-20；蛋白稳定剂选自PVP、蔗糖或明胶。

优选地，所述包被缓冲液为0.05～0.1M碳酸缓冲液，pH值为9.0～9.6；更优选pH值为9.0。

优选地，所述封闭缓冲液为Tris-Cl缓冲液、磷酸缓冲液或柠檬酸缓冲液的一种或多种的组合，所述封闭缓冲液的浓度为10～100mM，含有1.0～5.0％的封闭剂、0.01～0.05％的非离子型去污型，50～200mM NaCl，pH值为7.0～8.0。更优选地，封闭试剂选自BSA、脱脂奶粉或酪蛋白，浓度为0.5～5％；非离子型去污剂选自Triton X-100或Tween-20。

优选地，所述底物溶液为TMB显色溶液。

优选地，所述终止液为2M H₂SO₄溶液。

优选的，所述试剂盒还包括洗涤缓冲液，洗涤缓冲液选自Tris-Cl缓冲液或磷酸缓冲液，洗涤缓冲液的浓度为25～100mM，pH值为7.0～8.0，其中含0.01～0.02％的叠氮钠或硫柳汞(w/v)，0.01～0.05％的Tween-20或者Triton-X100。

作为本发明的另一个方面，本发明提供了上述检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤:

1)用包被缓冲液稀释毛孢子菌捕获抗体，加入酶标板的孔中，静置包被；

2)向步骤1)所得孔中入封闭缓冲液进行封闭，之后进行干燥、冷藏；

3)标准品的制备：通过裂解毛孢子菌获得TA-Ag总抗原，加入血清稀释所得溶液作为阳性对照样本，无添加TA-Ag总抗原的血清作为阴性对照样本；

4)毛孢子菌检测抗体用抗体稀释液稀释到工作浓度；以及

5)提供显色溶液、样品稀释缓冲液、浓缩洗涤液、封闭液，与步骤1)～4)所得，整合、包装即得所述检测试剂盒。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明利用多克隆毛孢子菌捕获抗体包被酶标板，使用高度特异性ELISA结合标准真菌培养方法证明了抗TA-Ag多克隆抗体(pAb)在混合培养物中区分T.asahii(毛孢子菌)与其他酵母病原体的准确性，以及本发明中捕获抗体与可与毛孢子菌特异性结合。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的试剂浓度均为质量浓度。如无特别说明，本发明中的实验方法均为常规方法。

实施例1

本发明中毛孢子菌检测试剂盒的一种实施例，包含毛孢子菌捕获抗体包被的酶标板、毛孢子菌检测抗体、标准品、样本稀释缓冲液、包被缓冲液、封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物溶液及终止液；

其中，标准品包括标准阳性血清(阳性对照样本)、标准阴性血清(阴性对照样本)；毛孢子菌捕获抗体为抗TA-Ag小鼠多克隆抗体；毛孢子菌检测抗体为HRP标记的抗TA-Ag兔多克隆抗体，效价比为1：6000；底物溶液为TMB显色溶液；终止液为2M H₂SO₄溶液；

样本稀释缓冲液为Tris-Cl缓冲液，所述样本稀释缓冲液的浓度为50mM，含有2.7％的封闭剂、0.01％非离子型去污型、1.7％的蛋白稳定剂、100mM NaCl、0.023％防腐剂，pH值为7.6；封闭试剂为BSA，浓度为2.2％；非离子型去污剂为Triton X-100；蛋白稳定剂为PVP；包被缓冲液为0.05M碳酸缓冲液，pH值为9.0；

封闭缓冲液为磷酸缓冲液，封闭缓冲液的浓度为43mM，含有5.0％的封闭剂、0.01％的非离子型去污型，200mM NaCl，pH值为7.7；封闭试剂为酪蛋白，浓度为1.9％；非离子型去污剂为Tween-20；洗涤缓冲液为Tris-Cl缓冲液，洗涤缓冲液的浓度为59mM，pH值为7.0，其中含0.014％的叠氮钠(w/v)，0.01％的Tween-20。

实施例2

本发明中毛孢子菌检测试剂盒的一种实施例，包含毛孢子菌捕获抗体包被的酶标板、毛孢子菌检测抗体、标准品、样本稀释缓冲液、包被缓冲液、封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物溶液及终止液；

其中，标准品包括标准阳性血清(阳性对照样本)、标准阴性血清(阴性对照样本)；毛孢子菌捕获抗体为抗TA-Ag小鼠多克隆抗体；毛孢子菌检测抗体为HRP标记的抗TA-Ag兔多克隆抗体，效价比为1：5000；底物溶液为TMB显色溶液；终止液为2M H₂SO₄溶液；

样本稀释缓冲液为磷酸缓冲液，样本稀释缓冲液的浓度为10mM，含有5.0％的封闭剂、0.024％非离子型去污型、0.1％的蛋白稳定剂、50mM NaCl、0.01％防腐剂，pH值为7.0；封闭试剂为脱脂奶粉，浓度为0.5％；非离子型去污剂为Tween-20；蛋白稳定剂为蔗糖；包被缓冲液为0.05M碳酸缓冲液，pH值为9.3；

封闭缓冲液为Tris-Cl缓冲液，封闭缓冲液的浓度为10mM，含有1.0％的封闭剂、0.03％的非离子型去污型，120mM NaCl，pH值为7.0。封闭试剂为BSA，浓度为0.5％；非离子型去污剂为Triton X-100；洗涤缓冲液为Tris-Cl缓冲液，洗涤缓冲液的浓度为25mM，pH值为8.0，其中含0.01％的硫柳汞(w/v)，0.023％的Triton-X100。

实施例3

本发明中毛孢子菌检测试剂盒的一种实施例，包含毛孢子菌捕获抗体包被的酶标板、毛孢子菌检测抗体、标准品、样本稀释缓冲液、包被缓冲液、封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物溶液及终止液；底物溶液为TMB显色溶液；终止液为2M H₂SO₄溶液；

其中，标准品包括标准阳性血清(阳性对照样本)、标准阴性血清(阴性对照样本)；毛孢子菌捕获抗体为抗TA-Ag小鼠多克隆抗体；毛孢子菌检测抗体为HRP标记的抗TA-Ag兔多克隆抗体，效价比为1：7000；

样本稀释缓冲液为柠檬酸缓冲液，样本稀释缓冲液的浓度为100mM，含有1.0％的封闭剂、0.05％非离子型去污型、5.0％的蛋白稳定剂、200mM NaCl、0.05％防腐剂，pH值为8.0；封闭试剂为酪蛋白，浓度为5％；非离子型去污剂为Triton X-100；蛋白稳定剂为明胶；包被缓冲液为0.1M碳酸缓冲液，pH值为9.6；

封闭缓冲液为柠檬酸缓冲液，封闭缓冲液的浓度为100mM，含有2.7％的封闭剂、0.05％的非离子型去污型，50mM NaCl，pH值为8.0。封闭试剂为脱脂奶粉，浓度为5％；非离子型去污剂为Triton X-100；洗涤缓冲液为磷酸缓冲液，洗涤缓冲液的浓度为100mM，pH值为7.5，其中含0.02％的叠氮钠(w/v)，0.05％的Triton-X100。

实施例4

本发明中毛孢子菌检测试剂盒的制备方法的一种实施例，包括如下步骤：

(1)免疫动物制备兔多克隆抗体(毛孢子菌检测抗体)，步骤如下：

1)毛孢子菌(Trichosporon asahii var.asahii)培养于麦芽酵母肉汤26℃下振荡(125rpm)孵育2天；

2)将菌液离心收集总菌体，重新悬浮于磷酸盐缓冲液。裂解菌体，制备TA总抗原(TA－Ag)。

3)免疫接种：TA－Ag抗原免疫新西兰兔。采用弗氏完全佐剂，与TA－Ag抗原完全乳化后，免疫24-30周龄新西兰兔，分别于首次免疫后第14、28、42天腹膜内注射进行3次加强免疫。在末次免疫后第7天，取全血分离血清，制备得到抗TA－Ag兔多克隆抗体。

4)取已经免疫的新西兰兔，在末次免疫后第7天，静脉取血。

5)3000rpm离心10min取血清。

6)饱和硫酸铵盐析法沉淀抗体，进行初步提纯：

A、取血清和等体积生理盐水，搅拌混匀，缓慢滴加50％总体积饱和硫酸铵，搅拌混匀，4℃静置6h以上，结晶析出。

B、离心去上清，结晶完全重新溶解于2/3原体积的生理盐水，缓慢滴加此次总体积2/5的饱和硫酸铵，混匀。4℃静置6h以上，结晶析出。8％PEG6000可以析出IgG。

C、离心去上清，加入适量PBS重新溶解。溶液再次透析。

7)Protein A sepharose亲和层析法再次纯化。

8)效价测定。用ELISA法，包被原为TA－Ag抗原，酶标二抗为辣根过氧化酶标记的驴抗兔多克隆抗体，确定效价比在1:5000以上。

(2)小鼠多克隆抗体(毛孢子菌捕获抗体)的制备

1)免疫动物。TA－Ag抗原混合弗氏佐剂，乳化，免疫6-8周龄SPF级BALB/c小鼠，皮下注射。分别于首次免疫后第14、21、28天进行3次加强免疫。

2)取已经免疫的BALB/c小鼠，在末次免疫后第7天，拉颈处死，心脏取血。多抗效价>1:10000(ELISA法)。

3)3000rpm离心10min取血清。

4)饱和硫酸铵盐析法沉淀抗体，进行初步提纯：

A、取血清和等体积生理盐水，搅拌混匀，缓慢滴加50％总体积饱和硫酸铵，搅拌混匀，4℃静置6h以上，结晶析出。

B、离心去上清，结晶完全重新溶解于2/3原体积的生理盐水，缓慢滴加此次总体积2/5的饱和硫酸铵，混匀。4℃静置6h以上，结晶析出。8％PEG6000可以析出IgG。

C、离心去上清，加入适量PBS重新溶解。溶液再次透析。

5)Protein A sepharose亲和层析法再次纯化。

6)效价测定。用ELISA法，包被原为TA－Ag抗原，酶标二抗为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠多克隆抗体，确定效价比在1:5000以上。

7)抗TA－Ag小鼠多克隆抗体进行经兔血清蛋白吸附处理，降低与兔血清的交叉反应。

(3)制备底物溶液

采用一步法显色底物，配制方法如下:

1)称取TMB 200mg，加入无水乙醇100ml，加纯水定容至1000mL。

2)称取过氧化氢脲0.0048g，溶解于0.1mol/L柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液，调至pH5.0-5.4，加纯水定容至1000mL。

3)上述两种溶液按1:1混合即成TMB-过氧化氢尿素溶液。

(4)检测抗体最佳稀释度确定

采用用TA－Ag抗原，加入血清稀释作为阳性对照样本，无添加TA－Ag抗原的血清作为阴性对照样本。倍比稀释后包被酶标板过夜，洗涤5次。检测抗体自1:2500～1:80000，倍比稀释，取阳性血清OD₄₅₀值最接近于1时的稀释比例为检测抗体的最佳工作浓度，在1:20000稀释为最佳工作浓度。

(5)捕获抗体和检测样本最佳稀释度

采用ELISA棋盘滴定法，捕获抗体自1:2500～1:80000倍比稀释；阳性血清与阴性血清自1:50～1:200倍比稀释。

按比例稀释捕获抗体并包被酶标板，洗涤后封闭液封闭60min，洗涤后加入按比例稀释血清样本，洗涤后加入检测抗体，洗涤后加入底物显色，终止反应。同时设定空白对照、阳性对照和阴性对照，而后选取包被抗体与待检血清最佳工作浓度。最佳工作浓度为：捕获抗体稀释度1:5000，血清稀释度1:100。

(6)临界值判定

取17份阴性血清，测OD₄₅₀，计算出平均值(X)为0.083，标准差(SD)为0.015，以0.113(X+2SD)为阴性值上限，0.155(X+4SD)为阳性值下限，在0.113～0.155之间判为可疑。

(7)ELISA试剂盒的组装

1)包被

A、将捕获抗体用包被缓冲液稀释到2ug/mL，，每孔取100uL加入酶标板，盖好盖板膜，4℃12h静置包被。弃去孔中各液，洗涤液洗涤5次，300微升/孔。

B、96孔酶标板每孔加入封闭缓冲液200uL。37℃封闭60min。弃去孔中各液，洗涤液洗涤5次，200微升/孔。

C、置干燥室干燥。干燥后，加入干燥剂，真空包装。冷藏保存备用。

2)待测对照品，阳性标准对照品的制备：TA－Ag抗原，加入血清稀释作为阳性样本，无添加TA－Ag抗原的血清作为阴性对照样本。

3)检测抗体按1：20000稀释到工作浓度。

4)提供TMB显色试剂按每板10mL、样品稀释液5mL、浓缩洗涤液25mL、封闭液5mL；

6)以上组分整合，包装即得所述毛孢子菌检测试剂盒。

实施例5

本发明的毛孢子菌检测试剂盒(采用实施例1的试剂盒)的使用方法的一种实施例，包括步骤如下:

1)取出包被好的酶标板，室温平衡30分钟。

2)待检测样本(血清)用样品稀释缓冲液1:100稀释。

3)取稀释好的样品加入酶标反应孔中，每孔100uL，同时加入阳性对照标准样品和阴性对照标准样品，置于37℃40～60min。用洗涤液满孔洗涤5遍，震荡，甩干。

4)加入酶标检测抗体。每孔加100uL，置于37℃30～60min。洗涤同步骤3)。

5)每孔加入100uL底物溶液显色。置37℃避光反应5～15分钟。双波长读数或单波长读数:空白孔系统调零，酶标仪450nm读数；每孔加入100uL终止液，震荡混匀，酶标仪630nm读数。

6)根据读数结果进行判断，判断标准参见实施例4的步骤(6)。

实施例6本发明的检测试剂盒的特异性实验

共采集临床血清样本9例，其中2份诊断为毛孢子菌阳性感染样本，6份为正常样本，1份隐球菌感染血清样本。使用本发明的检测试剂盒(实施例1的试剂盒)对样本进行检测。

本发明的检测试剂盒的具体操作如下:

1)在使用前，把试剂放置室温平衡至少30分钟。

2)配制工作洗涤液:将浓缩洗涤液稀释到1×。

3)加样：按1：100稀释待测血清。取稀释好的样品加入酶标反应孔中，每孔100uL，同时加入阳性对照标准样品(R1)和阴性对照标准样品(R2)，置于37℃40～60min。用洗涤液满孔洗涤5遍，震荡，甩干。

4)加入酶标检测抗体。每孔加100uL，置于37℃30～60min。洗涤同步骤3)。

5)每孔加入100uL底物溶液显色。置37℃避光反应5～15分钟。双波长读数或单波长读数:空白孔系统调零，酶标仪450nm读数；每孔加入100uL终止液，震荡混匀，酶标仪630nm读数。

6)根据读数结果进行判断。

阳性对照血清指数必须大于0.20，阴性对照血清指数必须小于0.10，此实验运行才被认为是有效的。否则此次实验认为无效，需重做。结果有效，则与临床诊断结果相比，本发明的实施例1的检测试剂盒的检测结果全部相符。

综上所述，本发明的检测试剂盒对于隐球菌等常见真菌感染均无交叉反应，特异性良好。目前国内还没有此类毛孢子菌ELISA检测试剂的公开专利，同样也没有通过国家认证的检测试剂类的ELISA产品。对于毛孢子菌的检测，传统的培养法，耗时长，阳性率低；而纤维支气管镜活检有一定侵入性，阳性率亦低。本发明的检测试剂盒对于传统的侵入性、培养法有非常大的优势。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种毛孢子菌检测试剂盒，其特征在于，包含毛孢子菌捕获抗体包被的酶标板、毛孢子菌检测抗体、标准品、样本稀释缓冲液、包被缓冲液、封闭缓冲液、底物溶液及终止液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述毛孢子菌捕获抗体为抗TA-Ag小鼠多克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述毛孢子菌检测抗体为抗TA-Ag兔多克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述抗TA-Ag兔多克隆抗体的效价比大于或等于1：5000。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样本稀释缓冲液为Tris-Cl缓冲液、磷酸缓冲液或柠檬酸缓冲液的一种或多种的组合，所述样本稀释缓冲液的浓度为10～100mM，含有1.0～5.0％的封闭剂、0.01～0.05％非离子型去污型、0.1～5.0％的蛋白稳定剂、50～200mM NaCl、0.01～0.05％防腐剂，pH值为7.0～8.0。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包被缓冲液为0.05～0.1M碳酸缓冲液，pH值为9.0～9.6。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述封闭缓冲液为Tris-Cl缓冲液、磷酸缓冲液或柠檬酸缓冲液的一种或多种的组合，所述封闭缓冲液的浓度为10～100mM，含有1.0～5.0％的封闭剂、0.01～0.05％的非离子型去污型，50～200mM NaCl，pH值为7.0～8.0。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述底物溶液为TMB显色溶液。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述终止液为2M H₂SO₄溶液。

10.权利要求1～9任一项所述检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:

1)用包被缓冲液稀释毛孢子菌捕获抗体，加入酶标板的孔中，静置包被；

2)向步骤1)所得孔中入封闭缓冲液进行封闭，之后进行干燥、冷藏；

3)标准品的制备：通过裂解毛孢子菌获得TA-Ag总抗原，加入血清稀释所得溶液作为阳性对照样本，无添加TA-Ag总抗原的血清作为阴性对照样本；

4)毛孢子菌检测抗体用抗体稀释液稀释到工作浓度；以及

5)提供显色溶液、样品稀释缓冲液、浓缩洗涤液、封闭液，与步骤1)～4)所得，整合、包装即得所述检测试剂盒。