JPS62238463A - プラスミン―α２プラスミンインヒビター複合体の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ａ　産業上の利用分野 本発明は、汎発性血管向凝固疾患（ＤＩＣ）等の患者血
漿中に存在する、ヒトプラスミン−σ！−プラスミンイ
ンヒビター複合体の測定法に関する。

ｂ　従来技術 ヒトのび！−プラスミンインヒビターは、青水と路弁に
よって最初に単離・精製された。

これは、線維素（フィブリン）溶解酵素であるプラスミ
ンのエステラーゼ活性（１！維素溶解作用）を、瞬間的
に阻害する強力なプラスミンインヒビタ−であり、１１
．７％の糖を含む分子量約６７．０００　　の１本鎖の
糖タンパクであることが知られている（　Ｍｏｒａｌ　
＆　Ａｏｋｉ　；Ｔｈ＠Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　。

２５１．５９５６−５９６５（１９７６ン参照）。この
α２−プラスミンインヒビタ−は、プラスミンの線維溶
解作用を阻止する部位（Ｂ、Ｗｉｍａｎ　＆Ｄ、Ｃｏ１
１ｅｎ　、　Ｊ、Ｂ、Ｃ，２５４、９２９１−９２９７
（１９７９）参照）以外に、カルボキシル基末端側のプ
ラスミン結合部位（Ｂ、Ｗｉｍａｎ　＆Ｄ、Ｃｏ１１ｅ
ｎ　；　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉ　−ａｔｒｙ　、８４，５７３−５７８
（１９７Ｂ）参照）とアミノ基末端のフィブリン結合部
位（Ｙ。

５ａｋａｔａ　、　ａｔ　ａｌ　；　ｓ　Ｔｈｒｏｍｂ
ｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ１６．２７９−２８２（１
９７９）参照）Ｉｋ有している。従って、ヒトｔ０ｔ！
−プラスミンインヒビタ−は、プラスミン活性をほとん
ど婢間的に阻害し、かつプラスミンと１；１の割合で結
合し複合体を形成する（　Ｂ、Ｗｉｍａｎ　＆　Ｄ、Ｃ
ｏ１１ｅｎ；Ｊ、Ｂ、Ｃ，２５４，９２９１−９２９７
（１９７９）参照）。

例えば、ＤＩＣ患者血漿中や、つｐキナーゼによる血栓
溶解療法実施中の患者血漿中では、プラスミンの前駆体
であるプラスミノーゲンの活性化が起こり、生成したプ
ラスミンとα、−プラスミンインヒビタ−が反応して両
者の複合体が形成される。

最近、血漿中のプラスミン−α、−プラスミンインヒビ
ター複合体の定量は、血栓溶解療法のモニターやＤＩＣ
の診断等に有効であると考えられるようになった。モし
℃、このためＫは、血液又は血漿中のプラスミン−α、
−プラスミンインヒビター複合体の量を、正確且つ簡便
に測定する必要がある。従来知られているプラスミン−
α！−プラスミンインヒビター複合体の測定方法として
は、３つの方法がある。第１の方法は、二次元交叉免疫
電気泳動を用いる方法である。第２の方法は、プラスミ
ン−ｄ、−プラスミンインヒビタ−複合体のネオアンチ
ゲンに対する、ポリクローナル抗体を用いたラテックス
凝集法である。第３の方法は、プラスミノーゲンに対す
るポリクローナル抗体と、α２−プラスミンインしビタ
ーに対するポリクローナル抗体を、一方を固定抗体にし
他方を酵素標識抗体にした、酵素免疫測定法である。

Ｃ発明が解決しようとする問題点 しかしながら、第１の方法は、感度と定量性が低いとい
う欠点があり、第２の方法は。

特異性の点で問題がある。また、第３の方法は、感度の
面では良好な方法であるが、以下に述べる様な問題を有
している。即ち、ヒトα２−プラスミンインヒビタ−に
対する一定の活性を有する抗血清を、安定して得ること
が困難なゆえに、測定における再現性にその問題がある
。また、免疫反応が２ステツプであるため（第１段；検
体中の複合体と固相抗体との反応、第２段；固相抗体に
結合した複合体と酵素標識抗体との反応ン、その操作が
煩雑であり、測定に長時間を有するという欠点がある。

煩雑な２ステツプの操作なよぎなくされる理由として、
血漿中に存在する遊離のプラスミノーゲン（プラスミン
の前駆体）とｄ、−プラスミンインヒビタ−は、免疫測
定法を阻害する因子であり、かつこれらの因子は血漿中
において、一般的に、プラスミン−α。

−プラスミンインヒビタ−複合体に比して多量に存在す
るという事実が存在する。それ故に２ステツプに分けて
、これらの影響を除く必要があるのである。従って、簡
便な１ステツプの方法をとると、その測定値の正確性な
らびに再現性を犠牲にしてしまうことになる。

ｄ　問題点を解決するための手段 本発明者らは、かかる事情に鑑みて、ヒトプラスミン−
ａ２−プラスミンインヒビタ−複合体を、簡便な１ステ
ツプ法で、正確に再現性良く定量する方法を開発すべく
鋭意研究の結果１本発明に到達した。

即ち、本発明は、サンドイツチ法によるプラスミン−ｄ
２−プラスミンインヒビタ−複合体の測定方法において
、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とのいずれか一
方が、ヒトα２−プラスミンインヒビタ−を特異的に認
識するモノクローナル抗体か又はヒトプラスミノーゲン
を特異的に認識する抗体（モノ又はポリクローナル抗体
）であり、他方が、ブラスミンーｄ、−プラスミンイン
ヒビタ−のネオアンチゲンに対する抗体（モノ又はポリ
クローナル抗体）であることを特徴とする、プラスミン
−α、−プラスミンインヒビター複合体の測定方法であ
る。

次に、本発明によるヒトプラスミン−α、−プラスミン
インヒビター複合体の含有量の測定方法を、具体的に説
明する。

−例えハ、プラスミンーα、−プラスミンインヒビタ−
のネオアンチゲンに対するポリクローナル抗体を適当な
不溶性担体に固定化する（固定化抗体）。ついで、不溶
性担体と測定しようとする試薬又は検体試料との非特異
的結合を避けるためＫ、適当な物質で不溶性担体の表面
を被覆する。゛ このようにして得られた固定化抗体と、検体試料を一定
時間及び温度で接触させ反応させる。この間に固定化抗
体と検体試料中のプラスミン−αｔ−プラスミンインヒ
ビタ−複合体が結合する。ついで適当な洗浄液で洗った
後、適当な標識物質で標識した、例えばヒトα２−プラ
スミンインヒビタ−を特異的に認識するモノクローナル
抗体（標識抗体）の溶液を、固定化抗体に結合したプラ
スミンｄ、−プラスミンインヒビタ−複合体と、一定時
間及び湿度で接触させ、標識抗体と反応させる。

または、望ましくは、前記の固定化抗体に、同時に検体
試料と、標識抗体の溶液を加え反応させる。これを適当
な洗浄液で洗い１次いで、不溶性担体上に存在する標識
抗体に標識された標識物質の量を測定する。かくしてそ
の値から、検体試料中のプラスミンｄ、−プラスミンイ
ンヒビタ−複合体の量を算出することができる。

本発明の測定法に使用される不溶性担体としては１例え
ば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、
ポリエステル、ポリアクリロニトリル、弗素樹脂、架橋
デキストラン、ポリサッカライドなどの高分子、その他
、紙、ガラス、金属、アガロース及びこれらの組合せな
どを例示することができる。

標識物質としては、放射性物質；酵素又は螢光物質を使
用するのが有利である。放射性物質としては　１２５　
■、　１３１　Ｉ、　＋４（、３Ｈなど、酵素としては
アルカリフオスファクーゼ、パーオキシターゼ、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼなと、また、螢光物質としてはフル
オレンセインインチオシアネートなどを使用することが
できる。

本発明のヒトαｔ−プラスミンインヒビタ−に対するモ
ノクローナル抗体は、例えば、ヒトαｔ−プラスミンイ
ンヒビタ−で免疫したマウスの肺臓細胞と、マウスの骨
髄腫細胞とを融合させて、所望のモノクローナル抗体を
産生ずるハイプリドーマな得、これをｉｎ　ｖｉｖ。

又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ　　で培養することによって任意
に得ることができる。特に好ましく・のは、（特開昭６
０−２２２４２６号）、ヒトａ、　−プラスミンインヒ
ビタ−中に存在する、プラスミンの線維索溶解作用を阻
止する部位な特異的Ｋｇ識し、かかる作用を抑制すると
いう性質を有するモノクローナル抗体である。

ｅ　作用 かくして、本発明により、血漿検体中に存在する遊離の
プラスミン、プラスミノーゲン。

α２−プラスミンインしビター等の挟雑物の影響を全く
受けずに、正確に再現性良く、血漿検体中のヒトプラス
ミンαｔ−プラスミンインヒビタ−複合体を、特異的に
測定することが可能になった。

本発明による測定法が、血漿検体中に存在する遊離のプ
ラスミン、プラスミノーゲン。

あるいはα！−プラスミンインヒビター等の挟雑物の影
響をうけない理由は次のごとくである。

即ち、本発明は、固定化抗体として、プラスミン−α、
−プラスミンインヒビタ−のネオアンチゲンに対する抗
体を用いているため。

遊離のプラスミン、プラスミノーゲン、およびα？−プ
ラスミンインヒビターとはまったく反応しない。固定化
抗体に結合した、プラスミン−ｄ、−プラスミンインヒ
ビタ−複合体のｄ！−プラスミンインヒビタ−と、標識
抗体とを反応させ、ｓＲ量を測定することｋより、高感
度で特異的に、血漿検体中の秤々の挾雑物の影響をうけ
ることなくプラスミン−α、−プラスミンインヒビター
複合体の定量を可能にしたわけである。

本発明な、以下実施例によって説明するが。

これによって限定されるものではない。

実施例１゜ ＥＩＡによるＷｔ裂プラスミン−α、−プラスミンイン
ヒビタ−の測定 ＋１１　　精製フラスミンーα２−プラスミンインヒビ
ター複合体の調整 Ｅｄｗａｒｄ　Ｆ、Ｐｌｏｗ（Ｊ、Ｌａｂ、Ｃｌ１ｎ、
Ｍｅｄ、　９３　、１９９（１９７９））　　もの方法
に従がって精製した。

即ち、ＩＩＩのプール血漿をリジンセファ０−スカラム
（５００ｄ　ｂｅｄ　ｖｏｌｕｍｅ　）　　Ｋ通過させ
、プラスミノーゲンを除いた血漿を作成した。次忙、こ
の血漿Ｋ　６００　ｍｃＩのプラスミンを含むリン酸緩
衝生食水（１０ＫＩＵ／ｍＴｒａｓｙｌｏｌ含）６０’
ＯｐＪを除々に加え反応させ、その後３７℃で１ｏ分間
放置した。次に、この反応液を、Ｉｇのりジンーセファ
ｐ−ス力ラムＫＡＬ、プラスミン−α２−プラスミンイ
ンヒビタ−複合体を十分結合させ、次いでＰＢＳにてカ
ラムな十分に洗浄した後、０．０５Ｍｇ−７ミノカブロ
ン酸含有ＰＢＳでこの複合体を溶出させ、Ｕｌｔｒａｇ
ｅｌ　ＡＣＡ　　４４力５　ムにて精製した。

（２１抗７’ラスミン−ｄ、プラスミンインヒビタ−複
合体−ネオ７ンチグン抗体の調整 家兎に、（１）で精製した該複合体を１１１ｇ、　７０
インド完全アジユバントとＷ１０エマルジョンを作成し
、皮下に投与した。２週間後、該複合体１ｉＩｇを、ツ
ーインド不完全７ジユバンドＷ１０エマルジョンを作成
し皮下に投与し、再度２週間後に投与後、１０日目に全
血を採取した。全血より血清を採取し、５０％硫安にて
沈殿後、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）ＩＣ透
析し、１０ｍＭの同緩衝液にて平衡化したＤＥＡＥ　　
セルロファインを用いて抗体のＩｇＧ分画を得た。α、
−プラスミンインヒビター固定セファロースおよびプラ
スミノーゲン固定セファロースな通過させ、抗プラスミ
ン−α、プラスミンインヒビター複合体を得た。

（３）　　酵素免疫測定法 抗フラスミンーα！プラスミンインヒビタ−複合体ネオ
７ンチゲン抗体を、タンパク濃度２０μｍ１７ｄＫなる
ようＫＰＢＳ　ｉｃてａ整ｔ、、これにポリスチレンボ
ールを加えて３昼夜漫ｆｆ１Ｌ、抗プラスミン−α！プ
ラスミンインヒビター複合体ネオ７ンチゲン抗体固定ポ
リスチレンボールを得た。

次に、、：れを０．５％ＢＳＡ−ＰＲ８Ｋて一夜浸漬し
た。次に、精製プラスミン−α、−プラスミンインヒビ
ター複合体の２５０，２００゜１５０．１００，５０，
２５，１０，０１１１１／ｄの希釈系列を生理食塩水溶
液にて作成し、各４００μ！　ガラス試験管に加え、３
７℃で１時間反応させた。次に、ホースラディッシュベ
ルオキシターゼ（ＨＲＰ　）標識したモノクローナル抗
体前記特開昭６０−２２２４２６号の実施例３１７）Ｉ
ＤＩＯＣＩ　（７）０．５１ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を４０
０　ｐｉ加え３７℃で１時間反応させた。

生食水にて洗浄後、ＨＲＰ用基質液（０，１Ｍリン酸／
クエン酸緩衝液（ｐＨ４，５））中に、ＡＢＴ８５０１
１９／ｄＪと２　ＭＨ，０２５０ｐｉ　／　ｄｉ　　ｆ
ｔ含む）４００μｌを加え３７℃で３０分発色させた。

０．２　Ｍシュウ酸水溶液１．Ｑｍ／で停止反応を行な
い、４２０ｎｔｎｌＣて吸光度を測定した。

検ｔｉ＄ｌｉ！を第１図に示した。

実施例２゜ 実施例１の方法に従い、プラスミン−α２プラスミンイ
ンヒビタ−複合体のない健常人血漿を次のごとく添加し
、健常人血漿に含まれるプラスミノーゲン、およびα２
−プラスミンインヒビタ−の本測定系への阻害効果を調
べた。

精Ｍ　７’ラスミンーα！−プラスミンインヒビタ−複
合体なｉ　ｏ　ｏ　＋Ｊ　／　”に固定し、健常人血漿
各々１．２．４．１０，２０，５０，１００　　倍希釈
溶液（最終希釈倍率２．４．８．２０，４０゜１００．
２００倍）を、各２００　ｐｉずつ加え、酵素免疫測定
法を行なった。

精製フラスミンーα、−プラスミンインヒビタ−複合体
のみの検量線を基準として、血漿を加えたとぎの複合体
の測定値の回収率を第１表に示した。第１表に示すごと
く、最終希釈倍率２倍でも、回収率が９０％以上であり
、血漿中のプラスミノーゲン、α２−プラスミンインヒ
ビタ−の影響がないことが明らかである。

第１表

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミン−α、−プラスミンインヒビター
複合体の測定のための検−Ｊｌｌ線である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、サンドイツチ法によるプラスミン−α＿２−プラス
   ミンインヒビター複合体の測定方法において、不溶性担
   体に結合した抗体と標識抗体とのいずれか一方が、ヒト
   α＿２−プラスミンインヒビターを特異的に認識するモ
   ノクローナル抗体か又はヒトプラスミノーゲンを特異的
   に認識する抗体であり、他方が、プラスミン−α＿２−
   プラスミンインヒビターのネオアンチゲンに対する抗体
   であることを特徴とする、プラスミン−α＿２−プラス
   ミンインヒビター複合体の測定方法。 ２、標識抗体とヒト血漿検体を不溶性担体に結合した抗
   体に、同時に接触させることを特徴とする、特許請求の
   範囲第１項記載のプラスミン−α＿２−プラスミンイン
   ヒビター複合体の測定方法。