JP2507317B2 - プラスミン―α２プラスミンインヒビタ―複合体の測定方法 - Google Patents
プラスミン―α２プラスミンインヒビタ―複合体の測定方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ａ 産業上の利用分野 本発明は、汎発性血管内凝固疾患（DIC）等の患者血
漿中に存在する、ヒトプラスミン−α2〔−〕プラスミ
ンインヒビター複合体の測定方法に関する。
漿中に存在する、ヒトプラスミン−α2〔−〕プラスミ
ンインヒビター複合体の測定方法に関する。
ｂ 従来技術 ヒトのα2−プラスミンインヒビターは、青木と諸井
によつて最初に単離・精製された。これは、線維素（フ
イブリン）溶解酵素であるプラスミンのエステラーゼ活
性（線維素溶解作用）を、瞬間的に阻害する強力なプラ
スミンインヒビターであり、11.7％の糖を含む分子量約
67,000の１本鎖の糖タンパクであることが知られている
（Moroi ＆ Aoki;The Journal of Biological Chemistr
y,251,5956−5965（1976）参照）。このα2−プラスミ
ンインヒビターは、プラスミンの線維溶解作用を阻止す
る部位（B.Wiman ＆ D.Collen,J.B.C.254,9291−9297
（1979）参照）以外に、カルボキシル基末端側のプラス
ミン結合部位（B.Wiman ＆ D.Collen;European Journal
of Biochemistry,84,573−578（1978）参照）とアミノ
基末端のフイブリン結合部位（Y.Sakata,et al;,Thromb
osis Research16,279−282（1979）参照）を有してい
る。従つて、ヒトα2−プラスミンインヒビターは、プ
ラスミン活性をほとんど瞬間的に阻害し、かつプラスミ
ンと1:1の割合で結合し複合体を形成する（B.Wiman ＆
D.Collen;J.B.C,254,9291−9297（1979）参照）。
によつて最初に単離・精製された。これは、線維素（フ
イブリン）溶解酵素であるプラスミンのエステラーゼ活
性（線維素溶解作用）を、瞬間的に阻害する強力なプラ
スミンインヒビターであり、11.7％の糖を含む分子量約
67,000の１本鎖の糖タンパクであることが知られている
（Moroi ＆ Aoki;The Journal of Biological Chemistr
y,251,5956−5965（1976）参照）。このα2−プラスミ
ンインヒビターは、プラスミンの線維溶解作用を阻止す
る部位（B.Wiman ＆ D.Collen,J.B.C.254,9291−9297
（1979）参照）以外に、カルボキシル基末端側のプラス
ミン結合部位（B.Wiman ＆ D.Collen;European Journal
of Biochemistry,84,573−578（1978）参照）とアミノ
基末端のフイブリン結合部位（Y.Sakata,et al;,Thromb
osis Research16,279−282（1979）参照）を有してい
る。従つて、ヒトα2−プラスミンインヒビターは、プ
ラスミン活性をほとんど瞬間的に阻害し、かつプラスミ
ンと1:1の割合で結合し複合体を形成する（B.Wiman ＆
D.Collen;J.B.C,254,9291−9297（1979）参照）。
例えば、DIC患者血漿中や、ウロキナーゼによる血栓
溶解療法実施中の患者血漿中では、プラスミンの前駆体
であるプラスミノーゲンの活性化が起こり、生成したプ
ラスミンとα2−プラスミンインヒビターが反応して両
者の複合体が形成される。
溶解療法実施中の患者血漿中では、プラスミンの前駆体
であるプラスミノーゲンの活性化が起こり、生成したプ
ラスミンとα2−プラスミンインヒビターが反応して両
者の複合体が形成される。
最近、血漿中のプラスミンとα2−プラスミンインヒ
ビターとの複合体すなわちプラスミン−α2−プラスミ
ンインヒビター複合体（以下、『プラスミン−α2−プ
ラスミンインヒビター複合体』と略記することがある）
の定量は、血栓溶解療法のモニターやDICの診断等に有
効であると考えられるようになつた。そして、このため
には、血液又は血漿中のプラスミン−α2−プラスミン
インヒビター複合体の量を、正確且つ簡便に測定する必
要がある。従来知られているプラスミン−α2−プラス
ミンインヒビター複合体の測定方法としては、３つの方
法がある。第１の方法は、二次元交叉免疫電気泳動を用
いる方法である。第２の方法は、プラスミン−α2−プ
ラスミンインヒビター複合体のネオアンチゲンに対す
る、ポリクローナル抗体を用いたラテツクス凝集法であ
る。第３の方法は、プラスミノーゲンに対するポリクロ
ーナル抗体と、α2−プラスミンインヒビターに対する
ポリクローナル抗体を、一方を固定抗体にし他方を酵素
標識抗体にした、酵素免疫測定法である。
ビターとの複合体すなわちプラスミン−α2−プラスミ
ンインヒビター複合体（以下、『プラスミン−α2−プ
ラスミンインヒビター複合体』と略記することがある）
の定量は、血栓溶解療法のモニターやDICの診断等に有
効であると考えられるようになつた。そして、このため
には、血液又は血漿中のプラスミン−α2−プラスミン
インヒビター複合体の量を、正確且つ簡便に測定する必
要がある。従来知られているプラスミン−α2−プラス
ミンインヒビター複合体の測定方法としては、３つの方
法がある。第１の方法は、二次元交叉免疫電気泳動を用
いる方法である。第２の方法は、プラスミン−α2−プ
ラスミンインヒビター複合体のネオアンチゲンに対す
る、ポリクローナル抗体を用いたラテツクス凝集法であ
る。第３の方法は、プラスミノーゲンに対するポリクロ
ーナル抗体と、α2−プラスミンインヒビターに対する
ポリクローナル抗体を、一方を固定抗体にし他方を酵素
標識抗体にした、酵素免疫測定法である。
ｃ 発明が解決しようとする問題点 しかしながら、第１の方法は、感度と定量性が低いと
いう欠点があり、第２の方法は、特異性の点で問題があ
る。また、第３の方法は、感度の面では良好な方法であ
るが、以下に述べる様な問題を有している。即ち、ヒト
α2−プラスミンインヒビターに対する一定の活性を有
する抗血清を、安定して得ることが困難なゆえに、測定
における再現性にその問題がある。また、免疫反応が２
ステツプであるため（第１段；検体中の複合体と固相抗
体との反応、第２段；固相抗体に結合した複合体と酵素
標識抗体との反応）、その操作が煩雑であり、測定に長
時間を有するという欠点がある。煩雑な２ステツプの操
作をよぎなくされる理由として、血漿中に存在する遊離
のプラスミノーゲン（プラスミンの前駆体）とα2−プ
ラスミンインヒビターは、免疫測定法を阻害する因子で
あり、かつこれらの因子は血漿中において、一般的に、
プラスミン−α2−プラスミンインヒビター複合体に比
して多量に存在するという事実が存在する。それ故に２
ステツプに分けて、これらの影響を除く必要があるので
ある。従つて、簡便な１ステツプの方法をとると、その
測定値の正確性ならびに再現性を犠牲にしてしまうこと
になる。
いう欠点があり、第２の方法は、特異性の点で問題があ
る。また、第３の方法は、感度の面では良好な方法であ
るが、以下に述べる様な問題を有している。即ち、ヒト
α2−プラスミンインヒビターに対する一定の活性を有
する抗血清を、安定して得ることが困難なゆえに、測定
における再現性にその問題がある。また、免疫反応が２
ステツプであるため（第１段；検体中の複合体と固相抗
体との反応、第２段；固相抗体に結合した複合体と酵素
標識抗体との反応）、その操作が煩雑であり、測定に長
時間を有するという欠点がある。煩雑な２ステツプの操
作をよぎなくされる理由として、血漿中に存在する遊離
のプラスミノーゲン（プラスミンの前駆体）とα2−プ
ラスミンインヒビターは、免疫測定法を阻害する因子で
あり、かつこれらの因子は血漿中において、一般的に、
プラスミン−α2−プラスミンインヒビター複合体に比
して多量に存在するという事実が存在する。それ故に２
ステツプに分けて、これらの影響を除く必要があるので
ある。従つて、簡便な１ステツプの方法をとると、その
測定値の正確性ならびに再現性を犠牲にしてしまうこと
になる。
ｄ 問題点を解決するための手段 本発明者らは、かかる事情に鑑みて、ヒトプラスミン
−α2−プラスミンインヒビター複合体を、簡便な１ス
テツプ法で、正確に再現性良く定量する方法を開発すべ
く鋭意研究の結果、本発明に到達した。
−α2−プラスミンインヒビター複合体を、簡便な１ス
テツプ法で、正確に再現性良く定量する方法を開発すべ
く鋭意研究の結果、本発明に到達した。
即ち、本発明は、サンドイッチ法によるプラスミン−
α2−プラスミンインヒビター複合体の測定方法におい
て、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とのいずれか
一方が、ヒトα2−プラスミンインヒビターを特異的に
認識するモノクローナル抗体か又はヒトプラスミノーゲ
ルを認識し、ヒトプラスミンと交叉反応性を有する抗体
（モノ又はポリクローナル抗体）であり、他方が、プラ
スミン−α2−プラスミンインヒビター複合体のネオア
ンチゲンに対する抗体（モノ又はポリクローナル抗体）
であることを特徴とする、プラスミン−α2−プラスミ
ンインヒビター複合体の測定方法である。
α2−プラスミンインヒビター複合体の測定方法におい
て、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とのいずれか
一方が、ヒトα2−プラスミンインヒビターを特異的に
認識するモノクローナル抗体か又はヒトプラスミノーゲ
ルを認識し、ヒトプラスミンと交叉反応性を有する抗体
（モノ又はポリクローナル抗体）であり、他方が、プラ
スミン−α2−プラスミンインヒビター複合体のネオア
ンチゲンに対する抗体（モノ又はポリクローナル抗体）
であることを特徴とする、プラスミン−α2−プラスミ
ンインヒビター複合体の測定方法である。
ここで、プラスミン−α2−プラスミンインヒビター
複合体のネオアンチゲンとは、プラスミン−α2プラス
ミンインヒビター複合体形成に伴って初めて現れる抗原
をいい、従って、かかるネオアンチゲンに対する抗体
は、そのような抗原を認識するが、ヒトプラスミン又は
α2プラスミンインヒビターとは反応しないか低反応性
を示すという特徴を有する。
複合体のネオアンチゲンとは、プラスミン−α2プラス
ミンインヒビター複合体形成に伴って初めて現れる抗原
をいい、従って、かかるネオアンチゲンに対する抗体
は、そのような抗原を認識するが、ヒトプラスミン又は
α2プラスミンインヒビターとは反応しないか低反応性
を示すという特徴を有する。
次に、本発明によるヒトプラスミン−α2−プラスミ
ンインヒビター複合体の含有量の測定方法を、具体的に
説明する。
ンインヒビター複合体の含有量の測定方法を、具体的に
説明する。
例えば、プラスミン−α2−プラスミンインヒビター
のネオアンチゲンに対するポリクローナル抗体を適当な
不溶性担体に固定化する（固定化抗体）。ついで、不溶
性担体と測定しようとする試薬又は検体試料との非特異
的結合を避けるために、適当な物質で不溶性担体の表面
を被覆する。
のネオアンチゲンに対するポリクローナル抗体を適当な
不溶性担体に固定化する（固定化抗体）。ついで、不溶
性担体と測定しようとする試薬又は検体試料との非特異
的結合を避けるために、適当な物質で不溶性担体の表面
を被覆する。
このようにして得られた固定化抗体と、検体試料を一
定時間及び温度で接触させ反応させる。この間に固定化
抗体と検体試料中のプラスミン−α2−プラスミンイン
ヒビター複合体が結合する。ついで適当な洗浄液で洗つ
た後、適当な標識物質で標識した、例えばヒトα2−プ
ラスミンインヒビターを特異的に認識するモノクローナ
ル抗体（標識抗体）の溶液を、固定化抗体に結合したプ
ラスミンα2−プラスミンインヒビター複合体と、一定
時間及び温度で接触させ、標識抗体と反応させる。また
は、望ましくは、前記の固定化抗体に、同時に検体試料
と、標識抗体の溶液を加え反応させる。これを適当な洗
浄液で洗い、次いで、不溶性担体上に存在する標識抗体
に標識された標識物質の量を測定する。かくしてその値
から、検体試料中のプラスミンα2−プラスミンインヒ
ビター複合体の量を算出することができる。
定時間及び温度で接触させ反応させる。この間に固定化
抗体と検体試料中のプラスミン−α2−プラスミンイン
ヒビター複合体が結合する。ついで適当な洗浄液で洗つ
た後、適当な標識物質で標識した、例えばヒトα2−プ
ラスミンインヒビターを特異的に認識するモノクローナ
ル抗体（標識抗体）の溶液を、固定化抗体に結合したプ
ラスミンα2−プラスミンインヒビター複合体と、一定
時間及び温度で接触させ、標識抗体と反応させる。また
は、望ましくは、前記の固定化抗体に、同時に検体試料
と、標識抗体の溶液を加え反応させる。これを適当な洗
浄液で洗い、次いで、不溶性担体上に存在する標識抗体
に標識された標識物質の量を測定する。かくしてその値
から、検体試料中のプラスミンα2−プラスミンインヒ
ビター複合体の量を算出することができる。
なお、前記第３の方法ではプラスミンではなくプラス
ミノーゲンに対する抗体を用いてプラスミン−α2プラ
スミンインヒビター複合体を測定していること、及びプ
ラスミノーゲンが切断されて活性体のプラスミンとな
り、しかもプラスミノーゲンのＮ末端側77〜790アミノ
酸残基がプラスミンと共通しているとおり、プラスミノ
ーゲンはその構造において約90％ブラスミンと共通して
いることから明らかなように、本発明の上記具体例にお
いて、ヒトα2プラスミンインヒビターを特異的に認識
するモノクローナル抗体の代りにヒトプラスミノーゲン
を認識し、ヒトプラスミンと交叉反応性を有する抗体を
用いる以外には原則的に上記具体例と同様の方法により
プラスミン−α2プラスミンインヒビター複合体を測定
することができる。
ミノーゲンに対する抗体を用いてプラスミン−α2プラ
スミンインヒビター複合体を測定していること、及びプ
ラスミノーゲンが切断されて活性体のプラスミンとな
り、しかもプラスミノーゲンのＮ末端側77〜790アミノ
酸残基がプラスミンと共通しているとおり、プラスミノ
ーゲンはその構造において約90％ブラスミンと共通して
いることから明らかなように、本発明の上記具体例にお
いて、ヒトα2プラスミンインヒビターを特異的に認識
するモノクローナル抗体の代りにヒトプラスミノーゲン
を認識し、ヒトプラスミンと交叉反応性を有する抗体を
用いる以外には原則的に上記具体例と同様の方法により
プラスミン−α2プラスミンインヒビター複合体を測定
することができる。
本発明の測定法に使用される不溶性担体としては、例
えば、ポリエチレン，ポリプロピレン，ポリ塩化ビニ
ル，ポリエステル，ポリアクリロニトリル，弗素樹脂，
架橋デキストラン，ポリサツカライドなどの高分子，そ
の他、紙，ガラス，金属，アガロース及びこれらの組合
せなどを例示することができる。
えば、ポリエチレン，ポリプロピレン，ポリ塩化ビニ
ル，ポリエステル，ポリアクリロニトリル，弗素樹脂，
架橋デキストラン，ポリサツカライドなどの高分子，そ
の他、紙，ガラス，金属，アガロース及びこれらの組合
せなどを例示することができる。
標識物質としては、放射性物質；酵素又は螢光物質を
使用するのが有利である。放射性物質としては、125I，
131I，14C，3Hなど、酵素としてはアルカリフオスフア
ターゼ，パーオキシターゼ，β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
など、また、螢光物質としてはフルオレンセインイソチ
オシアネートなどを使用することができる。
使用するのが有利である。放射性物質としては、125I，
131I，14C，3Hなど、酵素としてはアルカリフオスフア
ターゼ，パーオキシターゼ，β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
など、また、螢光物質としてはフルオレンセインイソチ
オシアネートなどを使用することができる。
本発明のヒトα2プラスミンインヒビターに対するモ
ノクローナル抗体は、例えば、ヒトα2プラスミンイン
ヒビターで免疫したマウスの脾臓細胞と、マウスの骨髄
腫細胞とを融合させて、所望のモノクローナル抗体を産
生するハイプリドーマを得、これをin vivo又はin vitr
oで培養することによつて任意に得ることができる。特
に好ましいのは、（特開昭60−222426号）、ヒトα2プ
ラスミンインヒビター中に存在する、プラスミンの線維
素溶解作用を阻止する部位を特異的に認識し、かかる作
用を抑制するという性質を有するモノクローナル抗体で
ある。
ノクローナル抗体は、例えば、ヒトα2プラスミンイン
ヒビターで免疫したマウスの脾臓細胞と、マウスの骨髄
腫細胞とを融合させて、所望のモノクローナル抗体を産
生するハイプリドーマを得、これをin vivo又はin vitr
oで培養することによつて任意に得ることができる。特
に好ましいのは、（特開昭60−222426号）、ヒトα2プ
ラスミンインヒビター中に存在する、プラスミンの線維
素溶解作用を阻止する部位を特異的に認識し、かかる作
用を抑制するという性質を有するモノクローナル抗体で
ある。
ｅ 作用 かくして、本発明により、血漿検体中に存在する遊離
のプラスミン，プラスミノーゲン，α2プラスミンイン
ヒビター等の挾雑物の影響を全く受けずに、正確に再現
性良く、血漿検体中のヒトプラスミンα2−プラスミン
インヒビター複合体を、特異的に測定することが可能に
なつた。
のプラスミン，プラスミノーゲン，α2プラスミンイン
ヒビター等の挾雑物の影響を全く受けずに、正確に再現
性良く、血漿検体中のヒトプラスミンα2−プラスミン
インヒビター複合体を、特異的に測定することが可能に
なつた。
本発明による測定法が、血漿検体中に存在する遊離の
プラスミン，プラスミノーゲン，あるいはα2−プラス
ミンインヒビター等の挾雑物の影響をうけない理由は次
のごとくである。
プラスミン，プラスミノーゲン，あるいはα2−プラス
ミンインヒビター等の挾雑物の影響をうけない理由は次
のごとくである。
即ち、本発明は、固定化抗体又は標識抗体として、プ
ラスミン−α2−プラスミンインヒビターのネオアンチ
ゲンに対する抗体を用いているため、遊離のプラスミ
ン，プラスミノーゲン，およびα2−プラスミンインヒ
ビターとはまったく反応しない。固定化抗体に結合し
た、プラスミン−α2−プラスミンインヒビター複合体
のα2−プラスミンインヒビター又はプラスミンと、標
識抗体とを反応させ、標識量を測定することにより、高
感度で特異的に、血漿検体中の種々の挾雑物の影響をう
けることなくプラスミン−α2−プラスミンインヒビタ
ー複合体の定量を可能にしたわけである。
ラスミン−α2−プラスミンインヒビターのネオアンチ
ゲンに対する抗体を用いているため、遊離のプラスミ
ン，プラスミノーゲン，およびα2−プラスミンインヒ
ビターとはまったく反応しない。固定化抗体に結合し
た、プラスミン−α2−プラスミンインヒビター複合体
のα2−プラスミンインヒビター又はプラスミンと、標
識抗体とを反応させ、標識量を測定することにより、高
感度で特異的に、血漿検体中の種々の挾雑物の影響をう
けることなくプラスミン−α2−プラスミンインヒビタ
ー複合体の定量を可能にしたわけである。
本発明を、以下実施例によつて説明するが、これによ
つて限定されるものではない。
つて限定されるものではない。
実施例1. EIAによる精製プラスミン−α2−プラスミンインヒビ
ターの測定 （１）精製プラスミン−α2−プラスミンインヒビター
複合体の調整 Edward F.Plow（J.Lab.Clin.Med.93,199（1979））ら
の方法に従がつて精製した。即ち、１のプール血漿を
リジンセフアロースカラム（500ml bed volume）に通過
させ、プラスミノーゲンを除いた血漿を作成した。次
に、この血漿に600mgのプラスミンを含むリン酸緩衝生
食水（10KIU/ml Trasylol含）600μｌを除々に加え反応
させ、その後37℃で10分間放置した。次に、この反応液
を、１のリジン−セフアロースカラムに通し、プラス
ミン−α2−プラスミンインヒビター複合体を十分結合
させ、次いでPBSにてカラムを十分に洗浄した後、0.05M
e−アミノカプロン酸含有PBSでこの複合体を溶出させ、
Ultragel ACA 44カラムにて精製した。
ターの測定 （１）精製プラスミン−α2−プラスミンインヒビター
複合体の調整 Edward F.Plow（J.Lab.Clin.Med.93,199（1979））ら
の方法に従がつて精製した。即ち、１のプール血漿を
リジンセフアロースカラム（500ml bed volume）に通過
させ、プラスミノーゲンを除いた血漿を作成した。次
に、この血漿に600mgのプラスミンを含むリン酸緩衝生
食水（10KIU/ml Trasylol含）600μｌを除々に加え反応
させ、その後37℃で10分間放置した。次に、この反応液
を、１のリジン−セフアロースカラムに通し、プラス
ミン−α2−プラスミンインヒビター複合体を十分結合
させ、次いでPBSにてカラムを十分に洗浄した後、0.05M
e−アミノカプロン酸含有PBSでこの複合体を溶出させ、
Ultragel ACA 44カラムにて精製した。
（２）抗プラスミン−α2プラスミンインヒビター複合
体−ネオアンチゲン抗体の調整 家兎に、（１）で精製した該複合体を1mg,フロインド
完全アジユバンドとW/Oエマルジヨンを作成し、皮下に
投与した。２週間後、該複合体1mgを、フロインド不完
全アジユバンドW/Oエマルジヨンを作成し皮下に投与
し、再度２週間後に投与後、10日目に全血を採取した。
全血より血清を採取し、50％硫安にて沈殿後、10mMのリ
ン酸緩衝液（pH7.2）に透析し、10mMの同緩衝液にて平
衡化したDEAEセルロフアインを用いて抗体のIgG分画を
得た。α2−プラスミンインヒビター固定セフアロース
およびプラスミノーゲン固定セフアロースを通過させ、
抗プラスミン−α2プラスミンインヒビター複合体−ネ
オアンチゲン抗体を得た。
体−ネオアンチゲン抗体の調整 家兎に、（１）で精製した該複合体を1mg,フロインド
完全アジユバンドとW/Oエマルジヨンを作成し、皮下に
投与した。２週間後、該複合体1mgを、フロインド不完
全アジユバンドW/Oエマルジヨンを作成し皮下に投与
し、再度２週間後に投与後、10日目に全血を採取した。
全血より血清を採取し、50％硫安にて沈殿後、10mMのリ
ン酸緩衝液（pH7.2）に透析し、10mMの同緩衝液にて平
衡化したDEAEセルロフアインを用いて抗体のIgG分画を
得た。α2−プラスミンインヒビター固定セフアロース
およびプラスミノーゲン固定セフアロースを通過させ、
抗プラスミン−α2プラスミンインヒビター複合体−ネ
オアンチゲン抗体を得た。
（３）酵素免疫測定法 抗プラスミン−α2プラスミンインヒビター複合体−
ネオアンチゲン抗体を、タンパク濃度20μg/mlになるよ
うにPBSにて調整し、これにポリスチレンボールを加え
て３昼夜浸漬し、抗プラスミン−α2プラスミンインヒ
ビター複合体−ネオアンチゲン抗体固定ポリスチレンボ
ールを得た。
ネオアンチゲン抗体を、タンパク濃度20μg/mlになるよ
うにPBSにて調整し、これにポリスチレンボールを加え
て３昼夜浸漬し、抗プラスミン−α2プラスミンインヒ
ビター複合体−ネオアンチゲン抗体固定ポリスチレンボ
ールを得た。
次に、これを0.5％BSA−PBSにて一夜浸漬した。次
に、精製プラスミン−α2−プラスミンインヒビター複
合体の250,200,150,100,50,25,10,0ng/mlの希釈系列を
生理食塩水溶液にて作成し、各400μｌガラス試験管に
加え、37℃で１時間反応させた。次に、ホースラデイツ
シユペルオキシターゼ（HRP）標識したモノクローナ
ル、抗体（前記特開昭60−222426号の実施例３の1D10C
1）の10.5％BSA・PBS溶液を400μｌ加え37℃で１時間反
応させた。生食水にて洗浄後、HRP用基質液（0.1Mリン
酸／クエン酸緩衝液（pH4.5））中に、ABTS50mg/dlと２
MH2O250μl/dlを含む）400μｌを加え37℃で30分発色さ
せた。
に、精製プラスミン−α2−プラスミンインヒビター複
合体の250,200,150,100,50,25,10,0ng/mlの希釈系列を
生理食塩水溶液にて作成し、各400μｌガラス試験管に
加え、37℃で１時間反応させた。次に、ホースラデイツ
シユペルオキシターゼ（HRP）標識したモノクローナ
ル、抗体（前記特開昭60−222426号の実施例３の1D10C
1）の10.5％BSA・PBS溶液を400μｌ加え37℃で１時間反
応させた。生食水にて洗浄後、HRP用基質液（0.1Mリン
酸／クエン酸緩衝液（pH4.5））中に、ABTS50mg/dlと２
MH2O250μl/dlを含む）400μｌを加え37℃で30分発色さ
せた。
0.2Mシユウ酸水溶液1.0mlで停止反応を行ない、420nm
にて吸光度を測定した。
にて吸光度を測定した。
検量線を第１図に示した。
実施例2. 実施例１の方法に従い、プラスミン−α2プラスミン
インヒビター複合体のない健常人血漿を次のごとく添加
し、健常人血漿に含まれるプラスミノーゲン，およびα
2プラスミンインヒビターの本測定系への阻害効果を調
べた。
インヒビター複合体のない健常人血漿を次のごとく添加
し、健常人血漿に含まれるプラスミノーゲン，およびα
2プラスミンインヒビターの本測定系への阻害効果を調
べた。
精製プラスミン−α2−プラスミンインヒビター複合
体を100ng/mlに固定し、健常人血漿各々1,2,4,10,20,5
0,100倍希釈溶液（最終希釈倍率2,4,8,20,40,100,300
倍）を、各200μｌずつ加え、酵素免疫測定法を行なつ
た。
体を100ng/mlに固定し、健常人血漿各々1,2,4,10,20,5
0,100倍希釈溶液（最終希釈倍率2,4,8,20,40,100,300
倍）を、各200μｌずつ加え、酵素免疫測定法を行なつ
た。
精製プラスミン−α2−プラスミンインヒビター複合
体のみの検量線を基準として、血漿を加えたときの複合
体の測定値の回収率を第１表に示した。第１表に示すご
とく、最終希釈倍率２倍でも、回収率が90％以上であ
り、血漿中のプラスミノーゲン，α2−プラスミンイン
ヒビターの影響がないことが明らかである。
体のみの検量線を基準として、血漿を加えたときの複合
体の測定値の回収率を第１表に示した。第１表に示すご
とく、最終希釈倍率２倍でも、回収率が90％以上であ
り、血漿中のプラスミノーゲン，α2−プラスミンイン
ヒビターの影響がないことが明らかである。
第１図は、プラスミン−α2−プラスミンインヒビター
複合体の測定のための検量線である。
複合体の測定のための検量線である。
Claims (2)
- 【請求項１】サンドイッチ法によるプラスミン−α2プ
ラスミンインヒビター複合体の測定方法において、不溶
性担体に結合した抗体と標識抗体とのいずれか一方が、
ヒトα2−プラスミンインヒビターを特異的に認識する
モノクローナル抗体か又はヒトプラスミノーゲンを認識
し、ヒトプラスミンと交叉反応性を有する抗体であり、
他方が、プラスミン−α2プラスミンインヒビター複合
体のネオアンチゲンに対する抗体であることを特徴とす
る、プラスミン−α2プラスミンインヒビター複合体の
測定方法。 - 【請求項２】標識抗体とヒト血漿検体を不溶性担体に結
合した抗体に、同時に接触させることを特徴とする、特
許請求の範囲第１項記載のプラスミン−α2プラスミン
インヒビター複合体の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8117086A JP2507317B2 (ja) | 1986-04-10 | 1986-04-10 | プラスミン―α２プラスミンインヒビタ―複合体の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8117086A JP2507317B2 (ja) | 1986-04-10 | 1986-04-10 | プラスミン―α２プラスミンインヒビタ―複合体の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62238463A JPS62238463A (ja) | 1987-10-19 |
| JP2507317B2 true JP2507317B2 (ja) | 1996-06-12 |
Family
ID=13738983
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8117086A Expired - Fee Related JP2507317B2 (ja) | 1986-04-10 | 1986-04-10 | プラスミン―α２プラスミンインヒビタ―複合体の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2507317B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2569383B2 (ja) * | 1989-01-19 | 1997-01-08 | 帝人株式会社 | 免疫学的測定方法、試薬及びキツト |
| JP2837030B2 (ja) * | 1992-06-17 | 1998-12-14 | 株式会社ヤトロン | 抗ヒトプラスミン−α▲下２▼−プラスミンインヒビター複合体特異抗体及び免疫学的測定方法 |
-
1986
- 1986-04-10 JP JP8117086A patent/JP2507317B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62238463A (ja) | 1987-10-19 |
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