JPS58151560A - ヒト尿カリクレイン測定用キツト - Google Patents
ヒト尿カリクレイン測定用キツトInfo
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- JPS58151560A JPS58151560A JP3533482A JP3533482A JPS58151560A JP S58151560 A JPS58151560 A JP S58151560A JP 3533482 A JP3533482 A JP 3533482A JP 3533482 A JP3533482 A JP 3533482A JP S58151560 A JPS58151560 A JP S58151560A
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
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- Pathology (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、多数の被検液中の尿カリクレインを迅速かつ
正確に定量することが可能なヒト尿カリクレイン測定用
キットに関する。
正確に定量することが可能なヒト尿カリクレイン測定用
キットに関する。
カリクレインは血漿中のキニノーゲンに作用して、生理
活性ペプタイドであるキニンを遊離する酵素である。
活性ペプタイドであるキニンを遊離する酵素である。
カリクレインの生物学的作用は、遊離されたキニンを介
して発現される。例えば血管拡張作用。
して発現される。例えば血管拡張作用。
面圧降下作用、平滑筋収縮作用１毛細血管透過性作用、
カテコールアミン分泌亢進作用、プロスタグランジン生
合成亢進作用等である。
カテコールアミン分泌亢進作用、プロスタグランジン生
合成亢進作用等である。
ヒトに限らず、多くの動物の尿にカリクレインが排泄さ
れることが知られている。尿中のカリクレインは腎臓に
おいて生合成されたもので、特に腎血流量の調節及び血
圧の調節に関与している。
れることが知られている。尿中のカリクレインは腎臓に
おいて生合成されたもので、特に腎血流量の調節及び血
圧の調節に関与している。
このように、カリクレインは広汎な生理作用を示すこと
により生体の恒常性維持に対して重要な役割をはたして
いる。従って、カリクレインの生合成低下や分泌低下は
重篤な疾患を惹起する。例えば１本態性高血圧症、腎性
高血圧症の患者の尿中へのカリクレイン排泄量は健常人
のそれと比較して著量に低下しており、また原発性アル
ドステロン症やバーター症候群患者尿ではカリクレイン
排泄量が高く、腎不全患者では低いことが知らされてい
る。
により生体の恒常性維持に対して重要な役割をはたして
いる。従って、カリクレインの生合成低下や分泌低下は
重篤な疾患を惹起する。例えば１本態性高血圧症、腎性
高血圧症の患者の尿中へのカリクレイン排泄量は健常人
のそれと比較して著量に低下しており、また原発性アル
ドステロン症やバーター症候群患者尿ではカリクレイン
排泄量が高く、腎不全患者では低いことが知らされてい
る。
このように高血圧症をはじめ、各神疾患においてカリク
レイン排泄量を定量することは疾患の診断にとって、極
めて有用である。
レイン排泄量を定量することは疾患の診断にとって、極
めて有用である。
ところで、カリクレインの定量法としては、古くよりＦ
ｒｅｙの方法、即゛ち麻酔した犬に検体をか・派内投与
して、その際に観察される全身血圧の降下度を指標とす
る方法がとられてきた（文献ｌ参照）。しかしながら、
この方法は操作が複雑で。
ｒｅｙの方法、即゛ち麻酔した犬に検体をか・派内投与
して、その際に観察される全身血圧の降下度を指標とす
る方法がとられてきた（文献ｌ参照）。しかしながら、
この方法は操作が複雑で。
かつ、犬の個体差によるバラツキを除去しがたいなど問
題が指摘されている。
題が指摘されている。
才だ、各種の合成基質、たとえば、トシルアルギニンメ
チルエステル、ベンゾイルアルギニンエチルエステル、
ゾロリルーフェニルアラニルーアルギニンメチルクマリ
ンアミド、Ｄ−バリル−ロイシル−アルギニンパラニト
ロアニリドなどに対するカリクレインの加水分解活性を
測定する方法は、Ｆｒｅｙの方法より操作が簡便であり
、再現性も高い。ところが尿中のカリクレインを測定す
る場合、これらの合成基質は尿中に存在するカリクレイ
ン以外の蛋白質分解酵素によっても分解されるため、カ
リクレインのみを選択的に、正確に測定することはでき
ない。
チルエステル、ベンゾイルアルギニンエチルエステル、
ゾロリルーフェニルアラニルーアルギニンメチルクマリ
ンアミド、Ｄ−バリル−ロイシル−アルギニンパラニト
ロアニリドなどに対するカリクレインの加水分解活性を
測定する方法は、Ｆｒｅｙの方法より操作が簡便であり
、再現性も高い。ところが尿中のカリクレインを測定す
る場合、これらの合成基質は尿中に存在するカリクレイ
ン以外の蛋白質分解酵素によっても分解されるため、カ
リクレインのみを選択的に、正確に測定することはでき
ない。
これらの方法に対して、抗原−抗体反応による免疫学的
定量法を応用すれば、たとえ尿を検体とした場合にもカ
リクレインのみを選択的に測定することが可能である。
定量法を応用すれば、たとえ尿を検体とした場合にもカ
リクレインのみを選択的に測定することが可能である。
これ迄に免疫学的測定法としては後記文献２．３及び４
に開示の方法が報告されている。
に開示の方法が報告されている。
これらの報告から明らかな通り、免疫学的定量法の応用
により、尿、中に排泄される微量のカリクレインを精密
に測定できるようになり、各種疾患と尿中カリクレイン
排泄量の関連性が詳細に検討されるようになった。
により、尿、中に排泄される微量のカリクレインを精密
に測定できるようになり、各種疾患と尿中カリクレイン
排泄量の関連性が詳細に検討されるようになった。
ところが、カリクレインの免疫学的定量法に関する上記
の文献に開示された方法では以下の間和点が指摘される
。すなわち、■抗原−抗体反応を定量的に追跡するため
に抗原であるヒト総カリクレインを放射性同位元素でＳ
ｔ＊する方法か採用されているため、放射性同位元素に
基づく欠点をもっている。たとえば放射性同位元素は通
常、不安定であり、従って、標識化合物を長期間保存す
ることができない。また、放射性同位元素は人体に対し
て有害であり、その取扱いには、一定の基準により認可
された施設を必要とする。その上に。
の文献に開示された方法では以下の間和点が指摘される
。すなわち、■抗原−抗体反応を定量的に追跡するため
に抗原であるヒト総カリクレインを放射性同位元素でＳ
ｔ＊する方法か採用されているため、放射性同位元素に
基づく欠点をもっている。たとえば放射性同位元素は通
常、不安定であり、従って、標識化合物を長期間保存す
ることができない。また、放射性同位元素は人体に対し
て有害であり、その取扱いには、一定の基準により認可
された施設を必要とする。その上に。
放射性同位元素は高価であり、測定機器も高価である。
■抗原−抗体反応を液相で行なっており、抗体と複合体
を形成した抗原（Ｂ体）と、遊離の抗原（Ｂ体）を分離
するために（いわゆるＢ／Ｆ分離）二抗体法または、ポ
リエチレングリコール沈澱法が採用されている。このた
め、インキュベーションや遠心分＊ｍ作を必要とし、シ
タがって測定のための所要時間が延長し、また操作も複
雑になる。
を形成した抗原（Ｂ体）と、遊離の抗原（Ｂ体）を分離
するために（いわゆるＢ／Ｆ分離）二抗体法または、ポ
リエチレングリコール沈澱法が採用されている。このた
め、インキュベーションや遠心分＊ｍ作を必要とし、シ
タがって測定のための所要時間が延長し、また操作も複
雑になる。
従って、放射性同位元素標識法に代わる′ｌｉ４識方法
及び簡便なり／Ｆ分離方法を見い出して、多数の被検尿
について迅速かつ正確に尿中のカリクレインを測定でき
る定量法を確立することは当面の課題であり、本発明の
目的はかかる課題を解決した尿中カリクレイン定量方法
ないし器具を掟供することである。
及び簡便なり／Ｆ分離方法を見い出して、多数の被検尿
について迅速かつ正確に尿中のカリクレインを測定でき
る定量法を確立することは当面の課題であり、本発明の
目的はかかる課題を解決した尿中カリクレイン定量方法
ないし器具を掟供することである。
本発明は、抗ヒトカリクレイン抗体固定容器、酵素標識
ヒト尿カリクレイン、標準ヒト尿カリクレイン及び酵素
活性測定用基質緩衝液よりなるヒト尿カリクレイン定量
用キットに関する。
ヒト尿カリクレイン、標準ヒト尿カリクレイン及び酵素
活性測定用基質緩衝液よりなるヒト尿カリクレイン定量
用キットに関する。
本発明に関する標準ヒト即カリクレインは、後述する標
準検量線を作成するために用いられるものであり、通常
は尿カリクレインの凍結乾燥品よりなるものである。か
かる標準ヒト尿カリクレインとしては、たとえば新鮮人
尿をコロイド性含水ケイ酸アルミニウムと接触後、不溶
液トリプシン阻害剤によるアフィニティクロマトグラフ
ィーを行う方法（特願ｌｉｔ！（５６−１８８７４４号
）にて得られたヒト尿カリクレイン凍結乾燥呂などか用
いられる。標準ヒト尿カリクレインは緩衝液に溶解して
使用され、この際たとえば５〜５００ ｎｐ／＊／とな
るように４〜６濃度段階まで小分けして標＄Ｉ模量線の
作成に使用される。
準検量線を作成するために用いられるものであり、通常
は尿カリクレインの凍結乾燥品よりなるものである。か
かる標準ヒト尿カリクレインとしては、たとえば新鮮人
尿をコロイド性含水ケイ酸アルミニウムと接触後、不溶
液トリプシン阻害剤によるアフィニティクロマトグラフ
ィーを行う方法（特願ｌｉｔ！（５６−１８８７４４号
）にて得られたヒト尿カリクレイン凍結乾燥呂などか用
いられる。標準ヒト尿カリクレインは緩衝液に溶解して
使用され、この際たとえば５〜５００ ｎｐ／＊／とな
るように４〜６濃度段階まで小分けして標＄Ｉ模量線の
作成に使用される。
酵素４１！識ヒト尿カリクレインは、ヒト尿カリクレイ
ンにエンザイムイムノアッセイに使用さｆする標識酵素
〔たとえば、アルカリホスファターセ（文献５参照）、
ペルオキシダーゼ（文献６参照）、リンゴ酸脱水素酵素
（文献７参照）、β−Ｄ −ガラクトシダーゼ（文献８
参照）〕を椋奥したものである。かかる酵素標識ヒト尿
カリクレインは、自体既知の方法、たとえばＮ−サクシ
シイξジル８−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
を用いる方法（文献θ参照）、グルタルアルデヒドを用
いる方法（文献１０参照）、Ｎ、Ｎ’−０−フェニレン
ジマレイミドを用いる方法（文献１１参照）にてヒト尿
カリクレインを標識することによって作成することがで
きる。
ンにエンザイムイムノアッセイに使用さｆする標識酵素
〔たとえば、アルカリホスファターセ（文献５参照）、
ペルオキシダーゼ（文献６参照）、リンゴ酸脱水素酵素
（文献７参照）、β−Ｄ −ガラクトシダーゼ（文献８
参照）〕を椋奥したものである。かかる酵素標識ヒト尿
カリクレインは、自体既知の方法、たとえばＮ−サクシ
シイξジル８−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート
を用いる方法（文献θ参照）、グルタルアルデヒドを用
いる方法（文献１０参照）、Ｎ、Ｎ’−０−フェニレン
ジマレイミドを用いる方法（文献１１参照）にてヒト尿
カリクレインを標識することによって作成することがで
きる。
抗ヒト尿カリクレイン抗体固定容器における客器として
は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンなど
の透明な合成樹脂を材質とする酵素免疫測定法用マイク
ロタイトレージョンプレートなどが適当である。
は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンなど
の透明な合成樹脂を材質とする酵素免疫測定法用マイク
ロタイトレージョンプレートなどが適当である。
当該容器に固定するための抗ヒト尿カリクレインは、た
とえばヒト尿カリクレインをフロイドのアジュバントと
乳化したのち、ウサギ、モルモット、ラット、ヤギなど
の動物に感作させて得られる。ここで抗血清からの抗ヒ
ト尿カリクレインの調製は、硫酸アンモニウム沈澱法、
イオン交換クロマトグラフィー、分子篩などの処理を単
独または組合せることによって行われる。
とえばヒト尿カリクレインをフロイドのアジュバントと
乳化したのち、ウサギ、モルモット、ラット、ヤギなど
の動物に感作させて得られる。ここで抗血清からの抗ヒ
ト尿カリクレインの調製は、硫酸アンモニウム沈澱法、
イオン交換クロマトグラフィー、分子篩などの処理を単
独または組合せることによって行われる。
抗ヒト尿カリクレイン抗体を容器に固定する方法として
は、たとえば次の如き方法があげられる、なお、固定さ
れるべき抗ヒト尿カリクレイシ抗体量には至適城があり
１通常は質料中のカリクレインの４０〜６０％が結合可
能な抗体量が至適抗体量である。
は、たとえば次の如き方法があげられる、なお、固定さ
れるべき抗ヒト尿カリクレイシ抗体量には至適城があり
１通常は質料中のカリクレインの４０〜６０％が結合可
能な抗体量が至適抗体量である。
抗ヒト尿カリクレイン抗体を、たとえば１．０００倍、
２．０００倍、 ４．０００＠ 、 ８．０００倍、
１６，０００倍程度に希釈する。ここで希釈のための
緩１１Ｍとしては、酢酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、トリ
ス−塩ｔ！＃ｍなどが使用されるが、特に、０．０１Ｍ
酢酸ナトリウムＩ衝液、ｐ Ｈ５，５が好ましい。当該
抗体希釈液の適量、たとえば５Ｏ−１ＯＯｐｌを客器に
入れ、たとえば０〜８７°Ｃにて１〜２４時間静！１伎
、希釈液を除去する。
２．０００倍、 ４．０００＠ 、 ８．０００倍、
１６，０００倍程度に希釈する。ここで希釈のための
緩１１Ｍとしては、酢酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、トリ
ス−塩ｔ！＃ｍなどが使用されるが、特に、０．０１Ｍ
酢酸ナトリウムＩ衝液、ｐ Ｈ５，５が好ましい。当該
抗体希釈液の適量、たとえば５Ｏ−１ＯＯｐｌを客器に
入れ、たとえば０〜８７°Ｃにて１〜２４時間静！１伎
、希釈液を除去する。
洗浄液の適量、たとえばｌｏｏ〜１５ｏｐｌを用いて、
好ましくは１〜８回洗浄する。洗浄液としては、蒸留水
、生理食塩液、及びこれらにｏ、。
好ましくは１〜８回洗浄する。洗浄液としては、蒸留水
、生理食塩液、及びこれらにｏ、。
ｌ〜０．１％アルブｉンやＴｗｅｅｎ−２０を添加溶解
した溶液が使用できるや洗浄後容器を乾燥す第１ば、抗
ヒト尿カリクレイン抗体固定容器が得られる。
した溶液が使用できるや洗浄後容器を乾燥す第１ば、抗
ヒト尿カリクレイン抗体固定容器が得られる。
このようにして得られた抗体固定容器に、ヒト尿カリク
レインとして２ｎｙ を含有する酵素標識ヒト尿カリク
レインを加えて、緩東液（たとえば、ｐ Ｈ６，５〜８
．５）にて全量を好ましくは１ｏａｐｌと′して、たと
えば０〜８７℃にて２〜２４時間静置した後、上記と同
様の操作にて洗浄を行う。
レインとして２ｎｙ を含有する酵素標識ヒト尿カリク
レインを加えて、緩東液（たとえば、ｐ Ｈ６，５〜８
．５）にて全量を好ましくは１ｏａｐｌと′して、たと
えば０〜８７℃にて２〜２４時間静置した後、上記と同
様の操作にて洗浄を行う。
抗体固定容器に結合した酵素標識ヒト尿カリクレイン量
は、標識酵素の酵素活性を定量することにより求める。
は、標識酵素の酵素活性を定量することにより求める。
かくして、用いた酵素標識ヒト尿カリクレインの約４０
〜６０％が結合する抗体固定容器を１本発明のキットと
して用いることが奸才しい。
〜６０％が結合する抗体固定容器を１本発明のキットと
して用いることが奸才しい。
本発明キット用として使用されるＷＩ衝液は、抗原−抗
体反応用のものと、標識用酵素の酵素活性測定用のもの
である。抗原−抗体反応用緩衝液は、特にｐＨが６〜９
．塩濃度が０．０１〜０．２Ｍ程度のものが好ましく、
具体的には、たとえば０．１Ｍリン酸塩緩衝化生理食塩
液ｐ Ｈ７，０のものがあげられろ。酵素活性測定用緩
衝液は、標識用酵素の種類により異るが１通常は上記の
抗原−抗体反応用緩衝液が共用できる。ｍ！識出用酵素
活性測定条件が上記の抗原−抗体反応用緩衝液のｊｔｉ
ｌｓ ＋ｉやｐＨと異る場合に限り、酵素活性測定用−
ｂｅを作成する。たとえば、標識用酵素としてアルカリ
ホスファターゼを利用する場合、ｐＢが９〜１１の緩１
ｌｉＪ液が用いられる。
体反応用のものと、標識用酵素の酵素活性測定用のもの
である。抗原−抗体反応用緩衝液は、特にｐＨが６〜９
．塩濃度が０．０１〜０．２Ｍ程度のものが好ましく、
具体的には、たとえば０．１Ｍリン酸塩緩衝化生理食塩
液ｐ Ｈ７，０のものがあげられろ。酵素活性測定用緩
衝液は、標識用酵素の種類により異るが１通常は上記の
抗原−抗体反応用緩衝液が共用できる。ｍ！識出用酵素
活性測定条件が上記の抗原−抗体反応用緩衝液のｊｔｉ
ｌｓ ＋ｉやｐＨと異る場合に限り、酵素活性測定用−
ｂｅを作成する。たとえば、標識用酵素としてアルカリ
ホスファターゼを利用する場合、ｐＢが９〜１１の緩１
ｌｉＪ液が用いられる。
酵素活性測定用基質は、当然のことながら、用いる標識
用酵素の種類によって異るが、当該酵素に適した基質の
粉末又は溶液である。
用酵素の種類によって異るが、当該酵素に適した基質の
粉末又は溶液である。
本発明キットを使用するヒト尿カリクレインの測定方法
は次の通りである。
は次の通りである。
抗ヒト尿カリクレイン抗体固定容器に酔素襟蟲ヒト尿カ
リクレインの緩絢液溶液及び被検液（被検尿）を加えて
インキュベーションする。かくして固定抗体と酵素標識
ヒト尿カリクレイン及び被検液中のカリクレインとが抗
原−抗体反応によって結合体（Ｂ体）を形成する。とこ
ろで、本発明においては抗ヒト尿カリクレイン抗体は容
器に固定されているので遊離の酵素ｍｓカリクレインＲ
。
リクレインの緩絢液溶液及び被検液（被検尿）を加えて
インキュベーションする。かくして固定抗体と酵素標識
ヒト尿カリクレイン及び被検液中のカリクレインとが抗
原−抗体反応によって結合体（Ｂ体）を形成する。とこ
ろで、本発明においては抗ヒト尿カリクレイン抗体は容
器に固定されているので遊離の酵素ｍｓカリクレインＲ
。
び被検液中の遊離のカリクレイン（即ちこれらは７体に
相当する）は、容器中の液を除去することによって容易
に除去できる。即ち１本発明においてはＢ／Ｆ分離が極
めて容易である。
相当する）は、容器中の液を除去することによって容易
に除去できる。即ち１本発明においてはＢ／Ｆ分離が極
めて容易である。
Ｂ／Ｆ分離を行なった抗体固定容器に酵素活性測定用緩
衝液と酵素活性測定用基質を加えてインキュベーション
した後、酵素反応により形成された生成物を分光光度計
を用いて定量する。
衝液と酵素活性測定用基質を加えてインキュベーション
した後、酵素反応により形成された生成物を分光光度計
を用いて定量する。
このとき、被検液中のヒト尿カリクレイン量が多ければ
多い捏、酵素Ｓｔ識カリクレインの結合量が少なくなる
ので、酵素活性は低下する。
多い捏、酵素Ｓｔ識カリクレインの結合量が少なくなる
ので、酵素活性は低下する。
−万、上記被検液の代りに種々の濃度の標準ヒト尿カリ
クレインを用いて標準検量線を作成し。
クレインを用いて標準検量線を作成し。
これと被検液の酵素活性値を対比して被検液中のカリク
レインを定量する。
レインを定量する。
標準検量線は、次の如くして作成される。
（ただし、Ｂｏは酵素標識ヒト尿カリクレインのみを抗
ヒト尿カリクレイン抗体固定容器に結合させた時の酵素
活性値、Ｂは各希釈度における標準ヒト尿カリクレイン
及び酵素＊＊ヒト尿カリクレインを結合させた時の酵素
活性値）を、横軸にヒト尿カリクレイン量＜ｎｆ／容器
）をとり、標準ヒト尿カリクレインの各濃度における値
を結ぶことによって作成されるや しかして、各被検液の１Ｘ１００値を求めれば当該標準
検量線に合して被検液中に含まれるヒト尿カリクレイン
量（ｎｆ／容器）が測定できる。
ヒト尿カリクレイン抗体固定容器に結合させた時の酵素
活性値、Ｂは各希釈度における標準ヒト尿カリクレイン
及び酵素＊＊ヒト尿カリクレインを結合させた時の酵素
活性値）を、横軸にヒト尿カリクレイン量＜ｎｆ／容器
）をとり、標準ヒト尿カリクレインの各濃度における値
を結ぶことによって作成されるや しかして、各被検液の１Ｘ１００値を求めれば当該標準
検量線に合して被検液中に含まれるヒト尿カリクレイン
量（ｎｆ／容器）が測定できる。
ヒト尿についてカリクレイン量を本発明キットにて調べ
た結果は、正常な血圧を示す健康成人（ｎ＝１５ ）で
１２１．８±８４．７ ｎｇ／ｗ／ 、 （ｎ ＝ ８
）で８２．５±２５．９ ｎｙ／ｙｘｌ 、本級性高血
圧患者であり、本発明キットによる定量結果は正確なも
のであった。
た結果は、正常な血圧を示す健康成人（ｎ＝１５ ）で
１２１．８±８４．７ ｎｇ／ｗ／ 、 （ｎ ＝ ８
）で８２．５±２５．９ ｎｙ／ｙｘｌ 、本級性高血
圧患者であり、本発明キットによる定量結果は正確なも
のであった。
また本発明キットを用いての回収試験、再現性試験は満
足のゆくものであった。
足のゆくものであった。
実施例１
（抗ヒト尿カリクレイン抗体固定容器の作成）ヒト尿カ
リクレインに対するウサギ抗血清から硫酸アンモニウム
沈澱法およびＤＢ、Ａｌｊ−ｃｅｌ １ｕｌｏｓｅクロ
マトグラフイーにて抗ヒト尿カリクレイン抗体を精製し
たのち、０．０１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，５を用い
て４，０００倍に希釈した。この希釈液の５０μｌをポ
リスチレン製酵素免疫測定法用マイクロタイトレージョ
ンプレート（９６穴、 平ａ型、容量８５０−μｌ）に
入れ、８７°Ｃにて４時間静置した。容器内液を吸引除
去したのら、０．０５％の牛血清アルブミンを含有する
生理食塩液の１５０μｌを用いて２回洗浄した。さらに
０，０１％Ｎ ａ Ｎ ３含有の生理食塩液の１５０μ
ｌで１回洗浄した。２５°Ｃにて送風乾燥した。
リクレインに対するウサギ抗血清から硫酸アンモニウム
沈澱法およびＤＢ、Ａｌｊ−ｃｅｌ １ｕｌｏｓｅクロ
マトグラフイーにて抗ヒト尿カリクレイン抗体を精製し
たのち、０．０１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，５を用い
て４，０００倍に希釈した。この希釈液の５０μｌをポ
リスチレン製酵素免疫測定法用マイクロタイトレージョ
ンプレート（９６穴、 平ａ型、容量８５０−μｌ）に
入れ、８７°Ｃにて４時間静置した。容器内液を吸引除
去したのら、０．０５％の牛血清アルブミンを含有する
生理食塩液の１５０μｌを用いて２回洗浄した。さらに
０，０１％Ｎ ａ Ｎ ３含有の生理食塩液の１５０μ
ｌで１回洗浄した。２５°Ｃにて送風乾燥した。
参考例１
（本キットによる尿中カリクレインの測定）抗ヒト尿カ
リクレイン抗体固定容器にリン酸塩緩衝化生理食塩液％
ｐ Ｈ７，０の１００μｌ、アルカリホスファターゼ標
識ヒト尿カリクレイン量Ｗｋ２０μｌ（ヒト尿カリクレ
インとして２ｎｙ含有）、及び被検尿の２０μｌを加え
、攪拌後、８７°Ｃにて４時間静置した。試験管内液を
吸引除去後、蒸留水の１５０μｐ を用いて２回洗浄し
た。酵素活性測定用緩衝液（０，１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ
−Ｎａｉｌ、緩衝液、ｐＨ１０，５）の１００μｌと酵
素活性測定用基質（５０ｍＭＰ−ニトロフェニルホスフ
ェイト）を入れ、８７°Ｃで１５分間インキュベートし
たのち、４０５ｎｍの吸光度を測定した。−万、上記反
応液中、被検尿のかわりに標準カリクレイン溶液の２０
μ６（カリクレインとしては、 ０．２ ｎｇ 、０
．５”ｆ−１ｆｌｆ、２Ｊｌｅ４ｎｆ、８ｎｇ含有）を
用イタ反応系により標準検量線を作成した。被検尿の反
応で得られた酵素活性を検量線と比較することにより、
被検尿に含まれるヒト尿カリクレインの域を求めた。
リクレイン抗体固定容器にリン酸塩緩衝化生理食塩液％
ｐ Ｈ７，０の１００μｌ、アルカリホスファターゼ標
識ヒト尿カリクレイン量Ｗｋ２０μｌ（ヒト尿カリクレ
インとして２ｎｙ含有）、及び被検尿の２０μｌを加え
、攪拌後、８７°Ｃにて４時間静置した。試験管内液を
吸引除去後、蒸留水の１５０μｐ を用いて２回洗浄し
た。酵素活性測定用緩衝液（０，１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ
−Ｎａｉｌ、緩衝液、ｐＨ１０，５）の１００μｌと酵
素活性測定用基質（５０ｍＭＰ−ニトロフェニルホスフ
ェイト）を入れ、８７°Ｃで１５分間インキュベートし
たのち、４０５ｎｍの吸光度を測定した。−万、上記反
応液中、被検尿のかわりに標準カリクレイン溶液の２０
μ６（カリクレインとしては、 ０．２ ｎｇ 、０
．５”ｆ−１ｆｌｆ、２Ｊｌｅ４ｎｆ、８ｎｇ含有）を
用イタ反応系により標準検量線を作成した。被検尿の反
応で得られた酵素活性を検量線と比較することにより、
被検尿に含まれるヒト尿カリクレインの域を求めた。
文献
１）Ｆｒｅｙ＋Ｅ、に、、Ａｒｃｈ、Ｋ１１ｎ、０ｈｉ
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１４２．６６８（１９２６）
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ａｎｄ Ａｃ−ｔｉｏｎｓ、１０，８２９（１９８０）
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Ｂｉｏ−’ｃｈｅｍ、、７９，２８８（１９７６）９）
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Ｌｅｔｔ、。
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Claims (1)
- （１）抗ヒト尿カリクレイン抗体固定容器、酵素標識ヒ
ト尿カリクレイン、ｌｌ拳ヒ）成力９タレイン、５酵素
Ｓ性欄定用基質、緩衝液よ巣なるヒト尿カリクレイン定
量用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3533482A JPS58151560A (ja) | 1982-03-05 | 1982-03-05 | ヒト尿カリクレイン測定用キツト |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3533482A JPS58151560A (ja) | 1982-03-05 | 1982-03-05 | ヒト尿カリクレイン測定用キツト |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58151560A true JPS58151560A (ja) | 1983-09-08 |
Family
ID=12438932
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3533482A Pending JPS58151560A (ja) | 1982-03-05 | 1982-03-05 | ヒト尿カリクレイン測定用キツト |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58151560A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0210029A2 (en) * | 1985-07-12 | 1987-01-28 | Temple University of the Commonwealth System of Higher Education | Monoclonal antibodies to human plasma prekallikrein and methods of preparing and using same |
-
1982
- 1982-03-05 JP JP3533482A patent/JPS58151560A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0210029A2 (en) * | 1985-07-12 | 1987-01-28 | Temple University of the Commonwealth System of Higher Education | Monoclonal antibodies to human plasma prekallikrein and methods of preparing and using same |
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