JP2001281253A - 酵素免疫測定法による試料中の測定対象物質の測定試薬及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 試料中の測定対象物質の測定を、標識物質と
してペルオキシダーゼを用いる酵素免疫測定法により行
うための試薬及び測定方法であって、かつ測定の盲検値
が高い試薬及び測定方法において、非特異的反応による
影響を抑制し、盲検値を低減させて、特異性、そして正
確性を高めた酵素免疫測定法による試料中の測定対象物
質の測定試薬及び測定方法を提供する。 【構成】 色原体として、（ｉ）４−アミノアンチピリ
ン、及び（ｉｉ）フェノール若しくはその誘導体又はア
ニリン誘導体のいずれか一方を使用することを特徴とす
る、酵素免疫測定法による試料中の測定対象物質の測定
試薬及び測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中の測定対象
物質の測定を酵素免疫測定法により行うための測定試薬
及び測定方法であって、特に測定の盲検値が高い試薬及
び測定方法において、色原体として、（ｉ）４−アミノ
アンチピリン、及び（ｉｉ）フェノール若しくはその誘
導体又はアニリン誘導体のいずれか一方を使用すること
を特徴とするものである。本発明は、特に化学、生命科
学、臨床検査等の分野において有用なものである。

【０００２】

【従来の技術】抗原と抗体、糖とレクチン、ヌクレオチ
ド鎖とそれに相補的なヌクレオチド鎖、リガンドとレセ
プター等の特異的な親和性を有する物質間の反応を利用
した試料中に含まれる微量の測定対象物質の測定試薬及
び測定方法は種々のものが知られている。

【０００３】中でも、抗原と抗体の間の抗原抗体反応
（免疫反応）を利用した免疫学的測定方法は広く実施さ
れている。この免疫学的測定方法のうち、抗原又は抗体
に酵素、放射性同位元素、又は蛍光色素のような微量の
差を識別できる標識物を結合させて、抗原抗体反応の特
異性を利用することにより、試料中の抗原又は抗体の存
在を免疫学的に測定しようとする標識物による免疫学的
測定方法は、比較的短時間に簡便に実施でき、かつ再現
性も良いことから汎用されている。

【０００４】この標識物による免疫学的測定方法のう
ち、標識物として酵素を用いるものを酵素免疫測定法
（ＥＩＡ法；Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）
という。このＥＩＡは、抗原又は抗体の一方を酵素で標
識し、抗原抗体反応の結果を酵素反応に変換して発色さ
せ、抗原又は抗体を定性的又は定量的に測定しようとい
うものである。また、ＥＩＡ法のうち固相を利用したも
のをＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍ
ｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）と呼ぶ。これら
酵素免疫測定法は、放射性同位元素を標識物質として使
用する放射免疫測定法と同等の感度を持ち、放射能汚染
の危険性もないため、広く利用されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、酵素免
疫測定法は高感度であるがゆえ、試料中に含まれる測定
対象物質以外の種々の微量成分の影響を受けやすく、い
わゆる非特異的反応を受けることが少なくないのが実状
である。これらの非特異的反応は、盲検値として測定さ
れ、測定の特異性、ひいては正確性を著しく損ねるもの
である。

【０００６】この酵素免疫測定法において、標識物質と
して用いるペルオキシダーゼ等の酵素の酵素反応には、
オルト−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）やテトラメチル
ベンジジン（ＴＭＢ）等の感度の高い色原体が用いられ
ている。しかし、この高感度化故に、測定対象物質と抗
原又は抗体との抗原抗体反応とは無関係な副反応とも言
える非特異的反応による影響が増幅され、盲検値が高く
なってしまい、つまり、特異性が悪くなってしまう。こ
れにより、試料中の測定対象物質の存在の有無の判定、
又は試料中の測定対象物質の濃度の測定が難しくなり、
正確に行われなくなる。そして、ひいては、疾病の診断
を誤る危険性も生じる。

【０００７】例えば、夏型過敏性肺炎を診断する場合に
は、罹患が疑われる人の血清中の「夏型過敏性肺炎の原
因微生物に対する抗体」の測定等を行う。これは、「Ｔ
ｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ」に対するヒト
の抗体が血清試料中に存在するか否かの判定、又はその
抗体の存在量（濃度）の測定を、夏型過敏性肺炎の原因
微生物である「Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉ
ｉ」という真菌由来の抗原成分を固定化したマイクロプ
レート、及びペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を
用いて、酵素免疫測定法のサンドイッチ法により測定を
行うものである。このため、「Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏ
ｎ ａｓａｈｉｉ」に対する抗体を含まない健常人の血
清試料においても、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ
抗体との非特異的反応が多く検出されてしまい、すなわ
ち盲検値が高くなり、「Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａ
ｓａｈｉｉ」に対する抗体の有無の判定、又は濃度の測
定が極めて難しいものとなっていた。

【０００８】そこで、非特異的反応が生じ、盲検値が高
い測定試薬及び測定方法において、この非特異的反応に
よる影響を抑制し、盲検値を低減させることができ、特
異性が高く正確に試料中の測定対象物質の測定が行える
測定試薬及び測定方法が求められていた。

【０００９】本発明は、上記課題に鑑みてなされたもの
であり、標識物質であるペルオキシダーゼによる酵素反
応の色原体として、（ｉ）４−アミノアンチピリン、及
び（ｉｉ）フェノール若しくはその誘導体又はアニリン
誘導体のいずれか一方を使用するものを用いて、非特異
的反応による影響を抑制し、盲検値を低減させて、特異
性、そして正確性を高めた酵素免疫測定法による試料中
の測定対象物質の測定試薬及び測定方法を提供すること
を目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、試料中の測定
対象物質の測定を、標識物質としてペルオキシダーゼを
用いる酵素免疫測定法により行うための試薬であって、
かつ測定の盲検値が高い試薬において、色原体として、
（ｉ）４−アミノアンチピリン、及び（ｉｉ）フェノー
ル若しくはその誘導体又はアニリン誘導体のいずれか一
方を使用することを特徴とする、酵素免疫測定法による
試料中の測定対象物質の測定試薬である。

【００１１】本発明の測定試薬においては、測定対象物
質が、抗体であることが好適である。

【００１２】また、本発明の測定試薬においては、「測
定対象物質である抗体と結合することができる物質−こ
の物質と結合することができる抗体−担体」を含むこと
が好適である。

【００１３】そして、本発明の測定試薬においては、測
定対象物質が、夏型過敏性肺炎の原因微生物に対する抗
体であることが好適である。

【００１４】更に、本発明の測定試薬においては、夏型
過敏性肺炎の原因微生物が、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ
ａｓａｈｉｉであることが好適である。

【００１５】また、本発明は、試料中の測定対象物質の
測定を、標識物質としてペルオキシダーゼを用いる酵素
免疫測定法により行う測定方法であって、かつ測定の盲
検値が高い測定方法において、色原体として、（ｉ）４
−アミノアンチピリン、及び（ｉｉ）フェノール若しく
はその誘導体又はアニリン誘導体のいずれか一方を使用
することを特徴とする、酵素免疫測定法による試料中の
測定対象物質の測定方法である。

【００１６】本発明の測定方法においては、測定対象物
質が、抗体であることが好適である。

【００１７】また、本発明の測定方法においては、「測
定対象物質である抗体と結合することができる物質−こ
の物質と結合することができる抗体−担体」を用いるこ
とが好適である。

【００１８】そして、本発明の測定方法においては、測
定対象物質が、夏型過敏性肺炎の原因微生物に対する抗
体であることが好適である。

【００１９】更に、本発明の測定方法においては、夏型
過敏性肺炎の原因微生物が、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ
ａｓａｈｉｉであることが好適である。

【００２０】

【発明の実施の形態】本発明による試料中の測定対象物
質の測定試薬及び測定方法は、標識物質としてペルオキ
シダーゼを用いる酵素免疫測定法により行うための試薬
及び測定方法において、色原体として、（ｉ）４−アミ
ノアンチピリン、及び（ｉｉ）フェノール若しくはその
誘導体又はアニリン誘導体のいずれか一方を使用するこ
とにより、測定の盲検値が高い測定試薬及び測定方法に
おいても正確な測定が行えるものである。

【００２１】本発明の測定試薬及び測定方法では、測定
の盲検値が高い測定試薬及び測定方法において、非特異
的反応による影響を抑えるために、標識物質であるペル
オキシダーゼによる酵素反応に使用する色原体をＯＰＤ
やＴＭＢ等の高感度なものから、４−アミノアンチピリ
ン、及びフェノール若しくはその誘導体の組み合わせ、
又は、４−アミノアンチピリン、及びアニリン誘導体の
組み合わせの低感度のものに変えることにより、非特異
的反応による影響を抑制し、盲検値を低減させ、特異性
を向上させることができるものである。

【００２２】なお、本来の測定反応である、測定対象物
質と抗原又は抗体との抗原抗体反応（免疫反応）を逃さ
ず捉えるため、測定反応に用いる標識物質結合抗体又は
標識物質結合抗原の濃度を高めることが好ましい。

【００２３】すなわち、これにより、標識物質であるペ
ルオキシダーゼの酵素反応に使用する色原体を、従来と
比べ低感度のものに変え、これにより低下した感度を、
標識物質として用いるペルオキシダーゼを結合させたペ
ルオキシダーゼ結合抗体又はペルオキシダーゼ結合抗原
の使用濃度を従来よりも高めて補うことにより、測定の
特異性を向上させることと、測定の感度を向上させるこ
との両方の目的を達成することができる。

【００２４】本発明の測定試薬及び測定方法において、
試料中の測定対象物質の測定を行う際の手順は、公知の
酵素免疫測定法の手順に準じて行えばよい。

【００２５】この操作の手順であるが、測定対象物質が
抗体であり、サンドイッチ法により測定を行う場合を例
に取り、以下説明を行う。

【００２６】 『「測定対象物質である抗体と結合す
ることができる物質」（例えば、測定対象物質である抗
体にとっての抗原、又はこの抗原の抗原決定基を有する
物質等）と結合することができる抗体』を担体に固定化
し、更に、前記の「測定対象物質である抗体と結合する
ことができる物質」を結合させて、「測定対象物質であ
る抗体と結合することができる物質−この物質と結合す
ることができる抗体−担体」の順に結合させて固定化さ
せたものを調製する。

【００２７】 次に、この担体の「測定対象物質であ
る抗体と結合することができる物質」等を固定化した部
分に一定量の試料を添加して一定時間接触させる。

【００２８】これにより、試料中に測定対象物質が存在
する場合には、「測定対象物質−測定対象物質である抗
体と結合することができる物質−この物質と結合するこ
とができる抗体−担体」の結合を形成させる。

【００２９】 この添加・接触と同時に、若しくは一
定時間のうちに、又は洗浄の後に、「測定対象物質であ
る抗体と結合することができる物質」であって前記の
「測定対象物質である抗体と結合することができる物
質」と同一又は異なる物質（例えば、抗体、又は抗原
等）に標識物質であるペルオキシダーゼを結合させたも
の（「ペルオキシダーゼ標識結合物質」）の一定量を、
この担体の「測定対象物質である抗体と結合することが
できる物質」等を固定化した部分に添加して一定時間接
触させる。

【００３０】この操作により、試料中に測定対象物質で
ある抗体が存在する場合には、「ペルオキシダーゼ標識
結合物質−測定対象物質−測定対象物質である抗体と結
合することができる物質−この物質と結合することがで
きる抗体−担体」の結合を形成させる。

【００３１】 次に、担体に結合していない未結合の
「ペルオキシダーゼ標識結合物質」を洗浄分離する。
（Ｂ／Ｆ分離）

【００３２】 そして、「ペルオキシダーゼ標識結合
物質−測定対象物質−測定対象物質である抗体と結合す
ることができる物質−この物質と結合することができる
抗体−担体」の結合により担体に結合したペルオキシダ
ーゼ標識結合物質のペルオキシダーゼ活性を測定するこ
とにより、試料中の測定対象物質の測定を行う。

【００３３】この測定においては、担体とペルオキシダ
ーゼ標識結合物質が試料中の測定対象物質等を介して、
「ペルオキシダーゼ標識結合物質−測定対象物質−測定
対象物質である抗体と結合することができる物質−この
物質と結合することができる抗体−担体」と結合するの
で、担体に間接的に結合したペルオキシダーゼ標識結合
物質の量を測定することにより試料中に含まれていた測
定対象物質の有無、又は量を測定することができるもの
である。

【００３４】「ペルオキシダーゼ標識結合物質−測定対
象物質−測定対象物質である抗体と結合することができ
る物質−この物質と結合することができる抗体−担体」
の結合により担体に結合したペルオキシダーゼ標識結合
物質のペルオキシダーゼ活性の測定であるが、色原体と
して、（ｉ）４−アミノアンチピリン、及び（ｉｉ）フ
ェノール若しくはその誘導体又はアニリン誘導体のいず
れか一方を使用し、更に過酸化水素を存在させて反応さ
せ、色原体よりロイコ型色素を生成させて、その生成し
たロイコ型色素の量を吸光度を測るなどの光学的方法等
により測定を行えばよい。

【００３５】本発明における酵素免疫測定法は、例え
ば、サンドイッチ法、又は競合法等の手法により行うこ
とができる。

【００３６】また、本発明における酵素免疫測定法は、
例えば、１ステップ法、又は２ステップ法等の手法によ
り行うことができる。

【００３７】また、本発明による試料中の測定対象物質
の測定においては、担体として磁性体よりなる物質又は
磁性体を含む物質を用い、これに磁力を作用させて、Ｂ
／Ｆ分離を磁気的に行うこともできる。

【００３８】本発明の試料中の測定対象物質の測定にお
いて、担体としては、抗原又は抗体等を固定化すること
ができる担体であれば、その種類、材質、形状等を特に
限定することなく使用することができる。

【００３９】これは、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定
法、放射免疫測定法、又は発光免疫測定法などの標識物
質を用いた免疫測定法等において、一般的に測定に用い
られている担体については、問題なく用いることができ
る。

【００４０】例えば、ポリスチレン、ポリカーボネイ
ト、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレ
ン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、
ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチ
ン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、
金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子、
マイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート、試験
管、スティック又は試験片等の担体を用いることができ
る。

【００４１】また、前記の担体を強磁性体で被覆又は担
体成型時に強磁性体を含有させて調製した磁性担体等を
用いることもできる。

【００４２】標識物質であるペルオキシダーゼを、抗原
又は抗体等に結合させる方法は、化学的結合法等の公知
の方法を用いることができる。

【００４３】この化学的結合法により行う場合には、日
本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨
床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床
病理刊行会，１９８３年、日本生化学会編「新生化学実
験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１
年等に記載の公知の方法に従い、標識物質であるペルオ
キシダーゼと、抗原又は抗体等を、グルタルアルデヒ
ド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等
の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、ペルオキシダー
ゼと、抗原又は抗体等のそれぞれのアミノ基、カルボシ
キル基、ＳＨ基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させ
ることにより結合を行うことができる。

【００４４】担体に、抗原又は抗体等を固定化させる方
法は、物理的吸着法又は化学的結合法等の公知の方法を
用いることができる。

【００４５】物理的吸着法による場合は、公知の方法に
従い、緩衝液等に溶解した抗原若しくは抗体等を、担体
の固定化したい部分に添加し接触させたり、又は、抗原
若しくは抗体等と担体を、緩衝液等の溶液中で混合し接
触させること等により行うことができる。

【００４６】例えば、緩衝液等に溶解した抗原若しくは
抗体等を、担体の固定化したい部分に添加し接触させ、
又は、抗原若しくは抗体等と担体を、緩衝液等の溶液中
で混合し接触させ、これを約２℃〜約４０℃で約１０分
〜約１日間行う。

【００４７】また、化学的結合法により行う場合には、
日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号
臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨
床病理刊行会，１９８３年、日本生化学会編「新生化学
実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９
１年等に記載の公知の方法に従い、担体又は担体の固定
化したい部分と、抗原又は抗体等を、グルタルアルデヒ
ド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等
の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、担体、担体の固
定化したい部分、又は抗原若しくは抗体等のそれぞれの
アミノ基、カルボキシル基、ＳＨ基、アルデヒド基又は
水酸基等と反応させることにより固定化を行うことがで
きる。

【００４８】更に、非特異的反応を抑制するために処理
を行う必要があれば、抗原又は抗体等を固定化させた担
体のこの固定化した部分を、ＢＳＡ、カゼイン、ゼラチ
ン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、
界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等
の公知の方法により処理して、ブロッキング処理（マス
キング処理）を行ってもよい。

【００４９】標識物質であるペルオキシダーゼを結合さ
せた抗原若しくは抗体、又は測定対象物質等を溶解させ
る溶液、あるいは試料の希釈液については、各種水系溶
媒を用いることができる。

【００５０】例えば、精製水、生理食塩水又はトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝
液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等の
水系溶媒を用いることができる。なお、この緩衝液のｐ
Ｈについては、ｐＨ３〜１２の範囲内にあることが好ま
しい。

【００５１】この緩衝液としては、例えば、ＭＥＳ、Ｂ
ｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＡＤＡ、
ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥ
Ｓ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、Ｐ
ＯＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒ
ｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、リン
酸、リン酸塩、ホウ酸、ホウ酸塩、グリシン、グリシル
グリシン、イミダゾール、又はトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン〔Ｔｒｉｓ〕などの緩衝剤の水溶液等
を挙げることができる。

【００５２】また、標識物質であるペルオキシダーゼを
結合させた抗原若しくは抗体、又は測定対象物質等を溶
解させる溶液、あるいは試料の希釈液には、ＢＳＡ、ヒ
ト血清アルブミン、カゼイン若しくはその塩などのタン
パク質、塩化ナトリウムなどの各種塩類、各種糖類、脱
脂粉乳、正常ウサギ血清などの各種動物血清、アジ化ナ
トリウムなどの各種防腐剤又は非イオン性界面活性剤、
両イオン性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤な
どの各種界面活性剤等を適宜添加して用いることができ
る。

【００５３】そして、これらを添加する際の濃度は特に
限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／
Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ま
しい。

【００５４】なお、この各種界面活性剤としては、ソル
ビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デ
カグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソル
ビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン
脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステ
ル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシ
エチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオ
キシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、
ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオ
キシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキ
シエチレンラノ キシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキ
シエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界
面活性剤等を挙げることができる。

【００５５】標識物質としては、ペルオキシダーゼを用
いるが、このペルオキシダーゼとしては、例えば、細菌
若しくはカビなどの微生物由来のもの、ヒト若しくはウ
シなどの動物由来のもの、西洋ワサビなどの植物由来の
もの、又は遺伝子組み換え法により調製したもの等を用
いることができる。また、ペルオキシダーゼの使用濃度
は、１６０〜６４０ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎ ｍＵ
／ｍｌの濃度範囲で用いることが好ましい。

【００５６】なお、本発明においては、前記の『「測定
対象物質の抗体と結合することができる物質」と結合す
ることができる抗体』が、Ｄ−８株由来のマウス抗Ｔｒ
ｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ・モノクローナル
抗体であることが好適である。このＤ−８株由来のマウ
ス抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ・モノク
ローナル抗体は、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈ
ｉｉの近縁の菌種との交差反応性が認められない抗体で
ある。〔Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１
巻，７号，１９４９−１９５１頁，１９９３年〕 この近縁の菌種との反応性が認められないＤ−８株由来
のマウス抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ・
モノクローナル抗体を用いると、近縁の菌種との反応性
のないＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉの抗原
を「測定対象物質である抗体と結合することができる物
質」として担体に結合することができるため、高い特異
性が得られて好ましい。

【００５７】本発明の測定方法及び測定試薬において
は、色原体として、（ｉ）４−アミノアンチピリン、及
び（ｉｉ）フェノール若しくはその誘導体又はアニリン
誘導体のいずれか一方を使用する。

【００５８】ここでフェノールの誘導体としては、例え
ば、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノー
ル、２，４−ジブロモフェノール、若しくは２，４，６
−トリクロロフェノール、又はこれらの塩等を挙げるこ
とができる。

【００５９】また、アニリン誘導体としては、例えば、
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５
−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロ
ピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ
−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−
エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニ
リン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ
−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フ
ルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スル
ホプロピル−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリ
ン（ＦＤＡＰＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ
−エチル−３，５−ジメトキシアニリン（ＣＥＤＢ）、
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル
−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシ．ニリン
（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル
−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＰＳ）、
Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＨＡＬＰＳ）、
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エ
チル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチル
アニリン（ＭＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン
（ＴＯＯＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エ
チル−３−メチルアニリン（ＣＥＭＢ）、若しくはＮ−
（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メトキシ
アニリン（ＣＥＭＯ）、又はこれらの塩等を挙げること
ができる。

【００６０】また、色原体の使用濃度であるが、４−ア
ミノアンチピリンは１０〜１０００ｍＭの濃度範囲で使
用することが好ましく、またフェノール若しくはその誘
導体、又はアニリン誘導体は、６〜３００ｍＭの濃度範
囲で使用することが好ましい。

【００６１】本発明の測定試薬及び測定方法における測
定対象物質としては、測定の盲検値が高いものが好適で
ある。このような測定対象物質の例として、夏型過敏性
肺炎の原因微生物に対する抗体等を挙げることができ
る。

【００６２】本発明において、試料としては、前記の測
定対象物質が存在する可能性があり、かつその測定対象
物質の存在の有無の確認又は場合によっては定量を行お
うとする液状のものをいう。

【００６３】例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血
漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等の体
液；ヒト若しくは動物の脳等の臓器、毛髪、皮膚、爪、
筋肉、又は神経組織等の抽出液；ヒト又は動物の糞便の
抽出液又は懸濁液；細胞或いは菌体の抽出液；植物の抽
出液；穀物、野菜、果物、魚介類、肉類又は加工食品等
の食品、水、茶、コーヒー、牛乳、又は果汁等の飲料、
そして、飲料水、河川水、湖沼水、海水、又は土壌の懸
濁液等の環境分析用試料等が挙げられる。

【００６４】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００６５】〔実施例〕（本発明による、抗Ｔｒｉｃｈ
ｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ抗体の測定）

【００６６】血清試料中の抗Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ
ａｓａｈｉｉ抗体の測定を、本発明の測定方法及び測
定試薬、並びに従来の測定方法及び測定試薬により行
い、本発明の測定方法及び測定試薬の効果を確かめた。

【００６７】１．測定試薬の調製

【００６８】 リン酸等張化緩衝液の調製 精製水約８０ｍｌに、リン酸水素二ナトリウム・十二水
の０．２９ｇ、リン酸二水素カリウムの０．０２ｇ、塩
化ナトリウムの０．８ｇ、及び塩化カリウムの０．０２
ｇを加えて溶解し、精製水で全量１００ｍｌとして、リ
ン酸等張化緩衝液を調製した。

【００６９】 ブロッキング液の調製 精製水約８０ｍｌに、トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタンの０．６０５ｇ、塩化ナトリウムの０．８８ｇ
を加えて溶解した後、塩酸を加えてｐＨ８．０に調整し
た。更に、カゼインナトリウムの０．５ｇ、アジ化ナト
リウムの０．２ｇを加えて溶解した後、精製水で全量１
００ｍｌとした。

【００７０】 試料希釈液の調製 精製水の約８０ｍｌに、トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタンの０．６０５ｇ、塩化ナトリウムの１１．６
８ｇを加えて溶解し、塩酸を加えてｐＨ８．０に調整し
た。更に、カゼインナトリウムの０．５ｇ、アジ化ナト
リウムの０．２ｇを加えて溶解した後、精製水で全量１
００ｍｌとした。

【００７１】 洗浄液の調製 精製水の約８０ｍｌに、リン酸水素二ナトリウム・十二
水の０．２９ｇ、リン酸二水素カリウムの０．０２ｇ、
塩化ナトリウムの０．８ｇ、塩化カリウムの０．０２
ｇ、Ｔｗｅｅｎ２０（界面活性剤）の０．０５ｇを加え
て溶解し、精製水で全量１００ｍｌとした。

【００７２】 ＰＯＤ標識抗体希釈液 精製水の約８０ｍｌに、トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタンの０．６０５ｇ、塩化ナトリウムの０．８８
ｇ、ラクトース・一水和物の１．０ｇを加えて溶解し、
塩酸を加えてｐＨ８．０に調整した。更に、カゼインナ
トリウムの０．５ｇ、硫酸ゲンタマイシンの０．０１ｇ
を加えて溶解した後、精製水で全量１００ｍｌとした。

【００７３】 Ｔ．ａｓａｈｉｉ抗原結合マイクロプ
レートの調製

【００７４】ａ）Ｔ．ａｓａｈｉｉ抗原 Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ株をＹｅａｓ
ｔを加えたＳａｂｏｕｒａｕｄ培地にて２週間培養し、
培養上清を得た。この培養上清を濃縮後、０．１％アジ
化ナトリウムを加えて、Ｔ．ａｓａｈｉｉ抗原とした。

【００７５】ｂ）Ｔ．ａｓａｈｉｉ抗原固定化マイクロ
プレート 前記ａ）で調製したＴ．ａｓａｈｉｉ抗原を、５μｇ／
ｍｌとなるようにリン酸等張化緩衝液に加えた。これを
マイクロプレートのウェルに各１００μｌずつ分注し、
その後３７℃で１６〜２０時間放置して、Ｔ．ａｓａｈ
ｉｉ抗原を各ウェルの内壁に固定化させた。

【００７６】次に、このマイクロプレートのウェル内の
液を除き、洗浄液で２回洗浄を行った。その後、各ウェ
ルにブロッキンク液を２００μｌずつ分注して、各ウェ
ルのブロッキングを行った。そして、このマイクロプレ
ートのウェル内の液を除き、洗浄液で２回洗浄を行っ
た。以上の操作により調製したものを、Ｔ．ａｓａｈｉ
ｉ抗原結合マイクロプレートとした。

【００７７】なお、対照として、Ｔ．ａｓａｈｉｉ抗原
は用いず、その代わりにブロッキング液を用いて、前記
操作の通りに調製したものを、対照マイクロプレートと
した。（この対照マイクロプレートでは、Ｔ．ａｓａｈ
ｉｉ抗原は固定化されていない。）

【００７８】２．試料

【００７９】 患者血清試料 夏型過敏性肺炎の患者８名の血清１０μｌの各々に、試
料希釈液１，０００μｌをそれぞれ加えて希釈して、８
種類の患者血清試料を調製した。

【００８０】 正常血清試料 健常人１０名の血清１０μｌの各々に、試料希釈液１，
０００μｌをそれぞれ加えて希釈して、１０種類の正常
血清試料を調製した。

【００８１】３．測定

【００８２】 本発明による測定 ８種類の患者血清試料の各々の１００μｌを、Ｔ．ａｓ
ａｈｉｉ抗原結合マイクロプレートのウェルと対照マイ
クロプレートのウェルの各々に添加し、３７℃で１５時
間反応させた。

【００８３】その後、これらのウェルを洗浄液にて洗浄
した後、ＰＯＤ標識抗体希釈液で１，０００倍に希釈し
たＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＧ抗体溶液（Ｓｉｇｍａ社製；
Ａ０１７０、Ｆｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）を各ウェルに１
００μｌずつ添加し、３７℃で２時間反応させた。次い
で、各ウェルを洗浄液にて洗浄した。

【００８４】この後、本発明法・色原体液〔１ｍＭ ４
−アミノアンチピリン、２０ｍＭフェノール、及び０．
００６％ 過酸化水素を含む０．１Ｍトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）〕
を１５０μｌずつ各ウェルに添加し、３７℃で１時間反
応させた。

【００８５】この反応の後、各ウェルに、本発明法での
反応停止液（８Ｍ 塩酸グアニジン水溶液）を１５０μ
ｌずつ添加して反応を停止させた後、マイクロプレート
リーダー（バイオラッド社製；３５５０型）を用いて各
ウェルの吸光度（主波長４９０ｎｍ、副波長６５５ｎ
ｍ）を測定した。

【００８６】そして、Ｔ．ａｓａｈｉｉ抗原結合マイク
ロプレートのウェルにおける吸光度測定値（Ａ）から対
照マイクロプレートのウェルにおける吸光度測定値
（Ｂ）を差し引いて吸光度差（Ｃ）を算出した。

【００８７】この患者血清試料の本発明の測定における
測定結果を、表１に示した。

【００８８】

【表１】

【００８９】また、正常血清試料についても、この操作
により測定を行い、吸光度を得て、吸光度差を算出し
た。

【００９０】この正常血清試料の本発明の測定における
測定結果を、表２に示した。

【００９１】

【表２】

【００９２】 従来の方法による測定 １０種類の患者血清試料の各々の１００μｌを、Ｔ．ａ
ｓａｈｉｉ抗原結合マイクロプレートのウェルと対照マ
イクロプレートのウェルの各々に添加し、３７℃で５．
５時間反応させた。

【００９３】その後、これらのウェルを洗浄液にて洗浄
した後、ＰＯＤ標識抗体希釈液で５，０００倍に希釈し
たＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＧ抗体溶液（Ｓｉｇｍａ社製；
Ａ０１７０、Ｆｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）を各ウェルに１
００μｌずつ添加し、室温で３時間反応させた。次い
で、各ウェルを洗浄液にて洗浄した。

【００９４】この後、従来法・色原体液〔「ＯＰＤ Ｐ
ｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｔａｂｌｅ
ｔ Ｓｅｔｓ」（Ｓｉｇｍａ社製；Ｐ９１８７；オルト
−フェニレンジアミンを含有）の１錠を精製水２０ｍｌ
で溶解し、０．００６％の濃度になるように過酸化水素
水を添加したもの。〕を１００μｌずつ各ウェルに添加
し、３７℃で２０分間反応させた。

【００９５】この反応の後、各ウェルに、従来法での反
応停止液（４Ｎ 硫酸水溶液）を５０μｌずつ添加して
反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（バイ
オラッド社製；３５５０型）を用いて各ウェルの吸光度
（主波長４９０ｎｍ、副波長５５０ｎｍ）を測定した。

【００９６】そして、Ｔ．ａｓａｈｉｉ抗原結合マイク
ロプレートのウェルにおける吸光度測定値（Ａ）から対
照マイクロプレートのウェルにおける吸光度測定値
（Ｂ）を差し引いて吸光度差（Ｃ）を算出した。

【００９７】この患者血清試料の従来方法の測定におけ
る測定結果を、表３に示した。

【００９８】

【表３】

【００９９】また、正常血清試料についても、この操作
により測定を行い、吸光度を得て、吸光度差を算出し
た。

【０１００】この正常血清試料の従来方法の測定におけ
る測定結果を、表４に示した。

【０１０１】

【表４】

【０１０２】４．考察 正常血清試料（１０種類）の従来方法の測定による測定
結果を示した表４において、吸光度差（Ｃ）の値は、
０．３７６〜２．０６８となっており、測定の盲検値が
非常に高いものであることが分かる。

【０１０３】これに対して、同じ正常血清試料の本発明
の測定による測定結果を示した表２において、吸光度差
（Ｃ）の値は、０．０５７〜０．４６３となり、これは
それぞれ従来方法における吸光度差の値の９〜２２％で
あって、盲検値を低減できていることが分かる。

【０１０４】つまり、本発明による測定は、非特異的な
反応の影響を抑制し、盲検値を低減させて、測定の特異
性を高めることにより、正確な測定を行えるものである
ことが分かる。

【０１０５】また、患者血清試料（８種類）の従来方法
の測定による測定結果を示した表３において、吸光度差
（Ｃ）の値は、２．６７６〜２．９４７である。

【０１０６】これに対して、同じ患者血清試料の本発明
の測定による測定結果を示した表１において、吸光度差
（Ｃ）の値は、１．９９３〜２．９９８であり、従来方
法における吸光度差の値と大きな差がないことが分か
る。つまり、患者血清試料の測定において、本発明によ
る測定は、従来方法と同等の吸光度、すなわち同等の感
度を有するものであることが分かる。

【０１０７】以上のことより、本発明の測定試薬及び測
定方法は、測定の感度を犠牲にすることなく、非特異的
な反応の影響を抑え、盲検値を低減し、特異性を高め
て、正確な測定が行える測定試薬及び測定方法であるこ
とが確かめられた。そして、それ故、疾病の診断を正確
に行うことができる測定試薬及び測定方法であることが
確認できた。

【０１０８】

【発明の効果】本発明の酵素免疫測定法による試料中の
測定対象物質の測定試薬及び測定方法は、非特異的反応
が生じ、盲検値が高い測定試薬及び測定方法において
も、この非特異的反応による影響を抑制し、盲検値を低
減させることができ、特異性高く正確に試料中の測定対
象物質の測定を行うことができる測定試薬及び測定方法
である。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料中の測定対象物質の測定を、標識物
   質としてペルオキシダーゼを用いる酵素免疫測定法によ
   り行うための試薬であって、かつ測定の盲検値が高い試
   薬において、色原体として、（ｉ）４−アミノアンチピ
   リン、及び（ｉｉ）フェノール若しくはその誘導体又は
   アニリン誘導体のいずれか一方を使用することを特徴と
   する、酵素免疫測定法による試料中の測定対象物質の測
   定試薬。
2. 【請求項２】 測定対象物質が、抗体である、請求項１
   記載の測定試薬。
3. 【請求項３】 「測定対象物質である抗体と結合するこ
   とができる物質−この物質と結合することができる抗体
   −担体」を含むことを特徴とする、請求項１又は請求項
   ２記載の測定試薬。
4. 【請求項４】 測定対象物質が、夏型過敏性肺炎の原因
   微生物に対する抗体である、請求項１〜請求項３のいず
   れか１項に記載の測定試薬。
5. 【請求項５】 夏型過敏性肺炎の原因微生物が、Ｔｒｉ
   ｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉである、請求項４記
   載の測定試薬。
6. 【請求項６】 試料中の測定対象物質の測定を、標識物
   質としてペルオキシダーゼを用いる酵素免疫測定法によ
   り行う測定方法であって、かつ測定の盲検値が高い測定
   方法において、色原体として、（ｉ）４−アミノアンチ
   ピリン、及び（ｉｉ）フェノール若しくはその誘導体又
   はアニリン誘導体のいずれか一方を使用することを特徴
   とする、酵素免疫測定法による試料中の測定対象物質の
   測定方法。
7. 【請求項７】 測定対象物質が、抗体である、請求項６
   記載の測定方法。
8. 【請求項８】 「測定対象物質である抗体と結合するこ
   とができる物質−この物質と結合することができる抗体
   −担体」を用いることを特徴とする、請求項６又は請求
   項７に記載の測定方法。
9. 【請求項９】 測定対象物質が、夏型過敏性肺炎の原因
   微生物に対する抗体である、請求項６〜請求項８のいず
   れか１項に記載の測定方法。
10. 【請求項１０】 夏型過敏性肺炎の原因微生物が、Ｔｒ
    ｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎａｓａｈｉｉである、請求項９記
    載の測定方法。