JPS6120867A - 抗体‐レクチンのサンドイツチ検定 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 及咀二分！ 本発明は、一般に、診断法に関し、とくに検定すべき物
質に対して特異性の成分、および標識付けのために非特
異性の成分を使用する方法を提供する。

良豆ム背Ｉ 特定された抗原（動物の中へ導入されると、それと特異
的に免疫学的に反応することができる抗体の生産を刺激
する物質として定義される）、ハプテン（動物の中に導
入してそれに対して特異性の抗体の生産する前に追加の
補助物質を必要をする物質）、および類似の物質（以後
集合的に「配位子」と呼ぶ）゛を体液、例えば、血液、
唾液、尿などの中において検出することは、最近、研究
および臨床的環境の両者において最も重要となってきた
。このような配位子の検出は、しばしば種々の病気の状
態に関係づけることができ、結局、診断ならびに病気の
発生に関する基本的理解を使用することならびにその治
療の効果を監視することにおいて極めて重要である。

したがって、水性試料中の配位子を検出するための改良
された方法は、絶えず探究されている。

とぐに、このような方法および検定は、それらの速度お
よび用いる設備、ならびにそれらの感度により特徴づけ
られる。好ましい検定は、努力を要しないで短時間に実
施することができるものであり、そしてより大きい感度
により特徴づけられる。これらの面は、もちろん、コス
トによって調節され、一般に前記検定を製作するとき関
連する困難によって調整される。

本発明の目的は、性質が簡単であり、それゆえコストを
低くして一層容易に製作される、臨床および研究実験室
における使用に適する感度を有する一般的および特別の
検定を提供することである。

−・殻に免疫検定は、タンパク質、例えば、抗体、抗体
断片、あるいはさらには抗体結合部位をまねる人工的に
発生されたペプチド［以後、集合的に［配位子結合相手
Ｊ　　（１ｉｇａｎｄ　　ｂｉ　ｎｄｉｎｇ　　ｐａｒ
ｔｎｅｒｓ）と呼ぶ］およびそれらが特異性である物質
、すなわち、配位子の間の免疫学的反応に基づく、免疫
学的反応は、その高い特異性により特徴づけられ、それ
ゆえ、多数の図式（ｓｃｈｅｍｅ）がこの特性の利点を
使用するための開発されてきてい、る。典型的には、こ
のような図式は精製された抗原または配位子を測定され
る配位子、および標識されかつ固定化された配位子結合
相手；またはそれらと反応性の多数の固定化されかつ生
成物結合された配位子結合相手および配位子と対抗させ
るために必要とする。

配位子結合相手上の結合部位について試料の配位子と対
抗させる（ｃｏｍｐｅｔｅ　　ｗｉｔｈ）ために精製さ
れた配位子を必要とする技術は、十分に無傷であってそ
の特異的結合相手との結合を許す形態で精製された配位
子を生産するために、困難なかつ経費がかかる製造方法
を不利なことには伴う。小さくかつ−・般に特性づけら
れない配位子とともに生産の困難性は悪化する。

本発明の目的は、それぞれのｒメイト（ｍａｔｅ）」の
ための配位子または配位子結合相手間の対抗に依存しな
い検定方法を提供することである。

伝統的な不均質前進検定（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ
　　ｆｏｒｗａｒｄ　　ａｓｓａｙ）において、固定化
された配位子または配位子結合相手（以後、配位子また
は配位子結合相手は、これらの成分のいずれかが試料中
において検定されうるので、互換的に使用し、配位子が
検定されている場合、それは配位子結合相手と結合しつ
つあり、そして逆もまた真であることが理解される）は
固相上に固定される。このような固相は、種々の形態を
取ることができ、そして、例えば、微小粒子、プラスチ
ック表面、例えば、微小力価のウェル（ｗｅ　Ｉ　ｌ）
　、パドル、微小粒子、巨大粒子などを包含する。

本発明の目的は、このような種々の固相とともに有利に
使用することができる検定を提供することである。

試料を次いで固定化された配位子結合相手と接触させ、
モして配位子は、試料中に存在する場合それらと特異的
に反応し、それらはそれら自体固定化される。未反応の
成分は典型的には除去され、引き続いて、配位子上の異
る抗原決定因子（すなわち、結合部位）に対して特異性
であるか、あるいは、固定化された（およびこうして配
位子の存在による反応から遮断された）配位子結合相手
上の結合部位に対して特異性である標識された配位子結
合相手が添加される。

第２配位子結合相手は、典型的には、直接にあるいは間
接にそれと会合（ａｓ５＋）ｃｉａｔｅｗｉｔｈ）した
検出可能な実在物を有する。このような検出可能な実在
物は、蛍光分子、化学ルミオセンス分子、酵素、アイソ
トープ、微小粒子などを包含する。これらの第２標識結
合相手は固定化された成分との反応することができ、引
き続いて、未反応成分は除去される。固相または水相と
会合した検出可能な実在物は、検出され、モしてもとの
試料中の配位子の存在に関係づけられる。

平均の実験室の技術者はこのような技術に非常に精通し
ており　本発明の他の目的はこのレベルの熟知および受
容性に基づいて利用することである。。

配位子結合相手は、それが抗体またはその断片である場
合、このような抗体の入手可能性、それらの特異性、結
合活性（ａｖｉｄｉｔｙ）特性に依存してポリクロナル
またはモノクロナルの起源であることができる。

しかしながら、このような従来の前進検定は、予決定因
子配位子、およびこうして異る特異性の多数の抗体の選
択、精製および生産を必要とする。抗体の１つは標識付
けられなくてはならないので、追加の成分は間接的標識
付けを必要とし、あるいは、直接標識付けの場合におい
て、第２結合相手の劣った免疫学的特性をしばしば生ず
る化学的操作を必要とする。結局、弱化した反応性によ
り、および回避することがしばしば非常に困難である非
特異性反応により、最適な感度はしばしば大きく傷害さ
れる。確かに、注意した合致した抗体対を得ることに関
連するコストおよび複雑さはそれらの開発をかなり妨害
する。さらに、ある配位子について少なくとも１つの「
許容されうる」　（特異性、結合活性などの特性に基づ
いて）特異性モノクロナル抗体を得ることは通常可能で
あるが、同一・配位子上の異るエピトープに対する１よ
り多い許容されうる抗体を得る困難のレベルは劇的に大
きくそして、もちろん、１つの単一・のエピトープを有
する小さい配位子では不可能である。

本発明のなお多の目的は、免疫学的対に頼らない前進、
不均質検定方法を提供することである。

本発明のなおさらに他の目的は、免疫学的反応に頼らな
い標識材は剤を提供することである。　　・ある検定に
おいてレクチンを使用するいくつかの試みがなされてき
た。例えば、ドイル（Ｄｏｙｌｅ）らへの米国特許第４
．２９８．６８９号は、Ｎ−アセチルグルコサミンに対
する親和性を有する植物のレクチンを利用するネイセリ
ア・ゴノルヘアエ（Ｎｅｉｓｓｅｌｉａ　　ｇｏｎｏｒ
ｒｈｏｅａｅ）についての試験を記載している。ネイセ
リア・ゴノルヘアエ（Ｎｅｉｓｓｅｌｉａｇｏｎｏｒｒ
ｈｏｅａｅ）微生物を植物レクチンと直接接触させ、そ
して前記微生物の表面上に形成された反応生成物の存在
を前記有機体の存在の仮定的証拠として使用する。この
試験は植物レクチンの非常に特異的型すなわちＮ−アセ
チルグルコサミンに対して特別の特異性を有するレクチ
ンに頼る。実際には、米国特許第４，２９８，６８９号
の方法は、レクチンをあたかもそれが色素であるかのよ
うに使用する。実施された免疫学的選択の方法は存在せ
ず、それゆえ、米国特許第４゜２９８．６８９号の方法
は非常に限定された融通性を提供する。

本発明の１つの目的は、より広い範囲の配位子の検出の
ためにより特定の方法、およびレクチンにより提供され
る利点を利用することである。

アダチ（Ａｄａｃｈｉ）へｃ７）米国特許第４，３８９
．３９２号は、米国特許第４，２９８，６８９号の方法
と同様な欠点を有し、特定のレクチンを使用し、前記レ
クチンは腫瘍に関連するグリコ結合含有物質を検出する
ために末端β１またはβ１−４−Ｎ−アセチルグルコサ
ミンまたは−Ｎ−アセチルガラクトサンミンと結合する
。しかしながら、米国特許第４．３８９．３９２号の方
法は、免疫学的系により提供される特異性の利点を利用
することができない。

こうして、試薬の利用および融通性を最大にする原理と
して、本発明の目的は、免疫グロブリンおよびレクチン
の両者を利用して、各々により提供される利点の組み合
わせを得ることである。

チ、−（Ｃｈｕ）への米国特許第４，２８９゜７４７号
および同第４，３７１，５１５号は、レグチンを用いる
異るアプローチを利用する。

チューはレクチンを免疫グロブリンと複合化し、次いで
糖に対するレクチンの親和性を利用して、例えば、糖が
不溶性化されるときのように、複合体を固定化する。こ
のアプローチの他の変更も記載されているが、それらは
複雑化した図式をもつレクチンの複合体または多数の免
疫グロブリンを不利なことには伴う。

本発明のさらに他の目的は、レクチンを用いる検定の構
成における複雑性、例えば、チューが記載するものを回
避することである。

本発明のなおさらに他の目的は、免疫グロブリンに対し
て複合化せずかつ免疫学的に反応した成分を不溶性化す
るために用いられないレフ太ンを使用することである。

本発明のなおそれ以上の本発明の目的は、レクチンおよ
び単一の免疫学的に特異性の成分のみを用いる比較的簡
単な検定法を提供することである。

本発明のなおさらにそれ以上の目的は、非免疫学的であ
るが、特異的に反応性の成分、例えば、コファクターお
よび受容体をレクチンと一緒に使用する検定法を提供す
ることである。

良豆五ｌ豹 本発明の原理および目的に従えば、水性試料から検定す
べき物質を特異的に選択するために固定化された免疫学
的に活性な成分を使用する検定法が提供される。未反応
の成分は好ましくは除去され、そして引き続いて、非特
異性の標識剤（ｌａｂｅ　ｌ　ｅｄ　　ａｇｅｎｔ）を
添加して非免疫学的機構を介してそれと反応させる。未
反応剤を好ましくは除去し、そして前記剤に関連する標
識を固相または水相中において検出し、モしてもとの試
料中の決定すべき物質または配位子の存在に関係づける
。

標識剤は反応のために免疫学的プロセスに頼らず、製造
が簡単であり、現在使用されている物質、例えば、免疫
学的対の第２抗体よりも長い貯蔵寿命を有し、そして特
定のクラスの配位子とともに一般に使用することができ
、こうしてそうでなければ種々の検定を実施することが
必要である特異的試薬の数を減少させる。ここで使用す
るとき、「非特異性」という用語は、標識剤、理想的に
はレクチンを修飾しかつ記載するために使用する。なぜ
なら、レクチンは選択的反応性のために免疫学的原理に
頼らないからである。こうして、免疫グロブリンに比較
して、それは決定すべき配位子の部分であるか否かにか
かわらず、それぞれの糖残基（または複数の残基）と反
応するであろう。しかしながら、異るレクチンは異る糖
残基と反応性であり、それにもかかわらず複数の糖残基
が利用可能であるとき、より高いレベルの結合をしばし
ば明らかにする。

添付図面を参照すると、本発明の原理および範囲はさら
に理解されるであろう。

゛よび　　　　°　・　な・ 特定の抗原に対して特異性のポリクロナル抗体の生産に
ついての免疫学的手順は、よく知られており、そしてこ
こで繰り返す必要はないであろう。同様に、コーラ−（
Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ）の方法に従う特定の抗原に対′して特異性のモノク
ロナル抗体を得るための手順は、また、よく知られてい
る。このような方法を用いて所望の特異性および固相へ
の免疫化のための結合活性をもつ抗体を得ること力゛で
きる。免疫化技術は選択した固相の性質に大きく依存す
るが、また典型的にはよく知られおりず、そしてここで
それ以上説明を要しないであろう。

問題の配位子に対して特異性の抗体または抗原断片を固
相中に固定化し、次いで検出すべき配位子を含有する水
性試料を固定化された配位子結合相手と、それらの間の
免疫学的反応を許すために適当な条件下で接触させる。

このような条件は、もちろん、この分野に精通している
者には知られており、そして一般に、濠度、体積、成分
間の距離、生理学的ｐＨなどをかんかみて、例えば、室
温、適当な反応時間を包含する。試料中に存在する所望
の配位子の免疫学的固定化を許すために十分な時間の間
装面上へ接触させた後、水性試料およびその中に含有さ
れる未反応の成分を、サイホン、ダンピング（ｄｕｍｐ
ｉ　ｎｇ）、吸い取り、洗浄または他の機械的手段によ
り除去することが好ましい。容易に理解されるように、
未反応成分の除去におけるすぐれた技術は非特異的反応
および感度の増大である。

その後、非特異的標識剤を固相と接触させ、そしてそれ
と会合する配位子と接触させ、そして反応させる。非特
異的剤は好ましくは存在する場合配位子とのみ反応し、
かつ固定化された配位子結合相手と反応しないように構
成され、これにより有利には非特異的反応を回避し、そ
して感度を増大させる。

一般に従来の検定に従い、標識はこの目的に入手可能な
種々のマーカー（ｍａｒｋｅｒ）から選択され、前記マ
ーカーは蛍光分子、゛リン光分子。

化学ルミネセンス分子、放射性同位元素および微小寸法
または巨大寸法の天然の重合体粒子、光散乱粒子および
酵素を包含する。酵素では、上の工程を実施した後、基
質を添加し、その上に酵素が作用して検出可能な生産物
を生産することができるようにしなくてはならない。あ
るいは、標識を結合相手と会合させることができ、そし
てこれは実施例１の手順により例示されるようにいわゆ
る間接的標識フォーマットにおいて非特異性剤と特異的
に反応する。しかしながら、この道筋は一般に試薬およ
びプロセスの工程の数および複雑性が増加するために好
ましさに劣る。むしろ、かつ本発明の目的に従えば、非
特異性剤は、安価な装置、例えば、実施例２に記載され
るような装置を用いる円滑な検出を可能とする標識で、
それ自体直接標識付けされる。

好ましい実施態様において、標識材は系は蛍光分子、例
えば、フルオレセイン、ローダミンなどにより生成され
る蛍光に頼るものであろう。あるいは、非特異性剤に結
合したセイヨウワサビのペルオキシダーゼ酵素を用いる
簡単な酵素系をエリザ（ＥＬＩＳＡ）！検出系の方法に
おいて使用することができる。その後、Ｏ−フェニレン
ジアミンを基質として供給し、そしてほぼ４９０ｎｍに
おける光学濃度の測定により検出される生産物の出現に
より検出する。

本発明は、特定的には、糖タンパク質、グリコペプチド
、炭水化物、糖脂質のような配位子の検出を考え、これ
らはレクチンにより認識される第残基の少なくとも１つ
を含有する。固相の配位子結合相手、好ましくはその特
異性を注意して適合させるようにつくることができるの
でモノクロナル起源の抗体を、配位子中のタンパク質、
炭水化物、ペプチドまたは脂質主鎖のある部分に対する
その特異性に従って選択する。対照的に、本発明の第２
剤またはレクチンは、それがすべての利用可能な露出し
た糖残基へ結合するという意味において「非特異性」で
あり、レクチンは前記第残基と通常特異的に結合しかつ
試料中に存在することができる。好ましい非特異性剤は
、なかでもヒラマメ（ｌｅｎｔｉｌ）レクチン、落花生
レクチン、・コンコナバリンＡ、または小麦胚レクチン
（またはアグルチニン）のようなレクチンを包含する。

レクチンの「特異性」の欠如、すなわち、それは配位子
と非配位子との間ではなく糖残基の間のみを識別するた
め、標識レクチンの添加前の分離工程を実施して、試料
中に存在する免疫学的に反応しなかった物質を含有する
他の糖残基との非特異性反応を減少することが有利であ
る。望まない成分の除去を促進する適当な洗剤および塩
の濃度を有する適当な洗浄を用いることにより、それ以
上の非特異的反応性を制限しあるいは完全に排除するこ
とができる。これに関するそれ以上の理解は、ここに提
供される実施例を参照することにより得られるであろう
。

好ましい実施態様および実施例はモノクロナル免疫グロ
ブリンにより提供される特異的を利用するが、他の特異
的結合部分、例えば、分析物（ａｎａｌｙｔｅ）受容体
、コファクターおよび補体成分が考えられる。

スロアンーケッターリング・キャンサー・センター（Ｓ
ｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｒｉｎｇ　　Ｃａｎｃｅｒ　　
Ｃｅｎｔｅｒ）のウェブ（Ｕｅｄａ）らは、腎の癌の確
立された培養系統で免疫化したマウスの牌細胞の融合か
ら誘導される１７のモノクロナル抗体の単離および反応
性を記載した［マウスのモノクロナル抗体により規定さ
れるヒト腎癌の細胞表面抗原（Ｃｅｌｌ　　Ｓｕｒｆａ
ｃｅＡｎｔｉｇｅｎｓ　　ｏｆ　　Ｈｕｍａｎ　　Ｒｅ
ｎａｌ　　Ｃａｎｃｅｒ　　Ｄｅｆｉｎｅｄ　　ｂｙ　
　Ｍ。

ｕｓｅ　　　Ｍｏｎｃｌｏｎａｌ　　　Ａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ）：組織特異性腎糖タンパク質の同定（Ｉｄｅｎ
ｔｆｆｆｃａｔｆｏｎ　　ｏｆ　　ＴｆＳｓｕｅ−ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃ　　Ｋｉｄｅｎｙ　　Ｇｌｙｃ。

ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、プロシーディンゲス・オブ・アカ
デミ−やサイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔ１、　　
Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、）、Ｖｏ１、７８：５１２２−
５１２６．１９８１１．ウェブらにより発見された抗体
の２つ、Ｓ２３およびＳ２７、はウェブらにより発見さ
れたは、トンプソン（Ｔ　ｈ　ｏｍｐ　ｓ　ｏ　ｎ）ら
への「シェド正常組織抗原による病気の診断（Ｄｉｓｅ
ａｓｅ　　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　　ｂｙ　　Ｄｅｔｅｃ
ｔｉｏｎ　　。

ｆ　　５ｈｅｄ　　Ｎｏｒｍａｌ　　Ｔｉ５ｓｕｅ　　
Ａａｔ　ｉ　ｇｅｎＳ）Ｊと題する係属中の米国特許出
願の首題である。これらの抗体をまたここの実施例にお
いて使用したが、本発明はこれらの特定の抗体の使用に
いかなる方法においても限定されないことを理解すべき
÷ある。前述の出願は抗体を完全に記載しているが、梅
景をまたここに便宜上提供する。Ｓ２３およびＳ２？抗
体は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ７
’（ＡＴＣＣ）（ｔ　ｈｅ　　Ａｍｅｒｉｃａｎ’　　
Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
）それぞれＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ８５４０およびＡＴＣＣ
Ｎ　ｏ　、ＨＢ８４２８として、受託されているハイブ
リドーマの細胞系統の結果である。（ウェブらの上に引
用した文献はＳ６抗体を記載しており、前記抗体はＳ２
？を引き続いて置換され、後者の抗体はＳ６抗体と実質
的に同一の反応性を有するが、好ましい結合特性を有し
、それゆえここにおいて好ましい、） Ｓ２９およびＳ２？抗体およびそれらの同等物は、また
、表１に記載するようにＡＴＣＣまたはメモリアルース
ロアンーケッターリング・キャンサー・センター（Ｍｅ
ｍｏｒｉａｌ　　Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ　　
Ｃａｎｃｅｒ　　Ｃｅｎｔｅｒ）のいずれから入手可能
なある数の細胞系統とのそれらの反応性によって特徴づ
けられ”る。

簡単に述べると、Ｓ２３抗体はヒト腎臓中の近接細管の
上積組織の細胞との観測された凍結組織の区画の反応性
を有する免疫化細胞系統５Ｋ−ＲＣ−７（腎の癌）から
形成されたＩ　ｇＧ、アイソタイプである。Ｓ２？抗体
はＳ２ａに類似するが、またヒト胃中のヘンレ（Ｈｅｎ
ｌｅ）のループのある凍結組織部分と反応することがわ
かる。

反応性は免疫蛍光着色技術および直接顕微鏡観察により
決定された。両者の抗体は１２０，００００の分子量の
糖タンパク質を同定し、そして他のヒトの組織との交差
反応性が最小であることを明らかにする。ＳＯＢおよび
Ｓ２？抗体は、複合化されていない形態で個々に商業的
に商標０ＲＴＨＯＵＲ９−４ａおよび０ＲＴＨＯＵＲＯ
−４のもとて本出願人から入手可能である。

＋　　　＋　　　十＋ｌ　　　　ｌ　　　＋＋＋１＋１ コ　　　ｌ　　　　１　　　１ コ　　ト 國　　虫 ＋Ｉ　　　　　　　１＋十 ＋＋＋＋＋ ｕ”＋ｔｎ　　　　ば）ｕ’＋　　　　ｌｊ’）＋＋＋
＋＋ ０　　　ＯＮ′）　　　り　　の （至） 個 弗 べ 屁 謳 娯 距 促 丙 駅 転 （至） 台 セ 文隻負」 ネズミのモノクロナル抗体は発生は、前述のウエダ（Ｕ
ｅｄ、ａ）らの文献中に詳述されている。

簡単に述べると、（ＢＡＬＢ／ｃＸｃ５７ＢＬ／６）Ｆ
ｌマウスを確立された胃癌細胞系統で免疫化した。肺細
胞を収穫し、そしてポリエチレングリコールの存在下に
ＭＯＰＣ−２１ＮＳ／ｌと融合させた。ハイブリドーマ
の培養物を、安定な系統が得られるまで希釈を限定する
ことによりクローニングした。抗体を表１に記載する細
胞のパネルおよび組織の棟木に対して特徴づけた。スイ
ス（Ｓｗｉｓｓ）バックグラウンド（ｂａｃｋｇｒ　ｏ
　ｕ　ｎ　ｄ）のｎ　ｕ　／　ｎ　ｕマウスの中にハイ
ブリドーマ系統を皮下的に注入することにより、腹水症
を生成させた。

■、　モノクロチルド　の アイ（Ｅ　ｙ）ら、免疫化学（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）１５：４２９−３６．１９７８およびセラパ
ラ（Ｓｅｐｐａｌａ）ら、スカンジナビアン会ジャーナ
ル拳オブ・イムノロジー（Ｓｃａｎｄ、　　Ｊ、　　Ｉ
ｍｍｕｎｏ１、）１４：３３５−４２．１９８１の方法
に従いタンパク質Ａ親和性カラムを使用して、Ｓ２？を
腹水タンパク質から精製した。抗体をカラムから０．０
１モルのクエン酸塩緩衝液、ｐＨ４，５で溶離した。あ
るいは、抗体は、プルツク（Ｂ　ｒ　ｕ　ｃ　ｋ）ら。

ジャーナルーオブーイムノロジカル拳メソッズ（Ｊ、ｏ
ｆ　　Ｉｍｍｕｎｏ１、　　Ｍｅｔｈｏｄｓ）５３：３
１３−１９．１９８２）の手順により、ＤＥＡＥ　　Ａ
ｆｆｆ−Ｇｅｌ　　ブルー・カラムで精製することがで
きる。抗体の活性を腎細胞系統、５Ｒ−ＲＣ−７、に対
して２工程の免疫蛍光手順により、フルオレセイン標識
材はヤギ抗マウスＩｇＧを使用して監視した。蛍光の強
さの評価はオーツ・スペクトラム（ＯＲＴＨＯＳ　ｐ　
ｅｃｔｒｕｍ）ｍ＠を使用して実施した。

当業者は容易に理解するように１種々の変更および置換
を検出すべき配位子の型、非特異性結合成分および、と
くに、異る型のレクチンに関して、本発明の精神または
範囲を逸脱しないでなすことができる。

■、　と炎上ヱム兼止五 トリチクム・ブルガリス（Ｔｒｉｔｉｃｕｍｙｕｌｇａ
ｒｉｓ）から単離しかつビオチン（ｂＷＧＡ）（ベクタ
ー・ラボラトリーズＯインコーボレーテッド）で変性し
た小麦胚アグルチ゛ニン（ＷＧＡ）を、特異的結合抗原
の検出に使用した。セイヨウワサビのペルオキシダーゼ
へ複合化したアビジン（Ａｃ　ｔ　ｄ−ＨＲＰ）　　（
ベクター・ラボラトリーズ・インコーホレーテッド）を
、結合レクチンの検出に使用した。最適信号対ノイズ信
号の比を、後述する検出において、ｂＷＧＡおよびＡｖ
ｉｄ−ＨＲＰ複合体対ガンマｌアイソタイプの非特異性
マウスＩｇＧ、およびＳ２７被覆微小力価板を力価測定
（ｔｉｔｅｒ　　ｏｕｔ）することにより決定した。ロ
フト番号２０５２２号のｂＷＧＡおよびロット番号３０
４２２号のＡｖｉｄ−ＨＲＰを使用して、それぞれ２５
ｎｇ／ｍｌおよび６２５ｎｇ／ｍｌの濃度が許容さるこ
とができることがわかった。

■、　同相の構成（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔ　ｉ　。

ｎ） 精製された５２？をイムンロン（ＩｍｍｕｎｌＯｎ）２
微小力価板（ディナテッチ・コーポレーション）の表面
上へ受動的に吸着させた。０，０１モル（７）　Ｎ　＆
　２　ＣＯＢ　／　Ｎ　ａ　ＨＣＯ３緩衝液中の１１０
１Ｌ／ｍｌの濃度で５０１Ｌｌの３２７を一夜４℃にお
いて吸着させた。次いで、板を０．３％のツイーン２０
および０，４５モルの塩化ナトリウムを含有するリン酸
塩緩衝液塩溶液（ＰＢＳＴ）で洗浄した。残りの結合部
位をリン酸塩緩衝液塩溶液（ＰＢＳ）中の１％ウシ血清
アルブミンで遮断した。板を使用前ＰＳＴで再び洗浄し
た。

詰製されｔ非航里什マウスＴｒＧ−ガング１フソタイブ
を、非特異的結合の対照として使用した。被覆および洗
浄の手順は、上のＳ２？につＩ／）で記載したものと同
一であった。

■、　徴！Ω里五１１ 後述の検定において、２．０を越える光学浸度の値をも
つ患者の尿のプールから標準を調製した。標準のアリコ
ートを取り、そして検定におし）て使用するまで一７０
℃において貯蔵した。異るレベルの抗原をもつ検定標準
を、標準の尿から、ＰＢＳ中の０．１％のウシ血清アル
ブミン中に希釈することにより調製した。

■、　入社Ω尿ム皇皿至 尿を正常の個体および腎の病気をもつ個体の両者から集
めた。ナトリウムアジドを０．０２％Ｗ／Ｖの最終濃度
に添加した。試料を４℃において検定まで貯蔵した。細
胞破片および不溶性物質を添加前に遠心により１５００
Ｇにおいて１０分間除去した。

ｍｍＱｎ）−７ｅ＞ｋｗ−Ｊｌ／（ｒｓＴＯｔＯＣ０５
０ｇ１の患者の尿、検定対照、および既知の検定標準を
、前もって調製したＳ２７および対照マウスのＩｇＧを
被覆した微小力価板へ添加した。尿を２５℃において１
時間インキュベーションした。結合しない抗原ならびに
他の炭水化物含有物質を吸引により除去し、そして板を
ＰＢＳＴで３回洗浄した。５０ＩＬ１のｂＷＧＡを添加
し、そして２５℃において１時間インキュベーションし
た。結合しないレクチンを吸引により除去し、そして板
をＰＢＳＴでさらに３回洗浄した。５０糾ｌのＡｖｉｄ
−ＨＩｔＰを１時間かけて添加し、次いで吸引しかつ洗
浄した。５０．１の酵素基質の０−フェニレンジアミン
を添加し、そして色を２５℃において１時間発現させ、
次いで酵素の作用を４．５モルの硫酸の添加により停市
させた。

酵素の活性を４９０ｎｍにおける色の発現の測定により
定量した。対照マウスＩｇＧへの非特異的結合は、典型
的には０．１〜０．３光学濃度単位であり、そしてそれ
を検定値から減じた。直線の標準曲線を作成し、そして
反応性の任意゛の単位（Ａ、Ｕ、）を割当てた。４９０
ｎｍにおける１光学濃度単位を１任意単位として表示し
た。患者の値をこの標準曲線から決定した。

検定の精度の範囲内および検定精度間は１２％以下であ
った。正常の尿の標本を検定し、そしてそれは０．３Ａ
、Ｕ、の平均値を有した。腎の病気をもつ患者は、０．
１から７．ＯＡ、Ｕ、より大までの増大したレベル−を
立証した。

実施例１の方法に従い調製した、３２？および対照マウ
スＩｇＧを被覆した微小力価の板に、５０ＩＬ１の患者
の尿、検定対照、および既知の標準を添加した。インキ
ュベーションに引き続いて、結合しない抗原および他の
炭水化物含有物質をＰＢＳＴで洗浄することにより除去
した。セイヨウワサビのペルオキシダーゼ哀複合化した
小麦胚アグルチニン（ＷＧＡ−ＨＲＰ）（ベクター・ラ
ボラトリーズ・インコーホレーテッド）を１時間かけて
２５℃において添加した。結合しないＷＧＡ−ＨＲＰを
洗浄により除去し、そして実施例１におけるようにして
色の発現およびを定量を実施した。ＷＧＡ−ＨＲＰの最
適濃度を実施例１におけるようにして決定した。ロー、
ト番号１０９１２を用いると、１６７ｇｇ／ｍｌの濃度
が許容されうるものであることがわかった。

支施懇」 比較のために使用したＳ２３／Ｓ２７二重抗体のＳ２Ｓ
を実施例１におけるようにして腹水タンパク質から精製
した。

Ｉ１、　　抗体の複合化（ｃｏｎｊｕｇａｔｉ。

ｎ） Ｓ２３をセイヨウワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
と、ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）およびナカネ（Ｎａｋ
ａｎｅ）の方法［免疫蛍光および関連する着色技術にお
いて（Ｉｎ　　Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
　　ａｎｄ　　Ｒｅ１ａｔｅｄ　　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　
　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、Ｗ’、ナツプ（Ｋｎａｐｐ
）ら編、２１５ページ、１９８７］に従い複合化した。

遊離のＨＲＰｔｌ−硫酸アンモニウムの分画化により除
去し、そしてゲル透過クロマトグラフィーにより５２３
−ＨＲＰ複合体をさらに精製した。後述する検定におい
て、３２３　　ＨＲＰ複合体対非特異性マウスＩｇＧ、
ガンマｌプロトタイプ、および５２？被覆した微小力価
の板により、最適信号対ノイズの比を決定した。５２３
−ＨＲＰの最適濃度は３８５ｎｇ／ｍｌであることがわ
かった。

■、　毘租Ω璽虞 ３２？を微小力価板の表面上に吸着させ、そしてすべて
の条件は実施例１に記載するものと同一であったが、た
だし洗浄溶液は０．０５％のツイーン２０および０．１
５モルの塩化ナトリウムを含有するリン酸塩緩衝液填溶
液（ＰＢＳＳ）であった。

■、　　徴見り呈１１ 実施例１に記載するようにして、標準を調製した。

■、　　挾亙１０Ｐａ）ジニル ５０ＩＬｌの患者の尿、検定対照、および既知の検定標
準を、前もって調製したＳ２？被覆微小力価板へ添加し
た。尿を１時間２５℃においてインキュベーションした
。結合しない抗体を吸引により除去し、そして板をＰＢ
ＳＳで３回洗浄した。

５ｔ３−ＨＲＰを添加し、そして１時間２５℃において
インキュベーションした。結合しない複合化抗体を吸引
により除去し、そして板をＰＢＳＳで３回洗浄した後酵
素の基質の０−フェニレンジアミンを添加した。色の発
現および定量を実施例１におけるように実施し、そして
種々の患者の試料についての結果を表１に示す。

５．２〜７．２％は検定精度の範囲内であり、そして６
〜１２％は検定精度の間であった。正常の尿標本を検定
し、そしてそれは０．ＩＡ、Ｕ。

の平均値を有した。急性の細管の壊死（ｔ　ｕ　ｂ　ｕ
ｆａｒ　　ｎｅｃｒｏｓｉｓ）をもつ患者または最近の
腎移植をもつ患者は、０．５からＩＯＡ。

Ｕ、を越える高いレベルの抗原の値を示した。

２つの異る標準の尿から調製した検定標準を、実施例３
に記載するＳ２．／レクチン検定および実施例３に記載
する３２３／Ｓ２？検定において評価した。データは線
形回帰分析により評価し、そして０．９９の相関関係係
数が第２図に示すように２回の検定について得られた。

実施例１に記載するモノクロナルＳ２？抗体−レクチン
のサンドイッチ検定の特異性および融通性を、実施例３
に記載する二重のエピトープのモノクロナルＳ２３／Ｓ
２７のサンドイッチ検定と比較して、立証するために、
腎移植後の患者について予期される研究を実施した。第
３図に見られるように、２種類の検定を用いて測定した
腎移植患者からの尿中の抗原のレベルは一致した方法で
毎日変動する。この変動の臨床的意義はなお評価のもと
にある。２種類の検定により測定される抗原レベルの線
形回帰分析、第４図、は２種類の検定の間のすぐれた相
関関係を例示し、この患者について０．９０の相関関係
係数は２Ｗ類の検定が同一の抗原を測定していることを
示す。他の腎移植の患者ならびに急性細管壊死の患者に
ついて同様な結果が観測された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、３２３／Ｓ２７の検定の結果を示すグラフで
ある。 第２図は、Ｓ２？／レクチン検定に対するＳ２７／レク
チン検定と比較したグラフである。 第３図は、Ｓ２３／Ｓ２？検定およびＳ２．／レクチン
検定の両者による移植患者における抗原レベルを追跡し
たグラフである。 第４図は第３図に示す検定結果を比較したグラフである
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、配位子に対して特異性でありかつ固相上へ固定化さ
   れた第１配位子結合相手を準備し、試料を前記第１固定
   化配位子結合相手とそれらの間の免疫学的反応を許す条
   件下に接触させ、結合しない試料の成分の実質的すべて
   を除去し、 前記固相を前記配位子と会合した部分と結合できる非特
   異性剤と接触させ、前記非特異性剤はそれと会合した検
   出可能な標識を有し、 結合しない非特異性剤の実質的にすべてを除去し、そし
   て 前記固相とあるいは前記除去された結合しない非特異性
   剤と会合した標識を検出し、これにより前記試料中の前
   記配位子の存在を決定することができる、 工程からなることを特徴とする試料中の配位子の存在を
   決定する方法。 ２、前記部分が少なくとも１つの糖残基であり、そして
   前記非特異性剤がレクチンである特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ３、前記第１結合相手が、抗体、抗体断片、分析物受容
   体、コファクター、および補体成分から成る群より選択
   される特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、前記固相が、微小力価のウェル表面、プラスチック
   表面、パドル、微小粒子、および巨大粒子から成る群よ
   り選択される特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、前記標識が、リン光分子、蛍光分子、化学ルミネセ
   ンス分子、光散乱粒子、光吸収色素、アイソトープ、お
   よび酵素から成る群より選択される特許請求の範囲第２
   項記載の方法。 ６、前記検出工程が前記標識の検出されたレベルを標準
   と比較することをさらに含み、これにより前記試料中に
   存在する配位子の量を決定することができる特許請求の
   範囲第２項記載の方法。 ７、前記レクチンが、ヒラマメのレクチン、落花生のレ
   クチン、コンコナバリンＡ、および小麦胚のレクチンか
   ら成る群より選択され、そして前記配位子が、糖タンパ
   ク質、グリコペプチド、炭水化物、および糖脂質から成
   る群より選択される特許請求の範囲第２項記載の方法。 ８、糖残基含有配位子を該配位子と会合した決定因子に
   対して特異性である結合相手と免疫学的に反応させ、そ
   して標識付けたレクチンを前記配位子と反応させ、これ
   により前記レクチンは前記配位子中の糖残基へ結合し、
   そして前記レクチンおよび前記結合相手と反応した前記
   配位子と会合した標識を検出することを特徴とする水性
   試料中の糖残基含有配位子の存在を決定する方法。 ９、前記レクチン反応工程前に未反応の水性試料を除去
   する工程、および前記検出工程前に未反応レクチンを除
   去する工程をさらに含む特許請求の範囲第８項記載の方
   法。